Rongeurs

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie réduisant leur fonction rénale à 30 % pour reproduire une insuffisance rénale chronique, puis reçoivent deux composés dans leur nourriture cinq jours sur sept pendant six semaines, avant une mesure de pression artérielle sous anesthésie terminale et le prélèvement de nombreux organes. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" et que le remodelage des tissus ne peut être évalué que sur un animal entier, tout en menant en parallèle des tests sur cellules rénales. Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements, sont renvoyés au moyen terme et au conditionnel.

Objectifs

La mortalité due à l'insuffisance rénale chronique (IRC) et l'insuffisance rénale terminale devrait devenir la 5ème cause mondiale de décès d'ici 2040. L'IRC altère significativement la qualité de vie et la sociabilisation des patients et représente une charge économique importante puisque la thérapie de remplacement rénal (dialyse) coute environ 38 000 €/patient/an. Ainsi, pour des raisons médicales, sociales et économiques, les efforts visant à réduire le nombre de patients atteints d'IRC présentent un intérêt majeur. Le rat va être utilisé comme modèle d’IRC induite par réduction chirurgicale de la masse rénale car il récapitule fidèlement la maladie humaine avec une atteinte des différentes structures du rein. L'objectif principal du projet est de contribuer au futur traitement de l'IRC en validant l'efficacité de deux composés innovants.. Les deux composés, administrés dans un cadre préventif précoce, ont montré des effets très prometteurs chez l'animal. Le projet a pour but : 1) la validation des 2 composés dans ce modèle de rat avec une focalisation sur la fibrose rénale et la synergie avec les traitements existants dans un cadre curatif ; 2) fournir une vue détaillée des mécanismes d'action des composés ; 3) évaluer la valeur translationnelle des composés, c’est-à-dire les possibilités de transposition des résultats chez l'homme et application en clinique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement à moyen terme de nouveaux traitements afin de lutter contre la progression de l'insuffisance rénale chronique. De nombreux médicaments initialement prometteurs dirigés contre la progression de l'IRC ont échoué en clinique. Nous visons à valider l'efficacité de 2 composés dans le traitement de l'IRC en nous focalisant sur leurs possibilités de transposition en santé humaine. Ainsi, les deux composés seront testés chez le rat en parallèle avec les traitements déjà utilisés chez l'homme. L'étude des protéines modifiées dans le rein, combinée à une analyse bio-informatique poussée et à une validation in vitro sur des cellules rénales, nous permettront d’étudier les processus affectés par les composés pour : 1) valider que les mécanismes anticipés sont bien ciblés; 2) prédire les effets secondaires/hors cibles et ; 3) proposer de nouveaux composés qui pourraient être utiles dans le traitement de l’IRC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour ne laisser que 30% de la fonction rénale pour mimer l'insuffisance rénale chronique humaine. Des injections sous cutanée deBuprenorphine sont effectuées pour prévenir la douleur lors de la chirurgie et pendant la période post-opératoire (pendant 24h à 48h). Un groupe contrôle suivra une chirurgie « simulée » (incision de l’abdomen et manipulation des reins sans ligature ni excision) . La durée de la chirurgie est de 35 minutes. Deux prélèvements d'urine auront lieu au cours du projet: 1 mL environ sera prélevé par massage abdominal au niveau de la vessie en moins de 2 minutes. La fonction rénale des animaux sera évaluée deux fois au cours du projet à l’aide d’un dispositif miniature placé en 10 minutes maximum. Ce dernier permet de mesurer à travers la peau l’élimination par le rein d’une substance fluorescente injectée en intraveineux sous anesthésie. Les dispositifs miniatures sont maintenus sur la peau des rats à l’aide d’un adhésif et d’une gaze et les mesures sont ensuite effectuées pendant 2h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement (pas de douleur et peu de stress). Cette technique évite la réalisation d’un prélèvement sanguin. Les traitements seront administrés 5 jours sur 7 pendant 6 semaines dans la nourriture des animaux (boulettes contenant les produits à tester). Les rats sont isolés en présence de la boulette de nourriture et remis dans leur cage une fois qu’ils l’ont mangée (évite les gavages). A la fin du protocole, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie générale gazeuse, cette partie de la procédure étant sans réveil. Un cathéter est implanté dans la carotide droite et relié à un capteur de pression. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Plusieurs étapes du projet sont susceptibles d’induire des nuisances pour les animaux : la chirurgie sous anesthésie gazeuse et la réduction de la fonction rénale. L’utilisation d’analgésiques lors de l'opération et pendant 48h post-opératoire permet de limiter la douleur. L'analgésie post-opératoire sera évaluée avec une grille de score. Trois à 5 jours après l’opération, une perte de poids de maximum 10 % peut être observée. Le poids doit revenir à la normale au bout d'une semaine post chirurgie. La perte de poids est due en partie à la laparotomie (incision des muscles abdominaux) qui peut causer une gêne pour l’alimentation, la nourriture étant sur le couvercle des cages. Afin de favoriser l’alimentation des rats, de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages. Les rats sont isolés pendant 24h (jusqu'à 48h) suite à la chirurgie, ce temps leur permet de retrouver une activité normale (exploration, mobilité) et permet de vérifier la bonne cicatrisation de leur plaie. L’isolement des animaux pouvant être une source de stress, ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urines sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux. Ce mode de prélèvement permet d’éviter d’isoler les rats dans des cages métaboliques pendant plusieurs jours (source de stress). Les nuisances induites se limitent alors à une contention de quelques secondes. Lors de l’étude de la fonction rénale, les rats sont anesthésiés avant d’être rasés et un dispositif miniature est fixé sur le dos, puis l’injection intraveineuse du traceur fluorescent est réalisée sous anesthésie également. La mesure se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Ainsi, ce protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Les traitements seront administrés dans la nourriture ce qui permet d’éviter le stress et les possibles lésions de la trachée induites par la réalisation quotidienne de gavages. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur et n’ont pas entrainé d’effet indésirable.

Devenir

A l’issue de la procédure, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%), cette partie de la procédure étant sans réveil. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement de la pression artérielle, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés par injection intraveineuse d’une dose létale de pentobarbital (Exagon ou Euthasol, 400 mg/kg, I.V.). L’euthanasie des animaux est nécessaire afin de permettre le prélèvement de leurs organes en vue de nombreuses analyses biochimiques, histologiques, génétiques et protéomiques, entre autres. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires. Seront notamment prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (soléaire, gastrocnémien), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (épididymal, péri-aortique, sous-cutané).

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à cette étude pour induire une insuffisance rénale chronique et une fibrose des reins, permettant ainsi l’évaluation du potentiel thérapeutique des molécules d’intérêt. Le remodelage de la structure des tissus (rénal notamment) est un processus complexe qui ne peut être évalué que sur l’animal. Ses déterminants ne peuvent pas être fidèlement reproduits par des méthodes alternatives. L'interaction entre différents organes (rein, cœur, vaisseaux sanguins, muscles, cerveau …) est nécessaire afin de représenter la pathologie humaine affectant divers organes cibles à divers stades de l’insuffisance rénale chronique. Le projet prévoit par ailleurs des tests in vitro sur différents types de cellules rénales. Ces tests permettront d’évaluer les mécanismes d’action des composés testés. Les résultats obtenus dans le modèle animal seront ainsi approfondis et complétés. L’étude sur cellule ne permet cependant pas de reproduire et d’appréhender le processus complexe de fibrose des reins.

Réduction

Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en teant compte de la diminution de la fibrose rénale (-35%) à atteindre, de la variabilité attendue des observations et des tests statistiques pour étudier l’efficacité des composés. Des animaux mâles et femelles seront inclus dans l’étude afin que nos résultats soient plus représentatifs. Ainsi, 12 animaux (6 femelles et 6 mâles) seront inclus dans les différents groupes et au total : 8 x 12 = 96 animaux seront nécessaires à la réalisation de l’étude. L’inclusion de groupes traités avec les thérapies existantes, les analyses approfondies de l'expression des protéines et les résultats très prometteurs dans d’autres modèles doivent permettre l’obtention de résultats positifs et transposables en clinique. L'étude des protéines apportera aussi une meilleure compréhension du modèle et des thérapies actuelles. Le test de 8 groupes en parallèle permet d’éviter de devoir répéter les groupes « contrôles » (animal sain et animal avec IRC non traitée) plusieurs fois. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires afin d’obtenir un maximum de résultats à partir d’un animal. Seront prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (mollet), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (gras). Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant les logiciels GraphPad Prism v5.0 et SAS v9.4.

Raffinement

L’opération chirurgicale deréduction de la masse rénale est réalisée sous anesthésie gazeuse et en une seule étape, ce qui évite d’avoir à opérer 2 fois les animaux. Des injections d’analgésique sont effectuées afin de prévenir la douleur lors et la chirurgie et pendant la période post-opératoire ( évaluation de la douleur avec une grille de score). La plaie sera désinfectée et une pellicule d’Ercefilm y sera déposée (pansement pelliculaire transparent qui protège les plaies des contaminations et permet le contrôle visuel de la cicatrisation). Un protecteur oculaire (« Ocry-gel ») sera utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement (activité, cicatrisation) pendant la semaine post-opération et de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages afin de favoriser leur prise alimentaire. Les rats sont isolés pendant 24h (à 48h) suite à la chirurgie, jusqu’à retrouver une activité normale (exploration, mobilité et cicatrisation). Ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urine sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux (pas d’isolement stressant pour les rats). La mesure de la fonction rénale se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Le protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Cette technique de mesure récente permet d’avoir accès à une mesure très précise de la fonction rénale et évite un prélèvement sanguin. Avant les traitements, la mesure permettra de vérifier que les fonctions rénales des rats dans les différents groupes sont homogènes et qu’il n’y a pas de biais d’un groupe à l’autre. Les traitements seront administrés dans la nourriture (après entrainement d’une semaine) pour éviter le stress et les possibles lésions de la trachée occasionnées lors de gavages quotidiens. Cela limite aussi l’utilisation de solvants (type éthanol) nécessaires à la dissolution de certains composés testés, pouvant présenter une toxicité et confondre les résultats. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur sans entrainer d’effet indésirable.

Choix des espèces

Le rat est un animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont très proches de celles de l’homme. Les genèse de l’IRC humaine est mieux reproduite chez le rat que chez la souris et seul des modèles complexes à utiliser (techniquement et éthiquement) tel que le chien ou le porc présentent une IRC plus proche de celle de l’homme. Le modèle de réduction de la masse rénale chez le rat est bien caractérisé et les outils immunologiques, biochimiques et moléculaires sont largement disponibles pour cette espèce, permettant une bonne exploitation des échantillons. Les rats sont réceptionnés à l'âge de 7 semaines (150-175g pour les femelles et 200-225g pour les mâles). La chirurgie sera effectuée après 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement soit à l’âge de 8 semaines. A cet âge les animaux ont récemment atteint leur maturité sexuelle (stade jeune adulte). La réduction de masse rénale à ce stade « jeune » permet d’obtenir une insuffisance rénale mimant bien la pathologie humaine. Les rats suivront ensuite des traitements entre leur 14ème et 20ème semaine de vie (stade adulte). Agés de 14 semaines après avoir suivi la chirurgie de réduction de masse rénale à 8 semaines, les rats présentent une pathologie bien installée tout en ayant encore une fonction rénale résiduelle assez importante (pathologie pas trop sévère permettant aux potentiels traitements d'agir).

800 souris et 1 520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des microhémorragies cérébrales leur sont provoquées par injection intracarotidienne de cyclodextrines ou par injection intracérébrale stéréotaxique de collagénase, suivies de tests comportementaux et d'imagerie IRM et TEP répartis sur douze mois. Le porteur indique des gênes possibles comme une perte d'appétit, une baisse de motivation ou une anxiété, et une mise à mort échelonnée pour examen du cerveau. Il affirme qu'un projet de neurosciences intégratives ne peut être mené avec des méthodes in vitro et nécessite un modèle animal.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation de 2 modèles pré-cliniques de microhémorragies cérébrales (MHC), chacun ayant leur intérêt et leur spécificité. En effet, le 1er modèle permet de développer des MHC disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se raprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives telles que l'angiopathie amyloide cérébrale. Ce modèle innovant repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, deviennent toxiques pour les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), et ainsi « érodent » les membranes cellulaires endothéliales et permettent ainsi d’obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris, mais, afin d’optimiser la résolution de nos analyses, nous souhaitons transposer ce modèle chez le rat. Nous pourrons ainsi améliorer la détection et l’évaluation des mécanismes impliqués dans la survenue de MHC. Le 2ème modèle a but pour d'induire une MHC unique au niveau cortical. Ce modèle a l'avantage de connaitre précisément la localisation de la microlésion et ainsi d'en étudier son impact direct sur le tissu environnant et son impact fonctionnel (cognitif et métabolique) de façon reproductible. Ce modèle repose sur l'injection stéréotaxique de collagénase et a été validé chez la souris. Ainsi, notre projet repose sur 3 axes essentiels: (i) Etudier la modulation des régulateurs hémostatiques dans le parenchyme de cerveaux de rats soumis à des microhémorragies disséminées. Les régulateurs de la coagulation et de la fibrinolyse seront examinés au niveau des microvaisseaux cérébraux pour évaluer l’altération de l’hémostase locale. De même, afin d’être au plus proche de la réalité clinique, nous souhaitons travailler sur des animaux des 2 sexes et plus âgés. (ii) Moduler pharmacologiquement les mécanismes impliqués lors de la survenue de MHC, notamment au niveau des régulateurs hémostatiques et de la neuroinflammation. (iii) Etudier les mécanismes physiopathologiques impliqués suite à l'induction d'une MHC unique et leur modulation pharmacologique dans une lignée de souris sauvages et dans une lignée transgénique portant un gène APP humain muté (souris APPJ20) et les corréler à l'évolution du déclin cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet a l'avantage de proposer 2 modèles différtents de MHC (unique et disséminées), ce qui permet d'étudier les différents aspects de ces micolésions. En effet, les conséquences cognitives et tissulaires à plus ou moins long terme ne sont pas les mêmes. De même, ces 2 profils sont retrouvés en clinique humaine et les médecins sont souvent impuissants quant à la prise en charge de ces microlésions. Grâce à ces 2 approches, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes d’action et les conséquences des microhémorragies cérébrales, à court terme et à long terme et envisager, des projets de recherche translationnels avec la clinique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet va subir une chirurgie qui sera différente en fonction du modèle de MHC utilisé (injection de CD en intracarotidien pour le modèle MHC disséminées, injection en intracérébral par stéréotaxie pour le modèle MHC unique). Ces chrirugies se feront sous anesthésie générale à l'isoflurane qui durera entre 10 et 30 minutes en fonction du modèle. Tous les animaux du modèle de MHC unique seront soumis à une IRM de controle à 24h. Puis, l'ensemble des animaux réalisera des tests comportementaux à différents temps post-induction afin d'évaluer l'impact de la survenue des MHC au niveau moteur et cognitif. Ces évaluations sont généralement étalées sur plusieurs semaines (2 à 8 semaines selon le test utilisé). Par la suite, pour chaque temps d'intérêt, certains animaux (5 par groupe et par temps) seront soumis à une IRM afin d'évaluer la charge microhémorragique cérébrale et/ou à une TEP FDG afin d'évaluer le métabolisme cérébral in vivo. En fonction de la séquence utilisée en IRM, la procédure peut durer entre 15 et 30 minutes et 30 minutes d'acquisition pour la TEP FDG.

Impact sur les animaux

L'induction des MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront au maximum 5 acquisitions réparties sur 12 mois (IRM et TEP-FDG) nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. Enfin, il se peut que l'animal subisse une douleur trainsitoire lors de l'injection intrapéritonéale de produit radioactif lors de la procédure d'évaluation du métabolisme cérébral (TEP-FDG). Cette douleur sera temporaire et sans conséquence car le volume et la quantité de rayonnement injectés restent faibles (équivalent à une radiographie classique). La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

L'esemble des animaux seront gardés en vie à l'issu des procédures d'induction de MHC unique ou disséminées (procédures modérées, 800 souris et 1520 rats). Ils seront également gardés en vie après la procédure IRM ou d'évaluations comportementales (procédures légères). Ils seront mis à mort à plusieurs temps post-induction (1,5-3-6-9 et 12 mois) pour examen histologique et immunohistochimique de leur cerveau (injection létale de pentobarbital (doléthal®, 182.2mg/kg) en IP, procédure sans réveil).

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur l'impact des MHC avec des approches neuronales, vasculaires et comportementales . Un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2320 animaux (1520 rats et 800 souris). Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études comportementales et la réponse aux traitements présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie. Ainsi, des études statistiques seront réalisées à l'aide de tests paramétriques (Test t de Student) ou non paramétriques (Test de Mann-Whitney) selon la normalité de la distribution (déterminée via le test de Shapiro-wilk). Pour les évaluations longitudinales, nous utiliserons une ANOVA à deux facteurs (analyse des variances de façon bidirectionnelle). Pour l'ensemble de ces analyses, les différences seront significatives lorsque p≤0,05.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression , humidité de l'air), avec enrichissement.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des rats Wistar sur fond génétique stable et/ou des souris C57bl6 homozygotes stables. Pour étudier l’impact des MHC dans un contexte neurodégénératif, nous avons aussi fait le choix de souris génétiquement modifiées (APPJ20) développant des lésions caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Pour l’évaluation d’agents pharmacologiques, nous utiliserons des rats et des souris âgés de 10 semaines, âge où les souris ont acquis une maturité cérébrale et dont nous avons déjà une expertise dans notre modèle. Pour les études autour des régulateurs hémostatiques chez le rat, nous utiliserons également des animaux plus âgés (autour de 12 mois de vie) où les mécanismes délétères liés à l’âge se mettent en place.

1 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une insuffisance rénale chronique leur est induite par ablation partielle du rein, un modèle de diabète étant aussi employé, avec des prélèvements de sang par incision de l'artère de la queue et une échographie avant la mise à mort. Le porteur indique un risque de mortalité de 20 à 30 % lié à la néphrectomie et fixe des points limites incluant une perte de poids de 20 %. Il affirme que l'insuffisance rénale et la calcification vasculaire sont impossibles à reproduire in vitro, rendant le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objet d’étudier les mécanismes physiopathologiques reliant l’IRC et la calcification vasculaire en fonction de l’âge.

Bénéfices attendus

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle, le diabète et l’âge. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC conduit à la mise en place d’une hémodialyse. De plus, les patients IRC présentent un fort risque de développer des maladies cardiovasculaires. Parmi les atteintes cardiovasculaires observées chez les patients IRC, la calcification des vaisseaux (trait caractéristique de l’athérosclérose tardive) est très fréquente. Le projet vise à étudier l’influence de l’âge sur les mécanismes physiopathologiques reliant l’IRC et la calcification vasculaire, et de tenter d’identifier les cibles moléculaires de potentiels candidats médicaments.

Procédures

L’IRC sera induite par ablation partielle rénale (néphrectomie) dans plusieurs souches de souris mâles et femelles, jeunes et âgées. Nous utiliserons également un modèle de calcification vasculaire associée au diabète de type 1. Après caractérisation des modèles, les souris seront exposées à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la calcification. Avant leur sacrifice, les animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale (diurèse, débit de filtration glomérulaire) et cardiaque (échographie). Des prélèvements de quelques gouttes de sang par petite incision au scalpel de l'artère caudale (volume inférieur à 50µl) pourront être effectués toutes les 2 à 3 semaines après la dernière chirurgie pour mesurer la glycémie à l'aide d'un glucometer. La calcification vasculaire sera mesurée sur des vaisseaux (aorte) prélevés après sacrifice.

Impact sur les animaux

Procédure #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #2: apparition progressive d'un diabète Procédure #3: pas d'effet indésirable Procédure #4: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Procédure #5: procédure non invasive et non douloureuse effectuée sous anesthésie.

Devenir

Procédures #1 et #2: gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 3 à 6. Procédure #3: gardés en vie et utilisés dans les procédures #4 à 6.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë et la calcification vasculaire sont impossibles à reproduire in vitro. Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement).

Réduction

Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Calcification dépendante de l’IRC : compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à la néphrectomie, 15 animaux sont a priori suffisants pour détecter des différences significatives de la calcification vasculaire avec un risque à 5%. Calcification indépendante de l’IRC : compte tenu du très faible risque de mortalité (moins de 5%) lié à l’injection de STZ, 12 animaux sont a priori suffisants pour détecter des différences significatives de la calcification vasculaire avec un risque à 5%. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Wilcoxon pour les paramètres quantitatifs. Outre la minimisation du nombre de souris, les animaux seront observés quotidiennement afin d’évaluer le bien-être ou la douleur des animaux. Les points limites sont définis ci-dessous : #1-Perte d’appétit et/ou une diminution de la consommation d’eau (pendant 24 ou 48h entraînant une perte de poids et une déshydratation; #2-Perte de poids supérieure à 20% du poids initial; #3-Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après la chirurgie. En cas de dépassement des points limites (#1 et #2) ou (#1 et 1#3), les animaux seraient suivis attentivement pendant quelques jours et, si leur état ne s’amélioraient pas, les animaux seraient euthanasiés

Choix des espèces

Les travaux antérieurs de l’équipe ont été menés dans cette espèce couramment utilisée dans les études expérimentales sur l'insuffisance rénale chronique. Par ailleurs, la souris est un modèle animal validé de calcification vasculaire. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines (développement rénal complet) et 24 mois d’âge. L’insuffisance rénale, le diabète et la calcification vasculaire sont des processus assez longs à se mettre en place.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles des maladies de Charcot-Marie-Tooth et de myopathie centronucléaire, elles subissent une batterie de tests moteurs, suspension, force de préhension, marche sur tapis, barre crantée, électromyographie, ainsi qu'un test de von Frey, avant une mesure terminale des propriétés musculaires sans réveil. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'est observée chez les mutants et que le test de sensibilité mécanique est indolore. Il indique qu'une étude sur cellules ne peut évaluer la force musculaire de l'animal entier et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Le but de cette étude est d’évaluer les conséquences d’une mutation au niveau du gène de la dynamine 2 responsable chez l’homme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et d’apporter une thérapie par croisement génétique. La CMT est une maladie génétique qui affecte les nerfs périphériques et qui touche 50000 personnes en France. A ce jour, aucun traitement efficace n’est disponible. Nous avons démontré dans une étude antérieure une baisse de l’expression de la dynamine 2 chez l’animal portant la mutation responsable de la maladie de CMT. A présent nous souhaitons moduler le niveau de dynamine 2 dans des souris atteintes de CMT par croisement avec des animaux mutants myopathe qui présentent une sur expression de cette même protéine. De cette manière, les animaux issus de ce croisement génétique devraient montrés un niveau de dynamine 2 normal.

Bénéfices attendus

Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur la maladie, dans des nouveaux modèles de souris myopathes dont les mutations génétiques reproduisent fidèlement les symptômes musculaires de patients atteints de myopathies centronucléaires. De plus, cette étude vise à évaluer l'efficacité de la diminution de la protéine dynamine 2 chez la souris atteinte par la maladie de CMT.

Procédures

Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Hanging test-Mesurer la force du corps. Les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 60 secondes maximum. La force des souris sera mesurée 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec 15 minutes de pause entre chaque essai. 2. Grip-Mesurer la force des pattes. Le test sera effectué 3 fois/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. Le Grip test sera effectué une fois par semaine, sur 2 ou 4 pattes. 3. Gait-mesurer la position des pattes pendant le déplacement. L'animal est déposé sur un tapis roulant se déplaçant à une vitesse comprise entre 8 m/s et 14 m/s pendant 1 minute maximum. Ce test sera exécuté une fois par semaine. 4. Barre cranté-Mesurer l’habilité à se déplacer sur une barre cranté de 110 cm de long. Le test sera effectué 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. 5. EMG (Electromyographie)-Mesurer l’activité électrique musculaire. Ce test sera réalisé une seule fois. 6. VF (Von Frey)-Mesure de la sensibilité mécanique sur les pattes arrière de l’animal. Chaque patte arrière est mesurée 2 fois. Ce test sera réalisé une seule fois par semaines. 7. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). C'est une PE sans réveil.

Impact sur les animaux

Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteinte de CNM développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 6 semaines. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur au animaux contrôles. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. La souris atteinte de la maladie de CMT présente une légère perte de poids. Avant les mesures de conduction nerveuse, les souris seront anesthésiées afin d’éviter toute souffrance due à l'implantation des électrodes et tout mouvement. Lors de la mesure de la sensibilité mécanique les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sur une grille pendant 30 minutes environ. Le test consiste à appliquer un fil de nylon sur la voute plantaire de l’animal et de mesurer s’il réagit. Cette procédure ne nécessite pas de dispositif particulier pour limiter la souffrance car il s’agit d’un test indolore. En revanche, pour limiter l’isolement de l’animal, ce dernier est immédiatement replacé dans sa cage avec ses congénères dès la fin du test. En ce qui concerne les mesures des propriétés contractiles musculaires in situ (classe sans réveil), l’animal est fortement anesthésié avant de subir une opération chirurgicale consistant à d’une part isoler le nerf sciatique et d’autre part à libérer le muscle tibial antérieur.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie car les différents muscles et organes seront collectés pour une analyse histologique et biomoléculaire. Ces analyses nous permettront d'évaluer les potentielles effets bénéfiques de cette thérapie par croisement génétique et de mieux comprendre la maladie.

Remplacement

Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, ce modèle animal nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, les mâles et les femelles seront utilisés car cette maladie touche aussi bien les hommes que les femmes. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience mâles et femelles, nous prévoyons 160 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de ce croisement génétique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Les souris seront testées à l'age adulte c'est à dire de 7 à 8 semaines. A cet âge le phénotype lié à la maladie de CMT et le bénéfice de la thérapie sur la maladie pourra être aisement évalué.

98 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses coliques leur sont transplantées, les animaux sont maintenus vingt-cinq jours puis tués pour prélever la tumeur, un régime riche en lipides étant testé pour son effet sur la tumorigenèse. Le porteur indique que du sang dans les fèces ou tout autre effet indésirable entraînera la mise à mort de l'animal, et précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas modifier la réponse inflammatoire. Il affirme que l'effet d'un régime alimentaire ne peut être caractérisé in vitro et que la proximité physiologique avec l'humain justifie le recours à la souris.

Objectifs

L’enzyme Elovl5 catalyse l’élongation des acides gras et son expression est augmentée dans les tissus coliques tumoraux comparés aux tissus sains chez l’Homme. De plus, nos résultats in vitro montrent que l’inhibition de cette voie métabolique réduit la prolifération des cellules cancéreuses du côlon. Notre projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme elovl5 dans le développement du cancer du côlon et à évaluer l’importance d’un régime riche en lipides dans ce contexte. En effet, un régime riche en lipides augmenterait la tumorigenèse colique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’importance de Elovl5 dans le développement de cancer colique dans un contexte nutritionnel riche en lipides. Nous attendons une effet protecteur de l’absence d’expression Elovl5 validant cette enzyme comme cible thérapeutique. L’utilisation des modèles CT-26 et MC-38 permet de comparer le comportement de deux lignées cancéreuses coliques murines avec des profils mutationnels différents.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée pour transplantation des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les modèles utilisés de transplantation de cellules cancéreuses en sous-cutanée et de cancer colique induit par AOM et HFD peuvent induire des nuisances concernant le stress lié à la contention de l’animal au moment des différentes injections. Dans le modèle de cancer colique, du sang dans les fèces pourrait apparaître et occasionnerait la mise à mort de l’animal. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses, les souris seront maintenues 25 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement de la tumeur.

Remplacement

L'utilisation de ces modèles murins de cancer sont nécessaires pour évaluer la progression tumorale et métastatique dépendante d’acteurs cellulaires différents (système immunitaire notamment). L’effet d’un régime alimentaire ne peut être caractérisé dans un modèle in vitro. Par ailleurs, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 178 souris mâles sur un fonds génétique C57Bl6 seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée.Des souris mâles âgées d’au moins 6 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses. Les souris wt et Elovl5 ko seront mises sous régime spécifique également dès 6 semaines pour prise de poids rapide.