Rongeurs
Etude des complications rénales du diabète de type 2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection, puis chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un rein et des séjours répétés en cage métabolique isolée, avant prélèvement sanguin terminal et mise à mort pour analyser les reins, dans une étude sur les complications rénales du diabète. Le porteur mentionne une douleur au point d'injection, une douleur post-opératoire et une possible atteinte du cœur, des reins et de la rétine. Il indique recourir aussi à des cultures cellulaires et affirme que le remplacement ne reproduit pas les interactions entre organes, d'où le recours à la souris.
Objectifs
Le diabète est la première cause de mise sous dialyse en Europe. L’insuffisance rénale est de sévérité variable au moment de la découverte de la maladie, mais la règle est que la néphropathie diabétique conduit à une altération lente et progressive des unités de filtration du rein, les glomérules. Nous recherchons les stimuli à l’origine des lésions des glomérules induites au cours du diabète. Nous avons identifié récemment un mécanisme de protection des glomérules. Nous allons maintenant étudier de façon plus précise le lien entre ce mécanisme et le développement de la néphropathie diabétique.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la néphropathie diabétique et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette complication sévère du diabète.
Procédures
Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 2 jours (20 secondes/ jour). Une procédure chirurgicale: uninéphrectomie (20 minutes). 11 Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute) .
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes rénales.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ avec un risque alpha de 5%, une puissance de 80%, une moyenne du groupe contrôle de 22, une moyenne pertinamment différente attendue de 26 dans le groupe traité, une déviation standard de 3 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 15 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental (pénétrance incomplète de la streptozotocine, mortalité liée à la chirurgie, point limites atteints). Nous optimisons l'utilisation des reins pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane 2%) avec une analgésie péri-opératoire (bubrénorphine 0,1mg/kg sc).
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Glucose et ShRNA Cx43 – Etude du rôle de la connexine 43 gliale du complexe vagal dorsal dans l’homéostasie du glucose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection d'un vecteur viral dans le cerveau, puis un isolement en cage individuelle pour toute la durée du projet, des jeûnes prolongés jusqu'à quatorze heures, des tests de tolérance au glucose et de privation de glucose provoquant une hypoglycémie, avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur reconnaît que la récupération chirurgicale, le jeûne et l'isolement sont sources de douleur, de stress et d'inconfort, et cherche à les limiter par des contacts visuels entre cages. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier le rôle des cellules gliales dans le contrôle de la glycémie et du poids.
Objectifs
L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques et les apports par l’alimentation) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu au complexe vagal dorsal (CVD) localisé dans le tronc cérébral caudal. Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles au glucose et à d’autres signaux informant des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Cette procédure vise à réduire l’expression de la connexine 43 par interférence ARN et ainsi altérer, au sein du complexe vagal dorsal, les communications par jonctions communicantes entre cellules gliales et les communications paracrines depuis les cellules gliales via les hémi-canaux de connexines, puis à en tester les effets sur la croissance pondérale, la prise alimentaire, la tolérance au glucose et l’adaptation précoce à un régime riche en sucre et graisse (comportement alimentaire, marqueurs métaboliques circulants et morphologie des cellules gliales). Nous utilisons des vecteurs viraux adéno-associés pour inhiber la connexine la plus abondante du système nerveux central spécifiquement dans les cellules gliales du CVD et ainsi altérer leur communication. Nous avons vérifié la spécificité et la fonctionnalité de ces outils dans un précédent projet pilote. Dans le présent projet, nous souhaitons déterminer le rôle fonctionnel joué par cette molécule sur l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si la communication des cellules gliales intervient : 1) dans la tolérance au glucose et les réponses comportementale et neuronales à une privation en glucose ; 2) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 3) dans l’activation gliale et l’adaptation homéostatique lors d’une exposition brève à un régime riche en sucre et en graisses.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la connexine 43 fortement exprimée par ces cellules gliales : 1) dans la régulation de la prise alimentaire et du poids corporel dans le cadre d’un régime alimentaire standard ; 2) dans les régulations de la glycémie en réponse à une surabondance ou une privation en sucre ; 3) dans les phases précoces de réaction à un régime alimentaire riche en sucre et en graisse, lors desquelles une surconsommation initiale laisse place à une normalisation de l’apport calorique. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Après récupération chirurgicale, certains animaux subiront un test de tolérance au glucose (4h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4h, moins d’1 min par prélèvement). D’autres animaux subiront des tests de privation en glucose (par injection IP d’un analogue non métabolisable du glucose ; durée 2h), suivi de mesures de la glycémie (5 prélèvements de sang à la veine caudale en 2h) ou de la prise alimentaire. Les tests de tolérance au glucose et les tests de privation en glucose nécessitent une mise à jeun préalable, respectivement de 14h et de 5h. A la 9ème semaine post-chirurgie, les animaux ayant subi le test de tolérance au glucose seront soumis à un régime alimentaire riche en graisse et en sucre pour une durée de 12h ou 5 jours, ou maintenus sur régime alimentaire standard pendant 5 jours (groupes contrôles). A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort sous analgésie morphinique et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux ayant subi les tests de privation en glucose recevront à nouveau une administration IP d’un analogue non métabolisable du glucose (ou de solution saline) et seront mis à mort 3h après cette injection, sous analgésie et anesthésie générale. Le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du statut glycémique et de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’administration orale de glucose ou l’administration intrapéritonéale d’un dérivé non métabolisable du glucose (2DG) causent un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h pour le test de tolérance au glucose et à 5 h pour la glucoprivation. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. L’hypoglycémie provoquée par l’administration 2DG et les contre-régulations physiologiques permettant le retour à la normo glycémie sont une source d’inconfort pour l’animal. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse pendant 12h à 5 jours ne génère aucune douleur ou inconfort mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Ces analyses post-mortem nécessitent donc une mise à mort des animaux.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.
Réduction
Au total, 80 souris mâles sont nécessaire à ce projet. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire l’expression de la protéine Cx43 de façon ciblée dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique avec quantification : du nombre et de la morphologie des cellules gliales d’intérêt en réponse à l’exposition brève à un régime riche en graisse et en sucre (procédure 1) et de l’activation cellulaire neuronale et gliale en réponse à une glucoprivation (procédure 2). Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour la procédure 1 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 3 conditions différentes de régime alimentaire (régime riche en graisse et sucre : 12 h ou 5 jours HFS ; régime alimentaire standard : 5 jours), soit 6 lots d’animaux. Pour la procédure 2 : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose), soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7-8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections de vecteur viral. Cet effectif par lot est pleinement compatible avec les mesures préalables de tolérance au glucose aux 3 délais post-chirurgie envisagés (4, 6 et 7 semaines), chacun de ces tests mobilisant deux lots d’animaux parmi les 6 de la procédure 1 (2 variables : vecteurs viraux contrôle et ciblant la connexine 43). Pour la procédure 2, les mesures de glycémie et prise alimentaire en réponse à la glucoprivation imposent un effectif de 8 animaux par lot. Ces expériences mobilisent chacune les 4 lots d’animaux de la procédure 2, en raison des 4 variables par expérience : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la connexine 43) x 2 traitements pharmacologiques (solution saline ou analogue non métabolisable du glucose).
Raffinement
Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie générale chimique. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale chimique et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une analgésie est systématiquement administrée et une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids. Les prélèvements sanguins à la veine latérale de la queue pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests de tolérance au glucose et de glucoprivation. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie et de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) et à la nourriture enrichie en sucre et en graisse (pendant 10 minutes en phase diurne les deux jours précédant la bascule sur ce régime) contribuera à diminuer le stress des animaux et évitera la néophobie lors du changement de régime alimentaire. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.
Radiothérapie par rayons X des tumeurs cérébrales de haut grade 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 300
600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, des séances de radiothérapie et des IRM répétées sous anesthésie, et peut développer selon le porteur des troubles neurologiques terminaux, convulsions, perte d'appétit et troubles du mouvement liés à la tumeur, avec un suivi de survie pouvant atteindre six mois pour certains. Les animaux sont mis à mort au point limite, notamment à une perte de 20 % du poids, pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que seule l'étude sur organisme vivant reflète les interactions entre tissu sain et tumeur et retient souris et rats pour la reproductibilité des modèles tumoraux.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies étudiées (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique a été étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches : simulation Monte Carlo, dosimétrie expérimentale, irradiation de cellules en culture. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation etc. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux radiations, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux, etc. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales par chirurgie stéréotaxique intracérébrale sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; 2 types de radiothérapies sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure
Impact sur les animaux
Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit, convulsions). Cependant, nous nous attendons à la prévention de ces symptômes grâce à la réduction du volume tumoral après la radiothérapie. Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une léthargie, une perte d'appétit ou des convulsions. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.
Devenir
A la fin de cette procédure, tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de cerveaux.
Remplacement
La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont sacrifiés à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique.
Réduction
Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. La réduction du nombre d’animaux porte en fait sur une implantation commune des animaux contrôles (animaux portant une tumeur mais ne subissant pas de thérapie) pour plusieurs expériences lorsque la programmation des expériences d’irradiation le permet. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.
Raffinement
Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Si possible, ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par une manipulation prudente, la mise à disposition d'hydrogel et un transport d'animaux groupés en cage filtrée. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes, sont atteints. Ceux ci comprennent l'apparition de symptômes cliniques (troubles neurologiques, prostration, anorexie, manque de toilettage) et une perte de poids de 20% de leur poids maximal.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. Les souris sont favorisée d'un point de vue économique, elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.
Rôle des neurones aromatase et de leurs sous populations dans les comportements socio-sexuels chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 730 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent une chirurgie du cerveau pour rendre des neurones fluorescents, l'insertion d'une micro-caméra intracérébrale, des castrations ou ovariectomies, puis des tests d'agression territoriale, de comportement sexuel et maternel, avant mise à mort par surdose d'anesthésiques. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et un stress chez les animaux servant d'intrus lors des confrontations, qu'il décrit comme bref et sans effet à long terme. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne reproduit ces comportements et retient la souris pour la sensibilité de son système olfactif.
Objectifs
Le but de ce projet est de mieux comprendre comment certains neurones du cerveau régulent les comportements socio-sexuels (comportement sexuel, agression, comportements parentaux). Nous savons que les neurones qui fabriquent l’enzyme appelée « Aromatase » qui produit l’estradiol (hormone sexuelle) sont impliqués dans différents comportements socio-sexuels. La question est de savoir comment cet ensemble de neurones régule différents comportements. L’hypothèse est qu’il existe des sous populations de neurones exprimant l’Aromatase qui seraient différentes et respectivement impliquées dans des comportements distincts. Pour caractériser ces sous populations, nous allons rendre les neurones Aromatase fluorescents et les filmer, directement dans le cerveau, pendant des comportements socio-sexuels. Nous pourrons ainsi voir quand ces neurones s’activent et si ce sont les mêmes qui s’activent, ou pas, pendant des comportements différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra donc d’identifier des sous populations de neurones Aromatase importantes pour les comportements socio-sexuels. Nombre de pathologies humaines sont caractérisées par une altération des comportements sociaux et, bien que fondamentales, les données récoltées permettront de mieux comprendre les mécanismes les régulant afin de pouvoir développer de nouvelle stratégies de traitement.
Procédures
Les mâles étudiés reçoivent une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Ils sont ensuite hébergés individuellement (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). Après un minimum d’1h de repos pour l’animal, 3 comportements sont étudiés : l’agression territoriale (face à un intrus mâle, 5 min), le comportement envers un nouveau-né (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Les femelles étudiées doivent être ovariectomisées (30 min)et supplémentées en estradiol (pose d’un implant sous cutané = 2 min, pendant la même intervention). Afin qu’elles soient sexuellement matures, 3 sessions de comportement sexuel sont réalisées, avec 1 semaine d’intervalle entre chaque session. Pour développer leur comportement maternel, elles devront cohabiter avec des mères pendant 1 semaine. Elles reçoivent ensuite une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Elles sont ensuite hébergées en groupe (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). 1 injection de progestérone est réalisée afin d’induire la réceptivité sexuelle de la femelle. 4h plus tard, 2 comportements sont étudiés : le comportement maternel (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Certains (certaines) mâles (femelles) non étudiés mais nécessaires pour l’observation des comportements des mâles étudiés, sont castrés (ovariectomisées) (30 min). Les animaux sont ensuite hébergés en groupe jusqu’au jour où les comportements seront observés (agression territoriale uniquement = 5 min d’interaction par session). Les animaux sont réutilisés pour différentes sessions de comportement, ils ne sont donc pas euthanasiés à la fin des comportements.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des rapporteurs calciques peut induire une douleur post opératoire de palier 2 pendant 2-3 jours. Les castrations et ovariectomies peuvent induire une douleur de palier 1 pendant 2-3 jours post-opératoire. Pour toutes les chirurgies, une récupération totale est attendue après une semaine. Les paradigmes comportementaux d'agression induiront nécessairement un état de stress, temporaire, chez les individus agressés. Il s'agira cependant d'un stress non chronique et d'une durée limitée (10 min maximum d'exposition au stresseur par comportement), n'induisant pas d'effet à long terme. En tout la durée cumulée d'exposition au stresseur sera de 40 min (4 comportements de 10 min avec 1 jour d'interval entre chaque).
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux expérimentaux seront euthanasiés par overdose de Ketamine/médétomidine (300/3 mg/kg). Les animaux stimuli seront euthanasiés par automate à CO2, par le personnel animalier.
Remplacement
Aucune étude comportementale ne peut être réalisée par des approches in vitro ou de modélisation : ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et ou comportementales (olfaction et comportement) qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. De plus, l'activité neuronale est dépendante de l'interconnectivité de ces neurones, elle ne peut donc être réalisée que sur un animal entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observées dans la littérature, en tenant compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, l'efficacité des injections et de la mise en place des implants. La taille des échantillons a été obtenue à l'aide d'un test de puissance calculée grâce à un logiciel spécialisé (G* Power). Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous avons également fait le choix de réutiliser les mêmes animaux pour l'étude de plusieurs comportements.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec enrichissement (abri cartonné ainsi que matériel de nidification) avec accès à de la nourriture et boisson ad libitum. Des protocoles d’administration d’analgésiques sont prévus en cas de souffrance de l’animal. Une stratégie d'analgésie est mise en place pour la prise en charge de la douleur per et post-opératoire : un AINS permettant une couverture analgésique de 24h est administré avant l’opération et poursuivi pendant 2 à 3 jours post-opératoire. Une analgésie locale est effectuée au niveau du site d’incision, en plus de l'anesthésie/analgésie générale. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux sont maintenus sur un matelas chauffant et leur température est monitorée afin d'éviter une hypothermie. Un gel ophtalmique est appliqué pour protéger les yeux du desséchement. La fréquence respiratoire est également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal reçoit une dose d’antisédan et la procédure est intérrompue.
Choix des espèces
Nous étudions le rôle de populations neuronales dans les comportements socio-sexuels à médiation olfactive. La souris est une espèce sociale, présentant de façon innée, des comportements socio-sexuels bien décrits, majoritairement régulés par des signaux olfactifs. Les souris sont un modèle expérimental de référence en physiologie de l'olfaction de par l'extrême sensibilité de leur système olfactif. De plus, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelle (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou que peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux seront tous adultes (8 semaines) au début des expériences
Etude des médiateurs impliqués dans un modèle rongeurs sur les phases de latence et de réactivation du virus de l’herpès HSV-1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, réparties à parts égales entre niveaux de souffrance légers, modérés et sévères. Les animaux sont infectés par le virus de l'herpès HSV-1 sous anesthésie puis surveillés, développant selon le porteur des lésions cutanées et oculaires, et pour environ 30 % d'entre eux une évolution potentiellement fatale avec prostration, troubles de la marche, perte de poids supérieure à 20 % et vocalisations. Certaines sont tuées par exsanguination sous anesthésie, l'étude portant sur le rôle de corps cellulaires dans la latence et la réactivation du virus chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme que les interactions entre le virus et le système immunitaire ne peuvent être modélisées in vitro de façon satisfaisante.
Objectifs
Le virus herpès simplex de type 1 (HSV-1) provoque de nombreuses maladies chez l'homme, notamment des infections oculaires potentiellement cécitantes, des atteintes neurologiques aigües, et pourrait être impliqué dans le développement de la maladie d'Alzheimer. La première infection a le plus souvent lieu au niveau de la muqueuse de la bouche et suivie d’une infection latente (absence de production de particules virales) pendant toute la durée de vie du patient infecté. Des « réactivations » virales peuvent survenir, à l’origine de récidives cliniques d’infection. Le génome des virus en latence sont associés à des protéines spécifiques qui forment des agrégats dans les noyaux des cellules nerveuses de l’hôte (corps PML pour promyelocytic leukemia). Nous formulons l’hypothèse que les corps PML pourraient être impliqués dans l’équilibre entre infection latente et réactivation. En outre, des études expérimentales suggèrent qu’ils contrôle la multiplication du génome viral en coordination avec des signaux du système immunitaire.). Cependant, la relation précise entre l'expression des corps PML, le maintien de la latence et l’environnement immunitaire des neurones restent à définir. Cette étude pilote explorera le rôle des corps PML dans l'équilibre entre latence et réactivation d’HSV1. Les interactions complexes entre le virus, les corps PML et le système immunitaire nous obligent à utiliser un modèle animal d’infection à HSV1 (en l’occurrence des rongeurs) que nous avons déjà bien caractérisé. Pour mieux étudier le rôkle des corps PML, nous utiliserons des animaux dépourvus de corps PML. - Objectif 1 : déterminer le degré de sévérité d’une infection aiguë par HSV-1 chez les animaux dépourvus de corps PML. - Objectif 2 : déterminer si l'absence de corps PML modifie les capacités de réactivation d’HSV-1 à partir des neurones infectés de manière latente. - Objectif 3 : déterminer comment l'absence de corps PML affecte le cycle d’HSV1, à savoir l'infection aiguë et la réactivation d’HSV-1
Bénéfices attendus
Les résultats détermineront s'il existe des différences dans les modèles murins exprimant ou pas PML et ayant été infecté par le virus HSV-1, les protéines PML semblent avoir un rôle dans l’immunité contre le virus HSV1. Les différences indiqueront soit un effet protecteur, soit un effet délétère des corps PML lors de la phase aiguë d'une infection à HSV-1, dans l'établissement de l’infection latente et/ou la réactivation virale. Ces connaissances permettront potentiellement d’envisager les corps PML comme une cible thérapeutique dans l’infection à HSV-1.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure d'inoculation virale avec une micro-aiguille, sous anesthésie générale de courte durée (20-30 mins). Ils seront surveillés quotidienne pendant la période d'infection aiguë (15 jours) et traités avec une analgésique pendant cette période, jusqu'à ce que la phase latente de l'infection soit établie, puis seront hébergés pendant un mois après. Dans certains cas, les animaux seront tués par exsanguination sous anesthésie chirurgicale (~ 8 minutes au total).
Impact sur les animaux
Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë lorsque la maladie survient, pour détecter les effets indésirables qui peuvent parfois se développer et disparaître spontanément lors d'une infection aiguë (légère et modérée : aspect ébouriffé du pelage, perte de poids , augmentation de la fréquence respiratoire, lésions vésiculo-croûteuses au site d'injection, lésions herpétique oculaires (kératite, uvéite, blépharite)) par HSV-1. Chez environ 30 % des animaux, des signes d’évolution vers une maladie plus sévère (agitation permanente, prostration et/ou troubles de la mobilité gênant la marche, et perte de poids > 20%, vocalisation spontanée ou déclenchée par le toucher) peuvent se développer indiquer une évolution fatale de la maladie.
Devenir
Les souris seront infectées et surveillées cliniquement pour détecter des signes de maladie pendant la phase aiguë de l'infection (jusqu'au jour 15) chez les souris PML-/- et comparées à des souris non déficientes. Pendant ce temps, pour étudier le rôle de la PML dans la réactivation, les souris seront euthanasiées après le jour 28, de sorte qu'une infection latente s'établira. Des tests ex vivo seront ensuite utilisés pour évaluer la capacité de réactivation. Les ganglions trigéminés, ou prend place l’infection latente, seront également analysés à l'aide de techniques moléculaires et histologiques. Les souris infectées seront euthanasiées lors des phases aigüe ou latente de l’infection.
Remplacement
Cette étude se concentre spécifiquement sur les interactions entre HSV-1 et le système immunitaire de l'hôte aux sites spécifiques de d'infection (ganglion trigéminés). Les modèles animaux sont essentiels pour ces expériences, en raison des interactions immunitaires entre le virus et l'hôte qui ne peuvent pas être modélisées in vitro de façon satisfaisante. Cependant, lorsque cela est possible, nous utilisons des tests in vitro ou ex vivo pour remplacer les animaux. Par exemple, les tests de réactivation virale sont effectués in vitro.
Réduction
Nous tirons parti de notre connaissance approfondie de notre modèle, accumulé pendant plus de 22 ans après avoir été développé par notre groupe. Cette histoire a permis faire des calculs statistiques (de puissance) qui permettent de définir le nombre minimal d'animaux requis pour obtenir des résultats significatifs, et de réduire au minimum le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront gardés en observation entre 3 et 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie, afin de leur permettre de s'acclimater à l'environnement. Au cours des expérimentations, un suivi clinique détaillé est effectué quotidiennement pendant la phase aiguë lorsque la maladie survient (J5-J15), afin de détecter tout signe de maladie et de souffrance, et avec un accès illimité à la nourriture et aux boissons. Si un point limite apparaît, les animaux seront euthanasiés dans les plus brefs délais. De plus, les manipulations sont limitées au strict nécessaire, avec des techniques réalisées sous anesthésie générale et analgésie pour la prise en charge des symptômes liés à l'infection.
Choix des espèces
Les humains sont les seuls hôtes naturels du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1, virus de l'herpès). Cependant, certaines souris peuvent également montrer des signes de rétablissement suite à une infection aiguë au HSV-1, tout en développant une infection latente à long terme, similaire à ce qui se produit lors d'une infection chez l'homme (présence de génomes viraux et absence de production de particules virales, mais avec la capacité de se réactiver à l'avenir).. De plus, la réponse immunitaire est comparable à celle observée chez l'homme. Comme les souris sont aussi de petits mammifères, elles constituent un modèle idéal pour étudier les interactions entre le système immunitaire des mammifères et le virus HSV-1 sur l'histoire naturelle de l’infection. L'âge des souris dans notre modèle est une variable importante que nous pouvons contrôler, car après 6 semaines, les souris commencent à développer une résistance naturelle. Nous comptons utiliser des souris porteuses d’une mutation spécifique, mutation qui n’altère pas l’état physiologique général de l’animal. Ces souris génétiquement modifiées, ne disposent pas de certains mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle des phases aiguë et latente de l’infection par HSV-1. Ce modèle nous semble le plus adapté pour déterminer le rôle des mécanismes immunitaires dans l'infection herpétique, sujet de cette étude.
Inflammation pulmonaire et fibrose chez le cobaye
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1200 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sous anesthésie, la trachée est dégagée pour injecter de la bléomycine qui déclenche sur trois semaines une inflammation puis une fibrose pulmonaire pouvant provoquer une détresse respiratoire, avant enregistrement de la respiration puis mise à mort pour prélever les poumons, dans le développement préclinique de médicaments. Le porteur reconnaît que le modèle n'a jamais été réalisé dans ces conditions au laboratoire et qu'aucun calcul de puissance n'est possible, tout en revendiquant 8 à 10 animaux par groupe. Il présente ce modèle comme "nécessaire" à la mise sur le marché de nouveaux traitements et retient le cobaye pour la sensibilité de ses voies aériennes.
Objectifs
L’inflammation pulmonaire est une réponse biologique complexe du tissu pulmonaire à divers stimuli néfastes : pathogènes, cellules endommagées, substances irritantes, etc. L’inflammation est un mécanisme immunitaire protecteur impliquant les cellules immunitaires, les vaisseaux sanguins et différents messagers cellulaires. Depuis ces dernières décennies, on assiste à une augmentation significative des maladies inflammatoires du poumon, telles que l’asthme ou la broncho-pneumopathie chronique obstructive , maladie chronique d'origine respiratoire atteignant les bronches. L’inflammation peut être aiguë, c’est-à-dire temporaire, ou devenir chronique et donc persister un long moment. Le plus souvent, cette inflammation chronique va évoluer vers une fibrose du tissu pulmonaire qui modifiera la fonction pulmonaire. Les tests décrits dans ce projet ciblent l’inflammation et la fibrose du système respiratoire dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines infections pulmonaires.
Bénéfices attendus
Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies pulmonaires. Les traitements ont pour objectif de réduire les symptômes et d’améliorer la tolérance à l’effort des patients. Le traitement antifibrosant par pirfénidone ou nintédanib ralentit l’aggravation de la maladie, mais n’entraîne pratiquement pas d’amélioration des symptômes (toux persistante par exemple). Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuive la recherche de nouveaux traitements efficaces et sans effets secondaires majeurs.
Procédures
Lors de l'injection de bléomycine, une phase de chirurgie en condition d'asepsie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés et leur trachée est dégagée pour injection du réactif. L'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil et un antisedan est administré pour accélérer le réveil. La durée de l'intervention de l'anesthésie à l'injection de l'antisédan est de 45 minutes maximum. L’inflammation et la fibrose pulmonaire se développe progressivement sur une période de 21 jours (durée maximale de l’expérience). En fin d’étude (généralement le dernier jour, jour 21), les animaux sont placés dans des chambres de pléthysmographie pour l’enregistrement des paramètres respiratoires (stabilisation, puis enregistrement sur une période de 3-4 heures). Pendant l’étude, des prélèvements sanguins (veine saphène) intermédiaires sous anesthésie peuvent être réalisés (maximum 2, pour un volume inférieur à 15% de la volémie de l’animal). Enfin, un prélèvement sanguin ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie est réalisé juste avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédures, il est attendu une réaction inflammatoire principalement localisée au niveau pulmonaire. Quand on cherche à moduler la réponse inflammatoire à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. L'inflammation est liée aux effets de substances administrées par voie intra-trachéale dont les effets sont bien caractérisés. Dans le cas de l'inflammation pulmonaire, les paramètres respiratoires peuvent être altérés et induire une détresse respiratoire. Dans la mesure du possible, les études sont réalisées sur des animaux hébergés en groupe (sauf lors de la mesure des paramètres respiratoires, mais sur une période de 4h maximum).
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour recueil du liquide bronchoalvéolaire et des poumons (pas de réveil).
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro ont pu être réalisés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Ce modèle est actuellement en développement, masi nos données historiques obtenues dans des modèles similaires indiquent qu'il est nécessaire d'inclure 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) pour atteindre une sensibilité correcte. Néanmoins, ce modèle n'ayant jamais été réalisé dans les conditions décrites au sein du laboratoire, aucune analyse de puissance ne peut être réalisée. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétique d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- ou post-opératoires complets.
Choix des espèces
Le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye reste utilisé dans plusieurs domaines de recherche (électrophysiologie cardiaque, immunologie, fonction respiratoire,...). Le cobaye est ainsi un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, ses voies aériennes sont sensibles à l'histamine et il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de toux. Principalement des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Etude des mécanismes centraux impliqués dans l’analgésie et l’hyperalgésie induite par la prise de morphine chronique: rôle du récepteur Fms-like tyrosine kinase 3 FLT3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent des injections répétées de morphine sur cinq jours qui provoquent selon le porteur une tolérance et une hyperalgésie, puis subissent des stimulations mécaniques de la patte au filament de Von Frey déclenchant un retrait douloureux, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les effets de la morphine chronique. Le porteur souligne que l'animal peut échapper à la stimulation faute de contention et décrit des points limites incluant vocalisations, automutilation et perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo car la douleur met en jeu de nombreuses régions nerveuses.
Objectifs
La morphine est un antalgique puissant qui appartient à la classe des opioïdes. Son utilisation, qui permet de soulager des douleurs intenses, peut être limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance (accoutumance nécessitant d’augmenter la posologie pour maintenir l’effet antalgique) et d’hyperalgésie (amplification de la douleur suite à un stimulus nociceptif). Ses deux effets secondaires sont liés à l’utilisation de morphine de façon chronique. Il a récemment été mis en évidence l’importance du récepteur Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) au niveau périphérique dans le développement des douleurs neuropathiques. L’objectif général sera d’étudier le rôle de ce récepteur FLT3 au niveau central (plus précisément de la moelle épinière) dans les effets induits par la morphine administrée en aigue et par la morphine administrée en chronique. Les objectifs spécifiques du projet seront : Objectif 1) d’étudier les comportements d’analgésie et d’hyperalgésie des souris Wild type (WT) et des souris KO FLT3 après administration de morphine en aigue ou de morphine en chronique, Objectif 2) d’étudier les effets de ce même traitement (morphine aigue versus morphine chronique) sur les propriétés électrophysiologiques et morphologiques des neurones de la moelle épinière dorsale sur les souris WT et les souris KOFLT3 et Objectif 3) de déterminer si l’activation globale des neurones des couches superficielles de la corne dorsale est différente après morphine aigue ou chronique et si la suppression des récepteurs FLT3 modifie cette activation.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un intérêt fondamental via l'étude des mécanismes d'action de la morphine au niveau central, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les effets secondaires dus à la prise chronique de morphine.
Procédures
Les animaux seront soumis à des piqures intrapéritonéales de morphine (1 à 10 piqures sur 5 jours). Par ailleurs, des stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey pour induire un retrait de la patte sera réalisé. Cette stimulation dure moins d’une seconde.
Impact sur les animaux
Les souris vont soit recevoir une seule injection de morphine (ou de liquide physiologique) en intrapéritonéale qui va induire un effet analgésique ou bien 2 injections/jours pendant 5 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal. Par ailleurs, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention.
Devenir
Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les 2 procédures sont 2 expériences différentes ne permettant pas de réutiliser les animaux.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Tout d'abord, une réduction sera réalisée dans la partie 1 du projet car les animaux de l'étude « comportement chronique morphine »(objectif 1) seront ré-utilisés pour l'étude des enregistrements électrophysiologiques (objectif 2). De plus, une réduction sera également réalisée dans la partie 2 du projet où nous ne ferons pas de groupe de souris "controle", nous utiliserons le coté contralatéral d'un même animal comme groupe contrôle. Enfin, le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes et sur un calcul de puissance (http://www. 3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html). Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 souris par groupe pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Afin d'anticiper une perte éventuelle d'animaux liée à la procédure expérimentale (injection...), un nombre maximum de 10 animaux par groupe sera envisagé pour le comportement et les stimulations électriques. La période d’habituation avant le comportement est fondamentale afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les données récoltées seront analysés par une mesure de variance suivie d’un test de Tukey si normalité vérifiée (sinon test de Mann-Whitney) pour comparer 2 groupes et une ANOVA one-way ou two-way sera réalisée pour comparer plus de 2 groupes expérimentaux.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement social: elle seront par groupes de 4 à 6 par cages et environnemental: des rouleaux et des nids seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine sera réalisée au cours de laquelle les animaux seront placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite seront exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permettra aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.
Choix des espèces
Il est nécessaire de réaliser ces études in vitro chez l’animal car aucune méthode alternative actuelle ne permet d’évaluer les effets de la morphine et les effets de délétion de FLT3 dans le développement de la chronicisation douloureuse. Les souris ont été choisies afin de pouvoir travailler en parallèle sur des souris transgéniques adaptées à nos recherches (dépourvues du gène FLT3) pour mieux comprendre les mécanismes d’action de la morphine dans l'induction de la tolérance/hyperalgésie, et sur des souris sauvages. Les souris auront entre 3 et 8 semaines, ce qui correspond aux âges utilisés dans la littérature.
Système du complément et démences vasculaires (type Alzheimer)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 1200 reçoivent une injection d'une molécule candidate, 1900 subissent des prélèvements de liquides biologiques et des tests de mémoire et de vision, pour étudier le rôle de l'inflammation dans la maladie d'Alzheimer, l'œil servant de "fenêtre" d'observation du cerveau. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer une cataracte passagère, une douleur ou une désorientation spatiale, ces animaux étant alors mis à mort. Il affirme le recours au modèle animal "indispensable" et présente les co-cultures in vitro comme non optimales et à valider in vivo.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de caractériser le rôle du système du complément, partie intégrante de la réaction inflammatoire, dans les démences vasculaires des maladies neurodégénératives liées à l'âge du système nerveux central. La finalité de ce projet est d'identifer des cibles thérapeutiques inflammatoires pour réduire a-les atteintes vasculaires cérébrales/occulaires et b-les dépôts neurotoxiques dans le cerveau des personnes atteintes de maladies neurodégénératives, type Alzheimer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples : 1- la caractérisation du rôle joué par l'activation de l'inflammation dans la mise en place et la progression de la maladie d'Alzheimer; 2- d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le système du complément pour traiter la maladie d'Alzheimer; et 3- de se servir de l'oeil comme fenêtre d'étude du cerveau et voir si il peut ainsi servir de diagnostic cérébral précose de la maladie d'Alzheimer, étant donné que cette pathologie apparait dans l'oeil avant le cerveau.
Procédures
Dans un premier temps, deux procédures seront appliquées pour l'injection de la molécule thérapeutique candidate (Nombre de souris=1200). puis, ces souris seront gardées en vie pendant au moins 1 mois pour évaluer le ou les effet(s) thérapeutique(s) de la molécule injectée et ce par la réalisation de prélèvements des liquides biologiques et de tests cognitifs (vision/mémoire, Nombre de souris=1900). Ces types d'intervention réalisés sur animaux vigiles sont rapides : 1- prélèvements liquides biologiques (5min/animal) , 2-injection (15-20min/animal), et 4-tests cognitifs (analyse de la mémoire (10min/animal) et de la vision (20min/animal).
Impact sur les animaux
Les molécules inflammatoires sont naturellement produites par l'organisme et n'entrainent pas d'effet toxique ou mortelle lors de leur injection ou suppression . Aucun effet indésirable spécifique n'est attendu sur les animaux pour les prélèvements de liquides biologiques et les tests cognitifs. Ces techniques sont couramment utilisées en thérapeutique humaine. L'injection peut entrainer une cataracte passagère, non débilitante et ne laisse aucune séquelle ou effets secondaires délétères, une douleur post-chirurgicale ou un comportement altéré de la souris (désorientation spatiale), dans ce cas les animaux seront observés et sacrifiés le cas échaéant si ils présentent des signes de mal être ou de douleurs.
Devenir
Suite à l'injection de la molécule thérapeutique testée (procédures "dites modérées ") les animaux seront gardés en vie afin de réaliser des tests cognitifs (visuelles et mémoires) et d'évaluer ainsi l'effet thérapeutique de la molécule médicament. Puis, en parallèle des prélèvements sanguins seront effectués et ce pour réaliser une cinétique d'analyse de la mise en place et de la progression de la pathologie. Enfin, suite à ces tests et prélèvements, les animaux seront toutes sacrifiées afin de prélèver les tissus cibles de la pathologie pour en faire leur analyse.
Remplacement
La perte d'une fonction cognitive reflète l’altération d’un organe – le cerveau ou la rétine – dont ni les causes ni les conséquences ne sont réductibles à des processus investigables in vitro. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour disposer d’un modèle de la pathologie capable de reproduire les signes diagnostiques et cliniques de la maladie, tous définis par des paramètres physiologiques et fonctionnels. Bien qu'il existe des sytèmes de co-culture de cellules in vitro, ces systèmes ne sont pas optimaux et les résultats obtenus doivent être validés in vivo. De plus, l'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris invalidées, pour l'expression d'un gène codant pour une protéine à potentiel thérapeutique, permet de mieux caractériser le rôle de cette dernière dans la pathogenèse de la maladie étudiée, données difficilement obtenues par des expériences in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot, fixé à 10, a été calculé de façon à optimiser la significativité des comparaisons statistiques. Outre le cerveau, d’autres organes (rétine, foie) seront prélévés et analysés, de manière à obtenir des données additionnelles sans utilisation d’animaux supplémentaires. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux, des expériences de mise en co-culture de cellules issues des tissus prélevés des différents groupes expérimentaux seront réalisées et devraient ainsi valider les expériences in vivo.
Raffinement
Un suivi quotidien est assuré avec un hébergement des souris en cage collective (5/cage) avec des nids végétaux. Pour chaque animal, les procédures prises séparément sont courtes (
Choix des espèces
La souris a été choisie en raison de l’existence de souris transgéniques dont les gènes d’intérêt ont été modifiés, et ce afin de servir de modèle à la maladie d'Alzheimer. C'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de fortes ressemblances avec celui de l'homme. Des souris agées de 1, 3, 6, 9 et 12-16 mois seront utilisées. Ces stades ont été précédemment caractérisés comme les stades présentant une évolution incontournable de la maladie d'Alzheimer dans ce modèle murin.
Travaux pratiques pour la formation « Expérimentation animale, éthique et bien-traitance, formation générale des concepteurs de projets scientifiques utilisant des animaux »
- Enseignement supérieur
Rats : 40
940 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux servent de support aux travaux pratiques d'une formation réglementaire pour concepteurs de projets, où stagiaires et formateurs répètent contentions, gavages, injections et prises de sang, avant euthanasie et autopsie pédagogique. Le porteur précise qu'une souris est partagée pour deux stagiaires et que des animaux supplémentaires sont prévus pour reposer ceux stressés par la maladresse d'un stagiaire, et note que ces travaux pratiques sont imposés par les autorités pour l'agrément de la formation. Il affirme que l'apprentissage de ces gestes exige de manipuler des animaux vivants.
Objectifs
Le projet consiste à réaliser des travaux pratiques sur animaux lors de sessions de la formation réglementaire en expérimentation animale destinée aux concepteurs de projets (formation approuvée par la Commission Nationale de l'Expérimentation Animale et agréée par le Ministère de l'Agriculture). L’objectif est d’enseigner aux stagiaires et futurs concepteurs de projets les bases d'une recherche respectueuse de l'animal et notamment les bonnes pratiques en termes de contention, prélèvements simples et injections chez les Rongeurs (rat, souris) et de les encadrer dans leur mise en œuvre, afin de limiter le stress pour l’animal et le risque pour le manipulateur. Des démonstrations sur le rat sont effectuées par les encadrants des séances de travaux pratiques, tous professionnels formés en zootechnie et recherche animale (niveau concepteur ou applicateur). Ces TP sont précédés par un cours théorique et le visionnage de vidéos de démonstration des gestes.
Bénéfices attendus
Ce projet concerne la formation réglementaire des expérimentateurs amenés à concevoir des procédures expérimentales. Cela implique notamment de les former à des pratiques telles que la contention et la manipulation des animaux incluant des gestes peu invasifs courants (prise de sang, injection sous-cutanée…) et permettant une approche respectueuse du bien-être animal. Les travaux pratiques proposés dans cette formation permettent aux personnels d’apprendre à mettre en œuvre ces différents gestes de base, en étant encadrés par des formateurs expérimentés et après avoir suivi un cours théorique sur les méthodes et voies de prélèvements et administrations, illustré par des vidéos. Ces TP font partie du programme imposé par les autorités pour l'agrément de la formation.
Procédures
Les démonstrations effectuées par les intervenants (animaux vigiles) et les manipulations pratiquées par les stagiaires (animaux vigiles puis anesthésiés) engendrent un stress modéré aux souris et aux rats. Il s'agit de gestes techniques courants : contention, gavage per os, injection de sérum physiologique ou prélèvement d'un volume restreint de sang. La contention et le gavage sont réalisés sur animaux vigiles et les prélèvements sur animaux anesthésiés qui seront ensuite euthanasiés. Souris de démonstration : souris vigile : contention, gavage per os, injection sous-cutanée, injection intra-péritonéale, injection intra-veineuse, prélèvement à la veine de la queue, prélèvement sous-mandibulaire. souris anesthésiée : prélèvement rétro-orbitaire. Souris d’étude par les stagiaires : souris vigile : contention, gavage per os, administration intrapéritonéale d’un mélange anesthésique. souris anesthésiée : injection sous-cutanée, injection intra-veineuse, prélèvement à la veine de la queue, prélèvement sous-mandibulaire. Rats de démonstration, rat vigile : préhension, tranquillisation, contention, gavage per os, injection intrapéritonéale, injection intra-musculaire, injection sous-cutanée, injection intraveineuse, prélèvement intra veineux. Chaque geste est effectué en quelques minutes (max 5 minutes). L’ensemble des gestes est effectué au fur et à mesure de la séance de TP, qui dure 3 heures maximum, permettant aux animaux de récupérer entre chaque intervention et considérant que pour une grande partie des interventions les animaux sont anesthésiés donc inconscients.
Impact sur les animaux
Les gestes pratiques sont peu invasifs et l’encadrement des stagiaires par les formateurs assure la limitation du stress et des contraintes imposées aux animaux. Cependant, l’apprentissage des gestes par les stagiaires peut engendrer un inconfort. De plus, quelques animaux supplémentaires sont inclus dans chaque séance afin de mettre au repos un animal qui aurait subi un stress plus important du fait de la maladresse d’un stagiaire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après que les gestes techniques aient été pratiqués. Une autopsie pédagogique est ensuite réalisée afin de visualiser l'anatomie des appareils et expliciter les modalités de dissection pour le prélèvements des différents organes. Sauf exception, les animaux utilisés pour ces TP sont des animaux de réforme ou d'élevage qui ne peuvent pas être replacés.
Remplacement
Pour apprendre à contenir un animal, réaliser un prélèvement de sang ou une injection intrapéritonéale, il est nécessaire de se placer dans les conditions réelles et donc de manipuler l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux engagés dans les procédures est calculé au plus juste mais on veille à privilégier le minimum de contrainte par animal : 1 souris est mise à disposition pour 2 stagiaires (mais des souris supplémentaires peuvent également être utilisées en cas de stress important d'un animal après une manipulation par un stagiaire), 2 rats par session (ils sont exclusivement manipulés par les encadrants pour des démonstrations). Au total : 900 souris et 40 rats Etant donné la nature du projet, aucune étude statistique n’est prévue.
Raffinement
Les animaux proviennent de l'élevage du site et sont hébergés dans les installations du service de Travaux Pratiques, inclus dans l’agrément de l’animalerie de l'établissement d'enseignement supérieur. En cas de besoin, l'effectif est complété par des animaux provenant d'un éleveur agréé. Les animaux sont acclimatés pendant une semaine lors de leur arrivée. L'hébergement est assuré en cages enrichies (nid végétal et/ou buchettes). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Les personnels de zootechnie du service de travaux pratiques sont formés à l'observation des animaux et tout signe de mal-être est immédiatement signalé aux responsables du projet qui prennent la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Les stagiaires réalisent les gestes techniques sur les animaux après avoir visionné des vidéos et observé les démonstrations des encadrants et ils restent sous leur supervision pendant toute la durée des TP. Les animaux sont rapidement anesthésiés après la manipulation qui pourrait être source de stress (gavage) afin de réaliser d'autres gestes de prélèvement sanguin et administration. Les animaux ne sont pas réveillés à la fin de la procédure
Choix des espèces
La formation est axée sur les rongeurs qui représentent plus de 80 % des animaux utilisés dans le cadre des procédures expérimentales. Elle donne droit à la délivrance d'une attestation de suivi de formation sur le modèle rongeurs La formation est faite sur des animaux adultes car il s’agit du stade permettant le plus facilement l’apprentissage des gestes techniques.
Etude multiparamétrique de la faiblesse musculaire chez un modèle murin de la myopathie à cores centraux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie, elles subissent des injections, des examens RMN et une électrostimulation musculaire sous anesthésie, certaines recevant un vecteur de thérapie génique quelques jours après la naissance, avant mise à mort pour prélever plusieurs muscles. Le porteur présente ces atteintes comme compatibles avec "une vie tout à fait normale" et met en avant le caractère non invasif de la RMN et de l'électrostimulation. Il conclut qu'aucune culture de cellules musculaires ne reproduit les mesures physiologiques recherchées et revendique une étape "indispensable" avant l'application à l'homme.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine de type 1 (RyR1) est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Chez l’homme, une mutation (notée RyR1I4895T) dans le gène RyR1 est à l’origine de la myopathie à cores centraux. Cette affection neuromusculaire génétique et héréditaire se caractérise par la présence de lésions rondes dans les cellules du muscle et par une faiblesse musculaire (réduction de la capacité à produire de la force, fatigabilité accrue) de sévérité variable. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette pathologie, et la prise en charge des patients se réduit à de la kinésithérapie et à de la corticothérapie, ce qui conduit à une légère amélioration de leur état général. Afin d'étudier le rôle de la protéine RyR1, un modèle de souris portant la mutation RyR1I4895T a été développé. Des études préliminaires ont montré que, comme chez l’homme, ces souris développent une myopathie à cores centraux et une faiblesse musculaire modérée. Ce projet vise à caractériser les muscles de ces souris myopathes d’un point de vue fonctionnel par le biais d’une analyse de leurs performances musculaires en lien avec le métabolisme énergétique. Cette étape est indispensable d’une part pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie mais également pour la mise en place d’approches thérapeutiques chez les patients souffrant de cette myopathie. Ainsi, nous envisageons dans un deuxième temps d'évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain chez ces souris.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’une part de mieux comprendre l’histoire naturelle de la myopathie à cores centraux et d’autre part d’identifier des approches thérapeutiques susceptibles d’engendrer une augmentation de la force musculaire (agents thérapeutiques) voire de restaurer un phénotype sain (par thérapie génique). Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.
Procédures
Les animaux subiront : des injections intrapéritonéales de molécules thérapeutiques sur animaux vigiles, des ingestions de croquettes ou de boisson supplémentées en molécules thérapeutiques, des examen RMN sous anesthésie générale, et des contractions musculaires induites par électrostimulation transcutanée sous anesthésie générale. Les injections d’AAV seront réalisées par l'organisme partenaire nous fournissant les animaux, avant le transfert de ces derniers dans nos locaux. Ces injections d'AAV seront réalisées en intrapéritonéal sur animaux vigiles, quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement, réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance.
Impact sur les animaux
D’après la littérature, les souris RyR1I4895T hétérozygotes âgées de 4-5 mois présentent une diminution de leur masse corporelle de 15% et une perte de force musculaire de 25% par rapport à des souris contrôles du même âge. Ces modifications n’entraînent pas de signes dommageables et les animaux ont une vie tout à fait normale. Concernant les nuisances associées aux actes expérimentaux, seules les injections IP de molécules thérapeutiques sur animaux conscients pourront entrainer un léger stress et une faible douleur lors de l'acte. L’administration de molécules par le biais de la nourriture (croquettes à façon) ou de l'eau de boisson, ainsi que les examens RMN et l’électrostimulation musculaire sur animaux anesthésiés ne devraient pas entrainer de nuisances particulières si ce n’est un léger stress lors du réveil de l’anesthésie générale. En particulier, le protocole d’électrostimulation musculaire transcutanée que nous mettrons en œuvre (comparable à ceux utilisés chez l’homme en kinésithérapie) est strictement non invasif et ne provoque ni blessure ni séquelle, les animaux retrouvant dès leur réveil leur mobilité initiale.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort une fois qu’elle sera terminée, en l’occurrence 3-4 jours après leur 3ème exploration non invasive du métabolisme énergétique et la fonction musculaire, de manière à laisser aux muscles (qui seront prélevés post mortem afin de réaliser des dosages biochimiques et de l’histologie) le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel. Les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale pratiquée sur animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Plusieurs muscles (gastrocnémiens, soléaire, EDL, tibialis antérieur) seront prélevés sur les animaux euthanasiés. Ces tissus musculaires seront ensuite conservés à -80°C. Le cœur et les tissus adipeux seront également prélevés pour d’éventuels dosages ultérieurs.
Remplacement
Ce projet a pour objectifs de mieux comprendre le rôle physiologique de RyR1 et de réaliser des essais précliniques afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de différents agents pharmaceutiques à rétablir un phénotype sain. Les critères métaboliques et fonctionnels (mesure des performances mécaniques) que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation des techniques RMN sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra de par leur caractère non invasif et totalement indolore de réduire le stress des animaux. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation de la douleur par score avec indices pour différents critères physiologiques et comportementaux, et des actions seront à mener en fonction des scores obtenus. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation d’isoflurane afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme pour sa physiopathologie et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris seront utilisées entre leur 2ème et 5ème mois d’âge : dès que la force musculaire commence à diminuer, à l'âge de 2 mois d'après les données de la littérature et pendant les 3 mois suivants de manière à suivre de manière non invasive et longitudinale l’évolution de la pathologie et les effets des approches thérapeutiques.
Traduction régionalisée en réponse à la FSH, dans les tubes séminifères
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Rats : 24
96 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux reçoivent des injections d'hormone folliculo-stimulante ou d'un antagoniste, puis sont tués par saturation en CO2 pour le prélèvement des testicules, dans une recherche décrite comme "strictement scientifique" sur la régulation de la spermatogenèse. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier l'effet de cette hormone dans un "organisme entier" en préservant les relations entre cellules de Sertoli et cellules germinales. Les bénéfices avancés relèvent de la connaissance fondamentale du dialogue cellulaire dans le testicule.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d'identifier les ARN traduits en protéine, en réponse à l'hormone folliculo-stimulante (FSH), dans les cellules de Sertoli du testicule d’animal pré-pubère et adulte. Cette identification permettra de comprendre comment ces ARN traduits localement régulent les différentes étapes de la spermatogenèse, dans le contexte histologique et physiologique du testicule adulte entier. Ces travaux sont menés à des fins strictement scientifiques. En effet, le dialogue entre cellules de Sertoli et cellules germinales est très peu connu au niveau moléculaire, ainsi que sa régulation hormonale.
Bénéfices attendus
Chez les Mammifères, ces mécanismes n’ont été étudiés principalement lors du transport dendritique d’ARNm, au cours des processus développementaux. A l’évidence, il est d’un grand intérêt d’explorer ces mécanismes dans la cellule de Sertoli, rare exemple de cellule de l’organisme en contact étroit avec un lignage cellulaire complet, dont elle doit assurer toutes les étapes de maturation, grâce aux produits de sécrétion que cette cellule élabore localement, en grande partie sous le contrôle de la FSH.
Procédures
Injection en sous-cutanée ou en intra-péritonéal sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Administration sous-cutanée et intra-péritonéale d'hormone et d'antagoniste hormonal : nos conditions expérimentales laissent présager qu’il n’y aura pas d'effet indésirable sur le bien-être des animaux.
Devenir
Dans ce projet, il est nécessaire de prélever les testicules des animaux pour les étudier ex vivo, dans les différentes conditions expérimentales. C'est pourquoi les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort avant prélévement. Le mode opératoire est la saturation progressive de l’atmosphère en CO2, dans un appareil programmé dédié et certifié.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode in vitro qui permette d’appréhender l’effet de la FSH sécrétée au niveau de l’hypophyse dans toute la complexité de son tissu cible, au sein d’un organisme entier. En particulier, il n’est pas possible d’étudier l’effet de la FSH sur la traduction locale in vitro, tout en maintenant l’intégrité des relations entre cellules de Sertoli et cellules germinales, et en intégrant l’impact des autres facteurs extracellulaires qui modulent son activité.
Réduction
Notre étude cherchera à optimiser l’utilisation de chaque animal, afin d’en réduire le nombre total. En particulier, la symétrie des testicules sera mise à profit. Par exemple, dans le cas des expériences réalisées chez la souris, l’un des testicules sera prélevé pour l’analyse du traductome, tandis que le testicule contra-latéral sera prélevé pour l’ensemble des autres expériences de validation : un hémi-testicule sera congelé à des fins d’imagerie sur testicule entier, l’autre hémi-testicule servira aux extractions d’ARN et de protéines.
Raffinement
- Raffinement : Les animaux pré-pubères sont élevés avec leur fratrie et leur mère, afin de maximiser leur bien-être. Les animaux seront observés tous les jours. Ils seront euthanasiés en cas d’atteinte d’un des points limites
Choix des espèces
Modèle souris : les souris transgéniques sont le seul modèle de mammifère permettant de suivre les processus de traduction in vivo, car le système riboTag n’existe que dans cette espèce. De plus, le modèle de souris AMH-Cre que nous avons créé il y a 20 ans a été utilisé par la communauté scientifique internationale à de multiples reprises pour conduire l’expression Sertoli-spécifique de la recombinase (160 citations de Lécureuil et al., 2002, Genesis, 33, 114). Modèle rat : l’organisation et la physiologie testiculaire sont très bien décrite dans cette espèce. Dans ce modèle, nous avons déjà acquis de nombreux résultats sur le contrôle de la traduction par la FSH, incluant des données de polysome profiling à partir de cellules de Sertoli de rats cultivées in vitro. Il est donc important d’évaluer la validité des conclusions que nous tirons de ces premiers résultats chez la même espèce. Les animaux seront étudiés à 18 et 19 jours post-partum qui est l’âge à partir duquel se met en place la barrière hémato-testiculaire, ce qui marque le début de la puberté. Ce stade permet d’étudier la traduction locale en relation avec la fonction de niche des cellules de Sertoli, c’est-à-dire le maintien et le renouvellement des cellules-souches germinales, les spermatogonies. C’est aussi à ce stade que nous avons obtenu nos premiers résultats de RNAseq après polysome profiling à partir de cellules de Sertoli cultivées in vitro, en absence de spermatogonies. Nous souhaitons donc refaire ces expériences au même stade, mais dans un contexte beaucoup plus physiologique. Nous utiliserons aussi des animaux adultes afin d’évaluer la traduction locale des ARNm en fonction du stade de spermatogenèse, qui n’est visible que chez l’adulte.
Etude de l’impact du diabète induit sur la fonction auditive chez la souris C57Bl/6JRj
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).
Bénéfices attendus
Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.
Procédures
- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).
Impact sur les animaux
Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).
Devenir
A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).
Remplacement
Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.
Raffinement
Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.
Choix des espèces
La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.