Rongeurs

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un écrasement chirurgical du nerf sciatique pour dénerver une patte, puis reçoivent un dérivé de cannabinoïde ou un placebo, avant mise à mort à 2 ou 21 jours pour prélever muscles et nerfs. Le porteur indique un risque faible d'automutilation des extrémités dénervées, entraînant la mise à mort en cas d'atteinte. Il affirme que les connaissances actuelles ne permettent aucune simulation in vitro ou in silico de ces processus.

Objectifs

Avec ce projet, nous voulons comprendre le mécanisme par lequel les cannabinoïdes (molécules dérivées du cannabis) régulent la (ré)génération nerveuse, et leurs implications potentielles dans les maladies neurodégénératives. Pour ce faire, nous procéderons à un écrasement chirurgical du nerf sciatique chez des souris, afin de supprimer transitoirement l’innervation d’une patte, ce qui que nous permetra d’étudier par la suite les effets des cannabinoïdes sur la dé/ré-generation nerveuse.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra amener au développment d’outils thérapeutiques visant les processus de dégénération des nerfs périphériques, qui manquent cruellement pour traiter un certain nombre de maladies neuro-dégénratives (telles que la sclérose latérale amyotrophique).

Procédures

Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées, dont le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 », est absent chez la moitié des individus. Ces souris subiront une dénervation complète et transitoire d’un membre inférieur par écrasement du nerf sciatique. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement morphinique pour prévenir la douleur. L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,1 mg/kg) sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Par la suite, un groupe de souris sera traité avec un analogue des cannabinoïdes tandis que l’autre recevra un traitement placebo, par injection quotidienne dans l’abdomen. Cette intervention aura une durée de 2 jours ou 21 jours comme expliqué apres. En fait la moitié des souris sera mise à mort après seulement 2 jours de traitement, pour l’analyse post-mortem de la dégénération nerveuse. L’autre moitié sera mise à mort après 21 jours de traitement, pour analyser cette fois-ci la régénération nerveuse.

Impact sur les animaux

La procédure de dénervation complète transitoire d’un membre inférieur par écrasement contrôlé du nerf sciatique offre un modèle fiable de dégénération/régénération nerveuse et sourtout sans impacts dramatiques sur l’état générale de l’animal, son comportement moteur et alimentaire ou presence de douleur chronique, car la procédure sera effectué de façon aigüe et unilaterale. Il n’y a pas de risque majeur de saignement lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traité par une anesthésie majeure et des analgesiques (voir procédure). La douleur est normalment associée à l’acte opératoire mais il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération et durant la régénération. Neanmoins, il peut y avoir des points limites bien décrit dans la procédure. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie et autotraumatisme des extremités suite à la dénervation est très faible et la mortalité lié à la procedure de dénervation est reportée aux alentours de 1% dans les publications sur le sujet. Ainsi, un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique e.g. cicajet et anti-inflammatoire systemique e.g. Metacam 5mg/kg I.P.) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal (automutilation), l’animal sera mis a mort.

Devenir

Les souris sont mises à mort par dislocation cervicale 2 jours ou 21 jours apres la procedure chirurgical/injections pour prelevement post-mortem des muscles et nerf sciatiques. Ce type de mise a mort est l’unique compatible avec les analyse hystologique at d’expression des proteines que seront effectué sur les echantillons.

Remplacement

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant le système nerveux est encore trop limitée pour permettre la conception de simulations numériques ou de modèles in vitro pour modéliser fidèlement les processus de dégénération et régénération nerveuse. De plus, l’usage d’invertébrés, qui ont un système nerveux complètement différent du nôtre, serait ici inapproprié. Dans ce contexte il demeure donc nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale sur des vertébrés.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 12 animaux par groupe expérimental, c'est-à-dire le nombre minimal d’animaux permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine. Cela représente au total 288 souris, sur les 2 années que dure ce projet. Les nombres prévus permettront de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, avec un milieu enrichi (matériel de nidification), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des soins soient immédiatement prodigués si nécessaire (désinfection, anti-douleurs, etc.). La mise en place de points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux et peut conduire à la mise à mort d’un animal afin d’éviter toute souffrance prolongée qui ne saurait être soulagée.

Choix des espèces

La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur aux cannabinoïdes de type 1, « CB1 »), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont parfaitement adaptées à l’étude des rongeurs. Les souris seront âgées de 8-12 semaines (âge adulte). En effet, les protocoles que nous avons établis nécessitent des souris adultes, pour éviter la variabilité associée aux différences de développement. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain. Les protocoles que nous avons établis seront utilisés sur des souris mâles pour éviter la variabilité associée au cycle menstruel des femelles, qui a un impact sur les niveaux d’expression du récepteur CB1. Cela nous permettra également de comparer les résultats obtenus avec ceux d'autres études déjà effectuées dans notre équipe.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intraveineuses de traceurs radioactifs sous anesthésie, suivies d'imagerie et d'un prélèvement sanguin terminal, pour tester des peptides de ciblage du cancer de la prostate. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grâce à l'imagerie non invasive. Il indique recourir à des cultures cellulaires tant que possible et réserver la souris aux expériences in vivo.

Objectifs

Les tumeurs peuvent co-exprimer différents récepteurs, cibles de nouvelles stratégies de détection et traitements tumoral. Des peptides à deux parties distinctes peuvent se lier à ces différents récepteurs et présenter des avantages (meilleure affinité, rester plus longtemps sur la tumeur, augmenter les chances de visualiser le tissu malade indépendamment du stade de la maladie) par rapport à des peptides simples. Ainsi ce projet vise à étudier les propriétés de ciblage tumoral de ces nouveaux peptides, marqués par de la radioactivité, pour leur utilisation en imagerie et thérapie nucléaires.

Bénéfices attendus

Un peptide à deux parties, ciblant à la fois le récepteur de la gastrine (GRPR) et le récepteur membranaire spécifique de la prostate (PSMA) pourrait permettre de détecter puis de traiter une très large gamme de profils d'expression du cancer de la prostate (y compris les tumeurs PSMA négatives ou GRPR négatives) quel que soit le stade de développement de la maladie.

Procédures

Les animaux du projet seront soumis à différents actes, en premier lieu acte 1 des greffes de cellules tumorales au niveau sous cutanée réalisées sous anesthésie qui vont permettre une croissance tumorale pendant 7 à 8 semaines au cours desquelles tous les animaux recevront sous anesthésie des injections intraveineuses de radiotraceurs qui permettront un suivi des tumeurs par imagerie non invasive TEP/TDM et enfin suite à la dernière imagerie un prélèvement sanguin sous anesthésie sera réalisé suivi d'une euthanasie par une méthode réglementaire. L'acte 2 s'étalera au maximum sur 3 semaines. L'acte 3 aura lieu environ entre 7 et 8 semaines après l'acte 1 de greffe tumorale soit lorsque les souris auront entre 12 et 14 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir d'effets indésirables attendus sur les animaux. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour des prélèvements post mortem.

Remplacement

Des cellules de cancer de la prostate en culture seront utilisées tant que les expériences le permettent et le modèle de souris de xénogreffe tumorale pour les expériences nécessaires in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux, 160 au total, sera limité au maximum par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Le nombre d'animaux a également été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive pour suivre des modèles in vivo uniques parfaitement décris dans la littérature (modèle de greffe sous-cutanée de cancer de la prostate).

Raffinement

Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maison de type igloo en plastique) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Pour chaque procédure, des points limites ont été fixés et des méthodes prévues (anesthésie) pour éviter toute souffrance ou douleur aux animaux, qui resteront sous surveillance tout au long du projet.

Choix des espèces

Des souris immunodéprimées sont utilisées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le testicule sous anesthésie pour inactiver un gène, suivie d'un prélèvement sanguin puis de tests comportementaux (exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et des partenaires sexuels), avant mise à mort pour prélever les testicules. Le porteur décrit une opération simple et peu invasive, avec analgésie sur 48 heures. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro le fonctionnement testiculaire et juge la souris "indispensable".

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse de testostérone et la reproduction chez les mammifères est indispensable tant du point de vue de la recherche fondamentale que pour les avancées évolutives et médicales qu’elle pourrait permettre. L’un de ces aspects est la régulation génétique de la synthèse de testostérone. Ce projet repose sur l’inhibition expérimentale de l’expression d’un gène régulateur de l’expression génique dans le testicule adulte, chez la souris, pour en comprendre la fonction. Les effets de ce gène sur la synthèse de testostérone embryonnaire étant connus, il est vraisemblable qu'il régule également la synthèse de la testostérone chez l’adulte. Cette régulation de l’expression génique repose sur une lignée de souris transgénique chez laquelle l’injection d’un vecteur permet l’invalidation locale du gène ciblé. Ce vecteur sera administré sous anesthésie générale couplée à des antalgiques dans les testicules adultes. Les conséquences de la réduction de l’expression du gène cible seront mesurées sur la synthèse de testostérone, le comportement reproducteur et l’anatomie des cellules testiculaires.

Bénéfices attendus

Ces connaissances permettront une meilleure compréhension des régulations du fonctionnement testiculaire, y compris ses dysfonctionnements. Les connaissances nouvelles que nous produirons, outre des avancées dans la compréhension du fonctionnement testiculaire physiologique, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour agir sur des déficits de synthèse de testostérone et améliorer la fertilité humaine et animale.

Procédures

Ce projet comporte deux procédures de classe modérée qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt dans le testicule. Cette invalidation nécessite l'injection d'un vecteur dans le testicule de souris adulte. Nous étudierons l’impact de cette absence génique sur la production d’hormone et le comportement reproducteur. Ainsi, une injection de 5 minutes sera effectuée au cours d'une anesthésie de 20 minutes, . Après une période de récupération de 2 semaines, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Lors de la procédure 2, 3 semaines après injection, les mâles seront inclus dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels : exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et mise en contact avec des partenaires sexuels pour corréler les expériences réalisées avec le phénotype des animaux.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur l'injection intratesticulaire d'un vecteur. L’injection nécessaire pour contrôler l’expression de notre gène d’intérêt sera réalisée sous anesthésie avec un contrôle analgésique multimodal pendant 48H assurant une absence de douleur. Cette opération est simple, rapide et peu invasive, ce qui permettra un rétablissement très rapide. Pendant cette période, pour permettre un Raffinement expérimental optimal, les animaux auront accès à une alimentation hydratée à leur hauteur, leur permettant de se nourrir sans effort. Ils seront surveillés quotidiennement pendant leur rétablissement et leur bien être évalué selon une grille de scoring multicritères (posture, alimentation, masse, état du pelage, déplacements). Si les animaux présentaient des signes de douleur persistante, l’expérience serait interrompue et le protocole révisé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs testicules prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.

Remplacement

La maturation et le fonctionnement testiculaires (stéroïdogenèse et spermatogenèse) sont des processus intégrés et complexes. Il est impossible de les modéliser ou de les simuler intégralement in vitro. L’utilisation d’animaux est indispensable pour aborder ces questions.

Réduction

Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure utilise des contrôles internes, ce qui évite de faire deux groupes distincts. La seconde procédure s'appuiera sur les résultats de la première pour permettre une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure. Enfin chaque prélèvement sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure.

Choix des espèces

Ce projet propose d'étudier le rôle de l'expression génique dans les fonctions endocrines et exocrines du testicule. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. -L'organisation du testicule est différente d'un clade à l'autre. Cette étude doit donc être réalisée sur une espèce mammifère, pour que les observations soient transposables à l'ensemble des mammifères, y compris l'homme. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale et d’observation de la fertilité ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons sont validés par de nombreuses publications. Les souris seront étudiées à l’âge adulte, entre 2 et 4 mois, l’âge requis pour avoir pleinement développé un comportement adulte.

6 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une semaine d'habituation, ils reçoivent des composés par voie orale puis subissent des prélèvements sanguins rapprochés jusqu'à 24 heures par la veine caudale, avant euthanasie au pentobarbital. L'étude, commanditée par une société cliente, vise à caractériser deux candidats médicaments anti-obésité avant essais cliniques. Le porteur indique que la répétition des prélèvements est source de stress et d'angoisse, et justifie le choix du rat par un volume sanguin supérieur à celui de la souris.

Objectifs

Le projet vise à étudier deux composés en développement chez le rat sain. L'objectif est de sécuriser le développement de composés d'intérêt thérapeutique avant leur passage sur l'animal pathologique et avant le stade d'études cliniques. Cette étude est commanditée par une de nos sociétés clientes, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser les paramètres pharmacocinétiques des composés en développement. Ainsi, les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination seront déterminés. Il s'agit ici de sécuriser le développement d'un candidat médicament anti-obésité, notamment en priorisant les composés les plus prometteurs avant passage aux études d'efficacité et aux études clinique. Les données obtenues permettront également de définir les doses a utiliser dans la suite des études.

Procédures

Pendant 7 jours (de D-7 à D-1), les animaux seront soumis à des administrations du véhicule (composé de référence) per os quotidiennement dans le but de les habituer à ce type d'administration. A D1, des prélèvements sanguins de 150µL par la veine caudale seront effectuées avant l'administration per os puis à 15min, 30min, 1h, 3h1 8h et 24h après.

Impact sur les animaux

La répétition rapprochée de certains prélèvements sanguins sera la source de stress et d'angoisse de l'animal même si l'animal aura été préalablement habitué au tube de contention. Aucune nuisance n'est attendu sur l'administration des composés et les animaux ayant subi une phase d'habituation seront donc acclimatés à l'administration par voie orale et au tube de contention pour prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection intraperitonéale de solution de pentobarbital (Euthasol, 250mg/kg)

Remplacement

L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques se justifie ici car pour étudier l'effet de l'organisme sur le composé à visée thérapeutique, il est nécessaire d'utiliser un modèle vivant. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de déterminer ce que l'organisme fait au médicament et donc les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ainsi, le nombre d'animaux utilisé a donc été réduit en comparaison avec la souris.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les phases d'acclimatation (de D-12 à D-8) et d'habituation (de D-7 à D-1) permettent d'éviter tout angoisse de l'animal pendant la phase d'expérimentation. Les rats seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes. Les expérimentateurs en charge des administrations orales et des prélèvements sanguins sont rodés à ce type de pratique.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ce modèle a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés sont de jeunes rats adultes (201-225g à réception correspond environ 7-8 semaines). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte.

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous la peau une greffe de fragment de tumeur prélevé chez un patient, puis des traitements par voie orale ou sous-cutanée, la tumeur pouvant provoquer de la souffrance. Le porteur teste de nouveaux traitements de lymphomes T avant un éventuel passage à l'humain et affirme que les lignées cellulaires ont un "intérêt très limité". Sa rubrique sur le raffinement se réduit à l'annonce de points limites et d'une grille de surveillance.

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux traitements des lymphomes chez la souris, avant un éventuel passage à l’Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de sélectionner les traitements les plus efficaces (seuls ou en association) et les mieux tolérés chez la souris, puis de mettre en place un essai clinique chez l’Homme afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité de ces nouveaux traitements.

Procédures

1) Greffe d'un fragment d'une tumeur humaine primaire, qui sera placée sous la peau des souris après courte incision sous anesthésie générale. 2) Administration des traitements : les souris recevront différents traitements, seuls ou en combinaison, par voie orale ou sous-cutanée. Au total, il y aura 4 expériences pour la procédure 1 et 3 pour la procédure 2. Chaque expérience durera 3 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est lié au développement de la tumeur sous-cutanée, qui peut induire de la souffrance. Nous serons donc très attentifs au bien-être des animaux. Afin de ne pas causer de souffrance, la mise à mort sera pratiquée lorsque le volume de la tumeur atteindra un certain volume ou en cas de signes cliniques. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi clinique minimal 2 fois/semaine sera mis en place afin de surveiller l’apparition de signes de souffrance. Le cas échéant, l’animal sera mis à mort. De cette manière, la souffrance liée au développement de la maladie sera réduite au minimum.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les cellules tumorales des patients sont fragiles et ne peuvent être utilisées au laboratoire pour évaluer de nouveaux traitements. L’utilisation de lignées cellulaires de lymphomes a un intérêt très limité, car les cellules sont différentes des cellules tumorales des patients. Pour être au plus proche de la pathologie humaine, nous greffons directement un fragment de tumeur de patient sous la peau des souris. Ce modèle est difficile à mettre au point et très précieux. Il permet d’évaluer de nouveaux traitements chez les souris, avant leur évaluation chez l’Homme.

Réduction

Ce projet nécessitera 630 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum, après estimation des effectifs, afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement significatifs et cliniquement pertinents, à l’aide de simulations informatiques (invivostat).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux et avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale.

Choix des espèces

Les souris sont très utilisées dans la recherche en général, et spécifiquement dans la recherche contre le cancer. De nombreux modèles ont été développés, proches de la pathologie humaine, permettant d’évaluer de nouveaux traitements contre le cancer. Cela permet aussi de comprendre les mécanismes d’action de ces traitements, et de pouvoir les améliorer pour les rendre plus efficaces et mieux tolérés.