Rongeurs

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.

Procédures

Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.

Réduction

La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.

Choix des espèces

La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage forcé unique et jusqu'à cinq prélèvements sanguins, puis sont mises à mort pour des analyses histologiques, afin de tester la toxicité et la pharmacocinétique de composés antipaludiques. Le porteur indique que le gavage cause un stress transitoire et un risque de fausse route, l'effet réel des molécules restant imprévisible. Il affirme qu'un test sur "organisme entier" est "nécessaire", les cultures cellulaires ne détectant pas la toxicité des organes.

Objectifs

Le paludisme, dû au parasite Plasmodium falciparum, est la première cause de mortalité parasitaire dans le monde. Les traitements actuels à base d'artémisinine font face à des échecs suite au développement de résistances, de sorte que de nouveaux traitements basés sur de nouvelles cibles du parasite sont nécessaires afin de contenir le risque de dispersion des résistances. Ces dernières années, la famille des quinazolines a été identifiée parmi les nouvelles entités chimiques démontrant des propriétés antiplasmodiales prometteuses. Le projet global financé par l'ANR concerne la synthèse et l'évaluation anti-paludique de composés originaux de cette famille. Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de la toxicité aiguë éventuelle des composés identifiés comme ayant les meilleures activités lors de tests in vitro. Cela permettra de déterminera si les composés testés peuvent poursuivre un développement pré-clinique, puis clinique plus poussé.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point de nouveaux antipaludiques. Il permettra de déterminer si les produits étudiés (dont l'activité antipaludique in vitro est démontrée) peuvent être administrés par voie orale sans toxicité particulière, et avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles avec le développement d'un principe actif. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de pouruivre le développement de ces molécules, à commencer par un test d'efficacité chez la souris infectée par le parasite Plasmodium. Le but final étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l'efficacité des médiaments existant actuellement décroit rapidement.

Procédures

Le animaux seront soumis à un acte de gavage forcé, une fois. Ils seront également soumis à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles u sous anesthésie, une fois pour 50% des animaux, trois fois pour 17% des animaux, et 5 fois pour les 33% restants. Tous les actes ont une durée inférieure à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le but est précisément de déterminer l'effet de composés potentiellement antipaludique sur l'organisme. Ces molécules étant nouvelles, et bien que les tests de toxicité in vitro aient été effectués, nous ne pouvons prévoir le réel effet à l'echelle de l'organisme entier. Néanmoins, l'administration par gavage en elle-même cause un stress transitoire à l'animal, et un risque de "fausse route" ne peut être totalment exclu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort : en effet, des analyses histologiques sur organe prélevés doivent être réalisées ultérieurement.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : efficacité antipaludique par tests biochimiques, tests de toxicité sur culture cellulaire (lignée et/ou primaire), premier test de métabolisation sur microsomes de souris. Cela a permis de réduire l'étude à seulement 5 composés parmi les nombreux synthétisés. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant détecter une éventuelle toxicité organique.

Réduction

Nous avons décidé de n'étudier qu'une seule dose de produit, la dose maximale tolérée, sur des groupes de 12 souris. Nos expériences précédentes ont montré que cela permet d'obtenir une réponse statistiquement exploitable. D'autre part, la détrermination de la dose de travail se fera par administration séquentielle des doses envisagées, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.

Raffinement

Le projet nécessite des prises de sang régulières. Pour limiter l'inconfort, nous utiliserons des souris swiss de 8 semaines, possédant un volume de sang de l'ordre de 2ml. Une prise de sang sera effectuée une semaine avant le début. En ce qui concerne la phamacocinétique sur 24h, nous effectuerons la moitié des prises de sang sur quatre souris, et l'autre moitié sur les quatre autres souris. Cela permettra de prélever un volume sanguin raisonnable en termes de nuisance pour chaque animal. D'autre part, afin d'éviter l'emploi de solvant organique souvent toxique, nous administrerons les composés en solution dans de l'huile alimentaire. Par ailleurs, les animaux seront très observés (toutes les deux heures pendant les 12 premières heures), et seront mis à mort s'ils montrent des signes de souffrance. Une réutilisation n'est pas prévue car l'effet sur l'organisme de ces composés n'est pas connu. Les animaux seront hébergés dans les conditions réglementaires avec eau et nourriture à volonté, et enrichissement par des abris en matière plastique et du coton.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris, ce qui correpond aux recommandations de l'OCDE pour les tests de toxicité de produits chimiques administrés par voie orale (fiche 423). L'espèce préférée est le rat, mais les autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 semaines, conformément aux recommandations de l'OCDE pour ce type d'étude.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques exprimant deux onco-protéines du papillomavirus reçoivent un allergène cutané, une exposition aux UV ou des mesures d'oreille sous brève anesthésie, pour étudier l'effet de ces protéines sur le système immunitaire. Le porteur indique que l'application de l'allergène ne génère pas de douleur apparente et que les doses d'UV sont contrôlées pour éviter des lésions cutanées. Il affirme que le développement d'une réponse immunitaire est trop complexe pour être étudié in vitro.

Objectifs

Le cancer de la peau de type non-mélanome (Non-Melanoma Skin Cancer, NMSC) est la forme de cancer la plus répandue dans le monde et particulièrement chez les populations adultes à peau claire. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l’apparition de ce type de cancer reste un enjeu sociétal mondial, le nombre de cas détectés par an étant en constante augmentation. Parmi les facteurs de risques majeurs impliqués dans le développement de ce cancer, il a déjà été démontré une coopération entre les rayons ultraviolets et l’infection par les papillomavirus humains cutanés (HPV). L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’impact de 2 onco-protéines du virus HPV sur l'immuno-surveillance tumorale et plus globalement, sur les réponses immunitaires. Pour cela, des souris transgéniques exprimant ces onco-protéines au niveau de la peau seront comparées à des souris sauvages contrôles. Leur réponse immunitaire sera étudiée dans un modèle d’hypersensibilité de contact induite par l'application d'un allergène sur la peau, car il reproduit bien le phénomène d'inflammation locale généré suite à une exposition aux UVs. Ce modèle est bien établi et couramment utilisé dans la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir les connaissances sur les mécanismes de la coopération entre les UVs et une infection par un papillomavirus dans le développement de cancers cutanés. A terme, la mise en évidence des mécanismes immunitaires qui sont dérégulés dans ce contexte pourrait mener à l’identification de cibles thérapeutiques pour le développement de traitement prophylactiques face à ces cancers.

Procédures

_Application d’un allergène sur la peau. Cette procédure concerne 560 animaux. Parmi eux, 220 animaux subiront une application unique, 340 animaux subiront 2 applications espacées de 5 jours. La durée nécessaire pour cette intervention est de 3 minutes par souris environ. _Mesure quotidienne de l'oreille, sous brève anesthésie, pendant 3 jours consécutifs. Cette procédure concerne 220 animaux, et sa durée est d'environ 3 minutes par souris. _Exposition de la peau aux UVs. Cette procédure concerne 80 animaux, qui seront exposés à une faible dose d’UVs quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. Sa durée est de 2 minutes par souris environ.

Impact sur les animaux

L'application épicutanée d'un allergène chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. Cette procédure peut conduire les souris à se gratter, mais il n'a jamais été observé de signe excessif de grattage dans ce modèle. Concernant les expositions aux UVs, elles sont réalisées à faible dose, et cette dernière est bien contrôlée de manière à ne pas induire de lésions cutanées chez l'animal. Il est à noter que les onco-protéines exprimées par les souris transgéniques utilisées dans ce projet peuvent conduire au développement de tumeurs cutanées uniquement en coopération avec les UVs, si ces souris sont exposées à des doses croissantes et pendant de longues périodes (plus de 20 semaines). Les expériences d'exposition aux UVs qui seront réalisées dans ce projet ayant une durée maximale de 18 jours, les animaux transgéniques n'ont pas de risques de développer des tumeurs. En résumé, les effets indésirables attendus dans ce projet sont donc le stress généré par le contact avec l’expérimentateur, et une réaction inflammatoire locale et modérée au niveau du site d’exposition aux UVs ou à l'allergène.

Devenir

A l’issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort de manière à récolter les tissus ou organes étudiés. Cela permettra de réaliser ex vivo une analyse fine de la réponse immunitaire développée chez ces animaux, à l’échelle moléculaire et cellulaire.

Remplacement

Le papillomavirus humain est impliqué dans le développement de tumeurs épithéliales bénignes et malignes. L’influence des protéines du papillomavirus ne peut être visible que dans un épithélium complet, étant capable de se différencier (habitat naturel du papillomavirus). De plus, le développement d’une réponse immunitaire est un phénomène biologique très complexe impliquant une collaboration étroite de l’ensemble des cellules immunitaires, ainsi qu’une forte influence de l’environnement, rendant impossible son étude par des tests in vitro.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base d'expériences précédentes ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique des résultats. Ainsi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et une grande importance sera accordée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le plus adapté pour l'étude de mécanismes immunologiques. De plus, ce modèle permet d’utiliser des animaux génétiquement modifiés n'existant que dans cette espèce. Le modèle murin utilisé correspond ainsi au seul modèle connu pour étudier les effets des papillomavirus cutanés sur le système immunitaire. Enfin, ce modèle étant couramment employé, cela permettra de discuter les résultats obtenus à la lumière des données existantes dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 8 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire doit être mature et non vieillissant.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale sous-cutanée, puis des agents anticancéreux par injection intrapéritonéale ou péritumorale, pour tester une technologie de délivrance locale prolongée dans le mélanome. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité systémique et renvoie les applications cliniques à un brevet et à des essais futurs. Il conclut que la preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles précliniques proches de la tumeur humaine et qualifie cette étape d'"incontournable".

Objectifs

L’apparition de nouvelles molécules anticancéreuses durant ces 10 dernières années a conduit à une révolution dans le traitement de certains cancers, en particulier le mélanome. Cependant seule une fraction des patients (30% à 50%) montrent une réponse efficace et durable au traitement et nombre d’entre eux sont obligés de stopper le traitement à cause d’effets secondaires sévères, surtout lorsque plusieurs molécules sont combinées et administrées au patient. Il y a donc une urgence pour comprendre les mécanismes de résistances aux thérapies actuelles et mettre en évidence de nouveaux protocoles thérapeutiques avec une toxicité plus faible et une tolérance maximale. Ce projet vise en particulier à démontrer une meilleure tolérance et une meilleure efficacité de traitements combinés montrant des effets secondaires sévères aux doses efficaces. Nous utiliserons une nouvelle technologie, nommée BEPO, pour administrer des molécules en solution ou en suspension localement sur le site tumoral permettant une diffusion lente des médicaments. Nous éviterons de ce fait les effets indésirables observés lorsque ces molécules sont injectées par voie classique intraveineuse. Cette technologie a fait ses preuves dans des modèles de maladies inflammatoires (polyarthrite rhumatoïdes) et l’objectif principal de ce projet et d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ce procédé dans le modèle de tumeur solide de mélanome cutané pourlequel nous avons une grande expertise. Ce nouveau mode d’administration ouvrira de nombreuses possibilités en thérapie anti-cancéreuse et constituera une véritable avancée dans l’administration des agents anti-cancéreux. D’autre part la diffusion lente et continue des drogues au voisinage de la tumeur augmentera l’efficacité thérapeutique, nous permettant de tendre vers des rémissions totales plus fréquentes. L’idée, à travers les modèles d’études précliniques décrits dans ce projet, est de rapidement mettre en œuvre de tels protocoles chez les patients.

Bénéfices attendus

Le but de notre projet est double: i) améliorer l’efficacité des médicaments antitumoraux en administrant plusieurs molécules en même temps, en une dose unique et avec une diffusion de longue durée sur le site de la tumeur ii) éliminer les effets secondaires souvent sévères de ces médicaments lorsqu’ils sont administrés de manières répétées par voie intraveineuse. En effet la délivrance locale évitera d’endommager les tissus sains, ce qui se passe en général lorsque les agents anticancéreux sont inoculés par voie intraveineuse et ce qui explique la majeure partie de leur toxicité et parfois pousse à l’arrêt du traitement. Le partenariat que l’on développe dans le cadre de ce projet nous permettra de rapidement breveter ce concept et d’envisager des applications cliniques dans la mesure où nous aurons validé les effets sur les deux modèles précliniques proposés dans ce projet. Nous sommes également en collaboration avec des cliniciens désireux de démarrer des essais cliniques utilisant ces thérapies inovantes capables d'améliorer grandement le confort des patients au cours du traitement et surtout d'augmenter leur chance de guerison sans récidive.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude (1600 souris) seront greffés une fois en sous cutané (15 secondes/souris, contention comprise). Pour la procédure n°1, en plus de la greffe sous-cutanée, la moitié des animaux (260 souris) recevra les différents agents thérapeutiques en injection intrapéritonéale (10 secondes/souris, contention comprise), l’autre moitié (260 souris) recevra ces mêmes agents thérapeutiques sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Pour les procédures suivantes n°2 et 3 les lots validés dans la procédure n°1 recevront la ou les molécules sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Aucun prélèvement n'est prévu sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’y aura aucun effet indésirable de toxicité systémique de ces drogues comme on pourrait s’y attendre en injection conventionnelle. Des preuves de concepts de ce mode d'administration ont été établies sur des pathologies inflammatoires (polyarthrite) et montrent notamment que ce procédé n’engendre aucun rejet ni effet secondaire avec une tolérance maximale chez la souris. Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs et le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept de ce nouveau mode de délivrance d’agents anticancéreux revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouveaux modes d’administrations de combinaisons thérapeutiques en clinique. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les deux modèles proposés très proches des deux grands groupes de patients atteints de mélanome cutané, nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements sur la croissance tumorale mais aussi de valider ce nouveau mode d’administration très innovant et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale pour un contrôle durable de la pathologie. L'obtention de tels résultats est une étape incontournable si on veut démarrer par la suite des essais cliniques chez l'homme avec ce nouveau procédé. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos combinaisons thérapeutiques et surtout pour valider ce nouveau mode d’administration.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 1600 souris sur 4 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos combinaisons thérapeutiques. Les molécules et combinaisons utilisées le seront de manière séquentielle ce qui implique que lorsque nous aurons des effets significatifs sur un protocole nous nous focaliserons sur celui-ci et ne testerons pas les autres molécules. D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été évalué de manière à obtenir une significativité statistique de nos résultats afin de valider ou d’invalider notre procédure. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur le modèle de mélanome mais également sur d’autres modèles de tumeurs solides nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum . Grace à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous-cutané, nous éviterons ainsi les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l'agressivité et l'isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant à l'euthanasie des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux afin de réduire le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, des diarrhées (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

L'espèce murine C57Bl/6 utilisée dans notre étude est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long-terme. Ces souris C57Bl/6 dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique . Nous avons déjà obtenus l'ensemble des données préliminaires à l'origine de ce projet sur ce modèle et devont continuer avec le même modèle pour une cohérence des résultats. L'âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge ou le système immunitaire est complètement fonctionnel.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.

Objectifs

L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.

Procédures

Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.

Réduction

Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.

Raffinement

Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.