Rongeurs

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement induisant chez leurs embryons des mutations qui reproduisent une carence complète en vitamine A, puis sont tuées par dislocation cervicale pour que les fœtus soient prélevés, observés et fixés, certains fœtus étant refroidis puis plongés dans un fixateur histologique. Le porteur décrit une "douleur minime" pour les femelles et reconnaît que la souffrance fœtale est "difficile à évaluer", les prélèvements étant programmés un jour avant la mort ou la naissance attendue. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier l'organogenèse et conclut à l'impossibilité d'un remplacement in vitro.

Objectifs

Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les anomalies congénitales sont définies comme des anomalies de développement qui surviennent durant la vie intra-utérine et qui peuvent être identifiées avant la naissance, à la naissance ou plus tard dans la vie. Pour mieux appréhender la pathogénie des anomalies congénitales, nous proposons de comparer des reconstructions tridimensionnelles (3D) d'embryons de souris porteurs de mutations connues avec leurs congénères normaux, entre le début de la formation des organes (9.5 jours post-fécondation ; E9.5) et la fin de la gestation (E18.5). Pour les stades de développement compris entre E9.5 et E15.5, nous utilisons une nouvelle technologie d’imagerie, l’HREM (microscopie épiscopique haute résolution), qui génère des images comparables, en termes de résolution, à l’histologie : elle permet de visualiser les surfaces et les volumes des organes internes et des cavités, dans le système nerveux, le poumon, le cœur et les vaisseaux, l'intestin et le système urogénital. Les embryons et fœtus mutants pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara, Rarb et Rarg) développent des anomalies congénitales. Ce modèle imite un état de carence complète en vitamine A qui, pour des raisons techniques, n’avait jamais été analysé auparavant puisque cette vitamine est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères. Ces mutants seront utilisés comme modèle d’anomalie congénitale dans notre étude en imagerie.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales affectent 1 nourrisson sur 30 partout dans le monde et entraînent annuellement 3 millions d'incapacités physiques, fonctionnelles et mentales. Les anomalies congénitales ne sont diagnostiquées qu'après la naissance ou, plus rarement, en fin de grossesse. Pourtant, la plupart d'entre elles sont déterminées très précocément, au cours des toutes premières semaines qui suivent la fécondation. De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de l’ensemble de ses gènes, la souris est un excellent modèle pour comprendre les maladies humaines. Les études cliniques et les approches expérimentales ont révélé que la vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes dont l’acide rétinoïque) exercent une grande variété d'effets sur l’embryogenèse. Ces anomalies sont retrouvées chez l’un ou l’autre des mutants combinés pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara/b, Rara/g et Rarb/g) ce qui suggère une redondance fonctionnelle entre les RARs. Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension du moment propice d’action de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque pour permettre les différentes étapes de l’organogenèse. Cet objectif sera atteint en étudiant les conséquences de l’inactivation de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Ceci sera réalisé par l’ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées pour permettre la mutation (recombinaison). Une contention simple qui dure 15 à 20 secondes pour administrer avec soin le traitement. Les souris femelles sont euthanasiées par dislocation cervicale (cela prend entre 5 secondes et 5 minutes selon la méthode utilisée). Les fœtus à E18.5 sont sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils sont ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 sont sortis des cornes utérines. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils sont rendus inconscients par le froid. Ensuite, les foetus sont euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.

Impact sur les animaux

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La souffrance des femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration du traitement permettant la mutation (recombinaison). Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables de nos manipulations génétiques chez la femelle gestante traitée, mais tous les animaux sont surveillés soigneusement. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (Femelles gestantes et fœtus) seront euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses HREM ou les analyses sur coupes. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

L’organogenèse fait intervenir plusieurs types cellulaires de l’embryon. Notre étude vise à évaluer les périodes pendant lesquelles l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires dans un système physiologique. Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants après le traitement utilisé pour permettre la mutation (recombinaison). La stratégie de prélèvement des embryons ou des fœtus permet aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés de l’organogenèse et permettent d’éviter la dissection au hasard. Les mâles et les femelles sont utilisés pour l’étude quand l’organogenèse s’y prête. Par exemple pour les études sur le développement du crâne ou des poumons, nous pourrons analyser les deux sexes. Par contre, pour les études sur le système urogénital, nous aurons besoin d’analyser à la fois des mâles et des femelles. Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade nous analyserons 3 embryons/foetus contrôles et 3 embryons/foetus mutants. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes (traitement utilisé pour permettre la mutation par recombinaison). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les malformations congénitales attendues suite à la mutation des gènes Rar entrainent généralement une létalité embryonnaire ou foetale. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort attendue ou un jour avant la naissance. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De part sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome; temps de génération court; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans l’organogenèse sont conservés chez l’homme. Afin d’évaluer les périodes pendant laquelle l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires (développement du crâne ou de la tête, du tractus urogénital, du tractus gastrointestinal, du système cardiovasculaire ou du système respiratoire), nous allons procéder à une ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs chez la souris. Cette ablation sera réalisée au moment où les RARs sont supposés être nécessaires aux processus de : neurogenèse, cardiogenèse, développement des bourgeons des membres, développement de l’oeil, etc.. Nous allons prélever les embryons à des stades précis pour pouvoir observer l’organogenèse. Stade traitement des femelles (Stade prélèvement embryons/foetus) E8 (E9 et E10) E8.5 (E10.5 et E11.5) E9.5 (E11.5, E12.5, E13.5 et E14.5) E10.5 (E12.5, E13.5 E14.5 et E18.5) La liste des observations qui vont être faites et qui sont énumérées ci-dessous n’est pas exhaustive : E9 à E10 = Vasculogenèse, développement des cavités cardiaques E10.5 = Trachée et arcs aortiques E11.5 = Artères iliaques, développement des poumons, de l’œil ou des cavités nasales, E12.5 = Cœur, aorte, cavités nasales, œil, rétine, E13.5 = Glandes salivaires, Vessie E14.5 = Paupières, Gonades, Canal de Muller, Rein E18.5 = Morphologie complète de l’embryon

175 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lignée de glioblastome humain est greffée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique, avec une pompe implantée diffusant une molécule tumorale rechargée chaque semaine, pour étudier son effet sur la croissance de la tumeur et l'épilepsie. Le porteur décrit des crises d'épilepsie, des troubles moteurs et une perte de poids liés à la tumeur, un petit groupe étant gardé jusqu'à des signes de souffrance inévitables. Il affirme que ce microenvironnement cérébral ne peut être reconstitué in vitro et retient la souris immunodéficiente pour accepter la greffe humaine.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales restent souvent sans thérapeutique efficace. Certains types de ces tumeurs produisent de grandes quantités d’une molécule nommée D2HG, et sont alors associées à une survie prolongée mais à un risque d’épilepsie accru. Nous émettons l’hypothèse et possédons des résultats préliminaires suggérant que le D2HG peut affecter l'excitabilité des cellules cérébrales neuronales par la régulation des principaux récepteurs excitateurs. En conséquence, une excitation déséquilibrée peut déclencher des crises épileptiques. C'est pourquoi, l'objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets de l'accumulation de D2HG sur la croissance des tumeurs cérébrales et sur développement de l’épilepsie. En complément d’études réalisées sur des tissus humains épileptiques postopératoires, nous souhaitons étudier les effets D2HG in vivo sur un modèle de souris de tumeur cérébrale. Le modèle de souris permet de reproduire les interactions de la tumeur humaine avec l'environnement cérébral et d'administrer en même temps des quantités contrôlées de D2HG. Les effets seront évalués sur la taille des tumeurs (identifiée par imagerie), la survie des animaux et sur l’épilepsie. Cette étude pourrait ouvrir la voie à de nouveaux développements thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet étudie le rôle du D2HG dans la neurobiologie des gliomes, translatant des concepts et des outils de l'électrophysiologie à la neuro-oncologie. Il vise à mieux comprendre comment le D2HG module la signalisation glutamatergique, influence l'excitabilité neuronale et la croissance tumorale, et comment les processus d’infiltration tumorale et de remodelage épileptique peuvent se co-localiser et permettre de développer de nouveaux biomarqueurs peropératoires. Les modèles animaux xénogreffés permettent d’étudier la croissance des cellules tumorales cérébrales placées dans un micro/macro-environnement récapitulant au plus près celui observé chez l’Homme et jouant un rôle clé dans le développement des cellules tumorales. Il n’est pas parfaitement modélisable in vitro. Il permet de plus d’étudier la réaction du tissu cérébral à la croissance de la tumeur et notamment l’épilepsie. De plus, il est maintenant reconnu que le microenvironnement neuronal joue un rôle majeur dans la croissance des gliomes, cette dernière ne pouvant se modéliser en cultivant ex vivo une ligne cellulaire. Les résultats de ce projet aideront à comprendre le rôle de la D2HG dans la croissance tumorale et l'épileptogenèse et son interaction avec d'autres effets de la mutation de l'IDH dans le meilleur modèle de glioblastome humain disponible aujourd'hui.

Procédures

Injection stéréotaxique de cellule tumorale - 1 fois (20 min, anesthésiée et analgésiée). Implantation de canule et d'une pompe - 1 fois (40 min, anesthésiée et analgésiée). Recharge de la pompe avec solution D2HG - 1 fois par semaine (5 min, anesthésiée). Imagerie bioluminescente - 1 fois par semaine (10 min, anesthésiée).

Impact sur les animaux

L'hypothermie pendant l'anesthésie. Les saignements à cause de l'endommagement des vaisseaux sanguins pendant l'intervention chirurgicale. Déshydratation pendant l'intervention chirurgicale en raison de l'hémorragie et pendant la période de récupération en raison de la difficulté à boire. Une inflammation excessive à cause des lésions tissulaires provoquées par l'intervention chirurgicale ou à une contamination accidentelle. Crises d'épilepsie et problèmes moteurs à cause de la développement de la tumeur. Perte de poids à cause de la réduction de la capacité à s'alimenter et au développement de la tumeur.

Devenir

Un petit groupe d'animaux sera conservé jusqu'à lorsqu’ils atteignent des signes de souffrance inévitables vu la croissance tumorale, selon les points limites, ils seront euthanasiés. Cela permettra d'estimer et de comparer la survie dans trois groupes d'étude différents (30 animaux au total). Le reste des animaux sera euthanasie pour des analyse électrophysiologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales se multipliant. Dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement (notamment neuronal) qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro. De plus ce travail évalue les effets du glutamate (produit par le tissu nerveux et par les cellules tumorales) et du D2HG (produit par les cellules tumorales) sur le tissu tumoral et sur le tissu cérébral avoisinant. Ces interactions ne sont pas étudiables in vitro. Les études préalables des effets de la mutation IDH et du D2HG sur tissus humains aigus ex vivo et en culture in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum requis pour disposer de souris dans lesquelles des cellules tumorales humaines xénogreffées peuvent survivre. L’utilisation de cellules tumorales transduites par le gène de la luciférase permet un suivi en temps réel de la croissance tumorale. Cela évite le euthanasie séquentiel d’animaux au cours du temps. Compte tenu de la complexité des procédures chirurgicales impliquées dans ce projet, nous estimons la perte possible d'animaux à environ 15%, c'est pourquoi le nombre total d'animaux utilisés doit être porté à 175. Cela nous permettra d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour l'analyse finale (150). Le nombre d'animaux à inclure dans les groupes lors des procédures a été a été estimé grâce à un calcul de puissance et les résultats seront évalués à l'aide de l'analyse statistique. Chaque animal sera exploité au mieux dans les différentes techniques pour obtenir un maximum d'informations. Chaque souris sera greffée dans l'hémisphère droit, et l'hémisphère gauche constituera un contrôle, limitant ainsi l'emploi de souris contrôles surnuméraires. Les mêmes animaux seront utilisés pour évaluer la survie et le volume tumoral. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier le volume tumoral et l’épilepsie.

Raffinement

Les animaux sont analgésiés à la Buprénorphine en pré-opératoire puis au Métacam en post-opératoire et anesthésiés à l’Isoflurane avant toute procédure chirurgicale. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Les animaux seront placés durant la chirurgie et le temps de réveil sur une plaque chauffante à 37°C jusqu’à leur réveil total (la température est monitorée à l’aide d’une sonde rectale durant la chirurgie). Après la greffe, une observation quotidienne des animaux sera effectuée jusqu'à l'euthanasie de l'animal. Une pesée quotidienne permettra de vérifier la régularité de leur prise de poids. Dès l'apparition de douleurs ou souffrances supérieures au tolérable (posture, amaigrissement, mauvais état du poil, apparition de lésions de grattage, etc.) la souris sera euthanasiée. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvage automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (12 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris) sont les modèles animaux classiquement utilisés dans les expériences et les études, cognitives ou thérapeutiques, menées en cancérologie. La taille et le poids de souris permet d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques, compte tenu du faible volume de distribution, et d’utiliser un faible volume expérimental dans l’animalerie. Les souches de rongeurs consanguines immunodéficiences (Athymic-Nude) permettent d’utiliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. Les lignées de souris immuno-compromises sont disponibles chez au moins 2 des éleveurs agréés en France. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain, ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les manipulations commenceront à partir de la 8ème semaine d’âge chez animaux sevrés et ayant atteint une taille et un poids adulte. La 8ème semaine chez les souris est le début du stade adulte le glioblastome étant une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est provoquée par injection intracérébrale d'un détergent sous anesthésie, complétée par des injections d'un marqueur de prolifération, pour étudier la régénération de la myéline dans la sclérose en plaques chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur indique une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque d'un fixateur pour prélever le cerveau. Il affirme que la myélinisation ne peut être reproduite que chez un animal vivant "dans son intégrité" et retient la souris comme modèle de référence des récepteurs de la vitamine A.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une membrane biologique, essentiellement composée de lipides, qui forme une gaine autour des fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, son remplacement est effectué par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche les OL de reformer la myéline conduisant aux symptomes cités précedemment. Il est important de comprendre pourquoi les OL ne forment plus la myéline. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler ces OL pour qu’ils régénèrent la myéline à nouveau. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons des facteurs impliqués dans la génération des OL pour mieux comprendre comment les stimuler à régénérer la myéline. De plus, dans la SEP les cellules immunitaires du SNC, les cellules microgliales (CM), contribuent à la pérennisation de la signalisation inflammatoire mais assurent aussi l’élimination des debris de myéline pour stimuler la remyélinisation. Les déterminants moléculaires impliqués dans le contrôle de ces fonctions opposées des CM ne sont pas connus, alors que leur connaissance est critique pour le développement de nouveaux traitements. Afin de caractériser ces déterminants, nous étudierons les CM et la progression de la remyélinisation par les OL en induisant une perte minime de myéline chez des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique composée majoritairement de lipides qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est synthétisée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL) et est nécessaire pour la bonne conduction des influx nerveux. La dégradation de la myéline est un processus physiologique naturel au cours duquel les cellules immunitaires du système nerveux central, les cellules microgliales (CM), éliminent les débris de myéline. Ceci stimule ainsi à nouveau les OL à renouveler la myéline. Toutefois, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est la cible du système immunitaire qui entraine une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher les OL à régénérer la myéline. Différents acteurs ont été identifiés comme facteur stimulant la formation de myéline dans la SEP, notamment des récepteurs de la forme bioactive de la vitamine A. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces récepteurs dans la formation des OL pour comprendre comment ceux-ci favorisent la myélinisation aussi bien en conditions physiologiques qu’en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques impliquant la vitamine A. D’autre part, nous caractériserons comment la myéline et notamment les lipides la composant sont pris en charge par les cellules microgliales (CM) pour être éliminés en utilisant des souris génétiquement modifiées. Cette information peut orienter des stratégies thérapeutiques basées sur un apport d’acides gras spécifiques dans la SEP.

Procédures

Une injection intrapéritonéale d’un produit marquant les cellules en prolifération cellulaire sera effectuée sur 231 animaux lors de la procédure 2, et sur 120 animaux lors de la procédure 3, soit sur un total de 351 animaux. Cette injection ne dure qu’une dizaine de secondes entre le moment où l’animal est saisi et le produit injecté. Nous réaliserons également une injection intracérébrale d’un produit détergent pour induire la démyélinisation unilatéralement sous anesthésie générale. Cet acte chirurgical sera réalisé sur 90 animaux en procédure 1, et sur 231 animaux en procédure 2. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal. Au total, 321 animaux recevront une injection intracérébrale une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales vont génèrer un stress chez l’animal. Les procédures des injections intracérébrales peuvent être douloureuses et générer un stress/déconfort à l’animal. Ces procédures seront effectuées par un expérimentateur entraîné sous anesthésie générale avec des propriétés analgésiques et ne devraient pas engendrer de troubles majeurs visibles de comportement car les lésions induites par l’injection seront unilatérales et très limitées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permet de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires (de type Western Blot). D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque d’un agent fixateur sera réalisée. Ceci permet la fixation complète et homogène des tissus, y compris du cerveau. Les organes pourront ainsi être prélevés et utilisés à des fins d’imagerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un autre modèle animal dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités des types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant et la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs des formes bioactives de la vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié les programmes moléculaires contrôlées par ces récepteurs ainsi que les traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, ce projet émane des nombreuses analyses in vitro réalisées sur des cultures cellulaires qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons le nombre minimal d’animaux permettant d’effectuer les analyses statistiques afin de révéler les différences significatives (n=3). En effet, ces effectifs ont été déterminés à partir de données de la littérature et sont suffisants pour voir si on obtient des différences en comparant la moyenne (et autres paramètres) des différentes conditions, notamment par l'utilisation d'un test de Wilcoxon, ou de Kruskall-Wallis. De plus nous utilisons les deux sexes pour ne pas produire de façon inutile les femelles qui sont plus rarement utilisées pour ces analyses à cause d’effets possibles dus aux différences hormonales ou sexuelles au niveau des fonctions de cellules étudiées. C’est un risque dans cette étude, que nous allons contrôler par une comparaison des résultats provenant des mâles et des femelles pour chaque condition expérimentale et génotypique. Pour minimiser le nombre d’animaux nous allons injecter qu’un hémisphère pour utiliser le deuxième comme contrôle. De plus, les effets de l’intervention chirurgicale (injection de solution saline) seront évalués sur un groupe d’animaux contrôle.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés, en groupe, et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Sont mis à la disposition des souris ad libitum des croquettes et de l’eau. La litière est renouvelée une fois par semaine. Ici, nous minimiserons la douleur chez les animaux. En effet, la dose de lysolécithine utilisée étant très faible, les dégradations de myéline seront mineures et ne devraient pas générer de troubles chez l’animal durant le suivi expérimental. Les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale accompagnée d’analgésiques (Xylazine/Kétamine) afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie, les yeux des animaux sont protégés du dessèchement. Ils sont préservés du refroidissement provoqué par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération, et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Les injections intrapéritonéales engendrent un stress chez l’animal. Les animaux ayant reçu l’injection seront remis en groupe en cage et surveillés. Les mises à mort des animaux seront effectuées par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones, assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La synthèse de myéline (ou myélinisation) est assurée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Chez des patients atteints de sclérose en plaques, la myéline est dégradée par le système immunitaire. La régénération de myéline par les OL (ou remyélinisation) est très limitée voire inexistante. Par conséquent, la transmission des messages nerveux est moins efficace et les patients souffrent de différents symptomes tels que des déficits moteurs et cognitifs. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler les OL, notamment via la vitamine A, à régénérer la myéline similairement à leur génération lors du développement embryonnaire En effet, la formation des OL se déroule durant le développement pré et post-natal. Leur formation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de différents types cellulaires qui ne peut être reproduit que sur un animal vivant dans son intégrité. Pour comprendre comment les OL sont ainsi formés, un modèle d’étude ayant un système nerveux proche de l’Homme est nécessaire. La souris est un très bon modèle puisqu’elle récapitule très bien la formation des OL et de la myéline chez l’Homme. Bien que le rôle de la vitamine A dans la formation des OL n’est pas encore élucidé, il est nécessaire d’avoir un modèle où la vitamine A est caractérisée. La souris reste le modèle de référence sur les travaux de la vitamine A. En effet, les mécanismes d’action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et différents traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d’action. Les étapes clés de la formation de myéline chez la souris ont lieu au jour de la naissance 0 (dit P0), P7, P14, P21 et à l’âge adulte (8 semaines). Pour suivre et comprendre comment la myéline est formée, nous devrons étudier des souris à ces stades de développement. Pour étudier la régénération de myéline en conditions pathologiques comme la sclérose en plaques, des souris adultes (8 semaines) seront utilisées afin d’évaluer le processus d’élimination et de régénération de la myéline.

78 souris âgées d'un an vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe implantée sous la peau diffuse deux composés provoquant une hypertension, puis les souris subissent chaque semaine une échographie cardiaque sous anesthésie et des prélèvements de sang, pour mesurer le rôle de deux protéines dans la réponse du cœur. Le porteur indique refaire une étude déjà menée, dont le protocole comportait une incertitude sur la durée de diffusion des composés, et fixe une mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ne reproduit une hypertension sur un organisme complet et retient la souris pour l'accès à des lignées génétiquement modifiées.

Objectifs

Nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines spécifiques dans la fonction cardiaque, et plus particulièrement dans le cadre d'une hypertension. Ces protéines semblent liées notamment à certaines atteintes musculaires d'origine génétique. Ce projet vise ainsi à comprendre comment la suppression de l'une ou de l'autre de ces protéines pourrait modifier les réponses du système cardiaque lors d'une hypertension. Cette dernière sera mise en place par le biais d'une exposition prolongée à deux composés (l'angiotensine II et la phenylephrine) dont l'infusion continue dans l'organisme impacte le système cardiaque. Ces travaux sont une étape nécessaire dans le développement de traitements potentiels de ce type de maladie ne disposant actuellement d'aucun traitement. Le modèle Souris nous permet d'accéder à des animaux génétiquement modifés, permettant d'étudier l'ensemble des fonctions d'une protéine au sein d'un organisme complet adulte. Il s'agit d'une approche très utile pour déterminer la fonction d'une protéine dans un organisme vivant et ainsi orienter le développement de nouveaux médicaments. Dans ce projet, nous prévoyons donc d'analyser des animaux génétiquement modifiés, ne disposant plus de l'une ou de l'autre des protéines. Nous avons pu constater que ces animaux ne présentent aucun déficit majeur durant leur vie, et que leur fonction cardiaque basale n'est pas altérée. Nous comparerons donc des animaux génétiquement modifiés pour l'une ou l'autre des protéines, avec ou sans hypertension induite pharmacologiquement. De premières données ont été générées lors d'une étude préalable et montraient un effet significatif de ces mutations sur la réponse à l'hypertension. Malheureusement, le protocole présentait une inconnue concernant la durée de diffusion des composés. Nous avons entre temps revu ce point et voulons donc conclure de manière robuste sur ce résultat. Chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux, cet effectif étant suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). Nous prévoyons six animaux additionnels afin d'anticiper l'atteinte de point limite durant le protocole. Nous souhaitons donc employer un total de 78 souris pour ce protocole, comparant des animaux exprimant ou non un récepteur d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou avec une hypertension (4 conditions au total pour chaque protéine étudiée).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre si la fonction cardiaque est altérée par l'absence de protéine, et comment ce système évolue durant une hypertension. Il vise aussi à confirmer des données préalables collectées durant un protocole précédent mais contenant une incertitude sur les modalités de diffusion des composés pharmacologiques.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques - durée d'environ 35 minutes. Elle seront anesthésiées par voie gazeuse. Des prélevements sanguins (durée environ 2 minutes) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital). Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical (durée environ 30 minutes). Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.

Remplacement

Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.

Réduction

Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 78 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).

Raffinement

Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie injecte un vecteur viral dans le cerveau pour bloquer une protéine des cellules gliales, puis les souris, logées seules, passent des tests d'anxiété en arène, de préférence alimentaire et un jeûne de 24 heures, afin d'étudier la régulation de la balance énergétique. Le porteur reconnaît que la récupération après chirurgie, l'isolement et le jeûne sont sources de douleur, de stress et de perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'étudie le rôle de ces cellules gliales et renvoie au long terme d'éventuelles voies contre l'obésité.

Objectifs

L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une région cérébrale appelée complexe vagal dorsal (CVD). Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Les cellules gliales sont équipées de protéines appelées connexines qui leur permettent d’envoyer des signaux aux neurones et d’établir une communication directe entre cellules gliales adjacentes. Nous utilisons des vecteurs viraux pour inhiber la fabrication des connexines spécifiquement dans les cellules gliales du CVD. Notre objectif global est d’évaluer le rôle joué par les connexines des cellules gliales du CVD dans le contrôle de la balance énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si les connexines des cellules gliales sont impliquées : 1) dans les préférences alimentaires des animaux ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la balance énergétique chez le rongeur. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle des connexines 43 fortement exprimées par ces cellules gliales : 1) dans les choix alimentaires entre une nourriture standard et une nourriture enrichie en graisse et sucre ; 2) dans le contrôle fin de la prise alimentaire, de la prise hydrique, des dépenses énergétiques, ou encore de l’activité locomotrice ; 3) dans la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité et pour les mesures individuelles de prise alimentaire et la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. Après récupération chirurgicale, un tiers des animaux subira un test comportemental, au cours duquel ils sont placés dans une arène pendant 30 minutes pour mesurer leur activité exploratoire et établir leur niveau d’anxiété. Une semaine après, un test de préférence alimentaire sur une durée de 8 jours sera employé. Les souris auront accès, à deux régimes différents : un régime standard et un régime enrichi en graisse et en sucre qui ne génère aucune douleur ou inconfort. A l’issue de ces régimes, soit à 6 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Après récupération chirurgicale, les autres animaux seront transitoirement hébergés dans des cages couplées à un système de calorimétrie indirecte pour étudier le métabolisme des animaux. Cet hébergement dure 3 jours, et aura lieu au cours de la 6e semaine post-chirurgie ou au cours de la 4e puis de la 7e semaine post-chirurgie. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. A la fin de la 9e semaine post-chirurgie, ces animaux sont utilisés dans un protocole visant à mesurer l’hyperphagie consécutive à un jeûne, les niveaux de signaux métaboliques en réponse au jeûne ou à la réalimentation, ainsi que la réponse neurale à ces modifications du statut nutritionnel. Ce protocole a lieu après une habituation de 3 jours, au cours de laquelle la nourriture est retirée de la cage pendant 2h afin de minimiser l’angoisse des animaux vis-à-vis du jeûne. Les souris du groupe contrôle sont mises à jeun pour une durée de 24h et les souris du groupe test sont mises à jeun pendant 21h et sont réalimentées pendant 3 heures. Après ces 24h, soit à 9 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’hébergement de 3 jours dans les Physiocages nécessaires pour l’exploitation du système de calorimétrie indirecte est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. L’exposition aux régimes riches en graisse et en sucre ne génère aucune douleur ou inconfort mais la pesée toutes les 12 heures pourrait également constituer une nuisance. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno-histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 48 souris mâles, réparties en 6 lots de 8 animaux. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire spécifiquement la fabrication des connexines des cellules gliales dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction. La procédure 1 mobilise deux lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les préférences alimentaires des souris. La mesure des préférences alimentaires entre un régime alimentaire standard et un régime riche en gras et en sucre nécessite un effectif de 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Deux lots d’animaux sont à comparer dans cette procédure, l’un ayant été traité avec le vecteur viral permettant de réduire la fabrication des connexines, et l’autre avec un vecteur viral contrôle. L’effectif de 8 animaux par lot est également compatible avec les autres mesures prévues dans cette procédure 1 (comportement exploratoire des animaux, qui donne une mesure du niveau d’anxiété) et analyse post-mortem du nombre de cellules gliales ayant incorporé les vecteurs viraux). La procédure 2 mobilise 4 lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les réponses à un jeûne ou la réintroduction de nourriture après un jeûne : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la fabrication des connexines) x 2 statuts nutritionnels différents (à jeun pendant 24h et à jeun pendant 21h puis réalimenté pendant 3h). Les mesures à effectuer nécessitent 8 animaux par lot compte tenu de la variabilité des mesures (mesure de la consommation alimentaire des animaux renourris ; mesure post-mortem sur le tissu cérébral analyse de la morphologie des cellules gliales, cartographie des neurones activés). Cet effectif par lot est compatible avec les mesures préalables prévue dans la procédure 2 (suivi de la consommation alimentaire et analyse du métabolisme énergétique par mesure de la consommation d’oxygène et de la production de dioxyde de carbone).

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie des points limites et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. La mise à mort sera réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Le recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non invasives, la mesure de plusieurs paramètres relatifs au métabolisme énergétique. Les mesures sont effectuées simultanément sur un même animal pour faciliter les études de corrélations entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests de réponse au jeûne, les animaux seront habitués à la manipulation et au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les trois jours précédant la mise à jeun de 24 h). Cette phase d’habituation a pour objectif de réduire l’angoisse animale, notamment causée par l’absence de nourriture en fond de cage et d’éviter, au cours de la phase de réalimentation, des fluctuations importantes de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.