Rongeurs

150 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 minutes pour injecter de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons par électroporation in utero, avant d'être tuées au CO2 et leurs embryons décapités pour analyse. Le porteur présente le projet comme une formation de chercheurs aux techniques d'étude de l'expression génétique embryonnaire. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier ce développement, qui ne peut selon lui se faire que chez l'animal vivant.

Objectifs

Le système nerveux central est composé de différents types de neurones dont la morphologie et la physiologie varient considérablement. Cette diversité commence au cours du développement embryonnaire et elle est déjà observée dans les cellules immatures qui donneront naissance à des neurones. Il est proposé que la hétérogénéité neuronale dépende, en plus que d'autres facteurs, de l'expression spécifique d'un ensemble de protéines de ces cellules. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la différenciation et la maturation des cellules pendant le développement, nous procèderons à transférer des gènes dans le cerveau embryonnaire grâce à la transfection par électroporation in utero menée chez la souris gestante. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement embryonnaire. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les souris arriveront à notre animalerie au cours de leur 8ème ou 9ème jour de gestion (E8/E9). Entre 4 et 5 jours plus tard, les souris suivront une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, une solution contenant de l’ADN sera injectée dans le cerveau des embryons. Deux jours après, les souris gestantes sont mises à mort par inhalation de CO2. Les cerveaux de tous les embryons seront prélevés pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur abdominale post opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice. Dans de très rares cas, les souris enceintes pourraient avoir des problèmes de mobilité après la chirurgie.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les souris gestantes seront mises à mort par inhalation de CO2. Tous les embryons seront mis à mort par decapitation et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro permettant d’étudier le développement embryonnaire de différents types de neurones, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Le nombre d'animaux est adapté́ a nos objectifs éducatifs. Nous devons démontrer et mettre en pratique les procédures pendant nos formations. Lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Pour diminuer le stress lié au transport, les souris sont stabulées, habituées, et manipulées quotidiennement dans une animalerie aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique formé et compétent. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par le personnel responsable de notre animalerie pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 2 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1). Si l’animal atteint un score >11 au cours de l’observation sur une journée ou si la perte de poids est > 20% l'animal sera mis à mort. Après la procédure chirurgicale nous rajouterons de la nourriture humidifiée au fond de la cage

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine Nous devons cibler les cellules progénitrices en une période embryonnaire précise, nous utiliserons des gestantes à 13 jours de gestation. Il s’agit d’un stade où les embryons sont facilement accessibles pour l'électroporation (à des temps plus tardifs les embryons sont plus gros et difficiles à manipuler au sein de la corne utérine).

2874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pancréatique sous la peau ou dans le pancréas par chirurgie abdominale, puis un produit radioactif par voie intraveineuse et des séances d'imagerie, pour tester le diagnostic et la radiothérapie du cancer du pancréas. Le porteur indique une surveillance de la croissance tumorale et une mise à mort dès qu'un seuil de volume ou une perte de poids de 20 % est atteint. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèles in vitro et in silico" reproduisant la complexité du milieu tumoral.

Objectifs

L'adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) représente 90% des cancers du pancréas. Il se classe à la 4ème place des causes de mortalité par cancer et la survie à 5 ans est aujourd’hui inférieure à 10%. Ce cancer souffre aujourd’hui de méthodes diagnostiques invasives et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer différents vecteurs biologiques pour la délivrance de radionucléides pour un diagnostic non-invasif et une thérapie ciblée du PDAC. Ce type d’approche a déjà été appliqué par l’équipe dans le cadre du cancer ovarien et fait l’objet de nombreux essais cliniques. Nous évaluerons le ciblage d’un récepteur exprimé à la surface des cellules de PDAC, ayant été validé sur des échantillons de PDAC humains et dont le potentiel clinique pour l’imagerie et la thérapie est établi. Nous souhaitons tester sur des modèles murins de PDAC, différents vecteurs biologiques afin d’évaluer l’impact de la taille du vecteur sur la distribution et la pénétration dans la tumeur. Cette étude permettra d’identifier le vecteur permettant d’identifier les sites tumoraux avec la meilleure définition et de détruire les cellules tumorales avec la plus grande efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet validera au stade préclinique l'utilisation de radiopharmaceutiques pour l'imagerie et la radiothérapie du cancer pancréatique. Le développement d’une telle approche à fort potentiel de transfert clinique pourrait favoriser le diagnostic précoce et la thérapie ciblée des 14’000 patients atteints de PDAC diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel (co-financeur du projet).

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet, nous avons prévu un nombre de 2874 souris sur une durée de 5 ans. Des souris saines et des souris porteuses de tumeurs pancréatiques seront utilisés. Les tumeurs pancréatiques seront implantés soit sous la peau des souris par une injection sous-cutanée soit directement dans le pancréas de la souris lors d'un chirurgie abdominale sous anesthésie générale. Les animaux recevront par voie intraveineuse un radiopharmaceutique. Une partie des animaux sera alors utilisé pour valider le potentiel diagnostic de l'approche, les animaux seront anesthésiés et imagé par une technique d'imagerie non-invasive. Une deuxième partie des animaux sera utilisé pour quantifier la concentration du radiopharmaceutique dans 15 organes différents. Enfin, la dernière partie des animaux sera utilisé pour valider le potentiel thérapeutique de cette approche. Après l'injection du radiopharmaceutique, la croissance des tumeurs des animaux sera surveillée quotidiennement et plus particulièrement de manière bi-hebdomadaire par une mesure au pied à coulisse ou par une technique d'imagerie non-invasive.

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une laparotopie et injection intrapancréatique. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adapté pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).

Remplacement

Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution d’un radiopharmaceutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat (analyse statistique préliminaire). L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivie par une technique d’imagerie non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

Toutes les expériences suivent les recommandations du Gircor (Guide l'évaluation éthique), la "Charte pour une éthique de l'expérimentation animale" et le "Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research "(Workman et al ; British Journal of Cancer ; 2010) . Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Un suivi quotidien des signes de souffrance sera effectué. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance ou perte de poids excessive (>20% du poids initial), ses douleurs ou sa détresse seront soulagées ou supprimées si les signes persistent plus de 24h selon des méthodologies adaptées au maintien du bien-être animal. Quand le volume tumoral dépassera un seuil limite défini pour chaque protocole l'animal sera sacrifié.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthodes alternatives aux expériences envisagées qui reposent sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques in vivo des radiopharmaceutiques. Seule une étude in vivo permettra d’avoir des informations sur la biodistribution en temps réel et l’efficacité thérapeutique des radiopharmaceutiques. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en age adulte.

440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées répétées et jusqu'à sept prélèvements sanguins par semaine, pour tester la tolérance et l'efficacité de molécules visant une maladie de la densité osseuse. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort pour des analyses ex vivo, quarante-quatre animaux surnuméraires pouvant être réutilisés pour une formation aux gestes techniques. Sur le remplacement, il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité́ et la tolérance sur un modèle rongeur (souris) de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse. Dans ce projet, nous allons tester des molécules candidates en développement qui ont montré un potentiel thérapeutique élevé in vitro.

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent par des fractures répétées et sévères. On observe chez les patients, de nombreuses complications associées dont des complications respiratoires. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Prélèvement de sang sur animal vigile (maximum 1 fois par semaine pour les prélèvements compris entre 20 et 130µL (pour une souris de 25g) jusqu’à 7 fois par semaine maximum pour des micro-prélèvements

Impact sur les animaux

Seuls des animaux WT seront utilisés dans ce projet, sans phénotype dommageable. Cependant, du fait du peu d’information disponible à cette étape du développement sur la tolérance des molécules testées sur des modèles in vivo, des effets indésirables pourraient être observés. Une attention accrue sur les animaux en cours de traitement sera apportée tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids corporel, signes cliniques…

Devenir

Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo. Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Des groupes de maximum 8 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans une autre CRO) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le suivi des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (week end & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie sur un modèle animal récapitulant la pathologie. Ce modèle est en cours de « réalisation » et s’agira de souris transgéniques, c’est pourquoi cette espèce WT est utilisé dans ce projet visant à évaluer dans un premier temps la tolérance de molécules sélectionnées au préalable. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 14 à 16 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 14/16 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

30 souris et 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils servent à entraîner le personnel d'animalerie aux injections, aux prélèvements sanguins et à la pose de cathéter, chaque animal étant réutilisé jusqu'à six fois sur trois mois. Le porteur indique que ces manipulations répétées peuvent provoquer un stress, et que les gestes sont réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. L'objet déclaré du projet n'est pas de produire des connaissances mais de maintenir les compétences techniques des soigneurs.

Objectifs

Au cours des différentes procédures, le personnel qualifié de l’animalerie pourra maitriser et s’entrainer régulièrement aux injections, prélèvements de sang et pose de cathéter sur animaux vigiles et/ou anesthésiés couramment pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Cela inclu la préparation de l’animal, l’analgésie, l’anesthésie, l’asepsie, la maîtrise et le contrôle des paramètres physiologique pendant toute la durée de l’intervention et le réveil de l’animal.

Bénéfices attendus

Grâce a cet entrainement, le personnel qualifié de l’animalerie aura les compétences adéquates pour réaliser des administrations et prélèvements de sang principalement demandés par les utilisateurs de l’établissement utilisateur. Le temps d’anesthésie générale sera raccourci avec l’entrainement ce qui limitera le stress chez l’animal.

Procédures

Liste des interventions effectuées sur tous les animaux (rats et souris) à une fréquence de 1 fois toute les 2 semaines sur 3 mois maximum : - Anesthésie par injection intrapéritonéale (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine (64.5/5.4 mg/kg ; 0.15-0.2 ml/100 g de poids vif). - Injection en intra-musculaire et en sous-cutanée de sérum physiologique - Prélèvements de sang dans la veine mandibulaire, la veine sublinguale et la veine caudale (pose de cathéter).

Impact sur les animaux

Les animaux d’entrainement seront utilisés à plusieurs reprises (maximum 6 fois sur une durée de 3 mois) afin de limiter le nombre d’animaux, donc un stress chez l’animal peut être observé.

Devenir

Proposé à l’adoption

Remplacement

Le personnel concerné s’entraine dans un premier temps sur des animaux euthanasiés. Lorsque la technique est acquise sur animal euthanasié, il est nécessaire de travailler sur des animaux anesthésiés afin d’appréhender les éventuelles complications que l’animal vivant peut présenter au cours d’une anesthésie et d’une chirurgie (ex : arrêt respiratoire, hémorragie).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour toute la durée du projet est le nombre minimum nécessaire permettant l’entrainement de 3 personnes : nous prévoyons au maximum 30 rats et 30 souris sur les 5 ans du projet : 60 animaux au maximum sur la totalité du projet.

Raffinement

Les injections via les différentes voies décrites dans ce projet (IP, SC etIM) seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Après l’induction de l’anésthésie, le personnel s’entrainera aux injections dans les minutes qui suivent afin de limiter le stress de l’anesthésie (si l’animal se réveil, il sera replacé dans la boite en plexiglas). Les prélèvements de sang et pose de cathéter seront réalisés sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Pour la pose de cathéter en veine caudale, l’anesthésie sera maintenue sous masque à isoflurane à 2-3%. Pour le prélèvement de sang via la veine mandibulaire et la veine sublinguale, l’anesthésie sera maintenue par injection intrapéritonéal (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine. Les différentes voies d’injections et les différentes voies de prélèvement ne seront pas toutes effectuées sur le même animal. Entrainement à une seule voie de prélèvement de sang par animal. L’animal sera réutilisé que 2 semaines après avoir été manipulé et au maximum 6 fois sur une durée de 3 mois si son état général le permet afin de laisser le temps à l’animal de récupérer et d’éviter un stress trop récurrent. Tout au long de l’expérimentation, les rats/souris seront observés et les paramètres physiologiques contrôlés (température, respiration). Des points limites sont définis dans la partie procédure expérimentale afin de préserver le bien-être des animaux Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée après réception et les rats/souris sont hébergés en groupes sociaux harmonieux, dans un environnement enrichi afin de limiter les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement : tunnels en carton, sizzle pads et bûchettes de peuplier. La taille des aiguilles et des cathéters est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car cette espèce est la plus couramment utilisée dans les différentes procédures pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Adulte : 8-12 semaines, 160-300 g, ce qui permettra de travailler sur des poumons entièrement développé et fonctionnel pour la procédure 1 et sur un système cérébral stable, mature pour la procédure 2.

48 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent sur huit semaines quinze gavages et quinze injections de docétaxel, avec des prélèvements de sang à la face sous contention renforcée. Le porteur décrit le gavage comme "inconfortable et relativement stressant" et prévoit une mise à mort si les nuisances deviennent trop importantes. Il teste un dérivé du cholestérol d'origine algale, dont l'effet antitumoral reste selon lui "peu documenté".

Objectifs

Ce projet fait suite à des travaux préliminaires obtenus avec le 4-Cholestène-3-one, un métabolite du cholestérol produit par le microbiote intestinal et par une algue (Laurencia Papillosa). Notre équipe a montré́ que ce dérivé stéroïde provoquait une diminution de la prolifération des cellules cancéreuses du sein, associée à des effets prometteurs sur le métabolisme lipidique des cellules tumorales. Par ailleurs, le 4-Cholestène-3-one induit l'augmentation du transport cellulaire du cholestérol des cellules tumorales. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer le potentiel anti-tumoral in vivo d’un apport nutritionnel de 4-Cholestène-3-one, associé ou non à un traitement par le docetaxel, dans un modèle de souris nude xénogreffées avec des cellules tumorales mammaires humaines. Pour cette expérimentation, nous utiliserons un total de 48 souris (souris nude = immunodéprimées, adultes femelles de 8 à 10 semaines) correspondant au total à 4 groupes de 12 souris par lot de condition expérimentale. En parallèle, nous envisageons des études biochimiques d’analyse du métabolisme lipidique (sur les tumeurs xénogreffées). Les résultats de ce projet devraient permettre de valider in vivo les effets du 4-Cholestène-3-one observés récemment in vitro et de confirmer l'intérêt potentiel de ce stérol dans le traitement pharmaco-nutritionnelle du cancer du sein.

Bénéfices attendus

Suite aux résultats de ces expérimentations le rôle potentiel du 4-cholestène-3-one, dont l'effet est actuellement peu documenté permettra d'envisager une approche pharmacologique et/ou nutritionnelle de prévention des cancers du sein. De plus, notre projet devrait aussi nous permettre de valider d'éventuels nouveaux biomarqueurs reliant la consommation du 4-cholestène-3-one au devenir des tumeurs. Enfin, en plus de son existence dans les algues, il est maintenant connu que le 4-cholèstene 3-one est un métabolite du microbiote intestinal (Chen et al., 2017), ce qui laisse entrevoir des stratégies possibles d'utilisation de probiotiques afin d'augmenter sa production.

Procédures

Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. L’injection sera réalisée sous anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Les cellules seront injectées au niveau du flanc. Prélèvements sanguins de 100µL au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire. Réalisation de trois prélèvements de sang au niveau de la veine faciale (100µL/souris de 25g) pour réaliser une NFS (numération de la formulation sanguine) et la récupération du sérum pour congélation avant l’analyse biochimique. Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Gavage avec huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One volume de gavage ≤ 250 µl pour une souris de 25g) Injection IP de Docetaxel (15mg/kg) (volume total injecté < 500µl pour une souris de 25g). En bilan, chaque animal recevra : - Une Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. - Deux prélèvements sanguins - Quinze injections intrapéritonéales à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Quinze gavages à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Trois séances d'anesthésie genérale gazeuse d'une durée de cinq minutes chacune.

Impact sur les animaux

- L’injection par voie sous-cutanée d’une suspension de cellules MDA MB231 sera réalisée sous anesthésie générale. - Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Le gavage des souris sera réalisé par une personne formée et expérimentée (madame Chauvet, technicienne en expérimentation animale). L’émulsion d’huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One sera administrée par voie orale via un gavage utilisant une sonde flexible dédiée aux souris. Un volume maximal de 0,25ml/souris de 25g sera respecté. Cette procédure bien qu’inconfortable et relativement stressante ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. Les administrations répétées de Docétaxel (15mg/kg) par voie intrapéritonéales seront-elles aussi réalisées par un personnel compétent et expérimenté. Le volume maximal injecté sera inférieur à 0,3ml pas souris. La cicatrisation au point d’injection entre deux injections successives sera possible vu la cinétique d'administration. - Les 3 prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire dédié. Cette technique sera réalisée sur animal vigile avec une contention renforcée (ne nécessitant pas l'anesthésie gazeuse ni l'ajout d'un anesthésique local). La quantité de sang prélevée peut être gérée par le relâchement de la contention. Une goutte de sang correspond entre 60 et 100µL et ce qui respecte les 20% de la volémie d'une souris de 25g. Cette procédure réalisée très rapidement ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. - Mesure de la taille des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse électronique sous une courte anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Cela ne devrait donc pas générer de douleur /nuisance chez les souris. - Les nuisances attendues chez l'animal seront donc éventuellement les effets secondaires liés au traitement antitumoral testé. Une observation attentive quotidienne du comportement général des animaux, de leur mobilité ainsi que de leur réactivité permettra de détecter les animaux en souffrance du fait des injections réalisées ou du développement des masses tumorales au niveau du flanc. Un ensemble de paramètres sera mesuré pour obtenir une estimation relativement précise de l’impact de la douleur. Une mise à mort de l'animal sera réalisée si les nuisances s'avèrent trop importantes.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort car des expériences d'analyses biologiques, biochimiques et de toxicologiques seront ensuite réalisées sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

La mise en évidence du "potentiel" antitumoral du 4-cholestène-3-one a été évalué in vitro sur lignées tumorales cellulaires issues de tumeurs mammaires (MCF-7, MDA-MB231). Pour confirmer les effets observés in vitro, un passage in vivo s'avère nécessaire afin de pouvoir étudier l'effet antitumoral du 4-cholestène-3-one. Le cancer étant une pathologie complexe, il n’existe pas à l’heure actuelle, de méthodes alternatives permettant d’éviter ou remplacer l’utilisation des animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre nécessaire d’animaux contrôles tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Les tests de Mann Whitney/Student et Kruskal Wallis/ANOVA seront utilisés pour la comparaison statistique entre lots. Pour calculer le nombre total d’animaux et le nombre d’animaux par lot, nous avons utilisé le logiciel Gpower et la méthode basée sur l’analyse de la puissance. Nous avons considéré les paramètres suivants : Alpha : 0.05 ; Puissance : 80 ; effet de la taille de l'échantillon : 0.5 (moyen) Le nombre minimal d’animaux nécessaire est de 48 souris souris, 12 souris par lot. Ce nombre d’animaux est un nombre minimal pour la validation statistique des résultats (Kruskal- Wallis One-Way ANOVA) et il tient compte d’un taux de prise de greffe > à 90%. Par ailleurs, ce nombre de souris par lot permet d’obtenir suffisamment de matériel biologique pour les analyses biochimique et histologique ultérieures, nécessaires à la caractérisation de l’activité anti-tumorale de la molécule testée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Elles seront réparties à raison de 4 à 5 souris par cage avec un enrichissement physique (copeaux de litière, frisottis) permettant aux souris de satisfaire leurs besoins comportementaux (exploration de leur environnement, confection de nid…). Si des cas de bagarre apparaissent on veillera à augmenter l'enrichissement avec des abris, tunnels supplémentaires dans la cage. Les litières seront changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. L'expérience a été́ conçue pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures : Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale après anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v dans une cage à induction (à 4% sous un débit d’air de 1 L/min).

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons des souris balbc nudes femelles. Les cellules MCF-7 et MDA MB 231 étant des lignées tumorales humaines, il est nécessaire d’utiliser de souris immunodéficientes afin de permettre la prise de greffe. Il s'agit donc de l'espèce classique pour cette première étape de l'évaluation pharmacologique antitumorale in vivo d'une molécule. Des adultes de 8 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est relativement homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.