Rongeurs

1593 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une greffe sous-cutanée de quatre biomatériaux sous anesthésie, puis est tué de six heures à six semaines après l'opération pour récupérer les implants. Le porteur qualifie la chirurgie de faiblement invasive et bien supportée, tout en reconnaissant un risque de septicémie. Il affirme que la sélection du meilleur couple cellules-biomatériau passe par l'animal, une partie du travail restant menée in vitro.

Objectifs

Le traitement des grands défauts osseux est un défi chirurgical puisque 5 à 20% des fractures des os longs sont incapables de se consolider après 6 mois, causant ainsi des morbidités et des hospitalisations prolongées. Actuellement, une partie de l’os de la hanche du patient est prélevée puis greffée au niveau du site du défaut osseux. Ces fractures vont augmenter avec le vieillissement de la population, ce qui nécessite de trouver des alternatives de soin moins invasives et moins douloureuses pour le bien être des individus touchés. Plusieurs alternatives ont donc été développées comme l’utilisation de matériaux synthétiques ou d’origine naturelle (biomatériaux). Cependant, ces supports ne possèdent pas la capacité de former de l’os du fait, notamment, de l’absence de cellules souches. L’ingénierie tissulaire combinant les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse humaines (BMSCs) avec des biomatériaux, représente une approche prometteuse pour réparer l’os endommagé. Cependant, malgré des résultats cliniques encourageants (essais de phase II), le délai de reconstruction de l’os reste encore trop long pour 75% des patients, révélant ainsi la nécessité d’optimiser l’efficacité de ces approches. Les résultats encore insuffisants des essais cliniques sont probablement dus à la courte durée de vie des BMSCs en raison du foyer inflammatoire et de l’absence de nutriment et d’oxygène au niveau du site endommagé. Ce projet est une phase préliminaire permettant d'étudier la vascularisation au niveau de l’implant afin d'améliorer la survie des cellules stromales mésenchymateuses greffées et ainsi améliorer la formation osseuse. L’association cellules-biomatériau ainsi que la répartition des cellules au sein du biomatériau semblent donc être fondamentales. L’objectif de ce projet à long terme est d’améliorer les thérapies de reconstruction osseuse existantes en concevant un produit d’ingénierie tissulaire efficace, adapté au patient et à moindre cout.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, en travaillant sur les procédés de culture des cellules stromales mésenchymateuses humaines, nous envisageons de réduire le temps et le cout de production des cellules. Concernant le biomatériau, nous utiliserons des biomatériaux issus de l’impression 3D permettant une adaptabilité parfaite au défaut du patient. Ce projet nous permettra de déterminer le biomatériau avec la porosité et les propriétés biomécaniques les plus adaptées au développement de la vascularisation, ainsi qu’à la croissance et à la différenciation vers la voie osseuse de nos cellules.

Procédures

Chaque animal du projet sera soumis à un acte chirurgical sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes environ. Les animaux seront mis à mort afin de récupérer les biomatériaux greffés 6 heures, 72 heures, 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après l’acte chirurgical.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale de greffe sous-cutanée est faiblement invasive et très bien supportée par les animaux. Une fois réveillés de l’anesthésie, les animaux retrouvent très rapidement leur mobilité permettant de retrouver une alimentation et des interactions sociales normales. Toutefois, bien que toutes les précautions nécessaires d’asepsie soient respectées, un risque de septicémie suivant l’acte chirurgical ne peut être écarté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de récupérer les échantillons greffés en sous-cutané.

Remplacement

Une partie du projet s’effectuera in vitro en testant la toxicité des potentiels biomatériaux sur les cellules ainsi que les capacités d’adhésion des cellules au biomatériau, son impact sur la différenciation vers la voie osseuse et sur la sécrétion de protéines favorisant l’inflammation. Le but de ce projet est de déterminer la meilleure association cellules / biomatériau afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques existantes. Pour sélectionner la meilleure association, des analyses in vivo sont nécessaires afin d’étudier les interactions avec les cellules de l’hôte ainsi que la mise en place de la vascularisation.

Réduction

-La procédure chirurgicale est maitrisée dans le laboratoire et est effectuée par du personnel qualifié. - chaque animal est greffé avec 4 biomatériaux en sous-cutané afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en s’assurant de la véracité des résultats obtenus - Pour que l’étude soit statistiquement pertinente, 6 implants par condition dans 6 animaux indépendants seront réalisés. Afin de limiter les effets donneurs-dépendants, l’étude sera menée en utilisant les cellules stromales mésenchymateuses de 3 donneurs différents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès libre à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, ou carré de coton compacté. La présence de blessure ou de tout autre signe de souffrance seront évalués quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Une période d’acclimatation d’une semaine est respectée avant de démarrer toute procédure sur les animaux. Une grille de score d'évaluation est proposée pour la prise en compte des critéres d'arrêt de la souffrance. Pour cela, nous suivrons la grille d’évaluation proposée : a)Changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids 20% b)Apparence physique 0. Normale 1. Manque de toilettage 2. Poil ébouriffé, paupière fermée 3. Poil très ébouriffé, posture anormale c)Comportement 0. Normal 1. Changements mineurs : activité réduite 2. Anormal : inactif 3. Très agité ou immobile, auto-mutilation Tout animal auquel aura été attribuée une valeur totale comprise entre 3 et 4 recevra de la Buprénorphine toutes les 12h pendant 3 jours après la chirurgie (0.1mg/kg en sous-cutané). Tout animal auquel aura été attribuée une valeur > 4 sera immédiatement mise à mort.

Choix des espèces

Afin d’éviter les biais dus à des variations physiologiques durant la phase de croissance osseuse, les souris utilisées seront d’âge adulte situé entre 6 semaines et 9 semaines (au-delà de cet âge une diminution de la masse osseuse due au vieillissement est observée)

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires et intrapéritonéales, des mesures de force musculaire sous anesthésie, un test de suspension et un test d'actimétrie, pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie liée au gène Bin1. Le porteur décrit une atteinte musculaire qu'il juge légère et sans douleur, mais tue les souris pour prélever leurs organes et parce que la maladie deviendrait sévère si elles restaient en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 600 tuées à l'issue et 40 réutilisées pour des formations. Chaque souris reçoit sous anesthésie une injection intracolonique de composés irritants comme l'huile de moutarde ou la capsaïcine, pour développer un modèle de douleur viscérale du côlon irritable. Le porteur indique que la stimulation ne peut être interrompue en fin d'observation, ce qui justifie la mise à mort des animaux dès la fin de la phase expérimentale. Il affirme que l'étude d'analgésiques chez l'animal vigile reste "la seule option" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le syndrome du côlon irritable est un trouble gastro-intestinal caractérisé par des douleurs abdominales récurrentes associées à des troubles du transit intestinal. Environ 1 personne sur 10 dans le monde souffre du syndrome du côlon irritable et ce diagnostic est associés à une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des impacts socio-économiques importants. L’objectif de ce projet est de développer deux modèles d’hypersensibilité viscérale non invasifs et ne nécessitant pas l’hébergement isolée des animaux. Ce modèle est basé sur l’administration de composés irritants, l’huile de moutarde et la capsaïcine, naturellement présents dans l’alimentation. L’administration de ces composés permet de stimuler les voies nerveuses viscérales et cause un ensemble de comportements spécifiques qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale. Le développement de ces modèles permettra de tester le potentiel analgésique de composés pharmacologiques pour avancer leur développement.

Bénéfices attendus

La douleur viscérale est une cause récurrente de consultation médicale. Les options pharmacologiques pour la prise en charge du syndrome du côlon irritable, qui entraine des douleurs viscérales récurrentes, restent limitées et concentrées sur la régularisation du transit intestinal, bien que la douleur soit la plainte principale des patients. Ce projet vise à développer un modèle d’hypersensibilité viscérale qui sera intégré à batterie de tests conçue pour évaluer rapidement et sur un nombre réduit d’animaux le potentiel analgésique de composés pharmacologiques. Le développement et l’amélioration de modèles afin que ceux-ci se rapprochent de la physiopathologie du syndrome du côlon irritable soutient la recherche pharmaceutique dans le développement de traitements en raffinant les outils d’évaluation des molécules. Enfin, le test de composés pharmacologiques des batteries de tests est une bonne pratique recommandée afin d’augmenter la probabilité de succès des composés lors des phases cliniques de leur développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’administration de composés irritant naturellement présents dans l’alimentation par une injection intracolonique réalisée sur des animaux sous anesthésie gazeuse puis observés pendant les vingt minutes suivant leur réveil. Cette intervention type administration ne prend que quelques minutes. Chaque animal ne subira la procédure qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. L’administration intracolonique des composés irritants est réalisée sous anesthésie gazeuse afin favoriser le relâchement musculaire de l’animal et d’éviter tout dommage tissulaire ou stress lié à la contention. Les modèles d’hypersensibilité viscérale par irritation colonique entrainent un ensemble de comportements spécifiques (léchage de l’abdomen, étirement de l’abdomen, écrasement/pression de l’abdomen contre le sol, rétraction de l’abdomen) qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale pendant les 20 minutes d’observation. L’interruption de la stimulation chimique à la fin de la période d’observation n’étant pas réalisable, les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de la période d’observation.

Devenir

Le stimulus administré (i.e. injection d’une substance irritante dans le côlon) ne pouvant être effectivement interrompu à la fin de la période d’observation et l’hypersensibilité viscéral induite risquant de se prolonger, les animaux seront euthanasiés dès la fin de la phase expérimentale. Par ailleurs, pour la procédure 1 : le groupe Sham neutre qui reçoit un véhicule et le groupe naïf qui ne reçoit aucune substance pourront être réutilisés pour des formations. De ce fait, ces animaux (n=40) ne seront pas mis à mort à la fin de la phase expérimentale.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur (IASP), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans l’article princeps décrivant le développement des modèles ajusté pour prendre en compte la variabilité de ces modèles rapportée dans la littérature. Ce nombre est cohérent avec l’expérience du laboratoire dans des modèles équivalents (Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.

Raffinement

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne nécessairement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique). Le choix d’un modèle d’hypersensibilité viscérale aigue constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances. L’irritation colonique subie par les animaux est limitée à la durée de l’observation et l’administration des composés est réalisées sous anesthésie gazeuse. La concentration des composés irritants sélectionnée sera la concentration minimale permettant d’éliciter une réponse reproductible avec le minimum d’effets secondaires pour les animaux. Les animaux seront suivis de près à la suite de l’instillation. De plus, avant l’instillation les animaux sont habitués au dispositif expérimental pour limiter les impacts sur leur bien-être. La procédure est arrêtée en cas d’atteinte de points limites tels que : Signes notables: freezing, tremblements, immobilité et signes sévères : morsure/mutilation de l'abdomen ou de la zone périanale, saignement anal, prostration/absence de réaction à la stimulation. Ces signes notables/sévères sont traités pour chaque animal. L'apparition récurrente de ces signes pendant la procédure entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet car les modèles développés dans ce projet l’ont initialement été chez la souris et bien reproduits et caractérisés dans la littérature. Les animaux utilisés seront des souris adultes, en cohérence avec la population humaine chez laquelle la prévalence est maximale.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec un régime gras à l'huile de palme, elles subissent des prélèvements sanguins répétés, des gavages et des périodes de jeûne, pour étudier le rôle d'une protéine intestinale dans l'obésité. Le porteur indique que le régime vise à induire l'obésité et que l'isolement, le gavage et les injections peuvent provoquer stress et gêne. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un excès d’apport énergétique et une élévation de l’endotoxémie. Le récepteur membrannaire CD36 (cluster of differentiation) semble impliqué dans le transport de ces toxines du microbiote intestinal. Dans un précédent projet, nous avons étudié l’impact d’un régime riche en acides gras insaturés. L’objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité induite par un régime riche en acides gras saturés. En effet le CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies associés à un excès de lipides. Pour ce faire nous utiliserons des souris n’ayant plus de CD36 dans l’intestin, comparées à des souris contrôles. 96 souris contrôles et 96 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime classique soit avec un régime hyperlipidique enrichi en huile de palme durant 12 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Afin d’étudier les variations liées au sexe l’intégralité de ce projet sera réalisée avec des animaux mâles et des animaux femelles. 192 animaux au total seront donc utilisés.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle la dépense énergétique en régime normo- et hyper-lipidique riche en acides gras saturés ? 2. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et l’adaptation intestinale à un régime hyperlipidique riche en acides gras saturés ? 3. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’endotoxémie et l’écologie du microbiote intestinal en régimes normo- et hyperlipidique riche en acides gras saturés? 4. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’effet obésogène de l’exces de lipides alimentaires saturés ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaire.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire, ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 à 3 minutes) en semaine 0, 2, 4 et 12. La procédure 1 est appliquée à la moitié de l’effectif pour laquelle des mesures de prise alimentaire et de récolte des feces dans la cage seront réalisées, en semaine 0 et 11. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine -2, -1, 6, 7 et 9. La procédure 2 est appliquée à l’autre moitié de l’effectif où une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 7. Cette mesure est indolore et non invasive et s’effectue dans des cages spécifiques de mesure. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine 0 et 5. A l’issue du régime en semaine 12, l’ensemble de l’effectif subira un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie générale, puis sera euthanasié pour réaliser des prélèvements d’organes.

Impact sur les animaux

Le régime hyperlipidique est utilisé pour induire l'obésité chez les animaux. Des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids pourraient être attendues. Toutefois, elles ne sont jamais observées après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris sur de courtes durées, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Un enrichissement supplémentaire sera proposé dans leurs cages d'hébergement afin de compenser cet effet indésirable. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gène de courte durée. L'echoMRI est une technique non invasive, qui recquiert une contention courte inférieure à 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique est indolore et non invasive. Cependant, elle nécessite une individualisation en cage spécifique, qui peut induire un stress sur 5 jours. Le sprelèvements sanguins à la queue des souris nécessite une contention légère et ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement sanguin en intracardiaque final est réalisé sous anésthésie, et ne dure pas plus de 30 secondes. Les souris subiront une mise à jeun de 12 heures. Pour les injections en IP (intrapéritonéale, au niveau de la cavité abdominale) et en IV (intraveineuse), il peut y avoir une douleur au point d'injection. Les produits injectés sont indolores (insuline) et à de faibles volumes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques (ANOVA), sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie du crâne d'environ une heure avec deux injections dans l'hippocampe, pour étudier le rôle de vésicules libérées par les astrocytes dans la mémoire. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids et infection du site opératoire. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable", d'éventuelles pistes contre la maladie d'Alzheimer restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que certaines cellules du cerveau, que l’on appelle « astrocytes », jouent un rôle clé au cours de la communication entre neurones. En effet, un astrocyte peut détecter l’information qui est transmise dans la zone de communication entre deux neurones et en retour venir réguler cette communication neurone-neurone en libérant des transmetteurs. Des études récentes sur des modèles de cultures cellulaires suggèrent cependant qu’une autre voie encore très peu explorée permettrait également aux astrocytes de réguler la communication neurone-neurone: la voie des vésicules extracellulaires. En effet, les astrocytes libèrent de petites vésicules contenant des protéines et des acides nucléiques capables de réguler l’expression de protéines à l’intérieur des cellules voisines. Ces vésicules, une fois libérées par les astrocytes, pourraient être capturées par les neurones voisins et modifier l’expression de protéines jouant potentiellement un rôle clé dans la communication entre neurones. Il est maintenant crucial de vérifier si cette voie des vésicules extracellulaires, identifiée dans des cultures cellulaires, est également présente dans des conditions physiologiques. Pour ce faire, nous allons étudier leur rôle dans l’hippocampe, une région du cerveau jouant un rôle clef dans la mémoire. Les astrocytes y régulent les communications neurone-neurone qui sont considérées comme la base cellulaire de la mémoire. Si les vésicules extracellulaires jouent un rôle dans cette régulation, alors empêcher leur libération par les astrocytes aura un impact sur les communications neurone-neurone et affectera potentiellement la mémoire. Notre projet vise donc à mieux comprendre le rôle des vésicules extracellulaires libérées par les astrocytes dans l’hippocampe de souris adultes en évaluant leur impact sur la communication neuronale et sur la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant les bases cellulaires de la mémoire. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 5 : 1/ Chirurgie pour injections intrahippocampiques: les animaux seront anesthésiés durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, puis deux petites craniotomies permettant la descente de l’électrode d’injection au niveau des deux hippocampes. Les animaux subiront donc au total 2 injections chacun, puis seront suturés. 980 soit la totalité des animaux seront concernés. 2/ Anesthésie pour perfusion : Avant de réaliser les perfusions intracardiaques, les animaux recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange d’anesthésiques. Tous les animaux utilisés pour les études immunohistochimiques sont concernés, soit un total de 180 animaux. 3/ Perfusions intracardiaques sur animal anesthésié : une fois l’injection d’anesthésiques réalisée, une perfusion intracardiaque sera effectuée. Les mêmes 180 animaux seront utilisés. 4/ Expériences d'électrophysiologie et de PatchSeq : les animaux seront anesthésiés puis le cerveau prélevé. 680 animaux sont concernés. 5/ Spectrométrie de masse et de nanocytométrie de flux : les animaux seront anesthésiés par une injection intra-péritonéale unique du mélange d'anesthésiants. Puis, 30 min après l’induction de l’anesthésie, et suite à la surveillance de la respiration et des réflexes de la patte et palpébral, le cerveau sera prélevé et transféré dans de l’azote liquide. Pour ce geste technique, 120 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suite aux procédures chirurgicales, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Pour prévenir ces phénomènes, un analgésique sera injecté en préemptif par voie sous-cutanée. Si nécessaire, l’injection sera renouvelée 24 heures après la chirurgie pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons quotidiennement une pommade cicatrisante, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort. Les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon la grille d’évaluation (cf grille jointe), organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si l’animal présente des signes de douleur (score entre 3 et 6), nous injecterons immédiatement un analgésique en sous-cutané pour calmer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement ou en cas de souffrance avérée (score entre 7 et 15), l’animal sera mis à mort.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires dans un réseau adulte, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo et sur tranches aigües de cerveau est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Nous ne pouvons donc pas recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au cours de la chirurgie, pipette utilisée pour injecter le virus bouchée, injection dans la mauvaise structure cérébrale, problème au moment de la dissection, problème rencontré au moment de l’expérience d’électrophysiologie). Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous regrouperons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest et sizzle nest), jusqu’au nombre de huit animaux par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur (score entre 3 et 6) au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement un analgésique en sous-cutané pour calmer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement ou en cas de souffrance avérée (score entre 7 et 15), l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Ce modèle permet de produire des tranches aiguës de cerveau afin de réaliser des études d’électrophysiologie. Les souris seront âgées de 7 semaines minimum au moment des injections intra cérébrales. Ensuite, les diverses études seront réalisées 3 à 5 semaines après les injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 10 à 12 semaines.

5 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées puis une injection intracérébrale sous anesthésie, avant d'être mis à mort par décapitation, y compris des nouveau-nés décapités à la guillotine ou après refroidissement, pour tester ex vivo des molécules candidates de laboratoires clients. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer stress, inflammations, infections et blessures de l'œsophage. Il décrit une activité de prestation pour l'industrie pharmaceutique et affirme que ces enregistrements sur tissu vivant constituent la "meilleure approche".

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleure prédictibilité d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phases précliniques réglementaires, il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grandes quantités d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié. Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central de rongeurs, traités par des molécules directement dans ce système nerveux central, permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur considéré. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique, le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec circuit imprimé d’électrodes et le Patch = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécules.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, injectés directement dans le cerveau constitue la meilleure approche car elle permet : - de franchir la barrière hémato-encéphalique ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons) ; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront administrés deux fois par jour avec une manipulation de 5 minutes maximum par animal, soit 10minutes da manipulation au total par jour. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne trois semaines au cours de nos études. Ces multiples manipulations et peuvent souffrir d’inflammation ou de blessure à l’œsophage en fonction des sites d’injections choisis. Tous les animaux subiront l’injection intracérébrale, durant 30-45 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Les nuisances pouvant apparaitre sont des inflammations aigues, des infections et, en conséquence indirecte, un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus entre 0 et 21 jours post naissance (c’est-à-dire non sevrés). Les temps de mise à mort varient en fonction du moyen utilisé mais n’excèdent pas dix minutes sous anesthésie et analgésie quand cela est nécessaire. Pour les Rats et Souris < P5 sont anesthésiés sur un bloc froid réfrigérant, sans contact direct, jusqu’à perte des réflexes au pincement d’une patte postérieure, puis décapités avec une paire de ciseaux adaptés, il temps entre l’anesthésie et la mise à mort est de 7 min ; Pour lesP5 < Rats et Souris P10 : les animaux seront anesthésiés par induction gazeuse à l’isoflurane (3.5% rat et 2.5% souris) puis décapités grâce à une guillotine adaptée, pour un temps de manipulation de maximum 7min. Si les animaux sont mis à mort par exsanguination, la totalité de l’intervention est de 12 minutes et passe par une anesthésie gazeuse, puis une analgésie sous masque anesthésique, 5 minutes d’attente et enfin exsanguination.

Impact sur les animaux

Nous avons une procédure qui peut amener à des effets indésirables. La procédure peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection comme des inflammations, des infections, de blessure de l’œsophage ; *- la mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection intra-cérébrale peut induire des problèmes de type opératoire et post-opératoire, comme des inflammations aigues, des infections et une conséquence indirecte : un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus opérés entre 0 et 21 jours post naissance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Ces mises à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégénératives et à la maîtrise des protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé un nombre suffisant d’animaux nous permettant de valider nos enregistrements. Compte tenu des variations du taux de réussite attendu lors de l’injection intracérébrale au cours des études utilisant cette procédure, nous adapterons ce nombre grâce à une étude pilote qui sera réalisée avant d’introduire plusieurs conditions de test. Cette étude pilote ne sera pas réalisée si les données de notre client sont suffisantes pour garantir une significativité. Les enregistrements validés sont rassemblés par condition pour l’analyse. Nos analyses statistiques des résultats permettrons de déterminer l’efficacité du test. Lors de l’étude pilote, nous pourrons évaluer la significativité statistique et si elle n’est pas atteignable, l’étude sera suspendue. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant par 4 conditions différentes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. .Les animaux préalablement administrés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera effectué. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique. Ces animaux seront asymptomatiques. L’injection intracérébrale sera précédée d’une prémédication et suivi par des soins antalgiques et enfin d’une couverture antalgique et de suivi clinique deux fois par jours. Les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse et analgésique pour assurer l’enregistrement des activités neuronales.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.