Rongeurs

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau, puis traitée par un virus injecté en intraveineuse et par des irradiations localisées, pour tester cette combinaison avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur annonce une possible perte de poids transitoire et n'attend aucun effet indésirable après irradiation. Il juge "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier", jugé impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le but principal du projet est d'évaluer l'effet thérapeutique de la combinaison d'un virus oncolytique avec l'irradiation sur la réponse tumorale. Ce projet a également pour but de définir le meilleur protocole de traitement afin de mieux guider la conception des protocoles d'études cliniques.

Bénéfices attendus

Les données de ce projet pourrait contribuer aux données précliniques en vue d'études cliniques d'utilisation de virus oncolytiques en combinaison avec l'irradiation (radiothérapie) pour le traitement des tumeurs qui sont en échec thérapeutique et permettraient aussi de mieux définir les protocoles d'études cliniques.

Procédures

Greffes des cellules tumorales: une fois par animal, durée 2 minutes. Injection intraveineuse: 1 fois par animal, durée 5 minutes. Irradiations localisées des tumeurs, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à la greffe de tumeur par voie sous-cutanée (durée maximale 3 mois), et possiblement une perte de poids des animaux due à aux traitements injectés en intraveineuse (durée transitoire de quelques jours maximum), ainsi que les effets de l'injections intraveineuse elle-même (petite plaie localisée cicatrisant en 24-48 heures). Aucun effet indésirable n'est attendu après les irradiations localisées.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre les différents facteurs cellulaires au sein d’une tumeur obéissent à des processus complexes impliquant de multiples voies métaboliques et impossibles à reproduire in-vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux a été rationalisé et défini au minimum suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à des calculs de puissance.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance, l'angoisse et la douleur des animaux, ces derniers seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront hébergés en groupes pour minimiser le stress de l'isolement. L'environnement sera enrichi en permanence (sizzlenests et tunnels ou maisons en carton) afin de diminuer leur mal-être potentiel. Toutes les procédures seront faites sous anesthésie locale. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront appliqués. Un complément alimentaire sera proposé aux souris en cas de perte de poids liée au stress de l'expérimentation.

Choix des espèces

La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en cancérologie translationnelle, en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en essais cliniques chez l'être humain. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour modéliser la maladie humaine.

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée sous la peau ou induite par injection intraveineuse, puis chauffée à 43-45 °C par des nanoparticules activées au laser ou par champ magnétique, sous suivi d'imagerie. Le porteur qualifie les effets secondaires de "très limités" et renvoie l'amélioration de la prise en charge des patients au conditionnel. Il présente le recours à un "organisme entier" comme un "passage obligé" avant tout transfert vers l'humain.

Objectifs

Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire).

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une toxine leur est injectée dans le cerveau pour détruire les neurones à dopamine et reproduire une lésion de type Parkinson, opération d'environ une heure suivie pour une partie d'une seconde chirurgie d'injection virale. Le porteur indique une perte de poids et des difficultés motrices après la lésion, évaluées par un test du cylindre, et précise que la lésion d'un seul hémisphère laisse l'autre compenser. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel, et il juge "incontournable" d'utiliser des neurones issus d'animaux modèles.

Objectifs

La dopamine est un neuromodulateur qui joue un rôle essentiel dans le contrôle des fonctions motrices. La dopamine est libérée dans le striatum, où réside une population spécifique de neurones cibles, les neurones épineux striataux. Ces neurones répondent à cette dopamine par le biais de « signaux intracellulaires », qui changent le fonctionnement neuronal. Au cours de la maladie de Parkinson, la libération de dopamine dans le striatum se réduit progressivement. Les neurones épineux s’y adaptent en augmentant leur sensibilité à la dopamine. C’est ce mécanisme d’adaptation à la perte de dopamine que nous souhaitons étudier, pour mieux comprendre comment le corriger dans la situation pathologique. Les biosenseurs optiques permettent de mesurer à l’aide de microscopie optique les effets de la dopamine sur les neurones vivants. Cette approche méthodologique innovante nous permet de décrire avec précision le décours temporel et l’amplitude de cette réponse à la dopamine, et mesurer l’effet de molécules pharmacologiques selon un protocole précisément établi. Cette approche nous permet de comparer les neurones provenant d’animaux modèles de la maladie de Parkinson avec ceux provenant d’animaux sains. Ce type de donnée est essentiel pour développer ensuite des modèles numériques pour la recherche «in silico».

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson résulte de la disparition progressive des neurones qui produisent la dopamine dans le cerveau. Le cerveau s’adapte à cette perte progressive en augmentant la sensibilité à la dopamine des neurones cibles. Mais lorsque la perte atteint environ 90%, cette compensation n’est plus suffisante et le patient montre les signes invalidants de la maladie. Grâce à notre expérimentation, et en comparant la situation parkinsonienne avec des adultes normaux, nous pourrons analyser en détail comment les neurones augmentent leur sensibilité à la dopamine. Ce travail pourrait mettre sur la voie d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour prolonger le plus possible le fonctionnement du système dopaminergique lorsque la maladie est diagnostiquée chez le patient. La maladie de Parkinson est caractérisée par un décours temporel lent, avec la perte inéluctable des neurones dopaminergiques. Toute méthode thérapeutique qui pourrait prolonger de quelques mois ou années le fonctionnement du striatum avant de devoir recourir à la dopathérapie serait très bénéfique pour les patients. Par ailleurs, notre étude révèlera certains mécanismes d’adaptations des neurones à un contexte pathologique, et cette connaissance sera importante dans le contexte scientifique de la compréhension de l’adaptation. Les mécanismes que nous analyserons seront mis en relation avec d’autres connaissances scientifiques liées à l’adaptation neuronale dans le striatum, comme par exemple l’addiction, la schizophrénie, la maladie de Huntington… Enfin, en mesurant avec une grande précision temporelle la réponse cellulaire à la dopamine chez l’animal sain et modèle de la maladie, nos données serviront à construire les modèles numériques qui permettront d’étudier la pathologie in silico. A l’aide de ces modèles numériques, la simulation permettra d’évaluer l’impact qu’aurait telle ou telle intervention thérapeutique sur le fonctionnement du striatum.

Procédures

La chirurgie vise à détruire sélectivement les neurones qui libèrent la dopamine dans une région précise du cerveau. Cette opération est effectuée par l’injection dans cette région du cerveau d’une toxine sélective de ces neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs, d’une molécule visant à protéger les neurones qui pourraient être marginalement affectés par la toxine, de sérum physiologique glucosé. L’opération dure environ 1h. Le lendemain, chaque souris reçoit une injection d’antidouleur. Dans les jours suivants, en cas de signe de douleur, l’animal concerné reçoit une injection d’antidouleur. Durant au moins 3 jours après la chirurgie et jusqu’à une reprise de poids, chaque souris reçoit une fois par jour une injection sous-cutanée de sérum physiologique glucosé. Afin d'évaluer la réussite de la lésion des afférences dopaminergiques, le test du cylindre est réalisé pour chaque animal trois semaines après la réalisation de la lésion. L'animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes. Un expérimentateur compte le nombre de fois où l'animal touche le mur du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche. Pour une partie des animaux, une 2e opération consiste à injecter dans une région précise du cerveau un virus pour faire exprimer un biosenseur dans les neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs. Cette opération dure environ 1h20. A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

L’injection de la 6-OHDA dans le striatum détruit une partie importante des afférences dopaminergiques. La perte de dopamine, caractéristique de la maladie de Parkinson, réduit la mise en route de programmes moteurs, qui induit une réduction de la mobilité de l’animal, à l’image de ce qu’on observe chez le patient. Il en résulte des difficultés motrices, et donc une perte de poids, les jours suivant la chirurgie. A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans un hémisphère. Ainsi, l’autre hémisphère cérébral compense au bout de quelques jours, de manière à ce que les symptômes moteurs ne soient pas invalidants pour l’animal. Les perturbations motrices sont alors minimes, et éventuellement détectables avec un test de comportemental spécifique. Les animaux contrôles récupèrent plus vite après la chirurgie. Ils ne présentent aucune altération motrice.

Devenir

L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.​

Remplacement

Cette étude vise à étudier les mécanismes d’adaptation qui se mettent en place au cours de la maladie de Parkinson. Dans le contexte réglementaire actuel, la validation de cette hypothèse ne peut être effectuée sur des patients, et doit être précédée par une démonstration pré-clinique sur l'animal. Pour cette étude, il est alors incontournable d'utiliser des neurones provenant d'animaux modèles de la maladie. La dopamine agit sur les neurones dans le cerveau, et l’effet de la dopamine change au cours de la maladie. De nombreux autres processus d’adaptation se produisent si les neurones sont mis en culture, dans un environnement artificiel où manquent la plupart des stimuli présents dans le cerveau. C’est pourquoi, au lieu d’analyser ce phénomène sur des cultures de cellules, il est indispensable d’effectuer les mesures au plus près de la situation pathologique. C’est en cela que notre approche d’imagerie de biosenseurs est puissante, puisqu’elle permet de mesurer la réponse à la dopamine dans un contexte anatomique préservé, qui représente au mieux la pathologie. Une modélisation numérique a été réalisée précédemment au sein du laboratoire et permet de mieux comprendre le fonctionnement du striatum. Toutefois, ce modèle demeure pour le moment incomplet, en particulier pour rendre compte des changements induits par la maladie de Parkinson. Les expérimentations par une approche d’imagerie cellulaire sont alors nécessaires et permettent de compléter le modèle numérique. Par ailleurs, la maladie de Parkinson est causée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques présents dans la substance noire et l’aire tegmentale ventrale. Ces neurones dopaminergiques projettent ensuite dans de nombreuses structurales cérébrales comme le striatum. Au sein du striatum, la dopamine libérée agit sur les récepteurs à la dopamine présents dans de nombreux types cellulaires du striatum. Chaque type de neurones du striatum (neurones épineux striatum et interneurones) s’adapte à la situation en fonction de l’évolution globale du système. Il est indispensable d’étudier ces adaptations, qui ont lieu lors du déficit en dopamine, dans un système complet, rendant l’étude sur des neurones en culture impossible.

Réduction

Ce modèle expérimental de souris est très bien connu et utilisé dans de nombreuses études sur la maladie de Parkinson. Ce modèle permet notamment d’obtenir des résultats transposables à l’être humain. Les animaux seront utilisés pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques. Une étude déjà publiées permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera 1un total de 216 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires; ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.

Raffinement

Condition d’hébergement : animalerie A2, cycle d’éclairage jour-nuit de 12h, température stable 22°C, hygrométrie 55%, nourriture et eau à volonté. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. Le milieu est enrichi par des frisures kraft pour la nidification tout au long de l’hébergement. La lésion des neurones dopaminergiques réalisée uniquement dans un hémisphère induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non-dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit systématiquement une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, il reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. L’animal est pesé. Au-delà des 3 premiers jours, si l’animal présente des signes de douleurs, le niveau de douleur est évalué quantitativement avec l’échelle des expressions faciales de la souris et, si nécessaire, il reçoit une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. Au-delà d’un seuil de douleur, l’animal est euthanasié. Tant que l’animal continue à perdre du poids, l’animal reçoit une injection sous-cutanée quotidienne de sérum physiologique sucré. S'il reprend du poids, il est pesé tous les 3 jours. Si la perte de poids est supérieur à 35 % du poids initial, l’animal est euthanasié. Si besoin, l’animal est placé sur un tapis chauffant. Pendant cette période de récupération, la nourriture est enrichie.

Choix des espèces

Ce modèle animal présente de nombreuses similarités avec la maladie de Parkinson chez l'humain. Il est communément utilisé dans les laboratoires s'intéressant à cette pathologie. Uniquement des mâles de 10 à 12 semaines (au début du protocole) seront utilisés. Cet âge est communément utilisé dans les laboratoires travaillant sur cette pathologie.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour inactiver le gène CAR, elles sont nourries pendant 40 semaines avec un régime gras induisant obésité et troubles métaboliques, avec trois prélèvements de sang à la joue, un gavage de FITC dextran et des prélèvements à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale. Le porteur décrit une obésité et une intolérance au glucose provoquées "sans souffrance visible", et renvoie les retombées pour les patients, un meilleur ciblage des médicaments, au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'axe intestin-foie impose un "organisme entier" et conclut à la "nécessité" de la souris.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la pathologie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. De plus, ces maladies touchent particulièrement les hommes. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 40 semaines, à 3 prélèvements de sang à la joue (représentant moins de 10% de leur volume de sang total) espacés chacun de 10 semaines. Les animaux seront soumis également à un jeûne de 6 heures, à un gavage oral de FITC dextran ainsi qu'à un prélèvement d'une goutte de sang d'environ 5 microlitres à la queue pour chaque mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui seront faite 2 fois au cours de l’expérimentation chacune espacée de 14 semaine.

Impact sur les animaux

Les régimes WD et HFD vont induire une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le seul effet indésirable provoqué par le prélèvement à la joue et l'administration orale du FITC dextran est le stress lié à la contention.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires. Voici les résultats d’une étude de pouvoir statistique basée sur nos résultats préliminaires de mesure d'alanine aminotransférase (ALAT marqueur utilisé en clinique pour évaluer les dommages hépatiques) obtenus sur des souris C57bl6/j sous régime CD versus WD. Variation minimale d’intérêt (Δ): ~50%. ALAT initiales CD : 200 U/L, ALAT WD: 324 U/L, écart type moyen 120 U/L. Calcul du nombre d’animaux (n) nécessaire pour un risque α de 5% avec une puissance de 80% n=16. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 16.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après chaque prélèvement à la joue et également après chaque mesure de la perméabilité intestinale. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local EMLA 5% sur le bout de la queue avant incision à l’aide d’un scalpel 1heure avant chaque intervention, lors de mesure de la perméabilité intestinale. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication avec une injection intrapéritonéale de Xylazine à 10 mg/kg est effectuée par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, on débute l'anesthésie avec 4% d'isoflurane dans une cage à induction volatile. L'anesthésie est maintenue sous masque pendant le prélèvement. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion de nourriture et d'eau); apparence physique externe; signes cliniques mesurables (ex.: changements du rythme cardiaque, du rythme respiratoire et de la nature de ceux-ci); changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin foie) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6j déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique ces modèles existent uniquement chez la souris. Nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturite physiologique. (7 semaines minimum)

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Parmi eux des rats diabétiques, ils reçoivent des injections d'insuline et de glucagon provoquant des hypo- et hyperglycémies transitoires, ainsi que des prélèvements de sang répétés, avant mise à mort par exsanguination sous anesthésie. Le projet met au point une mesure non invasive de la glycémie, présentée comme un progrès face aux dispositifs actuels douloureux pour les patients. Le porteur affirme qu'un substitut de sang a déjà été testé "sans succès" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

La mesure de la glycémie au quotidien chez les patients diabétiques est réalisée par prélèvements de sang au bout du doigt, ou par pose d’un capteur sur le bras avec insertion dans le derme d’une fibre de quelques millimètres de long. Ces dispositifs, quoique indispensables pour le suivi quotidien des patients traités par insuline, sont invasifs, perforant la peau et pouvant donner lieu à des réactions inflammatoires, et pour ce qui concerne les prélèvements au bout du doigt, douloureux. Une technologie de mesure de la glycémie non invasive serait un vrai plus pour la prise en charge des patients. Pour développer un tel système, des mesures des paramètres biochimiques seront effectuées sur prélèvements de sang de rat.

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie qui concerne des millions de personnes dans le monde. La mesure de la glycémie plusieurs fois par jour est indispensable à tous les patients traités par injection d’insuline. Les technologies actuelles sont invasives, douloureuses de par leur répétitions quotidiennes (5-10 prélèvement au bout du doigt) ou bimensuel (pose de capteurs), entrainant des inflammations locales et/ou une allergie (colle du capteur).. Le développement de nouvelles technologies non invasives de mesure de la glycémie permettra de réduire la douleur et l’inflammation causée par les systèmes existants.

Procédures

3 prélèvements de sang sous anesthésie, d’une durée de quelques minutes. Injections sous cutanées d’une durée de quelques secondes. Piqures pour recueillir une goutte de sang, d’une durée de moins d’une seconde. Prélèvement intracardiaque et euthanasie par exsanguino-perfusion sous anesthésie, d’une durée de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Douleur transitoire de type piqûre d’aiguille pour les injections de glucagon ou d’insuline ou pour les mesures de glycémie (1 goutte). Douleur due au prélèvement sanguin (réalisé sous anesthésie. Hypoglycémie modérée transitoire (30-40 min) après injection d’insuline. Hyperglycémie modérée transitoire (30-40 min) après injection de glucagon .

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour récupérer un volume important de sang pour les réaliser des analyses biochimiques complètes, ainsi que pour récupérer des pièces anatomiques d’intérêt, permettant de compléter précisément le profil des animaux.peuvent être réutilisés pour une action de formation ou pour obtenir des pièces anatomiques, à l’issue de l’étude.

Remplacement

Les paramètres biochimiques mesurés ne peuvent se faire correctement sur du liquide de substitution du sang, qui ne contient pas tous les éléments du sang circulant (cellules, protéines …). Cette possibilité a déjà été testée, sans succès. Le recours à l’animal est donc nécessaire.

Réduction

Les meilleures conditions de prélèvements pour réaliser les mesures biochimiques (avec ou sans anticoagulant) seront évalués sur 3 animaux. Les autres étapes comporteront 6 animaux par lots, nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques sur les résultats. Seul un lot de 3 animaux témoins non diabétiques seront utilisés pour comparer avec les rats de la même espèce diabétiques (n=6), car il n’y a pas de raison de penser qu’ils soient différents des rats non diabétiques de l’espèce Fisher.

Raffinement

Les animaux recevront un traitement antalgique 30 minutes avant le prélèvement, puis les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale. Normalement, une hypoglycémie est rapidement résorbée par le métabolisme de l’animal, sous 40-60 min. Une surveillance sera cependant réalisée, après le prélèvement sanguin suivant l’injection d’insuline, pour le cas où l’animal présenterait une hypoglycémie sévère entrainant des symptômes de détresse (animal amorphe, frissonnant). Dans ce cas, il recevra une solution glucosée concentrée en sous cutanée. L’hyperglycémie n’entraîne pas de symptômes de détresse et est rapidement résorbée chez l’animal normal, c’est l’état général normal du rat diabétique.

Choix des espèces

Le rat est plus gros que la souris et permet de prélever plus de volume sanguin à chaque prélèvement. Des animaux adultes, ayant terminés leur croissance, seront utilisés afin de comparer avec les rats diabétiques malades à partir de 14 semaines d’âge minimum. Les rats diabétiques sont nécessaires car présentant une glycémie naturelle plus élevée. Les rats Lund MetS auront plus de 14 semaines, âge où l’hyperglycémie est installée, chez le rat diabétique. Les animaux trop jeunes ne présentent pas un taux de glycémie élevée.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adénovirus sous anesthésie, subissent des changements de régime et des jeûnes répétés dont un jeûne intermittent de deux semaines, des injections d'insuline et une incision de la queue pour prélèvements sanguins. Cette recherche fondamentale sur le métabolisme du glucose, le diabète et la stéatose hépatique mobilise un effectif de plus de deux mille cinq cents animaux. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée.

Objectifs

Des perturbations du métabolisme du glucose pourraient jouer un rôle important dans des pathologies humaines comme le diabète de type 2. Ce projet nous conduit à nous focaliser sur deux cibles moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer les contributions de ces deux cibles moléculaires et des protéines produites dépendantes de ces cibles et pouvant signalées dans d’autres tissus, au maintien des fonctions hépatiques et de l’homéostasie glycémique et lipidique.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de l'insulinorésistance et de la stéatose hépatique. Très peu de molécules pharmacologiques sont développés pour réverser la stéatose hépatique. Nos recherches en modulant les acteurs moleculaires clefs de la voie d'utilisation du glucose

Procédures

Une partie des animaux subira une injection veineuse d'adenovirus sous anesthésie, cette injection durera par voie veineuse sera de 30 secondes maximum. Des changements de régime alimentaire seront réalisés avec des durées de 4 à 20 semaines en fonction des régimes. Nous réaliserons des tests physiologiques sur une durée de 2 heures. Pour cela après injection d'insuline ou gavage de glucose, des prélèvements de sang sur les animaux vigiles au niveau codal. Ces prélèvements se feront par une incision légère de la queue qui sera réalisée une seule fois et des prélèvements seront réalisés 7 fois pendant les 2 heures suivant cette incision. Nous réaliserons une injection d’insuline par voie intra-péritonéale. Les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures puis seront injectées d’insuline, injection qui durera 30 secondes maximum. Nous ferons une manipulation nutritionnelle sur nos souris. Pour cela, les souris seront soit mises à jeun 24h soit mises à jeun puis renourries pendant 18h ou on ajoutera à l’alimentation des souris de l’eau glucosée pendant 24h. pour les manipulations nutritionnelles, les souris subiront un jeûne intermittent pendant 2 semaines, ainsi il y aura un cycle de jeûne et d’alimentation toutes les 24h Les souris seront anesthésiées par une injection par voie intrapéritonéale en fin d’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Pour les procédures impliquant des injections des adénovirus, l’injection par voie veineuse d’adénovirus sous anesthésie ne cause pas de douleur. Pour les procédures impliquant un changement de régime, parmi les effets indésirables, il peut y avoir une perte de poids. Pour les procédures impliquant des injections d’insuline, il peut y avoir des risques d’hypoglycémie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et le sang pour des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies tels que la NAFLD. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. **Pour ce projet, nous utiliserons 2530 souris réparties sur 9 procédures. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe, La taille des effectifs ayant été établie grâce à un calcul de puissance pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.

Raffinement

** Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Pour respecter le principe des 3R, les mêmes souris seront soumises à différents tests physiologiques et métaboliques permettant de limiter le nombre de groupes expérimentaux. Pour la procédure impliquant des injections en intraveineuse, l’injection se faisant sur animal anesthésié à l’isoflurane (1-2% isoflurane dans 100% O2), cette procédure n’engendre pas de de douleur. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Pour les procédures impliquant un changement de statut de régime alimentaire, Le changement de régime pouvant induire une variation de poids, nous suivons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. Toutefois, les souris seront observées par les expérimentateurs pendant toute la durée du protocole puis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Enfin, nous surveillerons l’apparition des signes systémiques de souffrance suivant: 1) Apparence physique :0 : Normal 1 : Poils légèrement ébouriffés 2 : Poils ébouriffés, dos « vouté », yeux plissés 2) Apathie 0 : activité normale 1 : activité réduite 3 : activité nulle, apathie 3)Perte de poids 0 : Normale 1 :Perte de poids> 10% 2 :Perte de poids > 10% et 20% Pour une valeur totale égale à : 2 : l’animal sera suivi 2 fois par semaine et nous tenterons une réhydratation par injection de serum physiologique. Si le score maximal de 3 de l'un des critères est atteint ou si le score global atteint 6 l'animal sera mis à mort sur décision du porteur du projet**

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet de mieux comprendre le rôle de différents gènes dans le développement de s maladies que nous étudions et que ce sont le diabète et la stéatose hépatique. A terme cela permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes à partir de 8 semaines chez lesquelles la régulation de l'homéostasie glucidique est fonctionnelle.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie provoquant une cardiotoxicité, puis sont suivies par échocardiographie sous anesthésie, prélèvements sanguins et mesures de pression artérielle, avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une cardiotoxicité le plus souvent asymptomatique, avec de rares arythmies graves, et vise une stratégie pharmacologique de prévention. Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" faute de reproduire cette toxicité in vitro.

Objectifs

Certains traitements anticancéreux ont des effets cardio-toxiques et exposent les patients au risque d'insuffisance cardiaque. Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que l’inhibition d’une protéine , impliquée dans un réflexe primitif de la faim, induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter la cardio-toxicité chimio-induite chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie, qui est un facteur de risque chez les patients oncologique et qui représente un défi important pour la santé publique.

Procédures

Les injections intra-péritonéales (i.p.) ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile. La durée des injections i.p. est de quelques secondes. Les souris seront isolées pour un maximum de 2 jours quand placées dans les cages calorimétriques. Les animaux seront soumis à une évaluation d’échocardiographie (3 ou 4 fois), un prélèvement sanguin (4 fois), une mesure de la pression artérielle (4 fois). La mesure de la pression artérielle (environ 20 min par mesure) et le prélèvement sanguin (quelques secondes par prélèvement) seront effectués sur animal vigile. L’examen d’échocardiographie sera effectué sur animal anesthésié (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par l’induction de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie. La cardiotoxicité aigue qui est induite dans ce protocole est la plupart du temps asymptomatique (altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies). Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins de 1%) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2016 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.