Rongeurs
Etude de la conséquence d’un défaut d’une protéine des jonctions serrées sur la formation de l’émail chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une chirurgie de trente minutes pour implanter des germes dentaires sous la capsule rénale de souris receveuses, les donneurs étant des souriceaux nouveau-nés d'une lignée qui ne survit que quelques heures. Il affirme que seul un modèle animal intégré permet la formation d'une dent, sans méthode de remplacement possible. Il indique par ailleurs qu'un test statistique justifierait douze souris, quand le projet en prévoit quarante-huit.
Objectifs
L'amélogenèse imparfaite constitue un groupe de maladies génétiques rares du développement affectant la structure de l'émail de toutes les dents (temporaires et permanentes). Ces troubles de structure ont un impact important sur l’esthétique et la fonction des dents du patient et affectent de manière importante sa qualité de vie. L’amélogenèse imparfaite peut s’exprimer de façon isolée ou syndromique. Les formes isolées sont principalement liées à des mutations dans les gènes qui codent pour les composants de la matrice extracellulaire de l'émail, ou des protéines impliquées dans la maturation de l'émail, ou encore dans l’attachement cellule-cellule et cellule-matrice. L'amélogenèse imparfaite est aussi fréquemment diagnostiquée chez les patients présentant des troubles génétiques associés aux reins, à la peau et à de nombreux autres organes/systèmes ; on parle alors de formes syndromiques. L’objectif de notre recherche est d’étudier les consquences dune mutation d'un gène codant une protéine clée des jonction intercellulaires, dans l'amélogenèse . Nous disposons au laboratoire de la lignée de souris invalidée pour ce gène. Ce modèle, déjà bien établi dans la littérature, permet la formation complète d’une dent. Ceci nous permettra d’étudier tous les stades de l’amélogenèse dans un environnement nourricier contrôlé et idéal.
Bénéfices attendus
La mort des souriceaux de la lignée de souris invalidée pour ce gène survenant quelques heures après la naissance empêche l’étude des différents stades de l’amélogenèse (formation de l’émail). Quand bien même la souris serait viable au-delà de quelques heures, elle présenterait, comme chez les patients avec le syndrome, une homéostasie minérale perturbée, ce qui impacterait indirectement la formation de l’émail. Pour évaluer le rôle direct de l’absence de cette protéine sur la formation de l’émail, nous allons implanter les germes dentaires issues des souris de cette lignée invalidée pour le gène dans la capsule rénale de souris sauvages afin d’étudier tous les stades de l’amélogenèse, les germes continuant à se développer après implantation dans le rein. La capsule rénale est en effet un modèle d’implantation bien établi, qui constitue un environnement nourricier contrôlé et idéal. La capsule rénale est un compartiment bien isolé, accessible, richement vascularisé qui permet donc un afflux de nutriments et de minéraux qui va donc favoriser le développement et la minéralisation des germes inclus. Cette étude pionnière apportera des données essentielles sur la compréhension du rôle de ce gène dans l’amélogenèse. Les retombées de cette étude seront à la fois scientifiques mais aussi de manière plus générale apporteront des données nouvelles sur l’amélogenèse et ses dysfonctionnements. Il est à savoir qu’un nombre considérable de patients avec des maladies rares mais aussi des maladies chroniques comme la carie dentaire présentent des perturbations au niveau de l’émail. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’amélogenèse devrait apporter un bénéfice réel à la fois pour la connaissance scientifique et pour la population car cela pourrait ouvrir des pistes vers de nouvelles thérapies à la fois préventives et interventionnelles pour ce type de pathologies.
Procédures
Chirurgie : durée d’environ 30 minutes par animal réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
Notre expérience avec les procédures mises en place pour ce projet a montré qu’il y a peu d’effets indésirables observés moyennant un traitement antidouleur systématique en pré et post chirurgie (Buprénorphine 0.05mg/kg 2X/jour pendant 48h). D’après la littérature, aucun changement de comportement ne devrait être observé et la perte de poids resterait inférieur à 5%.
Devenir
À l'issue de la procédure, les souris sont mises à mort pour collecter des germes formés dans la capsule rénale puis pour différentes types d'analyses.
Remplacement
La formation d’une dent est un processus physiologique complexe qui fait intervenir différents types cellulaires et de nombreux facteurs de croissance qui n’ont pas tous été identifiés. Par conséquent seul un modèle animal intégré permet à l’heure actuelle ce développement et il n’y a pas de méthode alternative de remplacement.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette étude mais de disposer d’un nombre minimal d’animaux pour obtenir la puissance statistique requise, nous utiliserons le test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student. Ces tests permettent de déterminer qu’un nombre de 12 souris sera nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Afin de limiter au maximum la souffrance des animaux, les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les analyses se feront sous anesthésie générale avec une médication antidouleur systématique en pré et également post-opératoire. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la chirurgie et en phase de réveil. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites ont été définis au-delà desquels les animaux seront mis à mort. Les souris seront maintenues dans des cages bénéficiant d’un enrichissement composé d’un igloo rouge et de coton.
Choix des espèces
La souris est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’amélogenèse. Il permet une faisabilité technique et la biologie car l’émail murin est proche de celui de l’homme. Afin de limiter toute réaction immunitaire chez la souris receveuse, nous utiliserons la même souche. Pour les donneurs, seules les souriceaux nouveaux nés seront utilisés puisque les souris invalidées pour le gène ne vivent que quelques heures après la naissance. Pour les receveurs, des souris de 3 mois seront utilisées car à cet âge, leurs reins sont assez développés pour pouvoir réaliser les implantations de germe.
Impact de l’exposition précoce au bisphénol A sur le développement cérébral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées au bisphénol A par l'eau de boisson, leurs petits reçoivent des injections sous la peau dès la naissance, subissent des tests comportementaux, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les injections chez les nouveau-nés peuvent provoquer une douleur locale et que la séparation d'avec la mère génère un stress. Il affirme que l'étude de la myéline ne peut se concevoir qu'in vivo et qu'un modèle exposé par voie orale est le seul moyen de mimer l'exposition humaine.
Objectifs
Les troubles du développement cérébral, incluant des déficits d'apprentissage, de l'attention ou encore les troubles du spectre autistique, constituent un problème de santé publique majeur. Les perturbateurs endocriniens sont aujourd'hui mis en cause dans l'augmentation de la fréquence de ces pathologies. En mimant ou en bloquant les effets de certaines hormones, les perturbateurs endocriniens peuvent avoir des conséquences néfastes sur le développement cérébral. Parmi les composés préoccupants, le bisphénol A (BPA) est un agent plastifiant omniprésent dans notre environnement. Ainsi, dès la conception puis pendant la grossesse et la lactation, les fœtus et les nourrissons sont exposés au BPA provenant de l’organisme de leur mère à travers le placenta puis le lait maternel. L’une des étapes cruciales du développement cérébral correspond à la mise en place de gaines de myéline autour des prolongements de certains neurones. Ces gaines de myéline, très riches en lipides, permettent d’accélérer la transmission des messages nerveux et d’assurer un fonctionnement optimal du cerveau. Nous émettons l’hypothèse que le BPA pourrait perturber la mise en place des gaines de myéline dans le cerveau au cours du développement. En administrant du BPA à des souris au cours de la grossesse et de l’allaitement, nous avons pour objectif d’étudier l’impact de ce perturbateur endocrinien sur la mise en place de la myéline chez les descendants des mères exposées. Nous avons également comme objectif de mieux comprendre par quel mécanisme moléculaire le BPA pourrait exercer ses effets néfastes. Nous étudierons les effets du BPA en analysant la composition lipidique de la myéline chez les souriceaux exposés depuis la gestation. Le comportement des souris sera également évalué à différents stades, ainsi que la structure et la composition du cerveau des souris adultes.
Bénéfices attendus
Malgré son interdiction dans les biberons et les contenants alimentaires, le BPA est toujours omniprésent dans l’environnement, exposant les individus de façon permanente dès la conception. La concentration utilisée dans ce projet s’approche des concentrations retrouvées chez l’homme en cas d’exposition importante, et la voie d’exposition choisie (digestive) correspond à la voie d’exposition majoritaire chez l’homme. Ce projet permettra de compléter les connaissances sur la toxicité du BPA dans le cerveau immature en s'intéressant à une cible jusque-là peu étudiée, à savoir la myéline, dont les altérations pourraient participer à l’apparition de pathologies. L’étude des mécanismes moléculaires par lesquels le BPA exerce ses effets permettra d’améliorer l’évaluation de la toxicité de ce composé et notamment de mieux comprendre pourquoi il exerce des effets différents chez les mâles et les femelles.Il est crucial de mieux comprendre comment le BPA et les perturbateurs endocriniens exercent leurs effets sur la santé, particulièrement pendant les périodes critiques développementales, afin de contribuer à l’évaluation du risque qu’ils représentent et ce dans l’optique de protéger les populations les plus vulnérables.
Procédures
Les femelles gestantes puis allaitantes seront soumises à une exposition au BPA par l’eau de boisson pendant 30 jours, sans générer de stress ou de souffrance. Les souriceaux seront soumis à une injection par jour sous la peau pendant les 2 jours suivant sa naissance. En tenant compte du maintien du souriceau, la durée de l'intervention est de 10 secondes au maximum. L'injection elle-même dure 1 seconde. Les souriceaux seront également soumis à 2 tests comportementaux à 8 et 9 jours post-nataux. La durée de séparation avec la mère n’excède pas 10 minutes pour chaque test. Après la fin de l'allaitement, les souris âgées de 1 à 2 mois seront soumises à 3 tests comportementaux. Ces tests sont non invasifs et peu contraignants, les animaux sont libres d’explorer l’enceinte et ne reçoivent pas de stimulus désagréable ou douloureux. Certaines souris seront soumises, à l'âge de 2 mois, à une injection d’anesthésique afin de réaliser une sédation profonde. Une perfusion intracardiaque de solution saline sera réalisée, entrainant la mort rapide de l’animal. Le délai entre la sédation et la mort n’excèdera pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
Pour tous les animaux de ce projet, un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux de leurs mères au cours de tests comportementaux et lors de la réalisation d’injections sous-cutanées. Les injections sous-cutanées réalisées chez les souriceaux nouveau-nés pourraient entrainer une douleur locale et transitoire. Au cours des tests comportementaux réalisés chez les souris après le sevrage, un stress pourrait être engendré par la manipulation des souris. La perfusion intracardiaque réalisé sur des animaux profondément anesthésiés pourrait également générer une douleur de courte durée. Afin de minimiser ces nuisances, ce projet prendra en compte la réglementation des 3R selon les modalités décrites par la suite.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de leurs cerveaux, dans le but de réaliser différentes analyses moléculaires et tissulaires.
Remplacement
La mise en place de la myéline est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires du cerveau. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». En outre, un modèle animal exposé par voie orale est actuellement le seul moyen pertinent de mimer l’exposition humaine au BPA.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé grâce à notre expérience pour les différentes analyses et nous permettra de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Différentes analyses seront réalisées sur un même animal, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Des tests statistiques adaptés seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages enrichies en sopalin pour la réalisation des nids. L'administration du BPA par l’eau de boisson, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Les faibles doses de BPA administrées n'affecteront pas le bien-être des animaux. Seules deux injections seront réalisées chez les souriceaux, permettant un traitement efficace sur une période de 3 semaines. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront également prises pour minimiser le stress des animaux.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé chez la souris car plusieurs effets du BPA sur le développement cérébral ont été observés chez la souris dans la littérature scientifique. De plus, le laboratoire est spécialisé dans l'étude du développement cérébral chez la souris, pour lequel nous disposons de nombreux outils et approches. L’exposition au BPA pendant la gestation et l’allaitement sera réalisée de la seconde semaine de gestation jusqu'à la fin de l'allaitement. Cette période d’exposition classiquement utilisée dans la littérature permet d'éviter toute malformation potentielle due au BPA pendant les premiers jours de gestation. Chez la souris, la formation de myéline dans le cerveau au cours de la deuxième semaine après la naissance, progresse rapidement et se poursuit au moins jusqu’à un à deux mois. Un effet du BPA ayant été observé chez les femelles âgées de deux semaines pendant le pic de myélinisation, ce stade a été choisi dans ce projet pour étudier le mécanisme d’action du BPA. Nous complèterons les résultats par des analyses comportementales à différents stades et par des analyses moléculaires et tissulaires à 2 mois. Ces différentes études seront réalisés aux stades adéquats en accord avec la littérature scientifique et l'expérience du laboratoire.
Caractérisation motrice et de l’impulsivité induites par les agonistes dopaminergiques de modèles murins de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la maladie de Parkinson, elles subissent une lésion cérébrale par injection stéréotaxique, des tests comportementaux nommés Catwalk, cylinder test, cliff hanging et VDS, des injections quotidiennes de pramipexole pendant quatre semaines et une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 %. Le porteur indique que les animaux récupèrent difficilement après la lésion et perdent souvent plus de 10 % de leur poids. Il affirme que ces comportements moteurs et impulsifs ne peuvent être reproduits ni par des modèles cellulaires ni par des invertébrés.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative avec symptômes moteurs et comportementaux. Des mutations du gène Parkin (PRKN) ont été rapportées comme responsables de certaines formes génétiques. Parmi ceux-ci, des troubles des conduites impulsives (TCI) secondaires aux traitements par agonistes dopaminergiques ont été rapportés chez les patients Parkinsonien, et en particulier plus fréquemment chez les patients porteurs de la mutation du gène Parkin (PRKN). Malgré les consequences négatives, les comportements impulsifs et compulsifs, sont poursuivis sans contrôle, impactant négativement la vie des patients et leurs aidants. Des facteurs de risques ont été identifiés, principalement pharmacologique dus aux agonistes dopaminergiques, de façon dose- et durée dépendante; également retrouvé dans les modèles murins. La physiopathologie des TCI est encore imparfaitement connue et ce projet a pour but d’en étudier les substrats biologiques. L’objectif général de ce projet est porté en 3 points : • caractériser les troubles des conduites impulsives chez deux modèles murins de la maladie de Parkinson : avec lésion par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et porteurs de la mutation du gène Parkin (PRKN) • analyser l’effet dose et durée-dépendant d’un agoniste dopaminergique sur la sévérité de ces troubles (pramipexole (PPX) dans le cas de l’étude) • identifier les causes d’apparition de ces troubles d’un point de vue biologique
Bénéfices attendus
Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle et permettra l’identification de cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements de la maladie de Parkinson, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents, que sont les troubles des conduites impulsives liés au traitement par agonistes dopaminergiques dans la maladie de Parkinson. Après avoir établi les modifications comportementales dans les modèles murins de Parkinson dans ce projet, nous étudierons les modifications biochimiques et épigénétiques en rapport. Ce projet permettra donc : - de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition d'un effet indésirable grave chez les patients parkinsoniens traités par traitements dopaminergiques - de développer ultérieurement des nouveaux traitements ciblés permettant de prévenir ces troubles invalidants, ayant un bénéfice direct chez chaque patient et leur entourage, et un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux (déviances sexuelles, dépenses inconsidérées, alimentation compulsive, etc...) ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.
Procédures
Les souris effectueront une habituation préalable aux tests comportementaux d'environ 20 min pour l'ensemble des tests avec simple exploration des dispositifs expérimentaux, et 4 sessions d'entrainement au VDS d'une durée de 30 min chacune réparties sur 2 journées. Les souris sont évaluées sur une série de 4 tests comportementaux (2 pour l’évaluation motrice (Catwalk et cylinder test) et 2 pour l’impulsivité (cliff hanging et VDS) réalisés le même jour et dont la durée totale n'excèdera pas 1h30 par souris pour l'ensemble des tests. Ceci est répété 6 fois maximum au cours de la vie de l'animal. Les animuax recevront une injection sous-cutanée quotidienne lors de la phase de traitement par le pramipexole (PPX) sur une durée de 4 semaines. Une unique procédure chirurgicale est prévue pour certains des animaux : l’opération chirurgicale aura lieu dans la pièce de chirurgie. Elle durera 30 min environ pour une micro-injection dans une structure cérébrale. Les animaux se réveilleront 1 minute après l’injection en cas d’anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 30 à 45 min après en cas d’anesthesie par injection de Kétamine Xylazine.
Impact sur les animaux
Les injections stéréotaxiques pourraient potentiellement introduire un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie. Les animaux ont souvent du mal à récupérer après la lésion unilatérale des neurones dopaminergiques. Il est courant que les animaux présentent des difficultés à manger et boire dans les jours qui suivent l’opération, perdant plus de 10% de leur poids pendant cette période. Les injections répétées du traitement et le test comportemental répété à plusieurs reprise peuvent également être des nuisances. Le traitement par PPX devrait diminuer les symptômes parkinsoniens.
Devenir
A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Nous étudions des comportements moteurs et impulsifs, il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences
Réduction
Le nombre total d’animaux impliqués est de maximum 2016 pour l'ensemble des procédures. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne- nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum en phase post opératoire et rendues plus accessibles, le temps pour l'animal de récupérer, puis en quantité suffisante pour maintenir un poids à 90% du poids corporel habituel. Un carré de coton pour nidifier est également placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle biquotidien car suite à la chirurgie nous renforcerons les observations pour surveiller les animaux dans la période critique où ils perdent du poids pour s'assurer qu'ils s'alimentent, ne montrent pas de signes de douleur, etc... L'accès à l'eau et alimentation sera facilité (hydrogel, croquettes au sol, poudre, ré-hydratation sous-cutanée). En restriction alimentaire pour atteinde 85% du poids initial, ils seront isolés en cage seul afin de pouvoir quantifier les apports alimentaires et se prémunir des risques de dominance empêchant l'animal de s'alimenter en cage d'hébergement multiples en cage. Ils seront observés 1x/j, pesés à J1,J4,J7 et de façon supplémentaire en cas de signe de déshydratation/faiblesse. En cas de dépassement
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles moteurs et comportementaux de la maladie de parkinson, une pathologie neurodégénérative touchant l’adulte, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes (âgés de plus de 7 semaines). Notre projet propose de mieux comprendre le déclenchement des troubles conduites impulsives (TCI) induits par le traitement des agonistes dopaminergiques. Ces comportements ne peuvent être reproduits ni modélisés par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Une fois les acteurs pharmacologiques et moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles cellulaires lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Infection urinaire à Escherichia coli, contaminant alimentaire et carcinogénicité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'induction d'une infection urinaire par sondage de l'urètre sous anesthésie, répétée une fois, puis un traitement par l'eau de boisson pendant douze semaines associant une mycotoxine et un carcinogène. Il indique que l'infection provoque un inconfort et qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraînerait la sortie de l'animal du protocole. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", l'interaction entre plusieurs organes ne pouvant selon lui être modélisée in vitro.
Objectifs
Nous sommes constamment exposés à une multitude de contaminants chimiques ou toxines biologiques, qui même à faible doses peuvent affecter notre santé, par exemple en provoquant le cancer. La plupart des recherches examinent l'effet de ces contaminants ou toxines une par une, mais rarement en combinaison. Dans ce projet, nous étudierons si la combinaison d'une toxine produite par une bactérie pathogène et d'un contaminant naturel des aliments, une mycotoxine, pourrait provoquer un cancer de la vessie. L'une des infections les plus courantes est l'infection urinaire causée par Escherichia coli. Ce microbe produit des toxines qui peuvent endommager notre ADN et induire des mutations cancérigènes. Une femme sur deux est touchée par cette infection au cours de sa vie. Des études antérieures ont montré que les personnes souffrant de ce type d'infection ont tendance à avoir plus de cancers de la vessie. Nous sommes aussi fréquemment exposés à des toxines prédentes dans l'alimentation, comme celle produite par des moisissures qui poussent sur les céréales: une mycotoxine appelée déoxynivalénol ou DON. Le DON est éliminé par notre corps dans l'urine. On trouve des traces de DON dans 40 à 98% des Européens, c'est donc un contaminant très fréquent. On sait que lorsqu'ils sont ensemble, DON et Escherichia coli induisent encore plus de dommages à notre ADN. Est-ce que manger un aliment contaminé par le DON tout en ayant une infection urinaire pourrait endommager nos cellules et favoriser le cancer de la vessie?
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous répondrons à cette question en étudiant si la combinaison du deoxynivalenol et de l’infection avec Escherichia coli induisent des lésions cancéreuses à long terme. Si nous confirmons qu'ensemble ils peuvent conduire au cancer de la vessie, nous alerterons les médecins et les régulateurs, pour éventuellement modifier la façon de traiter les infections de la vessie et pour diminuer les quantités tolérables de DON dans nos aliments.
Procédures
Une infection urinaire sera induite chez les animaux par injection via leur urèthre, avec une sonde, sous anesthésie générale. Le sondage et l'injection sont effectués par une personne expérimentée, en 1 minute environ. L'injection est répétée une fois sur chaque animal une heure après la première (pour garantir l'infection). Le suivi des animaux est ensuite effectué par des prélèvement d'urine quotidiennement, sur animal vigile avec une simple contention manuelle. Le traitement des animaux avec le contaminant alimentaire et le carconogène urinaire est effectué par l'eau de boisson, sans intervention, pendant 12 semaines. Ces produits ne montrent pas d'effet sur la prise de boisson aux doses utilisées.
Impact sur les animaux
Les traitements avec le contaminant alimentaire et le carcinogène urinaire ne sont pas connus pour induire de la douleur. Les infection urinaires induisent de l'inconfort au niveau de l'aine, mais aucun autre signe clinique est attendu.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issu de l'expérience afin de prélever les tissus qui seront analysés. La technique d'euthanasie est la même que celle utilisée chez les vétérinaires.
Remplacement
Remplacer : des études ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d’élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’évaluer les répercussions à long terme de cette bactérie et ses toxines sur la vessie. Une veille scientifique sera mise en œuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Réduire : Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Le nombre maximum de rats envidagé est de 520 animaux. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, nombre de bactéries, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Raffiner : Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Une perte de poids (non attendue) supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt plus stricts seront mis en place.
Choix des espèces
L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes toxines et métabolites sur la cellule eucaryote en culture. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car les objectifs sont i) de découvrir les rôles des toxines bactériennes produites pendant l'infection urinaire et le cancer de l'urothélium, ii) de déterminer le lieu et la cinétique de production de ces toxines dans le tissu de la vessie et iii) de mesurer les effets des facteurs alimentaires sur leur production lors de l'infection urinaire. Étant donné que les infections urinaires sont des infections ascendantes impliquant plusieurs organes, que la production de toxines bactériennes peut être affectée par les réponses de l'hôte à différents endroits dans l'organisme, cette interaction complexe ne peut pas être modélisée in vitro.
La lactation comme période de reprogrammation du système métabolique et endocrine de la descendance exposée in utero à une hyperglycémie maternelle.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 748 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères subissent une manipulation nutritionnelle, des traites manuelles de lait et des tests de tolérance au glucose, tandis que leur descendance est soumise à des tests comportementaux, des prélèvements sanguins et une chirurgie avec pose d'un cathéter à la jugulaire pouvant durer trois heures. Le porteur indique que les petits sont tués à différents stades, de huit à deux cent soixante jours, pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance.
Objectifs
Le diabète gestationnel (DG), (8% des naissances en France), serait à l’origine du diabète de type 2 (DT2) chez 47% des patients âgés de 10-22 ans. Cette intolérance au glucose, transmise de génération en génération, contribuerait à l’explosion épidémique de la prévalence du DT2 dans le monde. Quelques études récentes montrent que, chez des enfants de 7 ans, exposés à une hyperglycémie maternelle in utero, la durée d’allaitement exclusif est inversement corrélée aux teneurs circulantes en hémoglobine glyquée (marqueur du DT2). Cependant, ces données épidémiologiques, parfois contradictoires, ne prouvent pas que la composition du lait maternel impacte le risque métabolique de la descendance. Nous émettons l’hypothèse que la lactation pourrait avoir un impact sur le devenir métabolique de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie maternelle qui pourrait s’expliquer en partie par des adaptations du métabolisme maternel et de la composition du lait. Nous avons préalablement montré dans des modèles rongeurs de programmation métabolique avec adoptions croisées, que la descendance mâle présentait des changements différents dans leur sensibilité à l’insuline à l’âge adulte selon que la descendance avait été allaitée par des rates maintenues en sous- ou sur-nutrition calorique durant la période périnatale. Ces changements étaient associés à des compositions spécifiques des laits maternels. Ce projet vise donc à caractériser : 1) la composition du lait maternel dans un modèle rongeur d’hyperglycémie maternelle durant la gestation suite à une manipulation nutritionnelle (mimant le DG chez la femme avec un retour post-partum à la glycémie pré-gravide), en lien avec les adaptations métaboliques des 3 organes clés du contrôle hormonal de la lactation que sont le placenta, le pancréas et la glande mammaire, 2) le devenir métabolique (insulino-sensibilité) de la descendance mâle et femelle jeune et adulte en réponse à des compositions de lait de mères DG ou normo-glycémiques (adoptions croisées) ou encore à des supplémentations postnatales en composés bioactifs du lait maternel identifiés dans le lait humain DG. La contribution du DG dans la prévalence des pathologies cardio-vasculaires à l’âge adulte, et neurodéveloppementales pendant l’enfance sera également explorée dans ce projet.
Bénéfices attendus
L’enjeu global de ce projet est d’évaluer l’impact de l’allaitement maternel sur le devenir métabolique de l’enfant soumis in utero à un DG. Le modèle expérimental nutritionnel de DG avec adoptions croisées va permettre d’étudier le rôle de la composition du lait maternel dans la programmation endocrino-métabolique de la descendance. L’objectif in fine est de tester la capacité de composants bioactifs du lait humain à (re)programmer la sensibilité à l’insuline de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie. Cette étude permettrait de prendre en compte ces biomarqueurs dans l’élaboration des formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, dans un contexte de diabète.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation et la lactation, à 4 prélèvements manuels de lait (30 minutes) et/ou 4 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes) selon les lots de rates (procédures expérimentales 1 ou 2). Leur descendance sera soumise à 4 tests de comportement (3 tests avec séquence de 10-15 minutes et 1 test avec une séquence de 1 heure), des prélèvements sanguins, une mesure de masse grasse par ostéodensitométrie (1 heure), 2 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes), une intervention chirurgicale (un clamp euglycémique/hyperinsulinémique avec pose d’un cathéter à la jugulaire et des prélèvements de sang à la veine caudale, durée 180 minutes) sur 260 jours de vie.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang répétés à la queue peuvent occasionner une douleur de classe légère due l'apparition d'une croûte. La cicatrisation qui fait suite à la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire peut être gênante pour l'animal. La traite régulière de lait chez les mères peut engendrer une irritation des mamelles. Le gavage oral peut induire très exceptionnellement une fausse route.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie d'une procédure à l'autre ou sont mis à mort à différents stades de développement (de J8 à J260) afin de prélèver les organes d'intérêt.
Remplacement
Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance en lien avec un diabète gestationnel (DG) et ceci, d’autant plus, que ce projet requiert un modèle d’étude de supplémentation nutritionnelle postnatale avec adoptions croisées pour mieux comprendre l’impact de la fenêtre de lactation sur cette programmation.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction sans compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, nous utiliserons autant que possible le même animal (suivi longitudinal de la glycémie et l’insulinémie). L’effectif retenu de n=8 mâles et 8 femelles par groupe d’adoption représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement une intervention nutritionnelle, prenant en compte le facteur sexe, avec une variabilité interindividuelle importante. Ce projet prévoit donc l’utilisation au maximum de 1332 individus sur une durée de 5 ans avec 372 rates Sprague-Dawley gestantes et allaitantes, 960 petits, mâles et femelles. Selon les résultats obtenus dans la première procédure expérimentale, le nombre de mères gestantes pourra être réduit dans la suivante. De même, si une différence d'effets selon le sexe est observée dans le suivi des descendants, la supplémenation postnatale ne sera mise en œuvre que sur la moitié des effectifs de ratons prévus.
Raffinement
Dans un souci de raffinement les animaux seront hébergés au moins 2 par cage pour le suivi de la descendance DG (sauf pour les périodes de gestation et de lactation des mères, où les mères seront seules avec leur portée après la mise-bas jusqu’au sevrage). Leur milieu de vie sera enrichi avec un tunnel et des frisottis leur permettant de faire leur nid, et de jouer. Aucune souffrance n’est attendue lors des manipulations nutritionnelles prévues : les rates en régime hypercalorique 1 semaine avant la conception et jusqu’à la fin de la gestation (4 semaines) ou jusqu’à la fin de la lactation (7 semaines) ne présentent pas d’obésité. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et manipulés quotidiennement (jeux, manipulations, caresses…) afin de réduire au maximum douleur et détresse et leur assurer un bien-être, en particulier après les chirurgies pour s’assurer de leur parfaite récupération. Les prélèvements de sang seront réalisés avec l’usage d’analgésiques afin de contrôler la douleur et dans des conditions d’asepsie nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Lors des prélèvements de lait, les rates seront anesthésiées et disposées sur un tapis chauffant. Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront anesthésiés après avoir reçu un antalgique qui agira pendant et après l’opération. Jusqu’au réveil et au-delà, les animaux seront surveillés et une grille comportementale pour chaque animal sera complétée avec des points limites à partir desquels les animaux seront pris en charges pour supprimer leur souffrance avec des injections d’antalgiques ou seront mis à mort si cette souffrance est trop importante.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle d’étude de la nutrition périnatale en raison de sa petite taille (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures), et de sa rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Contrairement à l’espèce souris, l’espèce rat (en particulier la souche Sprague Dawley choisie) présente des grandes qualités maternelles, permettant de mener à bien cette stratégie expérimentale avec des adoptions croisées en limitant notamment les risques de cannibalisme et d’abandon lors des adoptions, et limite sa prise de poids sous régime calorique, permettant de s’affranchir du paramètre obésité dans cette étude. Enfin, le volume de lait collecté par rate fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses individuelles de phénotypage du lait maternel de rate contrairement à la souris. Des femelles gestantes âgés de 8 semaines et de souche Sprague Dawley seront commandées. Ces femelles auront été soumises à un régime chow (CTL) ou HFHS, 1 semaine avant l’accouplement, chez le fournisseur d’animaux à qui nous aurons fourni l’aliment. A leur arrivée, les femelles seront en cage individuelle pendant la gestation et la lactation. Les rates utilisées pour les prélèvements de lait seront mises à mort en fin de procédure expérimentale N°1. Dans la procédure expérimentale N°2, 96 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles par mère adoptive, issus de mères biologiques différentes) seront constituées afin d’avoir au final 16 ratons (8 mâles et 8 femelles) par groupe d’adoption et par âge (6 temps). Ces groupes seront suivies durant la lactation (J8, J14), au sevrage à J21), au stade jeune (2 mois) et à long terme (âge adulte, 4 mois, sous régime standard et sous challenge hyper-énergétique durant 20 semaines).
Utiliser la pharmacothérapie pour prévenir et traiter les neurofibromes cutanés dans la neurofibromatose de type 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des molécules par gavage une à deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant deux mois, avec des prélèvements de sang à la queue et des photographies de la peau sous anesthésie. Le porteur affirme que les neurofibromes cutanés ne sont pas douloureux et qu'aucune des procédures n'est douloureuse. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces tumeurs liées à la neurofibromatose de type 1.
Objectifs
Le but de ce projet est d’utiliser la lignée NF1-KO,et d'identifier de nouvelles molécules qui régressent le développement des neurofibromes cutanés (NFc) dans la neurofibromatose de type 1. La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique due à des mutations du gène NF1 codant pour la neurofibromine, régulateur négatif des fonctions cellulaires importantes telles que la prolifération, la différenciation, la survie et le métabolisme des cellules. Tous les patients NF1 développent des NFc, tumeurs bénignes au niveau des terminaisons nerveuses dont le nombre peut atteindre des milliers. A part leur exérèse chirurgicale, ce qui n’est pas possible quand leur nombre est élevé, il n’existe aucun traitement permettant de prévenir ou faire régresser leur développement. Nous avons développé le modèle de souris (NF1-KO), dans leque le gène NF1 est inactivé et qui récapitule le développement des NFc et qui est à l’origine des découvertes de premier plan concernant les mécanismes responsables de leur développement. Ce modèle vient d’être utilisé par notre équipe avec succès pour réaliser des essais précliniques des molécules candidates afin de prévenir/régresser le développement des NFc. Recemment nous avons développé deux versions du modèle, appelées curatif et préventif. Le modèle curatif consiste à traiter les animaux NF1-KO présentant des nombreux NFc afin d’identifier les molécules capables de régresser/bloquer leur développement. Le modèle préventif consiste à traiter les animaux mutants juste avant l’apparition des tumeurs afin d’éliminer les cellules à l’origine des NFc et de prévenir leur développement. Dans cette étude, c'est le modèle curatif qui sera utilisé.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de : (i) valider le protocole d'analyse qualitative et quantitative de l'efficacité des nouvelles molécules à regresser le développement des NFc. Ce protocole sera par la suite proposé à la communauté scientifique afin de tester les nouvelles molécules dans les mêmes conditions pour pouvoir comparer les résultats, (ii) définir l'efficacité des molécules testées seules ou en combinaison à regresser le développement des NFc (iii) identifier des éventuels effets secondaires liés au traitement.
Procédures
Administration (1 à 2 x/jour, 5 jours/semaine pendant 2 mois) des molécules par gavage sur animaux NF1-KO. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux et sera réalisé par le personnel expérimenté. Il faut environ 1 min de contention de l'animal pour l'adminstration par gavage. La prélévement de sang se fera au niveau de la queue sur animaux non anesthésiés. La peau du dos des animaux sera photographiée sous une loupe à épifluorescence et sous anesthésie générale (AG). L'AG est de moins de 5min par souris ( rasage, epilation et prise de photos)
Impact sur les animaux
Récemment, deux études similaires ont été réalisées par notre équipe sans pour autant d'observer des effets indésirables pendant et à la fin du traitement. Les NFc ne sont pas douloureux et aucun effet indésirable n'a été observé liée à leur présence sur plus de 500 animaux NF1-KO. L'administration des nouvelles molécules peut provoquer des effets indésirables. Toutefois, les molécules testées dans ce projet ont déjà fait objet des études toxicologiques et ont été, ou sont, testés dans la cadre des études cliniques. Pour définir la gamme des concentrations des molécules nous nous sommes basées sur des données disponibles chez l'homme. Toutefois, en cas de présence d’effets nuisibles, le traitement sera modifié ou suspendu et si l’effet persiste, l’animal sera mis a mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la fin de la procédure 2 & 3. La peau des animaux sera prélevée puis analyser afin d'evaluer l'efficacité des molécules testées.
Remplacement
A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc.
Réduction
Nous avons récemment réalisé une étude similaire d’administration systémique et topique d’un autre inhibiteur, qui a permis d'optimiser le protocole de traitement des souris et d’analyse des résultats. Ce travail nous a également permis de définir le nombre minimum d’animaux à traiter afin de réaliser les analyses décrites dans les procédures 2 et 3 et d’obtenir des résultats statistiquement valides. Enfin, la présence des nombreux neurofibromes dans 100% des animaux mutants cela permet de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Aucune des procédures utilisées pour administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors de précédente étude (1 mois de traitement) nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Le gavage sera effectué par le personnel expérimenté, qui a déjà réalisé ce type de traitements.
Choix des espèces
A notre conaissance, Il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Nous utiliseront les souris NF1-KO males agés d'environ 4 moiscar dans notre modèle les NFc se developpent autour de 4 mois uniquement chez des males.
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie pour l'implantation de métastases hépatiques, puis des injections, des séances d'imagerie et une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que les effets indésirables attendus tiennent à la croissance des tumeurs et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte de la physiologie de l'organisme complet. Le projet vise à valider chez la souris un système de régulation d'un gène par la nutrition avant un éventuel transfert à l'humain.
Objectifs
ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique par la nutrition dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser ce système de régulation génique dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons maintenant valider notre approche de régulation génique par la nutrition dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser ce système de régulation génique par la nutrition dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané d'un analgésique sur animal vigile (10 à 15 min avant la chirurgie). Un agent de contraste sera injectée en intra-péritonéal sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour évaluation de l'expression génique par imagerie optique 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). L'expression génique sera induite par une injection d'un plasmide porteur du gène d'intéret dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile (Procédure 3, 10 min par souris). Un anticorps sera injecté en intra-péritonéal sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation esur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'est attendu concernant les procédures d'injection d'agents de contrastes ou de plasmides ou d'anticorps dans ce modèle. Les effets indérisables potentiels attendus sont liés à la croissance des métastases tumorales. Le suivi quotidien des animaux permettra de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort et/ou de souffrance pour l'animal.
Devenir
Les animaux seront réutilisés pour les procédures 1 à 6. A l'issue de la procédure 7 les animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse à l'isoflurane puis sacrifiés par ponction cardiaque.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro ont permis de tester l'efficacité de notre stratégie. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris. Pour la suite de notre étude, le recours à l'animal est indispensable afin de prendre en compte la physiologie à l'échelle de l'organisme complet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, nous suivrons l'évolution des métastases de façon non invasive par imagerie in vivo.
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
Etude pré-clinique de l’efficacité de la radiothérapie à faible dose associée à l’immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules tumorales, puis une ou deux séances d'irradiation à faible dose sur la tumeur et quatre injections dans l'abdomen, sur neuf jours, d'une immunothérapie anti-PD-L1 ou d'anticorps témoins. 800 souris immunocompétentes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs. Le projet cherche le meilleur schéma d'irradiation à associer à l'immunothérapie, une association qui "pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie" selon le porteur. Parmi les effets indésirables, il ne cite que ceux des injections et de l'irradiation, sans un mot sur la croissance des tumeurs, et annonce un "volume tumoral limite" sans en donner la valeur.
Objectifs
Il y a deux objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie.
Bénéfices attendus
Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.
Procédures
Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total.
Impact sur les animaux
Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grace à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirables de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.
Remplacement
Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.
Réduction
Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 32 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 800 souris au total. 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 800.
Raffinement
Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux seront mises en oeuvre. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapies s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.
Coopération de mutations géniques et de l’inflammation dans le développement de la leucémie myélomonocytaire chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une irradiation destinée à "tuer toutes les cellules de la moelle osseuse", une greffe de moelle porteuse de mutations, puis jusqu'à deux ans de prises de sang toutes les deux semaines, chaque semaine si la maladie s'aggrave : c'est le parcours prévu pour 1 140 des 1 320 souris du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objectif est de reproduire chez elles la leucémie myélomonocytaire chronique, un cancer du sang du sujet âgé, et de tester sur elles un composé chimique. 654 souris reçoivent aussi des injections dans l'abdomen deux fois par semaine pendant un mois pour induire une inflammation chronique. Dans les deux semaines qui suivent la greffe, les souris greffées peuvent souffrir d'infections, d'anémie, d'apathie et de perte de poids, selon le porteur. Il décrit le devenir des 1 140 receveuses, tuées pour prélever leurs organes, et ne dit rien du sort des 180 autres souris de l'effectif, ni de celui des souris donneuses de moelle.
Objectifs
Les leucémies sont des cancers du sang c’est-à-dire qui affectent la production normale des cellules sanguines. Les cellules du sang sont renouvelées quotidiennement à partir de cellules souches qui se trouvent dans la meolle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules sont douées d’auto-renouvèlement et sont donc responsables de la production des toutes les cellules du sang (les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes) tout au long de la vie. Il est donc tout à fait crucial de préserver leurs fonctions. Quand ces fonctions sont altérées, par exemple par exemple par des stress environnementaux (radiations) induisant des changements dans l’expression de certains gènes, cela conduit au développement de leucémies. La leucémie myélomonocytaire chronique est une leucémie caractérisée par l’accumulation de monocytes, un type des globules blancs circulants dans le sang. Cette maladie touche le sujet âgé. Elle est peu fréquente mais grave, avec une survie inférieure à 3 ans. L’âge avancé des patients ne permet pas d’utiliser la greffe de moelle osseuse et il n’existe actuellement aucun traitement curateur. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il n'est pas possible de modéliser les fonctions des cellules souches hématopoïétiques, base du cancer, in vitro. De même, le processus de développement d’une leucémie requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire dans une boite de pétri. Il est donc indispensable de développer des modèles murins mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie pour tester des molécules d’intérêt thérapeutique et en découvrir de nouvelles. Notre projet a pour but de : 1/ Développer des modèles de leucémie myélomonocytaire chronique chez la souris ressemblant au plus près à la maladie humaine et qui s’adapteraient à une étude clinique. Comprendre les mécanismes d’aggravation de la maladie. (2) Etudier le rôle d’une inflammation chronique sur le développement de la leucémie. Au cours de la vie nous subissons de nombreuses infections bactériennes ou virales qui mettent en jeu le système immunitaire et la production de monocytes dans le sang et créent une inflammation chronique. (3) Etudier les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie et analyser les mécanismes de la naissance du cancer pour découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. (4) Tester un composant chimique sur le développement et la guérison de la maladie.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement curatif spécifique de cette leucémie qui reste donc une maladie très sévère, induisant la mort des patients dans les 30 mois après le diagnostic. Il n’existe pas non plus de bons modèles de souris mimant cette pathologie humaine. En développant de tels modèles, notre projet permettra de tester de nouveaux traitements spécifiquement adaptées à cette leucémie incurable et sera à terme très bénéfique pour les patients. Au niveau plus fondamental, notre projet permettra de comprendre comment la maladie survient, quel est le rôle de l’inflammation chronique qui survient avec l’âge sur son développement ou son accélération.
Procédures
Pour étudier le développement de cette leucémie, nous utiliserons la transplantation de moelle osseuse. Les transplantations sont réalisées par injection par voie veineuse, sous anesthésie, de cellules de moelle osseuse de souris donneuses, portant des mutations dans des gènes, dans des souris receveuses préalablement irradiées. L’irradiation a pour but de tuer toutes les cellules de la moelle osseuse et de libérer ainsi de la place pour les cellules transplantées qui vont venir s’y greffer. La prise de greffe est analysée un mois après la transplantation par la présence de cellules donneuses dans le sang des animaux, par une prise de sang à la veine faciale, effectuée sous anesthésie. Nous suivrons ensuite le développement de la maladie au cours du temps, jusqu’à 2 ans, par prise de sang régulières (toutes les deux semaines ou toutes les semaines si la maladie s’aggrave) et analyse des différentes cellules sanguines. Toutes les souris receveuses (1140) seront soumises à ces injections et prélèvements sanguins. Pour induire une inflammation chronique, des injections intra-péritonéales seront réalisées 2 fois par semaine pendant un mois 654 souris seront traitées ainsi. Une anesthésie locale avec de la lidocaïne sera utilisée pour ces injections. Nous envisageons avoir besoin de 1320 animaux pour la totalité du projet.
Impact sur les animaux
Malgré la greffe de d’un nombre important de cellules de moelle qui permet aux cellules du sang de se reformer rapidement après l’irradiation, il se peut que dans les 2 semaines suivant la transplantation, les animaux souffrent : 1/ d’infections opportunistes, les cellules de l’intestin pouvant être aussi étant affectées par l’irradiation. 2/ d’une mauvaise prise de greffe et des difficultés à récupérer un taux normale de cellules dans le sang qui pourrait engendrer une diminution des globules rouges (anémie), fatigue, apathie, perte de poids, et perte de l’alimentation et dégradation de l’état général.
Devenir
Les animaux sont les animaux receveurs de cellules de moelle osseuse lors des transplantations dans nos procédures. Ils seront mis à mort et leurs organes prélevés pour étudier le phénotype et les mécansimes de la maladie.
Remplacement
Il n’est pas possible in vitro d’étudier les fonctions des cellules souches hématopoïétiques qui se trouvent dans la moelle osseuse, les mécanismes de production des cellules du sang et le développement de leucémies in vitro. Le développement de ces maladies requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire in vitro. Enfin, la prolifération in vitro de cellules cancéreuses est limitée et ne reflète pas ce qui se passe dans un individu. Il est donc indispensable de développer des modèles de souris mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie leucémique pour tester et sélectionner de nouvelles thérapies.
Réduction
La maladie évolue avec l’âge donnant des variations importantes d’un animal à l’autre. Pour avoir un pouvoir statistique suffisant nous pourrions être obligés d’étendre l’élevage pour avoir un nombre suffisant d’animaux du même âge au temps de l’expérience. Pour pallier cela (réduction), nous utiliserons la transplantation qui consiste en une greffe de moelle osseuse provenant d’une même souris donneuse à plusieurs souris receveuses qui développeront alors chacune une maladie identique à elle-même. Nous pouvons utiliser moins d’animaux pour tester rapidement plusieurs conditions avec un pouvoir statistique important. Cette approche permet aussi de réduire considérablement les élevages et d’avoir des groupes de souris greffées à traiter du même âge. Nous pouvons greffer 10 souris à partir d’une souris donneuse. Ces modèles de leucémie sont nouveaux. Le rythme de développement de la maladie n’est donc pas encore connu. En conséquence, nous avons calculé le nombre de souris nécessaires par groupe de greffe à 30 en nous fondant sur les données du laboratoire et de la littérature pour des pathologies similaires.
Raffinement
Immédiatement après irradiation, une observation des animaux sera réalisée 2 à 3 fois par semaine, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications directement liées à l’irradiation. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu (coton de nidification, cabanes) sera mis en place dans chaque cage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté et sous anesthésie pour tous les gestes techniques. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites généraux sont établis. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Du DietGel Energy sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et les cancers du sang car elle possède un système hématopoïétique et immunitaire proche de celui de l’Homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées ce qui permet d’effectuer des greffes de moelle osseuse en évitant les problèmes liés au rejet de greffe. Enfin, il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte pour être dotées d’un système immunitaire fonctionnel.
Allergie alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue lors d'un prélèvement terminal, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour provoquer chez elles une allergie alimentaire. Elles sont d'abord sensibilisées à un allergène, "généralement" une fois par semaine pendant plusieurs semaines, puis exposées de nouveau à cet allergène, avec des prises de sang à la veine sous-mandibulaire, sans anesthésie. Le porteur ne nomme ni les allergènes ni la voie d'administration, et décrit "une souffrance plus ou moins intense" dans des procédures "classées de légère à sévère", alors que la totalité de l'effectif est déclarée au niveau sévère. Il revendique un double usage, tester des médicaments contre l'allergie et évaluer l'allergénicité de "nouvelles préparations alimentaires", et affirme que l'effet des médicaments testés sur la réponse allergique des rongeurs est "prédictif de leur efficacité en clinique".
Objectifs
L’allergie alimentaire constitue une préoccupation importante en allergologie du fait de l’augmentation de son incidence au cours des dernières décennies. Les manifestations provoquées par une allergie alimentaire sont nombreuses et surviennent en général quelques secondes à quelques heures après avoir ingéré l'aliment responsable. Elles peuvent provoquer des manifestations modérées et exceptionnellement provoquer des manifestations sévères telles que l’œdème de Quincke ou le choc anaphylactique. La meilleure des solutions pour éviter une allergie alimentaire consiste à supprimer tout contact avec l’allergène. Cette éviction est relativement facile à mettre en œuvre lorsque le produit est peu utilisé dans l'alimentation quotidienne, mais plus difficile quand l'aliment est présent dans de nombreuses préparations, notamment industrielles. A ce jour, aucune thérapie n’a réellement montré son efficacité dans le domaine de l’allergie à l’arachide, contrairement à d’autres types d’allergie, excepté l’administration immédiate d’épinéphrine ou la totale éviction de l’aliment allergisant. Le développement de modèles murins précliniques à des allergènes cliniquement pertinents est donc prometteur pour évaluer non seulement de potentiels traitements pharmacologiques mais également pour tester de nouvelles préparations alimentaires.
Bénéfices attendus
Une allergie alimentaire est une réaction d'hypersensibilité immédiate qui se déroule en deux étapes : une phase de sensibilisation (premier contact de l'organisme avec l'allergène) et une phase de déclenchement (deuxième contact avec le même allergène). L'objectif est double: - mimer l'allergie et rechercher à diminuer la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques - évaluer l’allergénicité de certains aliments/formulations Après sensibilisation pendant plusieurs semaines, les souris subissent un test de provocation avec l’allergène sensibilisant. Les médiateurs de la réaction allergique précoce et tardive sont alors quantifiés. La majorité des signes cliniques observés chez l’homme sont mis en évidence chez la souris : bronchoconstriction, production locale de cytokines impliquées dans la réaction allergique,…
Procédures
Lors de la première phase, les animaux seront sensibilisés (généralement une administration par semaine) puis seront challengés avec l'allergène. Au cours de l'étude, les animaux resteront hébergés en groupe. A différents temps définis par le protocole d'étude, des prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine sub-mandibulaire chez l'animal vigile. En fin d’expérience, tous les prélèvements nécessaires (histologie, prélèvement sang etc…) sont réalisés de façon à pouvoir effectuer l’ensemble des analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de réduire significativement le nombre d’études, d’éviter d’avoir à dupliquer des expériences ou d’inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires. Pour les besoins des études, les animaux peuvent être euthanasiés pour le prélèvement des organes cibles d'intérêt (cerveau, rein, …).
Impact sur les animaux
Lors de l'évaluation de l’allergénicité de certains aliments, il est attendu de voir la potentielle apparition de signes cliniques plus ou moins marqués. L’anticipation de ces effets sert à écarter des aliments pouvant provoquer de sévères réactions. Quand on cherche à moduler la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner les effets secondaires ou l’efficacité des substances testées, les doses ayant induit ces effets et la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’homme. Selon la durée et la fréquence de ces événements, ces procédures engendrent une souffrance plus ou moins intense et sont donc classées de légère à sévère. Un effectif minimum de 10 souris est inclus dans les expériences pour mettre en évidence un effet suffisamment robuste. Il est donc difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure.
Devenir
Pour les 2 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux sont soumis à un prélèvement terminal et sont donc euthanasiés.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction allergique.
Réduction
Dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement allergisants, la stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant l'allergène à un groupe contrôle non-sensibilisé, l'objectif étant de réduire la réaction allergique induite par l'allergisant. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle non sensibilisé. Cherchant à réverser/diminuer la réaction allergique, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à une autre, 10 souris minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la réponse allergique des rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.
Etude de l’impact d’une séparation maternelle néonatale sur les propriétés électrophysiologiques des neurones relais du système nociceptif spinal et supraspinal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment une séparation précoce d'avec la mère, présentée comme un reflet de la prématurité humaine, modifie la perception de la douleur, 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus nerveux. La moitié des ratons est retirée de la cage maternelle trois heures par jour, du deuxième au douzième jour de vie, sous une lampe chauffante. Le porteur parle d'"épisodes de stress non douloureux", tout en décrivant chez les rats séparés une anxiété chronique et, d'après des travaux antérieurs, des "hypersensibilités douloureuses". Chaque mère est tuée après le sevrage, sans retour à l'élevage, parce que selon le porteur la séparation "altère le fonctionnement de son système nerveux" et accroît son anxiété.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.
Procédures
La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.
Impact sur les animaux
La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.
Devenir
Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.
Réduction
Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.
Raffinement
Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent
Effet de la température sur la réponse dépendante des anticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Sous anesthésie, les souris reçoivent une sonde thermique dans le ventre, puis une partie est vaccinée et portée pendant deux jours à 2 ou 3 °C au-dessus de sa température par un champ magnétique, avec une prise de sang chaque semaine sans anesthésie. D'autres se voient implanter sous la peau du flanc un objet métallique d'un centimètre de côté, que le champ chauffe trois heures dix jours plus tard. 880 souris adultes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Il s'agit de mesurer l'effet d'une fièvre ou d'une inflammation locale sur la production d'anticorps, une piste qui "pourrait" selon le porteur servir un jour à renforcer la vaccination. Il justifie le choix de l'espèce par un système immunitaire "proche de l'homme" et par une espèce qui "régule la température comme l'homme".
Objectifs
La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.
Bénéfices attendus
Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.
Procédures
Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.
Impact sur les animaux
L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.
Remplacement
Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.
Réduction
Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.
Choix des espèces
La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),