Rongeurs

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de tumeur de lymphome humain sous la peau, puis jusqu'à trois injections de composés sur animal vigile, la pousse tumorale étant surveillée jusqu'à un point limite. Le porteur teste une molécule immunostimulante déjà évaluée dans ce modèle et vise un futur essai clinique. Il affirme que la sensibilité des cellules tumorales dépend du microenvironnement et qu'il faut donc travailler sur un organisme entier.

Objectifs

Ce projet vise à étudier et quantifier l’efficacité antitumorale d'une molécule seule ou formulée avec des molécules encapsulées (qui rends la molécule moins toxique) sur un modèle humain de tumeur. Que ce soit la molécule ou la molécule encapsulée, les deux sont conçues stérilement et développées spécifiquement pour être compatible avec une injection intraveineuse. Cette molécule "prototype" seule ou encapsulée a déjà été évalué dans ce même modèle humain de tumeur. Dans les deux cas il a été observé une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer la molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, la molécule seule et la molécule encapsulée ont été optimisées. C'est pourquoi la Dose Maximale Tolérée (DMT) de la molécule industrielle doit être déterminée et son efficacité antitumorale doit être confirmée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale d’une molécule immunostimulante. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des molécules et des combinaisons qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale.

Procédures

- Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (une fois au début de l'expérimentation, degré de gravité léger, quelques minutes) - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite (lorsqu'il n'y a pas de réponse au traitement, la pousse tumorale prend une vingtaine de jours) - injection intraveineuse ou intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger, quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Impact sur les animaux

- Perte de poids >10% non améliorée par ajout de nourriture humidifiée dans le fond de la cage en maximum 24h (peu probable) - Perte de poids >20% (très peu probable qui conduirait à la mise à mort de l’animal) - Injection de cellules tumorales en sous cutané : quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec ce modèle tumoral. - Injection dans la veine caudale sur animal vigile sous contention de composés thérapeutiques: douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable), 2 heures maximum, pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation a déjà été validée sur un modèle in vitro utilisé au laboratoire. En effet, nous avons déjà pré-validé notre molécule et notre formulation liposomale en in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

vant toute manipulation les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en prenant la température corporelle par voie rectale (avec une sonde enveloppée avec un gel anesthésiant) une fois par jour pendant 5 jours. les souris seront observées quotidiennement 5 jours sur 7 . les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d'appliquer les meilleurs mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoter dans le cadre de l’expérimentation. Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection, puis toutes les 24h jusqu’à 72h par les expérimentateurs. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseigne une grille de suivi basée sur des critères comportementaux (activité, isolement ...), physiques (poils hérissés, dos vouté …) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo, grâce à l’utilisation d’une lignée cellulaire tumorales d'origine humaine (implantées chez la souris), avec des traitements utilisés en clinique humaine. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. En effet la souris immunodéprimée est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Notre équipe a une forte expérience de l’utilisation de souris immunodéprimées pour l’étude d'implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser a prise tumorale.

40 rats et 80 rats roussards du Soudan (Arvicanthis) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent l'implantation chirurgicale d'une électrode dans le cerveau et un protocole de décalage horaire, une partie une restriction d'accès à l'eau et l'administration de fluoxétine, puis des stimulations électriques répétées, l'euthanasie servant à vérifier le site d'implantation. Le porteur étudie le fonctionnement de l'horloge biologique chez une espèce diurne. Il affirme que ces bases neurales ne peuvent être reproduites in vitro ni in silico et nécessitent l'animal vivant.

Objectifs

L'horloge principale est responsable de la régulation de tous les rythmes du corps et permet à l'organisme de s'adapter et d'anticiper les changements environnementaux. La perturbation des cycles externes peut nuire à notre santé. Des études récentes chez l'homme indiquent que la perturbation de l’horloge, tels que ceux causés par l'exposition à la lumière artificielle de nuit, par le jet lag ou par le travail posté, augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, des troubles du sommeil, de la dépression et maladies métabolique. L'activité électrique de l'horloge biologique est la première étape de la formation de son signal de sortie qui détermine la libération de signaux capable de synchroniser toutes les fonctions rythmiques du corps, y compris l’activité comportementale. Il n’est pas clair quel est l’effet de l’activité électrique de l’horloge sur l’activité comportamentale, et si en stimulant l'activité électrique de l'horloge centrale on peut renforcer l'amplitude du rythme de l'activité comportementale, qui au contraire diminue avec l'âge. Ainsi, le premier objective est de définir l’effet de l’activité électrique de l'horloge sur l’activité comportementale chez une espèce diurne (Arvicanthis) et chez une espèce nocturne (rat) ; et de tester chez des Arvicanthis âgée si la stimulation de l’activité électrique de l’horloge peut augmenter l'amplitude du rythme d'activité comportementale. Un des signaux qui influence l'horloge biologique est la sérotonine qui peut modifier l'activité de l'horloge. Ainsi, le second objective de ce projet est de tester si une augmentation de sérotonine, peut accélérer la resynchronisation de l’activité comportementale de l’animale a un nouveau cycle de lumière /obscurité décalé de 6h.

Bénéfices attendus

Dans la société moderne, les rythmes sont perturbés et de plus en plus de preuves montrent que cela est nocif pour la santé. Les mécanismes de fonctionnement de l’horloge ne sont pas clairs chez les espèces diurnes, interdisant le développement de thérapies pour l'amélioration des fonctions diurnes, y compris humaines. Ce projet améliorera notre compréhension du fonctionnement de l’horloge centrale chez une espèce diurne. Cela fournira des informations utiles pour développer des stratégies efficaces pour améliorer les fonctions de l'horloge chez l'homme jeune et âgé. Plus précisément ce projet : 1. Fournira des informations sur la relation entre l'activité électrique et l'activité locomotrice chez les animaux diurnes, et les éventuelles différences avec les animaux nocturnes. Ces informations peuvent aussi être utilisées pour améliorer les conditions des patients qui présentent des pathologies associées à des troubles circadiens (troubles journaliers comme dans différents troubles de l'humeur, y compris la dépression). 2. Fournira des informations sur comment la signalisation sérotoninergique interagit avec la lumière pour déphaser l'horloge biologique chez une espèce diurne. Ces résultats pourraient permettre le développement de stratégies pour aider à combattre la désynchronisation circadienne chez les travailleurs postés et lors de décalage horaire.

Procédures

16 animaux seront soumis à un protocole de décalage horaire, dont 10 seront soumis à une restriction temporelle d'eau (accès à l'eau 6h par jour), pour un total de 16 jours (4 jours de restriction temporelle d'eau suivis de 5 jours d'accès à l'eau ad libitum). Cette restriction temporelle d’eau est nécessaire pour l'administration de fluoxétine-qui entraîne une augmentation des niveaux de sérotonine-(6 jours au total) à des moments précis de la journée. 6 animaux seront soumis au même protocole (décalage horaire) mais auront toujours accès à l'eau. Ces Arvicanthis seront soumis à une chirurgie de 1 heure 1 mois après la fin du protocole de décalage horaire (durée totale 47 jours). Tous les animaux (120) seront soumis à une chirurgie de 1h qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation de la zone de la zone d'intérêt. 40 jeunes (2-5 mois) Arvicanthis (dont 16 issues du protocole de décalage horaire) et 40 jeunes (2-5 mois) rats, recevront 4 stimulations électriques par jour (durée 2h), pendant 6 jours dans 3 conditions de lumière (2 jours en 12h lumière : 12h d'obscurité, 2 jours en obscurité constante, 2 jours en lumière constante). 40 Arvicanthis âgées (>12 mois) recevront une stimulation électrique par jour (durée 2h-4h), pendant 3 jours (1 jour en 12h de lumière : 12h d'obscurité, 1 jour en obscurité constante, 1 jour en lumière constante).

Impact sur les animaux

La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu. La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux (80 Arvicanthis, 40 rats) seront mis à mort à la fin du projet. L'euthanasie est nécessaire à la vérification du site d'implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

La compréhension des bases neurales de la diurnalité, qui implique au vu des connaissances actuelles un circuit de plusieurs structures cérébrales interconnectées, dont le schéma ne peut actuellement être reproduit avec une approche in vitro ou in silico, nécessite une approche in vivo chez l'animal vivant pour atteindre l'objectif.

Réduction

Notre approche longitudinale (enregistrement en continu d’un même animal dans différentes conditions expérimentales, animal utilisé comme son propre controle) permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et de réduire la variabilité inter- individuelle. Le nombre d’animaux utilisés nous permettra d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les résultats seront exploités avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les Arvicanthis seront gardés en cages ouvertes individuelles pour enregistrement rythmes journaliers, car les animaux adultes sont agressifs entre eux. Les animaux gardent des contacts olfactifs et auditifs avec les congénères dans la même pièce. Les cages sont enrichies avec un bâton à ronger. Les cages d'enregistrement in vivo sont équipées d'un joint tournant permettant à l'animal de rester libre de ses mouvements. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L'état de santé des animaux sera évalué au cours de l'étude et des points limites spécifiques ont été établis permettant d'interrompre les procédures et soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Rats: Pour comprendre la physiologie de l'horloge chez les animaux diurnes, nous devons aussi étudier les différences avec ll'horloge chez les nocturnes. La comparaison entre nocturne et diurne apporte des informations supplémentaires sur ce qui est différent entre les deux espèces. Cela permet d'améliorer les stratégies biomédicales actuellement en place, qui sont basées sur des informations provenant d'animaux nocturnes. Le choix de cette espèce nocturne est principalement basé sur le fait que le rythme de l'activité électrique de l'horloge biologique chez le rat a déjà été caractérisé. Ceci est nécessaire pour appliquer correctement notre protocole de stimulation Arvicanthis: Comprendre les bases neuronales de la diurnalité nécessite l'étude des animaux diurnes. La disponibilité du Rat roussard du Soudan (Arvicanthis ansorgei), un rongeur diurne élevé au Chronobiotron, est une opportunité unique d'atteindre cet objectif. Rats et Arvicanthis jeunes adulte (2-5 mois), pour étudier un système circadien mature et non-sénescent. Arvicanthis âgés (> 12 mois), pour tester l'effet de la stimulation électrique sur des animaux présentant un rythme faible d'activité comportementale.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent des greffes de tumeurs d'ostéosarcome puis des traitements par voie orale deux à quatre fois par semaine pendant trois à dix semaines, en portant sous la peau des tumeurs pouvant donner des métastases. Le porteur décrit une molécule première de sa classe censée vaincre la résistance aux chimiothérapies, les bénéfices pour les patients étant renvoyés aux essais cliniques à venir. Il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas la complexité de l'organisme et conclut au caractère indispensable du recours à l'animal.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’activité d'une molécule et d'évaluer spn efficacité anti- tumorale et de mieux comprendre les mécanismes ciblés par cette molécule, en vue de vaincre la résistance aux traitements et d’améliorer la réponse des patients à mauvais pronostics (ostéosarcome pédiatrique). Après nos résultats prometteurs obtenus avec la molécule seule et en association avec des chimiothérapies in vitro, nous évaluerons la sensibilité de cette molécule in vivo sur des modèles d’ostéosarcome (lignées cellulaires et des modèles dérivés de patients), administré seul et en combinaison avec les traitements standards qui devraient avoir une synergie avec la nouvelle molécule. Nous étudierons les mécanismes d’action de cette molécule et évaluerons leur application thérapeutique pour des ostéosarcomes de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique d'une nouvelle molécule et de mieux comprendre les mécanismes liés à cette molécule. Cette molécule a le potentiel de vaincre la résistance des cancers à certaines chimiothérapies et est la première de sa classe à entrer en clinique prochainement. Le traitement pourra être utilisé dans des essais cliniques sur l’ostéosarcome pour améliorer la survie des patients de mauvais pronostic.

Procédures

Une procedure chirurgicale unique sera réalisée pour le développement des greffes de tissus de patients, avec une durée maximale de 5-10min par souris. Les souris seront soumises à des traitements par voie orale de 2 à 4 fois par semaine pendant 3 à 10 semaines (durée 1 minute). Un prélèvement de sang unique sera réalisé, sous anesthésie générale, pour les études fonctionnelles (durée: 5-10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront liés aux interventions (greffes, gavages) et à la présence de tumeurs sous la peau. Dans le cas des modèles d’ostéosarcome sous-cutané les animaux peuvent aussi potentiellement développer des métastases.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux la réponse antitumorale mise en place après traitement par notre molécule.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, osseux…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la molécule XCE853 et son lien avec les mécanismes oncogéniques et métastatiques des cancers à mauvais pronostics mais également explorer et valider l'efficacité de thérapies susceptibles d’être utilisées chez les patients.

Réduction

Peu de modèles d’ostéosarcome sont décrits, ce qui montre la difficulté d'obtenir un modèle stable et représentatif de cette maladie. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées par rapport à la littérature et sur nos résultats obtenus in vitro. Pour les modèles issus des patients, la quantité de tissu disponible est limitée donc, selon les évaluations sur les lignées cellulaires in vivo, les modèles PDX seront choisis afin de compléter les observations sur les lignées cellulaires in vivo. Considérant un taux d'échec de greffe de 50%, nous considérons donc un effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir 15 animaux traités par groupe pour l’efficacité et un effectif de 20 animaux par groupe pour obtenir 10 animaux traités pour la pharmacodynamique.. Trois modèles cellulaires (2 lignées résistants au traitement actuel et la lignée parental) et 5 modèles PDX d'ostéosarcome, représentant l'hétérogénéité de la maladie seront utilisés et chaque modèle sera traité avec la molécule d'intérêt administrée seule et en combinaison avec des chimiothérapies utilisées dans le traitement de la maladie et supposées avoir une synergie avec la nouvelle molécule d’après nos études préliminaires. Afin de réduire le nombre d'animaux implantés, nous avons choisi de réaliser un suivi du développement tumoral longitudinal par imagerie. Dans notre étude, l’imagerie sera utilisée pour une analyse, de façon à confirmer la présence/croissance tumorale et le développement des métastases.

Raffinement

Les souris sont greffées et imagées sous anesthésie générale . Les animaux sont surveillés chaque jour après la chirurgie afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de détecter précocement un développement de la tumeur. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. De plus, si nous détections des signes de douleur, nous donnerions un antalgique ou morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d’une anesthésie locale . Les animaux sont stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement adapté à l'espèce sera systématiquement ajouté dans les cages. Un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. D'après notre expérience, nous avons pu observer que l’ostéosarcome se développe mieux chez la souris immunodéficiente, aussi les métastases semblent se développer davantage chez ces souris, ce qui en fait un modèle de choix pour notre projet. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 sur la langue, elles subissent un régime obésogène, des mises à jeun répétées, des tests de préférence au gras, un gavage au glucose et des prélèvements de sang, avant le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'obésité induite entraîne un inconfort et de possibles complications. Le bénéfice annoncé se limite à décrire une nouvelle souche génétiquement modifiée servant de modèle pour de futures questions sur le goût du gras.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récepteurs aux acides gras dont l’un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Cette étude a pour but d’étudier le rôle spécifique de CD36 au niveau de la langue. Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas le récepteur CD36 au niveau de la langue.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang) (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), et une individualisation ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test double choix (2 tests par semaines). Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les tests de préférence rapide au gras (mesure des lapements pendant 5 minutes) nécessiteront également une mise à jeun de 12h avant chaque test avec une pesée avant mise à jeun et après test permettant l’évaluation du poids des souris. Les souris seront soumises à un test nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes et gavage de 100 µL pour 10g de masse corporelle) et 5 prélèvements sanguins de faible volume (5 µL à chaque temps soit 25 µL au total) seront réalisés sous anesthésie locale. A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent être sous stress, des suites de prélèvements répétés lors de la glycémie ou encore des suites d’individualisation pour les tests double-choix.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’obésité est une pathologie faisant intervenir une communication inter-organes in vivo qui se caractérise par des altérations du métabolisme des lipides, des glucides et du comportement alimentaire. Ces paramètres métaboliques et comportementaux ne peuvent s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. De plus, les souris sont habituées à la contention pour les pesées hebdomadaires, et après la mise à mort des souris la collecte des tissus permet de construire une banque d’organes. Enfin, chaque geste technique est réalisé par les personnels qualifiés et entrainés ce qui diminue le stress.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris est anesthésiée et intubée pour recevoir dans les poumons une injection unique d'un composé induisant une inflammation de type BPCO. Le porteur indique une possible blessure de la trachée et des difficultés respiratoires liées au développement de l'emphysème. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité de la maladie et de la circulation des cellules immunitaires, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie chronique respiratoire. Chez les personnes atteintes, une inflammation des voies aériennes entraîne des perturbations dans le fonctionnement normal des poumons. Les alvéoles pulmonaires qui permettent les échanges gazeux lors de la respiration sont progressivement détruites, conduisant à un emphysème. On estime que la BPCO atteint 3,5 millions de personnes en France, soit 7,5% de la population. La maladie est plus fréquente chez les fumeurs, le tabac étant le principal facteur de risque. Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituter une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la BPCO.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques concernant la circulation et la prolifération des cellules immunitaires. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer la contribution des cellules immunitaires dans la BPCO. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans cette pathologie.

Procédures

La BPCO est induite chez les souris par une injection unique, directement dans les poumons, d'un composé provoquant une inflammation. Pour cela les souris sont anesthésiés (environ 20 minutes) et intubées le temps de l'injection (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

En de rares occasions, une blessure de la trachée pourra être observée . Le développement de l’emphysème pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Une évaluation exhaustive de la bibliographie nous a confirmé qu'il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre au cours de la BPCO et de la circulation des cellules immunitaires entre les organes. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons utilisé une analyse statistique a priori afin de limiter le nombre d’animaux au strict minimum.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. Avant la procédure expérimentale, les souris seront anesthésiées afin d’éliminer la souffrance potentielle due à la procédure. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'Homme pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait impacter sur les résultats.

168 souris âgées de 20 à 24 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant dix-huit semaines, chaque souris reçoit deux injections sous-cutanées par semaine, des prélèvements sanguins et des mesures répétées d'électroneuromyogramme et d'impédancemétrie, pour tester une molécule contre la fonte musculaire liée à l'âge. Le porteur indique des indurations possibles aux points d'injection et une perte de poids liée à l'âge ou à des tumeurs. Il affirme que le test de force ne peut se reproduire sur modèle cellulaire et que le recours à l'animal est un "prérequis réglementaire", les retombées visant les personnes âgées.

Objectifs

Au cours du vieillissement, la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement de façon involontaire. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : la sarcopénie (forme d' atrophie musculaire liée au vieillissement). La sarcopénie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. Les évènements biologiques contrôlés par le GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) sont connus pour être activés dans certaines conditions conduisant à une atrophie musculaire (écrasement du nerf par exemple): leur activation permet de contrer les effets de la fonte musculaire. Dans le cas du vieillissement, il a été montré que l'expression de GDF5 diminue dans les muscles, et que la sur-expression locale de la protéine recombinante rGDF5 dans un muscle de souris âgée augmente la masse musculaire. Des études de preuve de concept réalisées à une concentration unique de rGDF5 ont permis de mettre en évidence une amélioration du poids et de la force musculaire chez des souris âgées, ce qui permet d'envisager une transposition clinique de cette molécule chez des patients atteints de sarcopénie. Dans cette optique, ce projet aura pour but de définir la dose minimale efficace de rGDF5 nécessaire pour améliorer le poids et la force musculaire dans un modèle murin de souris âgées.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris devraient consister en une stabilisation ou une augmentation du poids des muscles, une amélioration de la composition corporelle (ratio masse grasse/masse maigre), de la communication nerf-muscle (mesurée par un test de l'activité électrique transmise du nerf au muscle) et de la force globale et spécifique des muscles, ainsi qu'une amélioration de la survie à 24 mois. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace de la molécule thérapeutique rGDF5 afin d'envisager dans un second temps une transposition en clinique chez le sujet âgé. Plus de 25% des personnes âgées de plus de 70 ans étant affectées par la sarcopénie, le bénéfice en termes de santé, et par voie de conséquence en termes de financement des soins liés à cette pathologie, est potentiellement très important.

Procédures

Les souris subiront deux injections sous-cutanées par semaine pendant une durée de 18 semaines. Chaque injection dure environ 1 minute. Des prélèvements de sang seront réalisés à 4 points de temps: au moment de l’inclusion des souris, puis 15 jours et un mois après l’administration, et en fin de protocole. Chaque acte ne durera pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures d'électroneuromyogramme espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 5 mesures d'impédencemétrie, espacées chacune de 1 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées en fin de mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées de 20 à 24 mois qui peuvent présenter une perte de poids possible due à l'âge ou développer des tumeurs. L'injection de protéine rGDF5 par voie sous-cutanée deux fois par semaine pourrait entrainer la formation d'indurations aux points d'injection.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements des organes et évaluation de l'efficacité du traitement.

Remplacement

Le projet a pour but de mesurer l'effet thérapeutique de la molécule rGDF5 au niveau de la musculature dans un modèle de vieillissement, notamment par des mesures de force musculaire: le test de force ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle dans toute leur complexité. De plus, le recours à l'animal est un prérequis réglementaire pour les études d'efficacité non-cliniques. L'utilisation d'animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre d'animaux, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une augmentation de la force musculaire de 14% minimum. Le calcul permet de conclure que 8 animaux sont nécessaires par groupe. Considérant l'expérience de nos collaborateurs, une mortalité élevée de 35% en moyenne a été observée chez les souris entre l'âge de 20 et de 24 mois: pour cette raison, l'effectif a été majoré, soit 8 animaux + 4 animaux supplémentaires = 12 animaux par groupe de souris par condition afin de permettre une analyse statistique fiable et d'éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo n'empêche la bonne exploitation des résultats.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux étant âgés, ils seront observés attentivement 2 fois par semaine. Tous les tests fonctionnels seront réalisés dans une pièce dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les grip tests ne sont pas source de stress pour l'animal, qui s'agrippe naturellement à la grille. Pour l'ENMG ou la mesure de la force sur le TA, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse pour l'ENMG et sous anesthésie générale pour la mesure de force sur le TA. La mesure d'impédencemétrie n'est pas douloureuse (courant de très faible intensité), mais les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour permettre le placement des électrodes et les mesures. Au cours des différentes procédures, les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leurs corps A l'exception du test de mesure de force sur le TA qui est terminal, en fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Après l'ENMG, ils recevront par voie sous-cutanée un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h. Ils seront ensuite surveillés très attentivement et pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de relever le moindre signe de souffrance. Les prélèvements de sang se feront par voie sous-mandibulaire durant le protocole et par voie rétro-orbitale au moment de l’euthanasie. Dans le cas du prélèvement sous-mandibulaire, l’animal sera maintenu par contention, des lancettes à usage unique seront utilisées puis une compresse sera appliquée quelques secondes au point de prélèvement pour stopper le saignement. Les souris seront surveillées individuellement après les prélèvements pour s’assurer que le saignement ne reprend pas, et un nouveau point de compression sera réalisé le cas échéant. Dans le cas du prélèvement rétro-orbital, le sang sera prélevé à l’aide d’un capillaire sur animal anesthésié par la voie générale, puis la souris sera euthanasiée. Les actes seront rapides (moins d’une minute).

Choix des espèces

Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment la sarcopénie liée au vieillissement, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur ces pathologies. De plus, ce modèle permet une évaluation fonctionnelle très complète à de multiples niveaux, comme mis en évidence lors de sa caractérisation (Grip test, mesure de force sur TA in situ, impédencemétrie, ENMG). Les souris C57BL/6 seront des adultes âgées de 20 mois en début de protocole et de 24 mois en fin de protocole afin que la sarcopénie soit à un stade avancé. Ces âges ont préalablement été définis par nos collaborateurs lors de la preuve de concept de l'efficacité de rGDF5. La caractérisation du modèle à donc également été réalisée à ces âges.