Rongeurs
Etude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements autistiques et épileptiques de souris déficientes en canaux sodiques Nav1.2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.
Remplacement
Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.
Choix des espèces
Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.
Evaluation des effets des champs électromagnétiques sur la thermorégulation selon les conditions d’expositions à différents âges chez des rats mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
432 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés à un champ électromagnétique de type 5G deux heures par jour pendant une à trois semaines, avec des mesures non invasives de température de la queue et de prise alimentaire, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur cherche des effets sur la thermorégulation à différents âges et déclare n'avoir observé aucun effet indésirable notable lors d'expositions antérieures. Les retombées annoncées, revoir la législation ou "rassurer la population", restent conditionnelles et lointaines.
Objectifs
Depuis novembre 2020, les opérateurs ont l’autorisation d’émettre des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G. Pour cela, en France, 3 bandes réparties entre les 4 opérateurs en 2020 pourront être utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G : 700 MHz et 2,1 GHz, auxquelles viendra s’ajouter la bande de 3,5 GHz. Au 1er novembre 2020, 54 000 sites d’émission contenant parfois plusieurs antennes étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment au regard de la jeune population, qui pourrait présenter une vulnérabilité plus grande aux CEM en raison de la taille, l’immaturité tant cérébrale, que métabolique, endocrinienne ou immunitaire des enfants. Cette vulnérabilité anatomique conduit à ce que les ondes pénètrent plus profondément dans l’organisme d’un enfant que dans celui d’un adulte, majorant ainsi l’exposition. Il est donc important de rechercher si les expositions pourraient produire des effets susceptibles de se répercuter (voire s’accentuer) à l’âge adulte. Dans ce contexte, nous voulons tester si une exposition de type 5G induit des modifications physiologiques. Pour cela, nous étudierons les fonctions physiologiques pour lesquelles nous avons observé des modifications lors d’exposition à 900 MHz : la température cutanée de la queue et la prise alimentaire. Ainsi, dans ces précédents travaux, après 5 semaines d’exposition aux CEM de 900 MHz, les animaux présentaient une vasoconstriction périphérique et une prise alimentaire augmentée qui sont des réponses typiques au froid. Afin d’étudier les effets d’une exposition de type 5G à une intensité de 1,5 V/m (intensité estimée sur les bases des données d’exposition 4G), nous analyserons ces 2 fonctions physiologiques lors d’une exposition à 3,5 GHz en les comparant avec les résultats issus d’un groupe non exposé (groupe contrôle) et d’un groupe exposé à 900 MHz (groupe contrôle positif) lors de différentes durées d’exposition (d’une à trois semaines), à différents âges (3, 8 et 13 semaines) chez des animaux mâles et femelles. Au maximum, 432 animaux seront étudiés, répartis dans 54 groupes constitués de 8 animaux chacun.
Bénéfices attendus
Une précédente étude menée au laboratoire PériTox avait été une des premières études françaises à montrer des effets des CEM de faible intensité sur la régulation thermique. Cette étude avait été citée dans les rapports « Radiofréquences et santé » (ANSES, 2013) et « Radio Frequency fields: Environmental Health Criteria Monograph » (OMS, 2015). Pour ce projet à court terme, nous souhaitons développer la même stratégie en communiquant les résultats à une très large échelle auprès de la communauté scientifique (congrès scientifiques nationaux et internationaux, publication dans des revues scientifiques généralistes) et d’agences mandatées par l’Etat pour réaliser des expertises sur les avancées récentes des travaux sur les effets des CEM. A long terme, si des effets sont observés, nous espérons qu’ils permettront de revoir la législation et d’abaisser les valeurs limites d’exposition de la population. Au contraire, si aucun effet n’est observé, les résultats pourront rassurer la population et notamment les différents collectifs et associations des personnes hypersensibles aux champs électromagnétiques.
Procédures
Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 1, 2 ou 3 semaines selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Il n'y aura donc aucune procédure chirurgicale. Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Dans le passé, nous avons exposé des rats à 900 MHz pendant 5 semaines afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.
Remplacement
La fonction étudiée dans ce projet est la thermorégulation. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique. De plus, cette fonction est en étroite relation avec d’autres fonctions physiologiques (sommeil, fonction cardiovasculaire). Ces interactions ne peuvent être étudiées qu’à l’aide d’un modèle in vivo car il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro capables de modéliser ces interactions.
Réduction
Le nombre de groupes se justifie afin d’étudier un maximum de paramètres pouvant influer sur les effets observés. Nous nous limitons à étudier 8 animaux par groupe. Ce nombre se justifie par de précédentes études menées dans le laboratoire : 4 animaux permettent d’observer une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 8 animaux nous nous assurons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel Statview. La normalité de la distribution des données sera vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données suivent la loi normale, des tests paramétriques seront réalisés. L’analyse de variance (ANOVA) sera utilisée pour tester les effets des différents paramètres (âge, sexe, fréquence et durée d’exposition). Les différences entre les séries expérimentales seront également testées afin de s’assurer que tous les animaux d’un même groupe ont des réponses uniformes. Lorsque la valeur de F sera significative, un test de Fischer sera appliqué. S’il existe des interactions entre plusieurs facteurs, un test t des Student sera réalisé. Le seuil de significativité sera fixé à 0,05.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des systèmes neurophysiologiques (comme le sommeil) qui sont particulièrement bien référencés dans la littérature (Revel et al., 2009). - l’hébergement dans les chambres climatiques au sein du laboratoire sont adaptés depuis plusieurs années pour cette espèce. L’exposition sera évaluée chez des animaux ayant 3 âges différents. La population juvénile étant potentiellement plus sensible aux CEM, des animaux âgés de 3 semaines seront étudiés, âge minimum d’animaux sevrés. Afin d’évaluer les effets sur une population adolescente, des animaux âgés de 8 semaines seront étudiés, âge de la maturation sexuelle. Enfin des animaux adultes âgés de 13 semaines seront étudiés afin d’évaluer si les effets observés disparaissent à l’âge adulte.
Evaluation de l’efficacité de probiotiques dans l’infection au SARS-CoV2 chez le hamster
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
160 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou orale, gavés chaque jour avec des probiotiques, et subissent une perte de poids progressive avant un prélèvement sanguin intracardiaque terminal sous anesthésie et une autopsie. Le porteur teste l'efficacité de bifidobactéries contre l'infection et présente le hamster doré comme un "modèle de choix" par sa sensibilité au virus. La perte de poids attendue reste sous le seuil de 15 % fixé comme point limite.
Objectifs
L’intestin héberge naturellement des milliards de microorganismes, constituant le microbiote intestinal. Outre sa fonction dans la digestion, le microbiote exerce un rôle important dans la protection de l’organisme contre les pathogènes. Lorsque le microbiote intestinal est perturbé dans sa composition et/ou son fonctionnement, on parle de dysbiose. La dysbiose peut être due à un traitement antibiotique par exemple mais aussi liée à une pathologie. Chez certains patients atteints de la Covid-19, outre les symptômes classiquement observés, on peut constater parfois un tel déséquilibre de la biodiversité de la flore intestinale, associé à des symptômes gastro-intestinaux incluant des diarrhées. Par ailleurs, les analyses des selles de ces patients démontrent que le virus SARS-CoV2 peut survivre dans le tractus gastro-intestinal suggérant ainsi que ce dernier peut constituer un site extra-pulmonaire pour la multiplication et l’activité virale. De plus, le récepteur utilisé par le SARS-CoV2 pour infecter les cellules de l’hôte (fortement exprimé dans les cellules pulmonaires) est aussi présent dans les cellules épithéliales du tractus GI et joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’inflammation intestinale et l'équilibre microbien. L’apport de probiotiques pourrait constituer une approche de traitement à 2 niveaux : 1/En exerçant un blocage du processus de fusion du virus aux cellules de l’hôte 2/en exerçant une activité de modulation des molécules de l'immunité. Le présent projet se propose d’évaluer l’efficacité de bifidobactéries sur l’infection à SARS-CoV2 chez le hamster doré. Deux probiotiques candidats (bifidobactéries) ont été retenus pour l'essai d'efficacité in-vivo.
Bénéfices attendus
Une activité immunomodulatrice des bifidobactéries associée à une activité de perturbation de la mutiplication du SARS-CoV2 permettraient de limiter l'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Le bénéfice attendu est donc l'apport de la preuve que les bifidobactéries peuvent constituer un potentiel traitement contre l'infection au SARS-CoV2.
Procédures
Les hamsters vigiles seront traités par gavage oral quotidien (sonde) avec un volume de 200µL, soit 11 ou 13 gavages (durée = 2/3 secondes/gavage) selon les groupes Les hamsters de la procédure 1 seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40µl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Les hamsters de la procédure 2 seront infectés une seule fois par voie orale (200µl - animaux vigiles - 2/3 secondes environ) Les hamsters seront manipulés quotidiennement pour une pesée (11 à 14 pesées selon les groupes - durée = 10 secondes) Les hamsters seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie (prooédure terminale de 15 minutes au total)
Impact sur les animaux
Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. La perte de poids prend généralement fin à J+6 et n'excède pas 15% du poids constaté le jour de l'infection.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier différents paramètres de l'infection.
Remplacement
Des experimentations préliminaires in-vitro ont été réalisées en amont du projet afin de sélectionner les souches candidates et de valider leur activité anti-protéase et immunomodulatrice. Néanmoins, l'évaluation de l'efficacité des traitements par probiotique (évalution de multiplication virale, la distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 16 afin d'avoir 8 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) afin d'obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.
Raffinement
Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.
Choix des espèces
Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.
Le métabolome sanguin, une nouvelle piste pour contrer les troubles psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
810 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 660 tuées pour prélever leurs organes et 150 autres réutilisées ou tuées selon les besoins. Les souris subissent un protocole de défaite sociale de dix jours qui provoque des comportements de type anxieux, puis des tests comportementaux évaluant mémoire et émotions. Le porteur emploie des mâles "agresseurs" d'une seconde lignée pour infliger ce stress et affirme que le modèle murin est "nécessaire" pour tester des métabolites sanguins. La perfusion intracardiaque finale se fait sous anesthésie profonde.
Objectifs
Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet est basé sur des découvertes récentes de l’implication de la communication entre les organes périphériques (intestin, microbiote intestinal, foie notamment) et le cerveau dans les maladies neurologiques et psychiatriques. Il va donc permettre de venir étayer ces nouveaux concepts en testant directement comment des molécules produites par les organes périphériques peuvent contrer la neuroinflammation et les troubles comportementaux. Ce projet va donc servir de base pour d’autres études visant à intervenir non plus uniquement sur le cerveau mais aussi sur le fonctionnement d’autres organes pour améliorer la santé mentale. Comme décrit en 3.3.2.1 (objectifs du projet) cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque de liquide physiologique ou de fixateur après anesthésie profonde (sans réveil).Les souris C57Bl6/j vont par ailleurs subir un protocole de stress validé d'une durée de 10 jours. Par ailleurs, ces souris seront amenées à réaliser des tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités mnésiques et émotionnelles. Ces tests sont d'une durée de 5 à 15 minutes au maximum. Chaque souris sera soumise à 5 tests espacés d'au moins 4 jours.
Impact sur les animaux
De par sa nature et son objectif le protocole de stress de défaite sociale que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les souris seront de toute façon suivi comme suit : Les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Les évaluations objectives de douleur après chaque session de défaite sociale sont effectuées systématiquement afin de déterminer si les animaux ont besoin d'analgésiques.
Devenir
L’ensemble des 660 souris mâles adultes C57Bl6/j ayant participé au procédure de défaite sociale ou de test d’acceptabilité seront mise à mort afin de prélever et étudier différents organes (cerveau, foie, rein, intestin…) Les 150 souris mâles adultes Swiss CD1 (procédure 2) seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible.
Remplacement
La sélection des métabolites à tester a été drastiquement réduite par un travail in silico visant à ne sélectionner que les métabolites avec une haute probabilité d’action cérébrale. Par exemple, la présence de récepteurs au niveau cérébral et l’implication des molécules dans des voies de signalisation / métaboliques impliquées dans les troubles psychiatriques et neuroinflammatoires étaient des pré-requis à la sélection des molécules. L’objectif du projet étant de tester les effets comportementaux de ces molécules dans le contexte des maladies psychiatriques il est nécessaire d’utiliser un modèle murin.
Réduction
Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 810 Mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse. L’étude d’acceptabilité aura pour objectif d’éliminer toute dose ayant des négatifs ou toxiques sur l’animal. Par ailleurs deux doses seront utilisées en commencant par la plus faible, si celle-ci a un effet alors la dose plus élevée ne sera pas testée. Cette approche permettra donc de supprimer des expériences inutiles et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris Swiss CD1 agresseurs seront employées durant plusieurs sessions consécutives de défaites sociales. A la fin des deux protocoles successifs, les CD1 seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'elles n'auront pas reçu de traitements particuliers. Elles ne seront mises à mort que si nul n'en a l'utilité.
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (carré de coton ou maison en carton). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg) si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites en dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. L’étude d’acceptabilité aura aussi pour objectif d’éliminer des métabolites ou des dosages qui pourraient entrainer un inconfort chez l’animal. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études de défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée, de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 8 semaines et auront donc 3 semaines d’acclimatation avant de démarrer les protocoles de défaite social. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte.Les expériences de comportement démarreront sur des animaux agés de 12 semaines et plus. L’âge de 12 semaines est utilisé car la maturation cérébrale y est terminée. Cela permet de diminuer la variabilité qui pourrait être observée en utilisant des animaux plus jeunes. Par ailleurs, l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été mise au point sur des animaux de cet âge-là. Ce choix permet donc d’assurer une reproductibilité des procédures, de diminuer la variabilité inter-individuelle et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaire.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 80
780 rongeurs, 700 souris et 80 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués à l'issue et dix-huit réutilisés pour d'autres entraînements. Des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections et aux prélèvements sur animaux vigiles, puis à la mise à mort par dislocation cervicale sur animaux anesthésiés. Le porteur indique qu'aucune limite n'est fixée au nombre de tentatives de gestes techniques par stagiaire, l'animal n'étant remplacé qu'en cas d'agitation. Il décrit cette mise à mort comme un apprentissage à "but pédagogique" et juge le recours aux animaux vivants "indispensable".
Objectifs
● Répondre à des besoins de formation sur l’expérimentation animale. De nombreuses entreprises privées ou institutions publiques nécessitent que leurs personnels soient formés à l’application ou à la conception de procédures/projets pour l’expérimentation animale pour être conforme à la réglementation en vigueur. Cette formation permet de répondre en partie à la demande locale e peut être réalisée dans le cadre de formation initiale ou continue. ● Pédagogique : de nombreux étudiants /doctorants de science, pharmacie ou médecine – de notre université - étudient dans le cadre de leur formation initiale les bases de l’expérimentation animale. Cette formation complémentaire s’inscrit dans la continuité de leur formation initiale et leur permet d’approfondir et valider leurs connaissances théoriques vis-à-vis de l’expérimentation animale. ● Scientifique : Proposer une formation qui permettra aux stagiaires de saisir les enjeux de l’expérimentation animale et de ces limites. Les travaux pratiques répondent à l'ensemble de ces trois points. Ils permettent d’apporter une réelle plus-value à la formation ainsi qu'aux stagiaires. Le stagiaire peut ainsi se familiariser avec les animaux tout en étant encadrer par des intervenants « experts » en expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Les stagiaires à la suite de cette formation réglementaire, scientifique et pratique possèdent l’ensemble des pré-requis indispensables à l’application et/ou à la conception des procédures/projets en expérimentation animale. Cela se traduit in fine par des connaissances robustes sur la réglementation française liée à l’expérimentation animale ainsi que les aspects éthiques et scientifiques. La simulation APAFIS permet aux stagiaires d’acquérir des connaissances et expériences suffisantes afin de procéder à l’élaboration et écriture de leur propre formulaire. Les travaux pratiques quant à eux s’inscrivent dans la lignée de ces cours théoriques. La mise en situation est indispensable pour appliquer les aspects théoriques enseignés. Ces TPs sont suffisamment étoffés pour enseigner les techniques d’administration, de prélèvement et de mise à mort les plus couramment utilisés et sont parfaitement adaptés pour rappeler les notions théoriques (réglementation – 3R – points limites…). Ces TPs sont basés sur une démonstration puis l’application des gestes les plus fréquemment rencontrés lors de la manipulation des rongeurs. Sur les précédentes sessions, l’évaluation par les stagiaires nous a confortés sur les bénéfices de notre formation et notamment sur l'importance de préserver des séances de mise en pratiques.
Procédures
Lors des enseignements, les animaux (souris et rats) seront soumis à de la manipulation et contention par les encadrants et stagiaire (30 minutes). Cela n'engendre pas de douleurs physiques aux animaux. Aucune limite n'est fixée sur ces gestes. Cependant, en cas de stress des animaux (agressivité ou prostration), ils seront remplacés. Des injections et prélèvements sur animaux vigiles (30 minutes-1 heure) sont également prévues dans le cadre de ces enseignements. Lors de la démonstration, deux injections et un prélèvement peuvent être réalisés au maximum chez la souris. Les voies d'administration étudiées chez la souris vigile sont : la voie orale - gavage, l'injection intraveineuse caudale, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée. Les voies de prélèvement enseignées sont : la voie caudale et la voie mandibulaire. Seule la voie intrapéritonéale est enseignée sur le rat. Aucune limite de tentatives de geste technique est fixée pour le stagiaire sur souris vigile. Cependant, les volumes injectés et prélevés resteront en adéquation avec les limites d'usage. En cas d'agitation, l'animal sera remplacé. A noter, que les souris utilisées par les stagiaires pour la pratique en condition vigile seront automatiquement anesthésiées puis mises à mort. À la suite de cette anesthésie (
Impact sur les animaux
La première partie de l'enseignement pratique a pour but d'enseigner la contention et la manipulation et n'engendre pas de douleurs ou effets secondaires aux animaux. Les animaux sont utilisés avec parcimonie. Cependant, la manipulation par des stagiaires inexpérimentés peut induire un stress chez l'animal (agressivité - prostration). Dans ce cas, l’animal expérimenté est substitué. La deuxième partie des travaux pratiques est basée sur l'injection et le prélèvement sur animaux vigiles. La manipulation par les stagiaires sur souris vigile sera supervisée étroitement par un des encadrants (4 encadrants minimum pour 10 étudiants) qui pourra le cas-échéant accompagner le stagiaire dans le bon geste de contention puis d’injection et/ou de prélèvement. Dans le cas d'une mauvaise manipulation par le stagiaire, l’encadrant jugera du besoin de remplacer l’animal, de la mise en place de stratégie antalgique ou de la mise à mort de l'animal en fonction des critères définis. L’administration sera réalisée avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal. Aucun effet pharmacologique n’est attendu. Un maximum de deux procédures d'administration et une procédure de prélèvement sera mis en œuvre par animal. La dernière partie de l'enseignement cible l’injection, le prélèvement et la mise à mort sur animaux anesthésiés. Une souris par étudiant et une souris par encadrant ; pour la démonstration de la mise à mort; seront utilisées pendant cette partie du TP. L'ensemble des animaux utilisé ayant reçu les anesthésiques ne seront pas gardés en vie. La mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale par le stagiaire sous supervision d’un encadrant. Dans le cas d'une séance normale, aucun point limite ne sera atteint pendant lors des deux premières parties des enseignements. Les animaux seront alors replacés dans l'animalerie. Un suivi longitudinal des animaux est réalisé quotidiennement pour s'assurer de la récupération des animaux par du personnel qualifié. Cette évaluation est basée sur les grilles d'évaluation de la douleur et de points limites décrits dans l'annexe 1. En fonction des scores de douleurs, des stratégies analgésiques peuvent être mises en place. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de la séance de TP est à but pédagogique afin d’inculquer aux stagiaires les bons gestes. Les souris et rats, non mis à mort seront réutilisés à des buts de formation et d’entrainement de la mise en pratique de ces gestes par le personnels et chercheurs du laboratoire en dehors de la formation de CESU. Dans le cadre du roulement de personnel actif, de nombreux étudiants et post-doc de notre laboratoire s'inscrivent au CESU de niveau A ou de niveau B. À la suite de la formation, ce personnel nécessite de continuer la formation pratique à l'expérimentation à l'aide d'un tuteur diplômé. Les animaux restants sont mis à profit afin qu'ils puissent s'exercer avant de débuter tout projet scientifique. Cet entrainement consiste à la répétition des gestes enseignés sur animaux vigiles. A l'issue, de cet entrainement, l'évaluation des scores de douleurs et points limites sont évalués par le tuteur basée sur l'annexe 1. Le suivi longitudinal quotidien des animaux est poursuivi (basée sur l'annexe 1 également). Les animaux sont mis à mort à la fin de l'apprentissage de ce personnel.
Remplacement
Cet enseignement/apprentissage est indispensable pour la mise en œuvre de futures expérimentations précliniques dans les meilleures conditions possibles. L’emploi d’animaux vis-à-vis des procédures enseignées ne peut être substitué par l’usage de mannequin notamment sur la pratique de gestes complexes tels que la réalisation d'injections ou prélèvement par voie rétro-orbitaire. Les stagiaires sont cependant sensibilisés pendant la formation théorique : 7h00 d’enseignement destiné aux méthodes in silico (ex : modèle pharmacocinétique), in vitro (modèle de tumoroides) ou in vivo chez des espèces alternatives (Drosophiles – Nématodes) et au respect des 3R. De plus, l'évaluation de ces TPs par les stagiaires convergent vers la nécessité les préserver.
Réduction
Ce projet à but pédagogique n’est pas basé sur l’obtention de résultats. Ainsi les méthodes statistiques requises habituellement ne peuvent s’exercer dans ce cas. Le nombre d’animaux est alors évalué en fonction du nombre de stagiaires inscrits à la formation. Ce nombre est donc prévu pour couvrir l’ensemble des TPs (TP1, TP2 et TP3) sur l’animal avec la prise en compte du nombre d’animaux mis à mort et du nombre d’animaux utilisés pour les exercices de contention – injection et prélèvement. L'objectif primaire de ces séances est de fournir une expérience pratique à la fois utile et en adéquation avec les points abordés lors des enseignements théoriques. Nous estimons que l'indépendance et la mise en situation des stagiaires sont des principes indispensables à ce type de formation. Pour cela, tout est mis en œuvre pour diminuer le nombre d'animaux. L'équipe pédagogique et encadrante (conforté par les résultats de satisfaction des séances de TPs par les stagiaires) a évalué qu'une souris par stagiaire était le minimum afin de pouvoir suivre la progression et conseiller les stagiaires individuellement à la pratique des gestes techniques et d'optimiser le temps de pratique pendant les séances. La réalisation de binôme ou trinôme pour l'expérimentation animale ne semble pas adapté du fait : les besoins des stagiaires ne sont pas les mêmes, certains gestes doivent être répétés plusieurs fois pour les "acquérir", ou ne peuvent être réalisés raisonnablement qu'une seule fois (prélèvement intracardiaque). Au-delà de ces considérations liées à l'enseignement, nous nous efforçons de maintenir les règles de distanciation sociale pendant ces séances. Le nombre de rat est adapté aux objectifs du TP1 et TP2 (manutention et injection intrapéritonéale) et au nombre de stagiaires. Pour terminer, les stagiaires se préinscrivent à minima, trois semaines avant le début de la formation, permettant de commander le plus petit nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux sont commandés et réceptionnés à minima 14 jours avant le début des séances de travaux pratiques. Lors des journées de TPs : Les animaux seront acclimatés dans la salle de TP, d’une à deux heures avant le début de la séance afin de diminuer leur stress. Dans cet optique, les animaux seront utilisés dans une ambiance sereine et calme favorisant la lumière naturelle dès que possible. Lors du TP1, aucune souffrance physique n'est infligée à l'animal. L'état de stress des animaux (agressivité/prostration) est évalué tout au long de la séance par les encadrants. Si l'animal apparait trop stressé, il sera remplacé. Les injections réalisées pendant le TP2 sont faites avec du sérum physiologique (par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, IV). Les volumes injectées maximales correspondent au volume optimal en fonction du poids de l'animal soit 1mL/100g de souris - 1 à 5 ml/kg de rat. Le choix des dimensions de l'aiguille doit correspondre à la voie d'administration étudiée, l'espèce et au poids de l'animal. Dans le cadre de mauvaise manipulation (injection ou prélèvement par le stagiaire), les encadrants jugeront du maintien de l’animal dans l’expérience, du remplacement ou de la mise à mort de l’animal en se référant à l'annexe 1. Lors du TP3, toute souffrance est évitée par l'anesthésie de l'animal avec des agents médicamenteux adaptés suivie de la mise à mort de l’animal à la fin de l'enseignement. Les animaux ne sont pas utilisés deux jours successifs pour éviter. En dehors des journées de TPs, les animaux sont monitorés quotidiennement par du personnel qualifié en fonction des scores et points limites établis en annexe 1. Les souris et rats sont hébergés sur des portoirs ventilés en groupe (adapté à la masse des animaux et surface de la cage), dans un environnement enrichi (copeaux, dôme, alimentation solide). L'eau et la nourriture sont en accès libres et illimités. Les locaux sont monitorés en permanence avec un suivi de l'hygrométrie et température. Une alternance jour/nuit de 12h est également mise en place.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées pour les études précliniques. Il existe une forte demande de formation vis-à-vis institutions privées ou publiques pour ces deux espèces. Ces espèces sont la base de l'enseignement pour l'expérimentation animale Afin de faciliter la contention, manipulation et injection par les stagiaires les animaux seront adultes. De plus, conventionnellement, l’expérimentation animale est réalisée chez des rongeurs adultes âgés de minimum 6 à 8 semaines.
Rôle du métabolisme des acides aminés dans la résistance à l’immunothérapie dans un modèle de souris humanisés
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles sensoriels
4 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles sont irradiées aux rayons X, greffées de cellules de mélanome humain, soumises à des prélèvements sanguins répétés et à des traitements quotidiens par immunothérapie. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable n'est attendu", en contradiction avec la gravité sévère qu'il déclare pour la totalité des animaux. Il justifie cet effectif de plus de quatre mille souris par la répétition d'expériences et qualifie le recours à la souris d'"indispensable".
Objectifs
Le traitement du mélanome a beaucoup progressé grâce aux immunothérapies. Les résultats étants encore insuffisants (50 à 70 % des patients ne répondent pas, et d’autres mettent en place des résistances), il est donc nécessaire de comprendre comment cette résistance se met en place afin de proposer des alternatives thérapeutiques efficaces. La régulation de la traduction des ARNm en protéines est impliquée dans la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc explorer les adaptations du métabolisme des cellules tumorales responsables du développement de cette résistance. Nos résultats préliminaires et les données de la littérature indiquent que des altérations de la synthèse de certains acides aminés sont associées au développement de la résistance. Ces résultats ont été obtenus in vitro et in vivo en utilisant des lignées de mélanome murin greffées dans des souris C57BL/6J. Il faut maintenant, valider nos résultats en utilisant des cellules de mélanomes directement issues de patients. Pour cela, nous utiliserons un protocole « d’humanisation » de souris NSG afin de reproduire le plus fidèlement possible la complexité d’un système immunitaire humain et d’évaluer l’effet des immunothérapies combinées ou non à un ciblage du métabolisme des acides aminés. Dans ce projet, 4368 souris seront réparties en 2 procédures et utilisées à 4 semaines (âge où la prise de greffe est optimale), mâles ou femelles indifféremment. Remplacement : Des expériences in vitro ont démontrer l’importance du métabolisme cellulaire dans les mécanismes de résistance à l’immunothérapie et ont permis de déterminer les doses optimales de molécules ciblant le métabolisme des acides aminés. Aucun modèle alternatif pertinent ne permet l’étude des interactions tumeur-système immunitaire. Il est donc indispensable de confirmer ces résultats chez la souris. Réduction : Nous avons choisi d'utiliser un nombre minimum de souris par groupe (8) nous permettant d'obtenir des résultats relevant. Si après 2 expériences indépendantes, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, nous ne réaliserons pas la 3 ème. Raffinement : Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes pour permettre la réalisation d’un nid), hébergées en portoirs ventilés (5 souris maximum/cage de 500cm2). Les animaux seront surveillés en continu (état général, pesée, taille et aspect des tumeurs) permettant l'arrêt de l'expérience avant tout début de mal- être ou de souffrance.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès du traitement du mélanome, avec les immunothérapies, la majorité des patients ne répondent pas à ces traitements ou bien, après une réponse, des résistances secondaires se mettent en place. Il est donc nécessaire de mieux comprendre comment la résistance à ces traitements se met en place et aussi de mieux identifier les patients susceptibles de répondre afin de proposer des alternatives thérapeutiques efficaces en cas de résistance à l’immunothérapie.
Procédures
-1 Irradiation Rayons X des animaux pendant environ 5 minutes - 4 Prélèvements sanguin (100 microl par prélèvement) espacés d'une semaine. Le prélèvement dure environ 1 minute. - 1 Injection de cellules tumorales en sous-cutanée. Injection dure environ 30 secondes. - Traitements en Intra-péritonéale quotidien qui dure environ 5 secondes. - 4 Traitements en Intra-périnonéale avec les immunothérapies qui durent environ 5 secondes.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Le remplacement des animaux est effectué chaque fois que cela est possible, par des modèles in vitro : des expériences préliminaires in vitro ont été menées et ont permis de mettre en évidence l’importance du métabolisme dans les cellules tumorales pour la mise en place de mécanismes de résistance à l’immunothérapie. Cependant ces expériences in vitro ne permettent pas de prendre en compte toute la complexité des interactions qui existe entre une tumeur et le système immunitaire. A l’heure actuelle et à notre connaissance, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’étude des interactions tumeur-système immunitaire. Il est donc maintenant indispensable de confirmer ces résultats chez la souris
Réduction
Des statistiques prédictives ont été faites avec G-Power. En fonction de nos précédentes expériences, nous avons choisi le t Test. Le logiciel préconise des groupes de 26 souris. Nous choisissons de faire des groupes de 8 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Par exemple, dans notre PEA324 « Etude des antidiabétiques et de leurs dérivés dans le traitement du mélanome », 1200 animaux avaient été demandés lors du dépôt du dossier, et 820 ont été utilisés.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des thérapies ciblées que nous voulons tester, un atout très important. Les souris seront irradiées et greffées vers l'age de 4 semaines. Elles seront laissées au repos pendant 3 à 6 semaines (condition à définir dans la P1) puis injectées par des cellules de mélanome et traitées pendant maximun 8 semaines après l'apparition de la tumeur. Il a été montré que la prise tumorale est optimale chez des animaux de 6 à 10 semaines. En les irradiant à 4 semaines, elles auront entre 8 et 10 semaines au moment de la greffe de cellules tumorales.
Implication du réseau neuronal thalamo-cortical et des AhR dans la migraine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et subissent des tests comportementaux d'allodynie mécanique, d'aversion à la lumière, d'anxiété et de dépression, certaines une chirurgie stéréotaxique avec implantation d'une lentille intracérébrale reliée à un microscope miniature. Le porteur étudie le rôle du réseau thalamo-cortical et des récepteurs AhR dans la migraine, avec une piste alimentaire et probiotique. Toutes sont tuées par injection de pentobarbital puis dislocation cervicale.
Objectifs
La migraine est la 6ème cause de handicap dans le monde. Elle est associée à une allodynie cutanée et à une photophobie, en plus d’autres maladies concomitantes qui rendent difficile le traitement. La migraine est influencée par les aliments et le microbiote intestinal. Les métabolites dérivés de l’activité bactérienne régulent le fonctionnement cognitif, et son impliqués dans les processus de neurodégénérescence. Dans ce contexte nous nous intéressons au tryptophane (Trp), acide aminé essentiel. Une réduction de son ingestion augmente l’intensité des nausées, de la douleur et de la photophobie pendant la crise migraineuse. Environ 6% du Trp est transformé par le microbiote en dérivés indoles, agonistes endogènes des récepteurs d’aryl d’hydrocarbone (AhR). L’AHR est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la neuroinflammation et la neurotoxicité. Son activation via les indoles a des effets protectifs et antiinflammatoires. Cependant, l’implication des indoles et des AhR dans la migraine est très peu connue. Le premier objectif est d’étudier leur rôle dans le déclanchement et/ou la chronicisation de la migraine ainsi que dans la comorbidité avec des troubles sensoriels et affectifs dans un modèle de migraine chez la souris. D’autre part, durant la crise migraineuse le message nociceptif issu des méninges et de la rétine converge au niveau du thalamus puis il est transmis vers les régions corticales. Ce circuit suggère le rôle du thalamus dans l'allodynie et la photophobie au cours de la migraine. Cependant, l’implication des neurones thalamiques et la manière dont ils intègrent l’information demeure une question jamais examinée à ce jour. Le deuxième objectif est d’étudier comment le message nociceptif est traité au niveau thalamique et cortical durant et entre les crises de migraine ainsi que d’évaluer l’implication des indoles et les AhR dans ce circuit neuronal.
Bénéfices attendus
Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau des noyaux thalamiques et du cortex. Cette altération implique les récepteurs AhR et les métabolites indoles comme principaux agonistes endogènes. Les différentes techniques utilisés dans ce projet permettront de révéler de nouveaux mécanismes moléculaires et de plasticité neuronale jamais abordés dans le cadre de la migraine et les troubles sensoriels associés. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence le rôle des AhR dans l’initiation et la chronicisation de la migraine ainsi que la vulnérabilité du circuit thalamo-corticale à la neuroinflammation, permettant de trouver des nouvelles cibles thérapeutiques adaptés au patient et centrées sur une approche alimentaire et probiotique à long terme.
Procédures
Procédure 1 : [1] injection intrapéritonéale (i.p.) soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] mesure de l’allodynie en réponse à une stimulation mécanique non nociceptive (une fois par jour, pendant 3 h, sur 2 jours consécutifs) ; [3] mesure de l’aversion à la lumière (10 min, une seule fois) ; [4] mesure du comportement anxieux (une fois par jour, pendant 10 min, sur 3 jours consécutifs) ; [5] mesure du comportement dépressif (pendant 15 min, une seule fois) ; [6] injection i.p. de pentobarbital sodique pour la mise à mort de l’animal (une seule fois). Procédure 2 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 3 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, une seule fois) ; [3] chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, une seule fois) ; [4] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 4 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [3] : chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [4] : installation du microscope miniature sur le support crânien fixé dans l’intervention précédente (une fois par jour, pendant 1-3 jours par semaine, durant 2 mois ; chaque session dure 10-30 min) ; [5] mesure de l’allodynie (une fois par jour, pendant 10-30 min) ; [6] mesure de l’aversion à la lumière (une fois par jour, pendant 10 min) ; [7] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois).
Impact sur les animaux
D’une part, les animaux soumis à une restriction/implémentation de Trp risquent de présenter une altération du régime alimentaire qui peut impliquer des perturbations de leur comportement et bien-être. Les études préliminaires avec le régime carencé en Trp indiquent une perte non significative du poids lors des premiers jours mais qui ne s’aggrave pas avec la suite du protocole. Les animaux n’ont pas présenté d’altérations de l’agressivité, le cycle du sommeil ni du stress, parmi d’autres évaluations. D’une autre part, certains animaux vont suivre une chirurgie d’implantation d’une lentille microendoscopique au niveau cérébral, qui sera ponctuellement connectée à un système miniature de microscopie au moment de l’expérience. La douleur occasionnée pour cette procédure sera prévenue et/ou traitée avec des antalgiques. Quelle que soit l’expérience réalisée, une évaluation de l’état physique de chaque souris sera effectuée chaque jour et avant chaque manipulation, afin de détecter le plus rapidement possible tout signe traduisant le mal-être de l’animal. Dans le cas où l’animal montre des signes cliniques, soit il pourra être soigné sans compromettre les résultats, soit nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. En plus, des points limites spécifiques pour chaque procédure seront mises en place.
Devenir
À la fin de chaque procédure ou expérience, les animaux seront euthanasiés avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de pentobarbital sodique (dose supérieure à 150 mg/kg). Afin de confirmer la mort, nous réaliserons une dislocation cervicale.
Remplacement
Notre projet étudie l’effet de la dérégulation du métabolisme du Trp et ses dérivés indoles sur les récepteurs AhR au niveau du réseau thalamo-cortical dans le cadre de la migraine. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Dans le cas de l’évaluation comportementale, l’expérience préalable de notre laboratoire nous permet de réduire le nombre d'animaux par groupe à 10 (compte tenu aussi du fait qu’environ 20% des animaux ne sont pas sensibles à l'ISDN, et que certains animaux ne répondent pas au traitement administré). Dans le cas de l’évaluation immunohistochimique suite au marquage du réseau neuronal, nous allons réduire à 5 animaux par groupe expérimental. Dans les études de RT-PCR et de quantification par HPLC des niveaux plasmatiques et cérébrales de Trp et ses métabolites, nous allons extraire les échantillons de tissu des mêmes animaux afin de réduire au maximum le nombre de souris. Cela nous permettra de réaliser une corrélation entre l’expression génique et le taux des molécules étudiées. Quelle que soit la procédure à réaliser, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin de tirer des conclusions statistiquement fiables et pertinentes avec un pouvoir d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique (test t de Student pour une comparaison entre deux groupes ; ANOVA suivie d’un test de comparaison multiples, tel que le test de Dunnet ou le test de Tukey, pour des comparaisons de plus de 3 groupes). Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques (test de Wilcoxon pour des comparaisons entre mesures répétées précédentes d’un même groupe ; test U de Mann-Whitney pour des comparaisons entre deux groupes indépendants ; test de Kruskal-Wallis pour des comparaisons entre plus de trois groupes). La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.
Raffinement
Afin d’assurer le bienêtre et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid). Une évaluation de l’état physique de l’animal sera réalisée avant chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contra la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques, il sera sacrifié. Des points limites (précisés ci-dessous) seront mis en place pour chaque procédure
Choix des espèces
Puisque ce projet est la suite d’une étude en cours de réalisation actuellement, nous continuons à utiliser le même modèle animal. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme et permet l’extrapolation et comparaison des résultats obtenus au laboratoire avec les études cliniques (dans la mesure du possible). De plus, elle possède des nombreux atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. D’ailleurs, la souris est idéale en raison de la disponibilité des knockouts génétiquement modifiés dont les souris AhR-/- que nous allons utiliser. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (5-12 semaines d’âge) car l'étude n’a pas pour objectif de travailler sur les jeunes (système nerveux en cours de développement) ou chez l'animal âgé.
Etude in vivo de l’effet des anticorps anti-MHC I sur les plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de plaquettes dans le sinus rétro-orbital et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue, puis un prélèvement terminal à l'aorte abdominale sous anesthésie. Le porteur étudie l'élimination des plaquettes transfusées chez un receveur devenu réfractaire et affirme que ces processus "ne peuvent être étudiés qu'in vivo". Il croise deux lignées de fonds génétiques différents pour reproduire la différence entre donneur et receveur.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle fondamental dans les processus d’hémostase. C’est ce qui nous permet d’éviter les hémorragies en cas de blessures ou de lésions. Quand le taux de plaquettes circulantes chute en dessous de 10.000 plaquettes par μL de sang chez un patient, le risque d’hémorragie interne devient important et une transfusion peut être envisagée. Une complication post transfusionnelle connue est la production d’anticorps anti¬plaquettes par le receveur dirigés contre les plaquettes du donneur. Ainsi, si receveur développe de tels anticorps de nouvelles transfusions seront inefficaces sur un plan thérapeutique puisque les plaquettes du donneur seront détruites par ces anticorps et très rapidement éliminées de la circulation : on dit alors que le patient est en état réfractaire. Cette problématique est particulièrement importante chez des patients dont les pathologies nécessitent des transfusions plaquettaires récurrentes. Objectif : Des études préliminaires ont permis d'avancer dans la compréhension du mode d'action des anticorps produits par le receveur et responsables de l'élimination des plaquettes transfusées. Ce projet nous permettra d'évaluer une approche pharmacologique ayant pour but d'éviter que les plaquettes transfusées soient éliminées trop rapidement de la circulation du receveur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d'apporter des connaissances sur les mécanismes d'élimination des plaquettes transfusées lorsque le receveur rejette sa transfusion et qu'il y a donc une inefficacité thérapeutique transfusionnelle appelée également état réfractaire. Les perspectives de ce travail sont denvisager des solutions thérapeutiques chez l'homme et une meilleure prise en charge des patients multitransfusés.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'aorte abdominale (prélèvement terminal sous anesthésie) ou des prélèvements sanguins à la queue (petits volumes prélevés, sous anesthésie ). Les prélèvements à l'aorte sont des prélèvement terminaux donc unique par définition. Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié : Les prélèvements sanguins à la queue sont réalisés 5 min, 30min, 2h, 24h et 48h après la transfusion de plaquettes, soit 5 prélèvements de 10 µL sous anesthésie gazeuse sur le même animal.
Impact sur les animaux
Pour réaliser ce projet, 304 souris au maximum devront être utilisées et mis à mort à la fin du projet. Cependant, les procédures réalisées sont modérées et seront effectuées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien être des animaux. Les animaux subiront un stress au moment de l'anesthésie (contention de l'animal pour lui injecter l'anesthésiant) mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à réaliser ce geste (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site d'injection des plaquettes dans le sinus rétro-orbital d'où l'utilisation d'un collyre contenant de la tétracaine pour limiter la douleur.
Devenir
Les animaux de la PE n°1 seront soit mis à mort (lot n°1: prélèvement sanguin terminal à l'aorte abdominale) soit utilisés pour la PE n°2 (lot n°2) Les animaux utilisés dans les PE n°2 et n°3 seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Les événements initiaux conduisant à la production d’anticorps anti-plaquettes et aux états réfractaires ne peuvent pas être étudiés chez des patients transfusés. Nous voulons évaluer l'effet d'une stratégie thérapeutique. Ces processus mettent en oeuvre simultanément des interactionsentre les vaisseaux, le sang et la circulation sanguine. Ces événements sont intégrés et ne peuvent être étudiés qu’in vivo.
Réduction
Les mises au point réalisées en amont pour vérifier que ce protocle d'alloimmunisaton conduit à un état réfractaire permettra de n’utiliser que le minimum de souris dans les groupes de souris immunisées. Les nombres d'animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés avec la contrainte d'obtenir des observations suffisamment représentatives. Des expériences préliminaires au laboratoire nous ont permis de fixer à 5 le nombre de souris par conditions testées, ce chiffre tient compte de la variabilité inter-individus.
Raffinement
Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec du coton et de la frisure, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Ils ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les individus sont hébergées par groupe de 6 par cage. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux.-Accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture -Anesthésie de l’animal afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. -Injection d’analgésique le cas échéant. -Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Ils veilleront au bien être des animaux grâce à l'utilisation d'une grille de scoring et à la défintion de points limites permettant d'éviter toutes douleurs ou souffrances inutiles de l'animal. Ce projet nécessitera 304 souris au maximum
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons mimer la différence qui existe entre un donneur et un receveur qui conduit à la production d'anticorps par le receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire (C57BL6/J et BALB/c). De plus, le modèle d’alloimmunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 7 à 12 semaines afin de pouvoir étudier l'effet des anticorps sur un individu au système immunitaire mature.
Etude de l’effet d’une molécule enzymatique sur un modèle murin de l’épilepsie myoclonique progressive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie avec implantation d'une pompe de diffusion, puis huit jours d'isolement, et présente une perte de neurones et un déficit de mémoire évalué par un test de labyrinthe en Y. Le porteur utilise une lignée 5xFAD, qu'il décrit à la fois comme modèle d'Alzheimer et de la maladie de Lafora, pour tester une molécule enzymatique. Les souris sont expédiées vers une société privée qui les tue à réception, et le bénéfice annoncé se limite à une "meilleure compréhension" de la maladie.
Objectifs
La maladie de Lafora (ML) représente une forme fréquente et particulièrement grave d’épilepsie myoclonique progressive. Ses premières manifestations surviennent à l’adolescence : la personne perd soudainement conscience et tombe avant de présenter des contractions musculaires généralisées. Cette première phase est suivie d’une seconde période durant laquelle le patient présente des spasmes rapides des quatre membres suivie d’une décontraction généralisée des muscles. Après un délai variable d’inconscience, la personne se réveille. L’évolution est dominée par une détérioration cognitive majeure et rapide, dont les premiers symptômes peuvent précéder les troubles moteurs. Le décès survient généralement 4 à 10 ans après les premiers symptômes dans les formes typiques. L’utilisation d’un modèle rongeur, vertébré présentant des structures cérébrales comparables à l’Humain, permet l’étude de ces dernières et des circuits neuromusculaires associés afin de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie de Lafora. L’objectif de ce projet est de tester une molécule enzymatique thérapeutique (VAL) sur ce modèle murin. Pour le modèle murin utilisé (souris 5xFAD : MMRRC Strain #034840-JAX) : Ces souris transgéniques 5xFAD surexpriment la protéine mutante humaine précurseur bêta-amyloïde (A4) 695 (APP) avec les mutations suédoises (K670N, M671L), de Floride (I716V) et de Londres (V717I) de la maladie d'Alzheimer familiale (FAD) avec la préséniline humaine 1 (PS1) hébergeant deux mutations FAD, M146L et L286V. Les deux transgènes sont régulés par le promoteur Thy1 de la souris pour entraîner une surexpression dans le cerveau. Les souris 5XFAD récapitulent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent constituer un modèle utile de neurodégénérescence intraneuronale induite par Abeta-42 et de formation de plaque amyloïde. De plus ces animaux présentent des formes d’épilepsie similaires à la maladie de Lafora, ce pourquoi nous les utilisons.
Bénéfices attendus
Meilleure compréhension de la maladie de Lafora.
Procédures
Tous les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la maladie de Lafora, le modèle murin utilisé est le modèle 5xFAD. Ces souris lorsque reproduites en hémizygotes (un organisme est dit hémizygote pour un gène particulier si ce dernier n'est présent qu'à une seule copie) sont viables et fertiles et présentent des déficits cognitifs et de mémoire ainsi que des épisodes d’épilepsie. Ces animaux subissent une chirurgie avec implantation d’une pompe de diffusion et sont isolés pendant 8 jours à la suite de cette chirurgie. Ces animaux présentent une perte de neurones et une déficience de la mémoire dans le test du Y-maze (test du labyrinthe en Y). Les souris transgéniques 5xFAD possèdent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent être des modèles utiles de la neurodégénérescence intraneuronale induite par l'Abeta-42 et de la formation de plaques amyloïdes. Pour limiter la souffrance, un analgésique [Meloxicam (Metacam™), 0.03 ml, 5mg/kg] est administré par voie intrapéritonéale avant la chirurgie et pendant les 3 jours (si nécessaire) suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Concernant le stress et l’anxiété, les animaux voient et sentent leurs congénères même s’ils sont isolés. La cage est enrichie avec un nid végétal. Les animaux sont manipulés avant et après la chirurgie pour minimiser le stress et l’anxiété.
Devenir
A la suite des opérations de chirurgie, les animaux seront envoyés à la société Neuroservices Alliance localisé à Aix en Provence. Les animaux seront envoyés à cette société avant l’apparition du phénotype dommageable. Cette société s’occupera de l’euthanasie des animaux dès leur réception ainsi que des prélèvements.
Remplacement
Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des structures cérébrales et des circuits neuromusculaires impliqués dans la maladie de Lafora nécessite l’utilisation d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Des méthodes in vitro telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neurones qui sont le sujet de nos travaux. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 10 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 60 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans diverses maladies myocérébrales. De plus, nous utilisons ici un modèle transgénique présentant un fort intérêt scientifique. Les animaux seront utilisés entre 4 et 9 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Évaluation de l’efficacité d’une trithérapie dans le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des médicaments deux fois par semaine pendant sept à neuf semaines, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur teste une trithérapie contre l'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, et prévoit de répéter voire de refaire l'ensemble de l'étude, ce qui porte l'effectif à 280. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence par chimiothérapie est inefficace dans 20 % des cas. Nos données en laboratoire montrent que l’action combinée de 2 drogues en sus de cette chimiothérapie de réfèrence permet d’éliminer très efficacement les cellules tumorales du foie en laboratoire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de cette trithérapie chez l’animal. Ces travaux de recherche nous permettrons aussi d’étudier pourquoi certaines drogues sont efficaces et pas d’autres et comment les cellules tumorales arrivent à résister à chacune de ces drogues lorsqu’elles sont utilisées seules. En effet, ces informations sont cruciales pour comprendre comment fonctionnent ces molécules et quelles propriétés les rendent efficaces. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du foie chez l’enfant permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, en particulier ceux en rechute ou en échec thérapeutique.
Bénéfices attendus
Démontrer que l’association de ces trois médicaments bloque la formation de tumeur d’hépatoblastome chez la souris plus efficacement que chaque drogue utilisée seule ou combinée deux à deux.
Procédures
Implantation de cellules tumorales en sous-cutanée sur 280 animaux. Suivi des animaux pendant 7 à 9 semaines. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur au pied à coulisse 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur les animaux sont l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée et la pousse de la tumeur pendant plusieurs semaines.
Devenir
Les 280 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.
Réduction
Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). Le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence interlots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si la dose d’utilisation d’une des drogues doit être réajusté, l’étude sera refaite une fois. Nous prévoyons d’utiliser 280 souris dans ce projet du fait que nous avons 7 groupes de 10 souris (7 conditions de traitements), que l’expérience sera refaite deux fois et que l’étude globale sera refaite une fois si la dose d’une drogue doit être réajustée. Nous allons bien sûr tout faire pour que les doses choisies des trois drogues soient les bonnes dès la première série d’analyses et que l’étude ne soit pas refaite, ce qui aurait comme conséquence une réduction de moitié du nombre de souris.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux définis par un chercheur référent en 1998. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément à la directive européenne 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures.
Choix des espèces
1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.
Etude des modifications des paramètres tumoraux et immunitaires suite au traitement par immunothérapie anti-PD1 dans deux modèles murins de mélanomes génétiquement modifiés (NRasQ61K et BRAFV600).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un mélanome, elles reçoivent des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine et portent une tumeur dorsale qui peut s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur étudie les mécanismes de résistance à une immunothérapie anti-PD1 et affirme que seul un modèle in vivo reproduit les interactions entre tumeur et système immunitaire. Toutes sont tuées faute d'entrer dans une nouvelle procédure.
Objectifs
Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique. La plasticité des cellules cancéreuses, c’est-à-dire leur capacité à s’adapter notamment aux traitements anti-cancéreux, est régulée par un ensemble de facteurs dont l’expression est fréquemment dérégulée dans le mélanome. Les objectifs de ce projet sont d’étudier dans des modèles murins de mélanome, les caractéristiques des cellules tumorales et du microenvironnement immunitaire au cours du traitement par immunothérapie.
Bénéfices attendus
Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des niveaux de douleur modérés. Des injections en intra-péritonéal seront réalisées maximum 3 fois/semaine dans des zones différentes du péritoine.
Impact sur les animaux
Ces modèles de mélanomes n’étant pas métastatiques, les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le dos mais qui n'entravera pas le déplacement de l'animal. Dans de rare cas, il peut y avoir apparition de plaie ou de nécrose au niveau de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car ils ne rentreront pas dans une nouvelle procédure.
Remplacement
Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions complexes entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires présentes au sein du stroma. En effet, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et les cellules tumorales présentent un fort niveau de complexité qui ne peut être reproduit in vitro. De plus, l'efficacité de traitement par immunothérapies ne peut être évaluée in vitro. Pour cela, la souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles murins de mélanomes qui reproduisent la pathogenèse chez l’homme et les caractéristiques histologiques. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=170) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Pour chacune des procédures expérimentales présentées, le nombre de souris par groupe a été défini a minima afin de permettre une analyse statistique des résultats adaptée selon le cas.
Raffinement
Une définition précise des points limites permettra de limiter au maximum toute souffrance animale. De plus, la bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et prédictifs et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Les modèles murins de mélanome que nous utilisons représentent la majorité des mutations retrouvées chez l'Homme et miment bien la pathologie humaine. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet.
Modulation par un miRNA de l’inflammation chez la souris lors d’une infection à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par gavage avec des spores de Clostridioides difficile, reçoivent des injections par voie rétro-orbitale sous anesthésie et, pour certaines, une inflammation intestinale provoquée par des molécules chimiques. Le porteur indique que l'infection cause une diarrhée légère et qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort, sans que ce seuil soit forcément atteint. Il teste un microARN comme piste thérapeutique et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" avant tout développement clinique.
Objectifs
Clostridioides difficile est une bactérie entéropathogène, première cause de diarrhée nosocomiale chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, 14 % de formes compliquées dont la plus connue est la colite pseudomembraneuse, marquée par 3 % de mortalité). Les infections à C. difficile sont caractérisées par un taux important de formes sévères résultant d’une réponse inflammatoire trop sévère. . Malgré des traitements antibiotiques généralement efficaces, les récidives des infections à C. difficile sont fréquentes (environ 20 %) et des résistances aux antibiotiques apparaissent. Les petits ARNs appelés microARNs (miRNAs) sont de plus en plus décrits comme régulateurs de la réponse immunitaire notamment de la réponse inflammatoire lors d’une infection bactérienne. Nous souhaitons évaluer la possibilité d’utiliser ces miRNAs comme outil thérapeutique permettant de contrôler cette réponse inflammatoire. Dans un précédent projet nous avons mis en évidence l'intérêt d’un miRNA comme outil thérapeutique permettant de diminuer la réponse inflammatoire dans un modèle de souris infectées par C. difficile. L'objectif de ce projet est de réaliser une étude pré-clinique chez la souris de l'efficacité de ce miRNA, préalable indispensable à la poursuite d’autres étapes de développement clinique de la molécule. Dans un premier temps, il sera réalisé une étude sur l’optimisation de l’efficacité du miRNA par diverses modifications chimiques. Puis il sera engagé une étude d’effet-dose d’un miRNA modifié choisi dans notre modèle d’infection par C. difficile et dans un modèle d’inflammation de l’intestin. Enfin, il sera réalisé une étude de pharmacocinétique, de biodistribution et de toxicité de ce miRNA modifié
Bénéfices attendus
La stratégie de lutte contre l'inflammation induite lors de l'infection par Clostridioides difficile avec un mIRNA pourrait permettre d'empêcher les formes sévères de la maladie.
Procédures
Le modèle d'infection des souris par la bactérie Clostrioides difficile nécessite un gavage orale par les spores de la bactérie d'une durée inférieure à 10 secondes. Certaines des procédures du projet impliqueront deux injections par voie rétro-orbital de molécule lors d'une légére anasthésie de quelques minutes. Les modèles d'inflammation de l'intestin par des molécules chimiques se feront soit par ajout de la molécule dans l"eau de boisson tout au long de la procédure soit par une injection par voie rectale lors d'une anésthesie d'une durée de 30 minutes environ.
Impact sur les animaux
L’infection de la souris par la bactérie Clostridioides difficile n’induit pas ou peu de signes cliniques : observation d’une diarrhée légère et spontanément résolutive 24 h après infection ne nécessitant pas de réhydratation. Les modèles d'inflammation chronique de l'intestin par des molécules chimiques induisent des diarrhées et des pertes de sang légères et parfois une perte de poids. Une perte de poids supérieur à 20% sera défini comme un point limite.
Devenir
Le prélevement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro sur un modèle de cellules de l’intestin permettent de sélectionner les miRNAs présentant une activité anti inflammatoire intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique de notre candidat anti-inflammatoire lors d'un processus infectieux et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 250, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.
Raffinement
Les animaux seront herbergés avec suffisament d'espace, par groupe de 6 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées quotidiennement et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée si nécessaire en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le modèle de souris est maintenant établi et est classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de l’infection à Clostrioids difficile. En effet, à la suite à d'une antibiothérapie visant à altérer le microbiote digestif de barrière, l’administration de C. difficile par voie orale permet une implantation reproductible et maîtrisée de la bactérie au niveau du tube digestif et le développement de signes cliniques modérés de la pathologie. De meme le modèle souris est l'un des modèles d'inflammation chronique par des molécules chimiques les plus utilisés par la communauté scientifique. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle d'infection par la bactérie.