Rongeurs

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis huit semaines à un régime riche en graisses, à des prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue et à une injection d'amphétamine, avant une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur indique que les rats mutants sont aveugles et anosmiques et que l'amphétamine peut provoquer une hyperagitation ou des troubles moteurs transitoires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une mutation sur les fonctions cognitives.

Objectifs

Le but du projet est de mettre en évidence l'impact bénéfique d'un régime cétogène sur les troubles cognitifs sur un modèle animal intelligent : le Rat. Le régime cétogène existe depuis une centaine d'année et a été longtemps utilisé dans plusieurs indications médicales. Au-delà de la perte de poids, le régime cétogène est utilisé dans le traitement de diverses pathologies : épilepsie, cancers, maladies inflammatoires, etc. Nous disposons d'un modèle animal d'une pathologie mentale et souhaitons analyser l'impact de ce régime sur les troubles de la mémoire observés. Dans ce projet, nous voulons comprendre si les troubles de mémorisation et les altérations des voies de signalisation neuronales (dopaminergiques principalement) présents chez les animaux génétiquement modifiés constatés chez ces animaux, sont impactés ou non par l'état de cétose.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une première approche fondamentale pour déterminer le rôle d'un gène identifié chez l'Homme, dans une population de malades. Nous pourrons accumuler des données permettant de mieux comprendre le rôle du gène et ses interactions avec le métabolisme, dans le cadre d'une cétose. Ce projet nous permettra de comprendre les voies d'action de cette cétose, mise en place par une régime lipidique, et de définir si les mécanismes impliquant gène modifié dans la lignée de Rat étudiée sont sensibles à cet état. Ce projet constitue une première étape dans la compréhension des maladies génétiques humaines impliquant ce gène et dans la mise en place de traitements permettant de réduire les symptômes.

Procédures

Chaque semaine entre 7 et 14 semaines d'âge, les animaux subiront un prélèvement de deux gouttes de sang à la queue sur animaux vigiles. Cela se réalise en quelques minutes. Durant l'une des expériences, les animaux recevront une injection d'une faible dose d'amphétamine, afin de mettre en évidence le fonctionnement des voies dopaminergiques. Ce protocole s'étale sur 2 heures environ En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés de manière profonde pour une procédure de perfusion qui entraînera leur décès.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants présentent une cécité et une anosmie complète. Néanmoins, ils présentent un état général tout à fait normal, aussi bien au niveau du poids, du toilettage, de l'activité. Durant ce protocole, ils recevront une diète spécifique dont la source principale de calorie est le gras. Le passage dans ce régime entraine rapidement un état cétogène qui est lié à une perte d'appétit et une baisse de poids. Néanmoins, sur la durée de l'étude (8 semaines sous ce régime), aucun risque pour la santé des animaux n'est attendu. La procédure d'amphétamine peut induire un état d'hyperagitation ou au contraire des troubles moteurs compulsifs. Ces effets sont transitoires et un retour à la normale se fait naturellement dans les 2 heures qui suivent l'injection. Par ailleurs, les animaux sont monitorés durant cette période.

Devenir

En fin de protocole, nous effectuerons des prélevements post-mortem pour étudier l'impact du régime et de la mutation au niveau hépatique et central.

Remplacement

Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur les fonctions cognitives. Seul le modèle animal est suffisamment informatif pour pouvoir poursuivre la recherche dans ce domaine.

Réduction

Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les tests concernés. Par ailleurs, nous avons constaté qu'ils convenaient dans les études antérieures. L'ensemble du protocole expérimental a été mis en place pour réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés pour conclure. Nous étudierons plusieurs paramètres dans ce projet : le poids de l'animal, sa glycémie, son niveau de cétogène circulant. Les mêmes groupes d'animaux effectueront plusieurs protocoles expérimentaux afin de limiter le nombre d'animaux employés.

Raffinement

Dans ce projet, nous nous assurerons que le bien-être des animaux sera respecté durant l'ensemble de sa réalisation. En respectant les conditions recommandées d'hébergement, en nous assurant de l'absence de signes de souffrance, de lésions liées à des combats entre animaux. Les rats seront suffisamment jeunes pour être maintenus à deux par cages afin d'éviter un stress d'isolement. Les cages seront changées régulièrement afin d'éviter que le gras du régime cétogène ne favorise des lésions cutanées. Si le cas se présentait ; un traitement local serait administré pour éviter une infection locale. Dans ce cas, nous pourrions êtes amenés à isoler les animaux concernés pour permettre une bonne cicatrisation des plaies. L'ensemble de ce protocole est encadré par un suivi hebdomadaire du bien-être des animaux : suivi du poids, de l'état général, toilettage, posture, vocalisation. Tous ces paramètres permettront de nous assurer de l'absence de souffrance des animaux. Néanmoins, en présence d'une souffrance estimée à l'aide de nos tableaux de scorage

Choix des espèces

Le Rat est une espèce intéressante pour modéliser des pathologies humaines. En effet, il s'élève facilement, présente des comportements élaborés et nous pouvons accéder à des animaux génétiquement modifiés. Nous travaillons avec des animaux jeunes adultes qui présentent déjà les troubles cognitifs observés et sont disponibles auprès de notre partenaire.

26 souris et rats vont être utilisés, tous tués le jour même, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à faire pratiquer à des stagiaires la contention et des injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire et intraveineuse, ainsi qu'un prélèvement sous la mâchoire sous anesthésie. Le porteur indique que la principale nuisance est le stress lié à la maladresse possible des apprenants. Il affirme que l'utilisation d'animaux est "nécessaire" car la formation en conditions réelles permet un meilleur apprentissage.

Objectifs

La réglementation en expérimentation animale impose une formation à toute personne manipulant des modèles animaux. Les formations de concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Le programme de cette formation a été validé par le ministère

Bénéfices attendus

Les apprenants vont apprendre les bons gestes pour travailler sur un rat et une souris, afin de veiller à conserver le bien-être animal.

Procédures

Un grand moment sera consacré à la préhension et la contention, pour rassurer l'animal et avoir les bons gestes pour ne pas le stresser. Pour la souris : Avec la bonne contention; les apprenants pourront étudier comment faire une injection sous-cutanée, une intrapéritonéale et une intramusculaire, ainsi qu'une injection intraveineuse. Le prélèvement submandibulaire leur sera appris sous anesthésie. Pour le rat : Avec la bonne contention; les apprenants pourront étudier comment faire une injection sous-cutanée, une intrapéritonéale et une intramusculaire, ainsi qu'une injection intraveineuse

Impact sur les animaux

les nuisances attendues sont surtout le stress de l'animal, lié à l'initiation des apprenants qui pourraient être maladroits et stressés. Les formateurs seront présents pour veiller au confort de l'animal

Devenir

les animaux seront mis à mort le jour même après la séance de TP, par les formateur. Les animaux recevront une surdose d'anesthésique (kétamine/xylazine)

Remplacement

La CNEA impose une formation à tout usager devant pratiquer des actes sur des animaux. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux pour cet enseignement. La formation en condition réelle permet un meilleur apprentissage.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum. Une seule souris par apprenant sera utilisée et 1 seul rat par binôme sera utilisé.

Raffinement

Les animaux utilisés le seront pour la durée du TP de 4H. De plus les gestes pratiqués seront peu invasifs. Les rongeurs sont auparavant hébergés en groupes sociaux, ils bénéficient d’enrichissement de milieu et d’une période d’acclimatation. Tous les gestes seront encadrés par les formateurs et les points limites sont définis : en cas de stress et/ou souffrance trop importants, la mise à mort de l’animal sera mise en œuvre pour interrompre sa souffrance. Les séances de TP seront encadrées par 3 formateurs expérimentés, se répartissant les stagiaires en petit groupe.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont les espèces les plus utilisées dans l’Etablissement utilisateur de l’Université de Bourgogne. Les animaux seront utilisés à l’age de 8 semaines (âge adulte) car c’est à cette âge en général que les équipes de recherche commencent leur expérimentation.

1 610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeurs bronchiques humaines, des gavages quotidiens jusqu'à deux fois par jour cinq jours sur sept et des scanners, pour étudier la résistance aux thérapies ciblées du cancer du poumon. Le porteur indique des difficultés respiratoires liées à la tumeur et des inconforts liés aux gavages répétés. Il affirme que la croissance tumorale ne peut s'étudier que sur un modèle vivant et que les données précliniques chez la souris sont une étape "nécessaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des résistances aux thérapies ciblées dans les cancers bronchiques, principalement les inhibiteurs tyrosine kinase de l’EGFR (ou EGFR-TKi) dans le but d’identifier des combinaisons thérapeutiques permettant de limiter ou de prévenir la rechute chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet servira d'une part à apporter des connaissances scientifiques sur l'origine des mécanismes de résistance aux thérapies ciblées in vivo afin d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques, et d'autre part de tester les cibles qui auront préalablement été validées in vitro en réalisant des combinaisons de traitement dans le but de prévenir l'émergence de résistances. Les bénéfices seront à moyen terme de développer des essais cliniques chez les patients.

Procédures

1) Implantation de tumeurs sous-cutanées (PDX et xénogreffes) ; 5 à 10 minutes/manipulation, 1565 souris; 2) Gavages ; une à deux fois/jour, 5 jours/semaine,

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables potentiels ainsi que les mesures prises pour réduire, éviter ou atténuer ces nuisances sont décrits dans les procédures expérimentales. Les principaux effets indésirables peuvent être : 1) Des difficultés respiratoires liées à la tumorigénèse bronchique du modèle CCSP-rTA-EGFRL858R 2) Des inconforts liés aux gavages quotidiens 3) Des effets potentiellement indésirables liés aux traitements, dont les potentiels signes de toxicité feront l’objet d’un suivi rapproché

Devenir

Procédure 1 (implantation de PDX) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 2 (Implantation de cellules tumorales bronchiques humaines) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 3 (Traitement des souris par gavage) : une fois les tumeurs établies, les animaux seront traités par gavage et mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 4 (Tumorigenèse pulmonaire du modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R) : la croissance tumorale sera déterminée par CT-scan (procédure 5) et les souris seront traitées par gavage (procédure 3) puis mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 5 (CT-scan) : la croissance tumorale sera monitorée, les souris seront ensuite traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2.

Remplacement

L'étude des mécanismes à l'origine des résistances aux thérapies ciblées est en majeure partie réalisée in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, pour étudier la croissance tumorale, la dissémination métastatique et la réponse aux traitements qui sont des processus complexes, il faut prendre en compte plusieurs paramètres comme la présence du microenvironnement tumoral, le métabolisme in vivo, la circulation sanguine ou encore la présence du système immunitaire le cas échéant, ce qui n'est possible que via l'utilisation de modèles vivants. De plus, l’obtention de données précliniques chez la souris est une étape nécessaire pour l’établissement d’un protocole clinique chez les patients.

Réduction

Le nombre de souris utilisées fera l'objet d'une étude statistique préalable a fin de limiter au mieux le nombre d'animaux à utiliser tout en garantissant la fiabilité statistique des résultats

Raffinement

Les souris sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur. Afin de réduire au maximum le stress des animaux, ils seront manipulés avec précautions et calme durant toute la durée de l’expérience. Pour éviter le stress des animaux, le milieu environnemental et les conditions d’hébergement des souris seront optimisés (enrichissement, igloos, ajout de gels nutritifs, manipulation par personnel formé). Si besoin, nous utiliserons un agent analgésique (Buprecare, Buprénorphine) pour réduire la douleur liée notamment à l'implantation de tumeurs sous-cutanées. Quand nécessaire, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane 3%. Les souris seront quotidiennement observées pour détecter d’éventuels signes de souffrance (difficultés à respirer, prostration, dos voûté, agitation, activité sociale anormale).

Choix des espèces

Les souris NSG sont classiquement utilisées en oncologie car elles favorisent l’implantation et le suivi des tumeurs d’origine humaines (PDX), et les souris nudes sont classiquement utilisées dans le cadre de l’implantation et le suivi de lignées cellulaires telle que les lignées PC9, HCC4006 ou H3122. Il existe de plus de nombreuses données bibliographiques sur ces modèles, ce qui permet d’une part d’optimiser les séquences techniques (protocoles d’implantation) et d’autre part d’ajuster les traitements en fonction des données publiées. Le modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R a déjà été utilisé dans de nombreuses études et notamment au laboratoire, car il présente le double avantage d’avoir des caractéristiques histopathologies très similaires aux adénomes et adénocarcinomes humains (Politi et al. Genes Dev. 2006) et de reproduire l’évolution clinique observée chez les patients sous traitement aux EGFR-TKi (Politi et al, Dis Model Mech. 2010 ; Starrett et al., Cancer Res. 2020). Implantation PDX et xénogreffes réalisés sur des souris jeunes âgées de 6 et 8 semaines, ce qui permet d’une part de favoriser la prise des greffes et d’autre part de pouvoir réaliser des traitements pouvant aller jusqu’à 6 à 8 mois selon les modèles.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 23 injections intrapéritonéales quotidiennes d'un inhibiteur enzymatique, puis des tests comportementaux de mémoire, pour comparer trois composés candidats sur un modèle génétique de trisomie 21. Le porteur décrit la douleur des injections répétées comme la principale nuisance. Il affirme que l'étude de ces déficits d'apprentissage "nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l'homme".

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous esperons obtenir une amelioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires, memoire de travail et mémoire sementique)

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules inhibitrices de l'enzyme kinase Dyrk1A.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour.

Devenir

Tous les animaux seront Euthanasiés à l'issue de l'unique procédure décrite dans ce projet.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposées à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ces tests, des rongeurs mâles et femelles seront utilisés à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Le test statistique utilisé sera le test de Student pour des groupes non appariés avec comparaison de moyennes des différents groupes à une constante spécifiée, ici 50% correspondant à une performance au hasard. 16 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous utiliseront également un test ANOVA « génotype » x « traitement ». L'étude de se déroulera en 3 groupes d’expérience (1 groupe par composé) comme détaillées ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées. Ici, nous aurons donc un maximum de 48 x 3 =144 souris.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris et egalement une espèces physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite par un cocktail d'anticorps anti-collagène, puis des dendrimères sont testés seuls ou avec du méthotrexate, avant une mise à mort sous anesthésie par ponction cardiaque. Le porteur indique une inflammation et des douleurs articulaires entre le septième et le onzième jour, la buprénorphine étant administrée en cas de signes de douleur et une perte de poids de plus de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que la maladie est "difficilement modélisable en dehors de l'organisme" et invoque un "besoin" de nouveaux traitements.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, inflammatoire et auto-immune qui affecte principalement les articulations, induisant de forte douleur et une réduction de la mobilité articulaire. Son développement dépend d’auto-anticorps qui ciblent le soi et forment des complexes immuns dans l'articulation, entraînant l'attraction des cellules immunitaires et ainsi l’inflammation qui régit cette maladie. L’objectif de ce projet est d’utiliser le modèle murin appelé CAIA (pour « Collagen Antibody-Induced Arthritis », ou arthrite induite par des anticorps anti-collagène) pour étudier l’efficacité thérapeutique de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Dans ce modèle, l'arthrite est induite à l'aide d'un cocktail d'anticorps monoclonaux dirigés contre le collagène, et donc basé sur la physiopathologie de la maladie humaine. Depuis plus de 10 ans, notre équipe étudie des dendrimères de type Poly(PhosphorHydrazone) (PPH) à activité immunomodulatrice qui : 1) activent les monocytes humains en les réorientant vers une réponse anti-inflammatoire pro-résolutive ; 2) inhibent les cellules dendritiques immatures en bloquant leur différenciation en cellules matures pro-inflammatoires ; 3) inhibent la prolifération des lymphocytes T inflammatoires et induisent la différenciation de lymphocytes T anti-inflammatoires et pro-résolutifs. Nous avons validé ces propriétés sur des cellules humaines et dans des modèles animaux en prouvant l’efficacité thérapeutique de dendrimères PPH dans d’autres modèles de maladies inflammatoires chroniques et aigües. Dans ce projet, ayant recours à 360 animaux, notre objectif est d’évaluer leur potentiel thérapeutique pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle CAIA, seuls ou en combinaison avec un traitement de référence pour cette maladie, le methotrexate.

Bénéfices attendus

Dans la polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire attaque les tissus de l'organisme affectant principalement les articulations qui peut entraîner de graves lésions articulaires, de fortes douleurs et un véritable handicap pour les patients. Cette maladie affecte près de 150 000 personnes en France et 10 % des patients montrent une invalidité grave en moins de 2 ans. Les traitements dit de fonds pour cette maladie tels que le methotrexate présentent une efficacité limitée et présentent de conséquents effets secondaires. Plus récemment, les biothérapies ciblées mises au point permettent l’obtention d’une réponse favorable dans près de 75% des cas, mais ces traitements sont très couteux et n’entrainent une rémission prolongée que chez 25% des patients. Ainsi, ces données, bien qu’encourageantes, montrent la nécessité du développement de nouveaux traitements ayant peu d’effets secondaires, qui sont peu couteux et qui entraînent des réponses durables. Nous croyons que les dendrimères PPH que nous avons développé pourraient répondre à ce besoin. Ainsi, les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’activité anti-inflammatoire et l’efficacité thérapeutique des dendrimères PPH sur un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde. Cette étude, en combinaison avec nos datas confirmant l’activité immunomodulatrice de nos composés obtenus dans d’autres modèles (in vitro et in vivo) et des études de toxicologie menées chez le rongeur et chez des primates non humains (qui ont montré que notre molécule candidate principale ne présente pas de toxicité), permettra d’avancer considérablement notre étude pré-clinique dans le but de préparer des études cliniques chez l’homme.

Procédures

L’ensemble des animaux subiront 2 injections intrapéritonéales (une avec le mélange d’anticorps anti-collagène ou du PBS, et l’autre avec du LPS ou de PBS) réalisées à 72h d’intervalle. Ce geste, rapide et indolore pour les souris, sera réalisé sur animaux vigiles. 210 animaux seront soumis à des injections intraveineuses des dendrimères et/ou de méthotrexate ou du PBS 5 fois (à J0, J3, J5, J7 et J9). Pour cette technique, les animaux seront placés dans des tubes de contention afin de limiter leurs mouvements et ainsi le risque de blessures et d’échouer à l’injection dans la veine caudale. Ce geste rapide et indolore, est réalisé sur animaux vigiles. 140 souris seront soumis à des administrations par voir orale des dendrimères et/ou de méthotrexate ou du PBS 5 fois (à J0, J3, J5, J7 et J9). Ce geste, rapide et indolore pour les souris, sera réalisé sur animaux vigiles. A l’issue des traitements, lors de la mise à mort des animaux, l’ensemble des souris seront profondément anesthésiés avec un mélange de kétamine (100mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg), puis un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé et une dislocation cervicale sera pratiquée afin de provoquer la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux qui développeront une arthrite peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires à partir de la mise en place de la pathologie (J7) jusqu’à la fin du protocole expérimental (J11). Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creusé/dos voûté, yeux enfoncés/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) de la buprénorphine (0,05mg/kg) sera administrée. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. L’expérimentation peut également induire un stress pour les animaux. Pour limiter cela, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie avant de débuter l’expérimentation et seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants.

Devenir

L’ensemble des souris seront soumis à la procédure 1. A l’issue de la procédure 1, (Induction de l’arthrite par administration d’un cocktail d’anticorps dirigés contre le collagène ou CAIA), pour tous les animaux sauf les 40 souris qui nous servent pour la mise au point du modèle CAIA, les animaux seront inclus dans les procédures 2 (Injection intraveineux de dendrimères ou de méthotrexate) et/ou 3 (Administration de dendrimères par voie orale). A l’issue de ces procédures, l’ensemble des souris seront inclus dans la procédure 4 (Sacrifice et prélèvement sanguin et des membres postérieures), classé sans réveil.

Remplacement

Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires. Le processus de développement d’un nouveau médicament comporte plusieurs étapes. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait généralement appel à l’expérimentation animale. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences réalisées sur des organsimes vivants ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées sur cellules isolées. En outre, la polyarthrite rhumatoïde est une pathologie complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires et, de fait, est difficilement modélisable en dehors de l’organisme.

Réduction

Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous réaliserons à l’issue des traitements des analyses anatomiques (étude des articulations), cellulaires (analyses des cellules immunitaires dans les articulations et circulantes) et moléculaires (dosage de cytokines inflammatoires) à partir d’échantillons prélevés sur un même animal. Nous avons une grande expérience de ces techniques et nous utilisons des analyses statistiques appropriées et des logiciels spécialisées pour les réaliser afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, les études sur l'efficacité des dendrimères pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle CAIA après administration par voie orale ne sera réalisée que si les molécules ont montré une efficacité après administartion par voie intraveineuse.

Raffinement

Nous avons conçu nos expériences dans l’optique de réduire le stress et la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie avant de débuter l’expérimentation et seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants. Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creuse/dos voute, yeux enfonces/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) de la buprénorphine (0,05mg/kg) sera administré. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées.

Choix des espèces

Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser la polyarthrite rhumatoïde et, en particulier, avec le modèle expérimental (CAIA) que nous avons sélectionné. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces comme le rat. Souris âgées de 7-9 semaines ce qui est en conformité avec les études publiées utilisant le modèle CAIA.