Rongeurs
Evaluation de l’Imlifidase combinée à la thérapie génique AAV dans la maladie de Crigler-Najjar, en présence d’anticorps neutralisants
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
140 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ces rats d'une lignée naturellement atteinte d'une maladie du foie reçoivent des injections intraveineuses et de nombreuses prises de sang sur deux mois, tantôt vigiles sous contention, tantôt sous anesthésie. Le porteur indique que le traitement testé peut provoquer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique, une hypotension ou des troubles rénaux, et affirme que le recours à l'animal est obligatoire pour le développement clinique. L'objectif est d'élargir l'accès à la thérapie génique aux patients porteurs d'anticorps, retombée renvoyée à la clinique future.
Objectifs
Aujourd’hui, dans le cadre d’une utilisation clinique de la thérapie génique utilisant un virus adeno-associé recombinant, seuls les patients séronégatifs, c'est-à-dire ceux qui ne possèdent pas d’anticorps préexistants dirigés contre ce virus, peuvent bénéficier du traitement. Cette réponse en anticorps est variable selon le type de virus adeno-associés : les études ont montré que 5% à 70% de la population possèdent des anticorps neutralisants, y compris parmi la population pédiatrique. Cette forte immunisation limite considérablement l’accèssibilité au traitement. Pour remédier à cela, différentes approches ont été explorées au cours des dernières années : (i) immunomodulations pharmacologiques ou physiques, telles que l'utilisation d'immunosuppresseurs ou de la plasmaphérèse, (ii) ingénierie des virus recombinants pour contourner les défenses immunitaires, etc... mais aucune de ces techniques ne permet aujourd’hui l’inclusion des patients séropostifs, c'est-à-dire les patients qui possèdent les anticoprs, dans les essais cliniques. L'utilisation de l’imlifidase, une enzyme d'origine bactérienne capable de dégrader les anticorps humains, semble être une approche très prometteuse que nous souhaitons développer jusqu’à la clinique. Notre laboratoire a conçu un virus adeno-associé recombinant spécifique pour traiter le syndrome de Crigler-Najjar, une maladie métabolique extrêmement rare (1 naissance sur 1 million en France). Il est important de permettre à tous les patients atteints par cette maladie, y compris aux patients séropositifs, de bénéficier de ce traitement. Pour cela, nous souhaitons étudier l'efficacité de l'imlifidase à éliminer les anticorps préexistants dirigés contre notre virus recombinant et évaluer ses potentiels impacts sur la thérapie génique pour Crigler-Najjar. Ces études seront réalisées chez le modèle animal de cette pathologie, le rat Gunn. Les résultats de ces travaux serviront non seulement pour cette maladie, mais aussi à l’ensemble des programmes utilisant le virus adéno-associé recombinant pour une thérapie génique.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, de nombreux patients ne peuvent pas avoir accès aux traitements innovants qui sont développés à base de virus adeno-associés recombinants, car ils possèdent des taux d’anticorps neutralisants trop importants. Le statut sérologique des patients est aujourd’hui un des critères d’exclusion qui écarte le plus de patients d’un essai clinique. Les travaux de recherche pouvant aboutir à l’inclusion de ces patients sont donc extremement attendus par la communauté scientifique mais surtout par les patients eux-même, qui espèrent voir un jour la possibilité de recevoir un traitement. Nous souhaitons développer cette approche jusqu’à la clinique, dans un premier temps pour le syndrome Crigler-Najjar, mais elle pourra être étendue à tous les programmes scientifiques basés sur l’administration de virus adeno-associés recombinants, soit plus de 260 études cliniques référencées courant octobre 2021.
Procédures
En début de procédure, à j0 et j1, des injections intraveineuses (2 à 3 selon les procédures) seront reálisées sur les animaux vigiles placés sous contention (~200uL/injection). Les rats seront suivis et pesés pendant 2 mois et des prises de sang régulières seront effectuées (à j-2, j0, j1, j14, j30, j45, j60). Le volume maximal prélevé sera ~600uL/semaine. Ces prises de sang seront réalisées alternativement sur rat vigile, sous contention (veine caudale) et sur rat anesthésié sous isoflurane (veine submandibulaire).
Impact sur les animaux
Le rat Gunn est atteint d’une hyperbilirubinémie modérée pouvant provoquer chez lui, dans de rares cas, une atteinte neurologique. Toute manipulation/contention du rat vigile est susceptible de provoquer chez lui un stress. Aucun effet indésirable n'est attendu suite à l'administration des traitements décrits dans ce projet. Il est toutefois décrit quelques effets secondaires possibles comme : des réactions d’hypersensibilité/allergiques pouvant aller jusqu'au choc anaphylactique, une certaine hypotension, ou des troubles rénaux.
Devenir
A la fin des procédures 1 et 2, les rats sont euthanasiés afin de collecter les organes pour analyses.
Remplacement
Imlifidase étant une enzyme qui fonctionne essentiellement sur les anticorps humains, la grande majorité des informations essentielles à la démonstration de la faisabilité et de l’efficacité de cette approche seront tirées des expériences réalisées in vitro, sur des prélevements sanguins de donneurs et/ou patients (i.e cinétique d’action, dose efficace, ...). De plus, cette molécule étant déjà commercialisée (domaine des transplantations rénales), beaucoup de données sont disponibles dans la littérature. Cependant le recours à l’animal s’avère obligatoire pour le développement clinique de cette molécule dans une application en thérapie génique, afin d’étudier ses interférences éventuelles sur l’efficacité des virus adéno-asscociés recombinants, nottament celui que notre laboratoire a developpé pour la maladie de Crigler-Najjar. En effet, les paramètres physiologiques tels que la biodisponibilité du virus, une/des réponse(s) immunitaire(s) qu’il peut engendrer, une réaction inflammatoire, etc… sont autant de facteurs qui interviennent dans ces études et qui ne peuvent pas être reproduits, à l’heure actuelle, in vitro. De plus, pour apporter ces preuves que la loi exige avant tout essai chez l’Homme, nous devons nous assurer de l’absence de contre-indications éventuelles de l'imlifidase avec notre traitement de thérapie génique. Pour cela, il n’existe aucune méthode substitutive. Le rat Gunn est le modèle animal atteint du syndrome Crigler-Najjar qui est le plus prédictif pour évaluer l’efficacité du produit de thérapie génique développé pour cette maladie, c’est pourquoi il a été choisi pour ce projet.
Réduction
Nous avons réfléchi cette étude dans le souci d’utiliser le nombre adéquat d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, tout en veillant à ce que ce nombre soit le plus bas possible. Nous avons optimiser les procédures de façon à ne pas dupliquer des groupes contrôles inutilement. Ainsi la dose d'imlifidase efficace sera définie dans la même étude que l'evaluation des interactions avec le virus adéno-associé recombinant. Le nombre d’animaux par groupe experimental a été établi par étude statistique. Puisque l’efficacité du transfert de gène est le paramètre essentiel dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser le niveau de bilirubine plasmatique comme marqueur discriminant pour l’étude statistique. Nous avons donc décidé d’utiliser un nombre d’animaux approprié pour détecter une diminution d’environ 50% de la valeur contrôle : un traitement efficace doit être capable de faire passer un taux de bilirubine plasmatique de 7mg/dL (chez les animaux malades) à un taux maximum de 3 mg/dL, reflet d’une activité enzymatique restaurée dans le foie. Au regard de nos études précédentes (pour déterminer variance et écart-type) et à l'aide d'un test unilatéral standard de comparaison des moyennes pour calculer ce nombre, 6 rats seront utilisés par groupe : n= 2x(SD²/Δ²)x(zα/2-zpuiss)² • la différence attendue entre la moyenne d’un groupe contrôle et celle d’un groupe traité : Δ = 7-3=4 • les écart-type observés au cours des études précédentes= environ 2mg/dL • une puissance statistique de 90% et un risque d’erreur à 5% (loi normale, zα/2= 1.96 ; zpuiss =-1.28), n=2x(2²/4²)x(1.96-(-1.28))²=2x(4/16)x3.24²=2x0.25x10.5=5.2
Raffinement
La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hebergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales. L’enrichissment des cages avec des élements tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à macher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général. Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit etre réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après chaque acte experimental, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement. Une surveillance accrue sera établie durant les premières 48 heures afin de surveiller l’apparition eventuelle de signes d’hypersensibilité ou d’inflammation aigue. Afin de diminuer le recours à l'anesthésie et limiter la repetition des ponctions au meme site de prélevement, le sang sera prélevé alternativement à la veine submandibulaire et à la celle de la queue.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale qui développe une hyperbilirubinémie semblable au syndrome Crigler Najjar humain. Ce modèle animal naturel est le rat GUNN. Il est le modèle de référence pour cette maladie et le plus pertinent pour estimer les doses thérapeutiques de thérapie génique. Nous souhaitons traiter des animaux dont le foie est pleinement developpé. En effet, la croissance du foie pourrait entrainer une perte d'effacité à long terme de la thérapie génique. Pour cela nous allons utiliser des rats adultes ou jeunes adultes : basés sur nos études précédentes réalisées sur ce modèle, des animaux de plus de 6 semaine pourront être inclus.
Etude de la comorbidité entre la douleur chronique et la dépression : analyse anatomo-fonctionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie provoque une douleur neuropathique à la patte, une seconde implante une fibre optique dans le cerveau, et les animaux développent des troubles de type anxieux et dépressif, objets mêmes de l'étude. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle constitue le sujet de recherche, et que les souris subissent jusqu'à vingt-huit tests de douleur puis des tests comportementaux. Les cibles thérapeutiques évoquées pour l'humain restent renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction entre ces 5 régions pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur grâce à des techniques de mesure d’activité neuronale in vivo. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérets mais aussi systèmes de neurotranmissions) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ et une chirurgie stéréotaxique avec injection de virus puis implantation de fibre optique ou plateforme multimode d’une durée de 45 min environ, soit au total 2 chirurgies. Ces deux chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 2 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai de 4 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 28 tests maximum. Ils subiront également 4 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 test pour évaluer la douleur spontanée et 4 tests anxio-dépressifs (avec 24h minium entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g). Afin d’éviter tout risque de variabilité liée au vieillissement, notre étude portera sur des animaux adultes de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire. Le décours temporel de nos expériences fait que ces animaux seront testés jusqu’à leur ~18-19eme semaine à la fin des expériences.
Identification des mécanismes impliqués dans la fonction pro-tumorale des cellules tuft dans le cancer gastrique causé par Hélicobacter
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie sous anesthésie sans réveil et le reste de gravité légère à modérée. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter felis, qui provoque des lésions gastriques et un cancer de l'estomac avec perte de poids, et reçoivent des gavages et des injections répétés. Le porteur indique suivre l'apparition des lésions sur des durées d'au moins six mois et mettre à mort les animaux dès l'atteinte de scores de souffrance définis. Il qualifie le modèle animal d'"indispensable" faute de méthode reproduisant ce processus, l'objectif restant de comprendre le rôle de certaines cellules dans la tumeur.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes impliqués dans les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft en utilisant des modèles murins innovants suite à une infection à Helicobacter.
Bénéfices attendus
Elucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les propriétés pro-oncogeniques des cellules intestinales suite à une infection à H. felis. Les analyses moléculaires pourraient permettre l'identification de substances biologiques potentiellement médicamenteuses. Cela mettrait en lumière de nouveaux mécanismes d’interaction entre H. felis, les cellules tuft et la muqueuse gastrique, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques inexplorées.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 1100 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Injection intrapéritonéale sur animal vigile : 150 souris, 1 fois par jour pendant 5 jours Prélèvement sanguin rétro-orbitaire sous anesthésie générale : 1980 souris, 1 fois en phase terminale
Impact sur les animaux
Perte de poids liée à l’infection à H. felis et au développement de lésions gastriques dans les expériences d’infection d’une durée supérieure ou égale à 6 mois. Souffrance observée.
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft gastriques suite à une infection à H. felis. A ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Le modèle d’infection à H. felis est connu et maitrisé par notre équipe. En souris contrôle (dit WT) nous utiliserons les souris non transgéniques issues des accouplements des lignées dans un but de réduire le nombre d’animaux. Nous prévoyons également d’utiliser des mâles et des femelles pour l’objectif 5 dans les expériences de lineage tracing, toujours dans un but de réduction. Pour les autres objectifs, des mâles seront utilisés car la réponse inflammatoire et la carcinogenèse sont maximales chez les mâles d’après les études antérieures du laboratoire et d’après la littérature scientifique. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. felis qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.
Raffinement
Les souris seront suivies en suivant les critères de la feuille de scoring fournie en annexe. Pour un score compris entre 6 et 12 les souris recevront de la nourriture humidifiée dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement sacrifié. Si le score est supérieur ou égal à 12, l’animal sera sacrifié sans attendre. Les souris seront pesées (de façon hebdomadaire), si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera sacrifié sans attendre.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus nous disposons de plusieurs lignées de souris transgéniques pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Les souris seront utilisées à un âge de 6-7 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.
Est-ce que les neurones en contact avec le liquide céphalo-rachidien au niveau thoracique appartiennent au système nerveux sympathique ?
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.
Objectifs
Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.
Réduction
Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.
Raffinement
La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.
Choix des espèces
La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).
Effet de bactéries de la famille des Christensenellaceae dans la modulation de l’inflammation aigûe dans des modèles précliniques murins d’induction de la colite
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
363 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une colite est provoquée chimiquement par injection intra-rectale de DNBS, puis les animaux reçoivent par gavage la bactérie testée, avec pour effets attendus une perte de poids, des diarrhées et des saignements anaux suivis sur trois jours. Le projet, mené par une entreprise, vise à évaluer une bactérie vivante comme futur médicament contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur affirme que ces modèles d'inflammation induite sont les seuls à reproduire la maladie et qu'un modèle in vitro ne restitue pas la complexité du microbiote.
Objectifs
La maladie de Crohn (MC) touche plus de 2,3 millions de personnes dans le monde, avec une prévalence en constante augmentation, en particulier dans les pays nouvellement industrialisés. L'étiologie de la maladie est liée à de multiples facteurs, notamment des facteurs environnementaux, génétiques, immunitaire et un microbiome intestinal altéré. Les patients sont atteints d’anomalies du système immunitaire intestinal associées à un microbiote intestinal peu diversifié et à une perte de bactéries bénéfiques par rapport aux individus sains. La qualité de vie des patients atteints de MC est fortement altérée car ils souffrent de douleurs abdominales atroces, de diarrhées récurrentes, de douleurs articulaires, etc. Les traitements disponibles - à ce jour (par exemple, corticostéroïdes, molécules immunosuppressives et agents biologiques) ou en développement - ciblent les voies responsables de l'inflammation qui déclenche ces symptômes. Cependant, il existe un fort besoin médical de nouvelles thérapeutiques avec un mode d'action différent, car ces traitements ne guérissent pas la maladie et sont associés à de nombreux effets secondaires. Aujourd'hui, il n'y a pas de nouvelle solution pour guérir la maladie. L’objectif du projet est de proposer un nouveau schéma thérapeutique pour la gestion de maladies inflammatoires de l’intestin, pour ceci nous allons évaluer le potentiel thérapeutique, ainsi que de déterminer le profil toxicologique d’une bactérie vivante Christensenella minuta dans des modèles précliniques bien établie qui reprennent les principaux symptômes de l’inflammation au niveau du colon. Ce projet rentre dans le programme de recherche de l’entreprise qui s’inscrit dans sa lignée de développement de nouveau médicament à base de microbiote.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la détermination d’un nouveau traitement qui aura une activité bénéfique dans la gestion de l’inflammation, basée sur une bactérie vivante de l’intestin, ainsi qu’une amélioration de la composition bactérienne et de ce fait nous pourrons ainsi proposer un nouveau schéma thérapeutique pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin, telle que la maladie de Crohn.
Procédures
Les interventions auxquelles seront soumis les animaux sont : injection intra-réctale de DNBS pour l’induction de la colite sous anésthésie. La durée du geste est de moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur certains animaux. La durée du geste de prélèvement est évaluée à moins d’une minute. L'administration orale par gavage des traitements sur tous les animaux du projet sera également réalisé. La durée du geste de gavage est évaluée à moins d’une minute. Les différentes interventions sont réalisées par une personne formée et les animaux sont suivis quotidiennement selon les critères mis en place au sein de l'établissement.
Impact sur les animaux
La colite chez les souris sera induite chimiquement par le Dinitrobenzène acide sulfonique (DNBS), afin de créer l’inflammation au niveau du côlon, cette procédure a pour effet une perte de poids des animaux qui sera surveillée attentivement au cours des 3 jours qui suivent l’induction. Une grille d’évaluation associée aux mesures à prendre a été mise en place et sera suivie tout au long de la procédure. De plus, il est important de prendre en considération que l’absence ou une perte de poids moindre chez nos animaux traités est un paramètre important marquant l’efficacité de notre traitement. Des effets sur le transit intestinal peuvent être observés, tel que des diarrhées ou des saignements au niveau de l’anus, qui seront suveillés et scorés sur les 3 jours post-induction (jour du sacrifice).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de réaliser des tests et analyses ex-vivo permettant de valider et compléter les données.
Remplacement
L’efficacité et de la tolérabilité d’un médicament en cours de développement doit fait l'objet d'études réglementaires d’évaluation avant toute mise sur le marché, celles-ci exigent l’utilisation de modèles précliniques, qui puissent répondre à des questions toxicologiques. L’ensemble des données générées par ces modèles animaux nous permettront de pouvoir envisager une application thérapeutique chez l’homme. Le recours à des modèles d’inflammation induite chez le rongeur est une étape nécessaire dans notre démarche. Il s’agit des seuls modèles mimant la physiopathologie et la symptomatologie de la colite observées chez les patients atteints de la maladie de Crohn. La réponse immunitaire exprimée suite à l’induction de l’inflammation chez ces modèles précliniques est égalament similaire à celle observée chez l’homme, ce qui nous permet d’évaluer l’impact de notre médicament non seulement d’un point de vue clinique mais également physiologique. Par ailleurs, afin de minimiser au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons réalisé au préalable des tests in vitro de criblage sur modèles cellulaires, qui ont permis d’identifier quelques bactéries pertinentes ayant des effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires. Nous souhaitons donc tester ces bactéries sur ces modèles animaux et valider l’effet de C. minuta sur la colite induite et sur la modulation du microbiote intestinal, ce paramètre ne pouvant pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, car ils ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des interactions du microbiote intestinal.
Réduction
Le plus petit nombre d’animaux nécessaire par groupe a été défini tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, en se basant sur la variabilité interindividuelle et de la sensibilité des marqueurs biochimiques, dont les cytokines. Ce nombre tient aussi compte du fait que les expériences seront réalisées trois fois de manière indépendante afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Afin de raffiner les procédures et de réduire tout stress, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal en garantissant un enrichissement de l’environnement et une habituation aux personnes travaillant avec les animaux . Après 7 jours d’acclimatation qui leur permet de s'adapter à leur environnement, ils seront hébergés entre 3 à 5 par cage pour le respect la cohésion sociale de l'espèce, et manipulés quotidiennement jusqu’au début des expériences. Cette période d’habituation permet de réduire leur niveau de stress lors des manipulations ultérieures. Les cages, transparentes, sont enrichies (tunnels de manipulation en carton, carrés de cellulose et bâtonnets) et sont rapprochées les unes des autres, afin que les animaux aient un contact visuel avec leurs congénères. Un suivi des points limites sera mis en place suivant une méthode de prise en charge adaptée au projet. Les expérimentations sont réalisées lorsque cela le nécessite, sous anesthésie générale avec l'utilisation d'analgésiques adaptés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé et expérimenté, soucieux du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en toxicologie et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines et de leur impact sur le microbiome intestinal. La disponibilité de modèles animaux d’induction de colite murins pertinents pour nos questions de recherche et le besoin ponctuel de travailler en environnement axénique (complétement stérile) , principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent de plus des facteurs important qui en fait l’espèce animale de choix. Les animaux seront utilisés à partir de 6-8 semaines (adultes), afin que le système immunitaire et le microbiote instestinal soient installés, ainsi nous pourrons évaluer l’impact de notre bactérie sur la structure, la composition de l’intestin, ainsi que la gestion de l’inflammation associée à la colite induite, et ce dans l'objectif de proposer aux patients une solution thérapeutique adaptée et efficace.
Défaut diaphysaire fémoral chez le rat : un modèle orthopédique pour l’étude de biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
220 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux au fémur, puis un suivi par micro-scanner sous anesthésie toutes les deux semaines pendant deux mois, avant l'euthanasie pour analyses histologiques. Le porteur revendique un modèle déjà maîtrisé et reproductible dans son unité, et affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer les biomatériaux au regard de la réglementation. Les retombées annoncées, de nouveaux dispositifs de comblement osseux pour les patients, restent formulées au conditionnel.
Objectifs
Si les greffes de tissus osseux sont désormais courantes pour réparer un os à la suite d’une fracture ou d’autres lésions, cette stratégie présente des limites. C’est pourquoi notre équipe travaille sur le développement de fragments d’os synthétiques ou hybrides (incluant des cellules souches) qui sont nommés des biomatériaux. Ces biomatériaux doivent être à la fois souples et résistants, mais aussi poreux afin qu’ils puissent être colonisés par des cellules. Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau (c'est à dire sa capacité à reformer de l'os) nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle étudié est un défaut osseux au niveau du fémur du rat afin d'évaluer le pouvoir régénérant des biomatériaux implantés. La formation de l'os sera suivie dans le temps grâce à une technique d'imagerie de pointe, indolore et non invasie : un système de tomographie préclinique micro scanner X. L'objectif étant à terme de pouvoir proposer aux patients des matériaux implantables efficaces et adaptés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) qui pourraient être proposés aux patients atteints de pathologie osseuses ou accidentés (fracture...).
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Elle est réalisée sous anesthésie générale et le suivi des animaux durant la phase de récupération est renforcé. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure d'imagerie non invasive, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (et maintenu au masque dans l'enceinte du scanner). L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sur un site orthopédique, cette intervention ne nécessite pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie pourra engendrer une douleur modérée pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Les signes de douleur et de récupération des animaux représente ceux communément observés pour une telle intervention chez l'Homme suite à une reconstruction osseuse suite à un accident par exemple. Une surveillance rigoureuse sera établie afin de pallier à ces inconvénients et de mettre toutes les mesures en place afin de prendre en charge les animaux.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivi par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés a être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les examen d'imagerie par micro-scanner sont réalisés sous anesthésie générale, avec un suivi des paramêtres tout au lon de l'exeman. Le raffinement des conditions d’hébergement est réalisé notamment par l'enrichissement de l’environnement d’hébergement (la litière en copeaux, jouets, bâtons à ronger mis à disposition) et suivi quotidien des animaux par le personnel qualilié et attentif au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit, étape primordial dans le cadre du processus de validation d'un disposition médical à destinée humaine. Des rats adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Validation des méthodes d’évaluation de l’ototoxicité à l’aide d’une molécule de référence: 3, 3′ iminodipropionitrile
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
84 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère. Ils subissent une chirurgie crânienne pour la pose d'un dispositif de contention, puis reçoivent pendant trois jours un composé neurotoxique de référence, le 3,3'-iminodipropionitrile, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur indique que ce toxique provoque une dépression du système nerveux, une faiblesse musculaire, une hypothermie et des troubles de l'équilibre qui persistent dans le temps, et décrit deux tests comportementaux, le retournement et la suspension par la queue. L'objectif affiché est de valider les méthodes du laboratoire pour évaluer plus tard la toxicité de produits industriels sur l'oreille interne.
Objectifs
Ce projet consiste à valider des méthodes qui seront utilisées pour évaluer la toxicité de produits industriels, rencontrés dans le monde de travail, sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre, tous deux situés dans l’oreille interne à l'aide d'une molécule de référence: 3, 3' iminodipropionitrile. Cette étude permettra au laboratoire de poursuivre l'investigation de molécules suspectées toxiques pour l'oreille interne et d’informer les préventeurs sur des risques potentiels de certains produits industriels en renseignant notamment les fiches toxicologiques.
Bénéfices attendus
Les tests mis en oeuvre dans cette pré-étude avec le 3, 3' iminodipropionitrile, molécule de référence connue pour altérer l'audition et l'équilibre chez l’animal, permettront de valider les méthodes expérimentales qui seront déployées afin d'évaluer la toxicité de produits industriels sur la cochlée et le vestibule, récepteurs de l'audition et de l'équilibre.
Procédures
Chirurgie crânienne: Les animaux (42 rates) sont équipées d’un dispositif de contention au niveau de leur crâne, dans le but d'enregistrer leur mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par rotation. Cette intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excèdera pas une heure par animal. Elle sera réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures seront effectuées sur les 42 rates ayant subi une chirurgie cranienne, au moins 21 jours auparavant. Elles seront réalisées avant administration du 3, 3' iminodipropionitrile ou de NaCl 0,9% (T0) et 1 mois après traitement (T1). Cette mesure nécessite une contention. La durée de cette procédure est estimée à 10 minutes par animal. Tests comportementaux : A T0 et T1, 42 rates seront soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire : le test de retournement et la suspension par la queue. Moins de 10 minutes par animal sont requis pour effectuer ces 2 tests comportementaux. Une fois ces mesures effectuées, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 42 rates seront soumises à une anesthésie légère (kétamine / xylazine, 45 / 5 mg/kg) afin d’enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir positionné une sonde au niveau de l’oreille gauche. Ces mesures seront effectuées avant traitement au 3, 3' iminodipropionitrile (T0) puis 1 mois (T1) après traitement. Quinze minutes par animal sont nécessaires. Traitement par voie intrapéritonéale avec le 3, 3' iminodipropionitrile ou NaCl 0,9% : Les rates seront traitées pendant 3 jours successifs par voie intrapéritonéale (2mL/kg) soit au NaCl 0,9% (20 rates), soit à une des trois doses de 3, 3' iminodipropionitrile : 150, 200 ou 300mg/kg (64 rates). Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque afin de réaliser l’histologie de l’oreille interne.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans ce projet sont ceux résultant du traitement des rats avec le 3, 3’ iminodipropionitrile, décrit dans la littérature comme un toxique engendrant des dommages au niveau des récepteurs de l’audition et de l’équilibre. Il est rapporté une apparition rapide d’un effet dépresseur sur le système nerveux central, ainsi qu’une faiblesse musculaire et une hypothermie. Des troubles de l'équilibre et des effets sur le système locomoteur apparaissent dans les jours qui suivent la fin du traitement et persistent dans le temps. Des pertes de poids reversible sont attendues pendant la semaine du traitement. L’utilisation de ce toxique nous permettra de valider les outils mis au point au laboratoire pour évaluer la toxicité de produits chimiques rencontrés par les salariés au niveau de leur poste de travail.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates traitées au 3, 3’ iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 3 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rats traités au 3, 3’iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 4 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques.
Remplacement
La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle in vitro de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données devront être confirmées par une étude sur l’animal avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces substances sur cet organe. L’étude prévue s’appuiera sur des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochleotoxiques et vestibulotoxiques. Etant donné l’absence de recul sur ces techniques appliquées au vestibule, il s’averait nécessaire de valider et calibrer nos méthodes à l’aide d’une molécule toxique à la fois pour la cochlée et le vestibule. Le choix s’est porté sur le 3, 3’ iminodipropionitrile. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que deux tests comportementaux pour l'équilibre (retournement et suspension par la queue). Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.
Réduction
Tous les efforts ont été faits pour limiter le nombre d’animaux utilisés afin de répondre à la question scientifique. Trois doses différentes de 3, 3’ iminodipropionitrile sont nécessaires pour encadrer le seuil de toxicité qui doit se trouver vers 3 x 200 mg/kg. Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus post-rotatoire ne permettant pas les mesures de produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront donc prévus. Ainsi pour chaque dose de 3, 3’ iminodipropionitrile, 2 groupes expérimentaux seront programmés, l’un pour la mesure du nystagmus post-rotatoire et le second pour les mesures de comportement suivies des mesures de produits de distorsion acoustique. De la même manière, 2 groupes contrôles seront également prévus. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé en réalisant un calcul de puissance statistique (logiciel G-Power) en se basant sur un test de comparaison de moyennes à partir de données obtenues dans une étude antérieure avec un autre toxique où des variations de 25 % du nombre de saccades du nystagmus post-rotatoire sont attendues (contrôle : 100 ± 10, traités 75 ± 15, p
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront placés en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h, à une température de 22 ± 2°C et une hygrométrie de 55 ± 15%. Ils seront stabulés à 2 ou 3 animaux par cage dans des cages de polycarbonate ayant une surface au sol de 1032 cm2, et une hauteur conforme aux critères habituels pour leur espèce. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper du dispositif crânien, seront hébergés seuls pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose irradiée. Leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à être manipulés dans un premier temps puis à la contention.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.
Etude du rôle d’un facteur de synthèse des ribosomes dans le maintien de l’identité des cellules souches embryonnaires murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.
Objectifs
Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.
Bénéfices attendus
L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.
Procédures
Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.
Remplacement
Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.
Raffinement
Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.
Choix des espèces
L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la caracterisation des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant l'euthanasie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'imagerie n'ajoute pas de douleur mais qu'elle sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liés à la tumeur, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. L'objectif reste de valider l'IRM comme outil de suivi tumoral, les retombées pour les patients étant renvoyées à un stade ultérieur.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est le type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus mortel. En principe, les médicaments peuvent atteindre les tumeurs via les vaisseaux, mais l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses joue le rôle d'un antagoniste à toute délivrance efficace de médicaments. Les traitements récents associent la chimiothérapie à des médicaments, qui visent à renormaliser les vaisseaux de la tumeur en réduisant l'angiogenèse, c'est-à-dire la ramification de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants. Cependant, il n'existe pas encore de facon de distinguer les différents effets du traitement sur les cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer chez la souris 1) la taille de la lésion tumorale suite à l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau 2) les modifications des propriétés visqueuses et élastiques du cerveau qui permettent d'évaluer l'intégrité des tissus et l'organisation vasculaire, 3) la circulation du sang dans les vaisseaux et leur organisation.
Bénéfices attendus
Disposer d’un marqueur biologique identifiable par imagerie robustes et non-invasifs pour évaluer les composants individuels de la t umeur, c'est-à-dire la composition des tissus et l'organisation du réseau des vaisseaux. Ces approches d'imagerie sont donc le moyen idéal pour évaluer les effets de la thérapie sur les tumeurs et l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses.
Procédures
Tous les animaux seront soumis a: 1) Imagerie par résonance magnétique au temps J7, J14, J28, J40 après implantation des cellules tumorales dans le cerveau (J0) pour une duree de 2h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse ) 2) prélèvement sanguin (qui dure environ 5 sec) afin d’évaluer la lésion tumorale 1 fois par semaine sans anesthesie pendant toute la duree du protocole 3) euthanasie pour prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises telles que l’administration d’ analgésiants. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure a fin de recuperer les cerveaux pour les analyses biologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'expérimentation animale sera mise en place pour étudier une modification locale de l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, qui serait difficile à étudier par des moyens alternatifs (par culture cellulaires ou en modélisation par logiciel).
Réduction
Les groupes ont été conçus de manière à minimiser le nombre d'animaux utilisés. Un calcul statistique du nombre de sujets nécessaires a été effectué afin d'évaluer le nombre d'animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en minimisant le nombre d'animaux. Ces calculs ont été rendus possibles par les résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur seront limités pour garantir le bien-être de l'animal et des résultats fiables. Le stress a un impact important sur le comportement biologique de la réponse immunitaire. Par conséquent, la manipulation des animaux sera réduite au minimum. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. De facon systematique, du coton est ajoute dans les cages pour que les souris fassent leurs nids. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Neanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. En effet, si le score comme indiqué ci-dessous indique des signes de douleur et donc la nécessité d'utiliser un analgésiant, celui-ci sera administrée avant de se rendre sur le site de l'IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillee et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
L'utilisation des animaux pour etudier le cancer présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation des cellules in vitro (n’utilisant pas de modèle animal). Plus de 80 % des gènes de la souris sont similaires à ceux de l'homme, ce qui a conduit à l'adoption de la souris comme organisme pour etudier la biologie et la thérapie du cancer du cerveau. Beaucoup d'etudes scientifiques ont démontré que les tumeurs dans les animaux, reproduisent mieux les caractéristiques des vaisseaux et des cellules des tumeurs cérébrales humaines. Dans ce contexte, les souris (âge adulte, agées 9-11 semaines) sont soumises à une transplantation dans le cerveau des cellules tumorales, et puis les souris sont soumises au protocole d’IRM pour étudier les propriétés des tissus et développer de nouvelles stratégies diagnostiques.
Effet de deux traitements sur la maladie Waldenström, pathologie maligne caractérisée par une production anormale d’anticorps.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Waldenström, elles reçoivent un gavage quotidien pendant trente jours et des prélèvements de sang hebdomadaires, sur une durée pouvant atteindre neuf mois, pour tester l'effet combiné de deux molécules. Le porteur indique ne prévoir aucune analgésie, au motif qu'elle fausserait l'étude du système immunitaire, et s'en remet à une grille de score stricte. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est connue et qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire.
Objectifs
La maladie de Waldenström est une pathologie hématologique maligne (cancer) qui se caractérise par une production anormale et excessive d’anticorps (élément impliqué notamment dans la réponse immunitaire suite à une infection). Les patients présentent alors une anémie (diminution de la production normale des globules blancs, rouges et des plaquettes) caractérisée par une fatigue et une pâleur de la peau notamment. Cette maladie est associée à deux mutations génétiques retrouvées fréquemment chez ces patients. A ce jour, le traitement le plus utilisé chez ces patients cible l’une de ces mutations. Cependant même s’il est efficace, il ne conduit pas à une rémission complète. Un essai clinique actuellement en cours, utilise une molécule agissant spécifiquement sur la seconde mutation. Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique combiné de ces deux molécules sur cette pathologie en utilisant un modèle de souris et obtenir des informations sur le mécanisme d’action de ces traitements en vue de leur amélioration.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de deux molécules pouvant être utilisées dans le traitement de cette maladie. Cela pourrait nous permettre également d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de cette maladie encore incurable.
Procédures
Afin de tester l’effet combiné des deux traitements, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées exprimant les deux mutations génétiques retrouvées chez les patients atteints de la maladie de Waldenström. Les connaissances actuelles sur ce modèle murin ne montrent pas d’altération de leur bien-être. Nous utiliserons comme contrôle des souris normales (sans mutation génétique) ainsi que des souris exprimant l’une ou l’autre de ces mutations (pas d’altération du bien-être observée chez ces animaux). Toutes les souris seront soumises à un protocole de traitement consistant à administrer par gavage les deux types de molécules thérapeutiques seules ou combinées (soit quatre groupes expérimentaux dont un recevant uniquement une solution saline). Cette administration non douloureuse durant moins d'une minute (réalisée sur souris éveillées avec des sondes adaptées afin de ne pas générer de blessures) sera quotidienne pendant 30 jours. Le traitement pourra être répété une seconde fois avec un intervalle d’un à six mois entre les deux cycles. Afin de suivre l’effet des traitements sur le développement de la maladie, des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux d'une durée de 30 secondes réalisé sur souris éveillées) seront effectués chaque semaine sur toute la durée de la procédure expérimentale (durée pouvant allant de 30 jours à 9 mois). Dans la première expérience, les animaux seront euthanasiés immédiatement après la fin du traitement (au bout de 30 jours). Dans la deuxième série, les animaux seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 12 mois maximum (soit 8 mois après la fin du traitement) afin de caractériser l’éventuelle reprise de la maladie. Enfin, nous procéderons à deux cycles de traitement, le second étant initié dès réapparition des symptômes (au plus tôt un mois après la fin du premier cycle de traitement). L’ensemble des souris inclus dans ces deux séries d’expériences seront euthanasiées au plus tard à l’âge de 12 mois.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet peuvent générer un stress important des animaux du fait de leur fréquence (administration par gavage quotidiennement pendant 30 jours, irritation possible du tube digestif, apparition des signes cliniques de la maladie). Nous y serons particulièrement vigilant (expérimentateur aguerri au geste de gavage et prenant soin de minimiser le stress lors de la manipulation des animaux).
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Les pathologies caractérisées par des dérèglements des cellules du système immunitaire sont complexes et mettent en jeu différents acteurs. L’étude de molécules thérapeutiques impliquent un système regroupant cet environnement. Aucune procédure de remplacement permettant d’éviter le recours à l’expérimentation animale n’est connue à ce jour. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude. De plus la distribution des molécules à visée thérapeutique ne peut pas être modélisée à ce jour dans un système non animal.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Trois fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. L'analgésie des souris n’est pas prévue. En effet, ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour réaliser les expériences de ce projet. Ce modèle animal est pertinent dans notre étude, car il existe un modèle transgénique servant de modèle à la maladie de Waldenström. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes avec un système immunitaire totalement développé et fonctionnel.
Etude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par asphyxie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés en cage métabolique puis mis à jeun seize heures, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des farines de quatre insectes destinées à l'alimentation humaine. Le porteur reconnaît que l'environnement appauvri et la privation de nourriture induisent une angoisse et un stress modérés. Il affirme que ces effets nutritionnels ne peuvent être évalués in vitro ni maîtrisés directement chez l'homme.
Objectifs
Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de poissons (dont la disponibilité diminue) et de viandes. Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à̀ la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets organiques et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Suite aux résultats obtenus dans une étude préliminaire précédemment autorisée, il a été identifié une première farine d’insectes, source de protéines et enrichie en certains oligo-éléments (fer). Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’approfondir les effets observés en évaluant les impacts sur d’autres nutriments (fibres, acides gras, acides aminés) mais aussi en évaluant des impacts physiologiques (activité anti-inflammatoire, effet prébiotique, effet sur l’immunité). De plus, 3 autres types de farines provenant d’autres insectes seront étudiées et comparées.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d'insectes seront supérieur à une alimentation standard, ce qui mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées en alimentation humaine en substitut aux protéines d'origine animale.
Procédures
Les rats seront placés en cage métabolique pendant 40 heures au total. Durant les 24 premières heures, les rats recoivent eau et aliments spéciaux sans restriction. Ensuite, les rats seront placés à jeun pendant 16 heures toujours en cage métabolique, l'eau sera accessible sans restriction durant cette période. A l'issue de la procédure expérimentale, les rats seront mis à mort par asphyxie.
Impact sur les animaux
Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole et la mise à jeun pendant 16h, ceci classe la procédure en classe gravité modérée selon les recommandations réglementaires (https://www.legifrance.gouv.fr/loda/id/LEGITEXT000027038877/2020-09-23/) : en effet, l'environnement apauvri (pendant 2 jours) et la privation alimentaire (pendant une journée) induisent une angoisse et un stress modérés.
Devenir
Les rats seront mis à mort par asphyxie afin de recueillir tissus et organes qui doivent être analysés pour obtenir les résultats scientifiques escomptés.
Remplacement
L'étude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (42 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres, ce qui ne serait pas possible si l’étude était réalisée directement chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. De plus, nous souhaitons tester des farines issues de quatre insectes qui présentent des propriétés nutritionnelles différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à proposer pour l'alimentation humaine.
Raffinement
Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera ajouté au maximum 30 % de farines d’insectes. La formulation finale des aliments permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels, caloriques et physiologique des rats (aliments sous forme de croquettes à ronger). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelle, dans un environnement adapté et contrôlé dépourvu de pathogènes. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies sans restriction excepté pendant les heures de jeun. Le milieu sera enrichi pour pallier l'isolement. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle animal a été choisi en tenant compte de la littérature récente. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des rats. Nous nous appuyerons sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. De plus, ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude préliminaire précédemment autorisée réalisée sur des rats. Nous utiliserons de jeunes rats âgés de 6 semaines au démarrage de l’étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc adapter notre modèle animal à cette tranche d'âge.
Création des lignés primaires de muscles lisses bronchiques à partir du modèle de l’asthme chronique murin allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées à un allergène par injections intrapéritonéales puis intranasales sous anesthésie, avant des mesures respiratoires réalisées après trachéotomie sans réveil, pour produire des lignées de cellules de muscle lisse bronchique. Le porteur indique un risque de dyspnée corrigé par nébulisation de salbutamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du remodelage bronchique, tout en présentant ces cultures cellulaires comme un moyen de réduire à terme le nombre de souris.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autre des altérations de l’épithélium, des modifications de la matrice extracellulaire, un épaississement de la membrane basale, une hyperplasie des cellules à mucus, et une augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Les muscles lisses des bronches d’asthmatique se caractérisent par l’excès de prolifération cellulaire dont les mécanismes sont encore inconnus. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. L’augmentation de la masse mitochondriale est un support pour la prolifération des cellules du muscle lisse bronchique. L’étude sur les cellules musculaires lisses bronchiques en culture offre une possibilité de mieux déceler les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la masse mitochondriale des MLB et à son influence sur le remodelage bronchique. Le but de ce travail est de produire les lignées primaires de MLB à partir des bronches de souris témoins et asthmatiques sensibilisées soit à l’ovalbumine soit aux acariens. Ces cellules primaires seront analysées avec les techniques très variées. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines de témoins et asthmatiques. Cette approche nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme. Cela permettra également d’apercevoir les différentes caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.
Bénéfices attendus
L’obtention des cultures primaires des MLB des souris asthmatiques et témoins permettra considérablement élargir le champs techniques d’études de remodelage bronchiques. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines des témoins et asthmatiques. Cette approche in vitro nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle important dans l’asthme. Cela permettra également de repérer la différence dans les caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales de l’allergène et à 9 injections intranasales sous l’anesthésie gazeuses (2 minutes). A la fin de protocole les mesures des paramètres respiratoires seront effectuées sur les animaux trachéotomisés (protocole sans réveil sous anesthésie).
Impact sur les animaux
Le risque de dyspnée chez les animaux suite à l’instillation de l’allergène sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie, les animaux seront observés par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation de salbutamol.
Devenir
L’objectif de ce projet est la récupération des bronches des animaux asthmatiques et témoins afin de produire les lignées primaires de MLB. La première phase nous permet de développer l’asthme murin. Lors de la seconde phase, les mesures des paramètres respiratoires seront faites et les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement des organes d’intérêt.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chronique murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes. Les lignées primaires des MLB nous permettront d’utiliser plusieurs techniques additionnelles pour déceler les causes de la maladie. Au final, cela permettra de réduire le nombre des souris de l’expérimentation animale dans l’étude de l’asthme.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 10 souris dans chacun des trois groupes pour trois productions des lignées primaires en question. Le nombre défini est le nombre minimal de souris qui peut être utilisé pour l'obtention de données scientifiques robustes.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, copeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales d’allergène, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). La dernière phase du projet, comporant les mesures des fonctions respiratoires est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée, sans réveil pour l'animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.