Rongeurs
Evaluation des effets thérapeutiques d’une nano molécule immuno-modulatrice dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 360 en gravité sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'une neurotoxine, le MPTP, pour reproduire une maladie de Parkinson, puis un dendrimère testé comme candidat-médicament. Le porteur signale une mortalité aiguë d'environ 10 % liée à la neurotoxine et un effet néfaste sur le système cardiovasculaire. La preuve d'efficacité recherchée reste au stade de l'espoir, présentée comme une "pré-maturation" du candidat.
Objectifs
La maladie de Parkinson est le deuxième trouble neurodégénératif le plus fréquent après la maladie d'Alzheimer. Les caractéristiques cliniques comprennent des tremblements, une rigidité musculaire, une lenteur des mouvements volontaires et une instabilité posturale. Ces symptômes sont attribués principalement à un déficit en dopamine dans le cerveau. Parmi les différents systèmes dopaminergiques du système nerveux central, la voie nigro-striée ascendante a été identifiée comme la plus gravement endommagée dans la maladie de Parkinson. Plusieurs traitements sont actuellement disponibles. Ils permettent une amélioration de la qualité de vie et une diminution des symptômes. Cependant, ces médicaments ne sont efficaces que sur une partie des patients et, fondamentalement, ne permettent pas la guérison de cette maladie. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies. A l’heure actuelle, ni la cause ni les mécanismes sous-jacents à la mort des neurones dopaminergiques nigro-striataux ne sont connus. Mais, il est maintenant communément admis que l’inflammation chronique contribue à la dégénérescence neuronale. Les cellules microgliales, macrophages résidents du système nerveux central, participent à l’instauration et au maintien de cette neuroinflammation chronique. Tout agent capable de moduler ces cellules et donc ce phénotype délétère sera un candidat-médicament de choix pour le traitement de cette maladie. Nous développons en ce moment dans le laboratoire, une molécule qui pourrait remplir cette fonction. En effet, nous avons précédemment montré que des molécules synthétiques de taille nanométrique, les dendrimères phosphorés, ont des propriétés anti-inflammatoires et immuno-modulatrices inédites. En particulier, nous avons apporté les preuves de concept in vivo du potentiel thérapeutique du dendrimère ABP dans des modèles murins de trois maladies inflammatoires chroniques : la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le psoriasis. Nous avons depuis des résultats in vitro qui prouvent que ce dendrimère ABP pourrait aussi être efficace pour combattre la composante inflammatoire dans la maladie de Parkinson. L'objectif global de ce projet est donc d'évaluer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Au terme de ce programme de pré-maturation nous espérons apporter la preuve d’efficacité dans le modèle murin de maladie de Parkinson (modèle d’intoxication au MPTP) et valider le dendrimère ABP en tant que candidat-médicament pour combattre la maladie de Parkinson. Ainsi, nous souhaitons valider notre concept de rééducation de la microgliose réactive par le dendrimère ABP qui sera alors un candidat-médicament validé pour le traitement de la maladie de Parkinson. Pour rappel, la microgliose réactive est commune à la plupart des maladies neurodégénératives. De fait, le dendrimère ABP sera un candidat-médicament pour d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaque amyotrophique. En outre, le rôle de la microglie dans l’étiologie d’autres pathologies neurologiques telles que l’autisme et l’épilepsie étant de plus en plus décrit, l’utilisation du dendrimère ABP pourrait aussi y être envisagée.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Injection intrapéritonéale de la neurotoxine MPTP ou PBS sur 720 souris vigiles (durée 5 sec ; 4x toutes les 2 heures sur 1 jour) 2) Injection intraveineuse du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 2 min): Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 3) Injection intracérébroventriculaire (Intervention chirugicale stéréotaxique) du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 20 min) : Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 4) Mise à mort par perfusion intracardiaque (durée 3 min) : Toutes les souris (1020) du projet subiront cette intervention chirurgicale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de l’intoxication au MPTP, est la forte mortalité aiguë (pour la souche C57BL/6 de l’ordre de 10%). Les effets du composé sur le système nerveux central ne sont pas mis en cause. Par contre, il semble qu’ils soient reliés à une diminution de la température corporelle et à un effet néfaste direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles 24h.
Devenir
Les souris de la prodédure 1 (Génération des souris MPTP modèles de la maladie de Parkinson) sont utilisés dans les procédures 2 et 3. Ensuite, toutes les souris des procédures 2, 3 (Et donc 1) sont utilisées dans la procédure 4. Cette dernière procédure consiste à la mise à mort des animaux afin de prélever leur cerveau pour des analyses de biologie cellulaire et moléculaire. Ces analyses permettront de détailler les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du dendrimère ABP. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter leur cerveau pour procéder les expériences suivantes : 1) Mesure de la fluorescence émise par ABP dans le cerveau pour établir la distribution de la nanoparticule dans le cerveau après injection i.v. ou i.c.v.. 2) Extraction et mise en culture de la microglie pour évaluer par cytométrie en flux leur profil pro- ou anti-inflammatoire dans le modèle MPTP suite aux injections i.v. ou i.c.v. d'ABP. 3) Immunohistochimie afin d'évaluer l'effet protecteur d'ABP sur la neurodégénérescence des cellules dopaninergiques de la substance noire. 4) Exprériences de RT-PCRq pour étudier les gènes impliqués dans le profil pro- ou anti-inflammatoire de la microglie.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées (doses inhibiteurs, durée du régime) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible (par priorité : alimentation ou boisson/injection i.p./ injection i.v./injection i.c.v.).
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20%. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires chroniques. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer que le dendrimère ABP est un candidat médicament pour la maladie de Parkinson. On appelle « développement d’un médiatement », le processus de fabrication d’un nouveau médicament. Il englobe les différentes étapes (toutes essentielles), de la conception à la demande d’autorisation de mise sur le marché. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait appel à l’expérimentation animale. Cette étape permet de définir la valeur thérapeutique potentielle d’une nouvelle molécule et d’obtenir les premiers éléments sur le comportement d’un candidat médicament (toxicité, efficacité, etc…). C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. En effet, ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Nous en sommes à cette étape concernant le dendrimère ABP dans la MP.L’expérimentation animale est indispensable au processus de création de nouveaux médicaments. Elle est donc rationnelle dans notre projet de développement d’une nouvelle molécule thérapeutique et elle sera réalisée en suivant les bonnes pratiques et en garantissant un traitement éthique des animaux.
Caractérisation d’un modèle murin dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth et thérapie par croisement génétique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et subissent chaque semaine une batterie de tests, suspension, force de préhension, marche sur tapis roulant, barre crantée, électromyographie et test de sensibilité mécanique de Von Frey. Le porteur teste une thérapie par croisement génétique visant à normaliser le niveau d'une protéine, la dynamine 2. Les bénéfices pour les 50 000 personnes touchées en France restent formulés au conditionnel.
Objectifs
Le but de cette étude est d’évaluer les conséquences d’une mutation au niveau du gène de la dynamine 2 responsable chez l’homme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et d’apporter une thérapie par croisement génétique. La CMT est une maladie génétique qui affecte les nerfs périphériques et qui touche 50000 personnes en France. A ce jour, aucun traitement efficace n’est disponible. Nous avons démontré dans une étude antérieure une baisse de l’expression de la dynamine 2 chez l’animal portant la mutation responsable de la maladie de CMT. A présent nous souhaitons moduler le niveau de dynamine 2 dans des souris atteintes de CMT par croisement avec des animaux mutants myopathe qui présentent une sur expression de cette même protéine. De cette manière, les animaux issus de ce croisement génétique devraient montrés un niveau de dynamine 2 normal.
Bénéfices attendus
Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur la maladie, dans des nouveaux modèles de souris myopathes dont les mutations génétiques reproduisent fidèlement les symptômes musculaires de patients atteints de myopathies centronucléaires. De plus, cette étude vise à évaluer l'efficacité de la diminution de la protéine dynamine 2 chez la souris atteinte par la maladie de CMT.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Hanging test-Mesurer la force du corps. Les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 60 secondes maximum. La force des souris sera mesurée 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec 15 minutes de pause entre chaque essai. 2. Grip-Mesurer la force des pattes. Le test sera effectué 3 fois/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. Le Grip test sera effectué une fois par semaine, sur 2 ou 4 pattes. 3. Gait-mesurer la position des pattes pendant le déplacement. L'animal est déposé sur un tapis roulant se déplaçant à une vitesse comprise entre 8 m/s et 14 m/s pendant 1 minute maximum. Ce test sera exécuté une fois par semaine. 4. Barre cranté-Mesurer l’habilité à se déplacer sur une barre cranté de 110 cm de long. Le test sera effectué 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. 5. EMG (Electromyographie)-Mesurer l’activité électrique musculaire. Ce test sera réalisé une seule fois. 6. VF (Von Frey)-Mesure de la sensibilité mécanique sur les pattes arrière de l’animal. Chaque patte arrière est mesurée 2 fois. Ce test sera réalisé une seule fois par semaines. 7. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). C'est une PE sans réveil.
Impact sur les animaux
Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteinte de CNM développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 6 semaines. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur au animaux contrôles. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. La souris atteinte de la maladie de CMT présente une légère perte de poids. Avant les mesures de conduction nerveuse, les souris seront anesthésiées afin d’éviter toute souffrance due à l'implantation des électrodes et tout mouvement. Lors de la mesure de la sensibilité mécanique les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sur une grille pendant 30 minutes environ. Le test consiste à appliquer un fil de nylon sur la voute plantaire de l’animal et de mesurer s’il réagit. Cette procédure ne nécessite pas de dispositif particulier pour limiter la souffrance car il s’agit d’un test indolore. En revanche, pour limiter l’isolement de l’animal, ce dernier est immédiatement replacé dans sa cage avec ses congénères dès la fin du test. En ce qui concerne les mesures des propriétés contractiles musculaires in situ (classe sans réveil), l’animal est fortement anesthésié avant de subir une opération chirurgicale consistant à d’une part isoler le nerf sciatique et d’autre part à libérer le muscle tibial antérieur.
Devenir
A l'issue de cette procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie car les différents muscles et organes seront collectés pour une analyse histologique et biomoléculaire. Ces analyses nous permettront d'évaluer les potentielles effets bénéfiques de cette thérapie par croisement génétique et de mieux comprendre la maladie.
Remplacement
Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, ce modèle animal nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, les mâles et les femelles seront utilisés car cette maladie touche aussi bien les hommes que les femmes. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience mâles et femelles, nous prévoyons 160 animaux pour cette étude (REDUCTION).
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de ce croisement génétique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Les souris seront testées à l'age adulte c'est à dire de 7 à 8 semaines. A cet âge le phénotype lié à la maladie de CMT et le bénéfice de la thérapie sur la maladie pourra être aisement évalué.
Effets d’un régime supplémenté en vitamine D et en acides gras Oméga-3 dans la prévention des altérations ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils sont soumis à un régime obésogène puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, à des prélèvements de sang et à un test de tolérance au glucose, avant euthanasie par exsanguination pour prélèvement d'organes. Le porteur teste l'effet d'une supplémentation en vitamine D et oméga-3 sur les atteintes articulaires liées à l'obésité, avec des applications renvoyées à terme à l'humain, aux chiens et aux chats. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut remplacer l'observation du développement des lésions.
Objectifs
L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’un traitement à la vitamine D avec une supplémentation en acides gras Oméga-3 n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et des acides gras Oméga-3 sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). Les acides gras DHA et EPA seront administrés par voie orale (gavage). Ces traitements dureront 14 semaines et débuteront après une période de 14 semaines où ils seront soumis au régime seul. Tous les animaux seront hébergés dès leur réception dans l’animalerie Rongeurs du groupe II d’Oniris et subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libidum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou des acides gras Oméga-3. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouveaux questionnements sur son rôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 64 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moélculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 avec écart-type de 24 à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.
Impact de la perte d’expression de régulateurs clés du cycle de division de l’hépatocyte et de l’immunosurveillance dans la NAFLD et la carcinogenèse hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles subissent une injection intrapéritonéale, une injection rétro-orbitale sous anesthésie et des prélèvements mensuels de sang à la queue pendant six à douze mois, pour étudier le cancer du foie et la maladie du foie gras. Le porteur reconnaît une prise de poids importante liée aux régimes imposés et une altération de l'état général due au développement tumoral attendu au foie. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul modèle permettant selon lui d'invalider des gènes de façon tissu-spécifique.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 2132 souris et sera mené pour une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de STING, RhoA, ATM, ATR, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée 30 secondes ) sur animal vigile (756 animaux). Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié (820 animaux). Un prélèvement au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière mensuelle (6 répétitions, pendant 6 ou 12 mois suivant l’expérimentation, durée : 30 secondes - 1 minute) sur animal vigile (2132 animaux).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (2132).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence NAFLD/NASH/CHC.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet, 2132 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux sont constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. La taille des groupes a été déterminée selon nos travaux préliminaires ou basée sur l’expérience de nos études antérieures. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour-nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
NEUROCONFLICT: Circuits neuronaux impliqués dans des situations conflictuelles chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles reçoivent des injections de cocaïne, des chocs électriques jusqu'à 0,6 mA, des chirurgies stéréotaxiques avec vecteurs viraux et l'implantation de fibres optiques, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les circuits neuronaux du conflit approche-évitement et de la rechute. Le porteur affirme que la cocaïne, l'évitement et la perfusion "n'engendrent ni douleur ni stress" et que le choc choisi reste inférieur aux intensités habituelles. Il conclut à la "nécessité" d'un organisme vivant intègre, qu'aucune technique in vitro ne remplacerait.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’identifier les mécanismes impliqués dans les situations conflictuelles chez la souris, lorsque l'individu hésite entre approche et évitement en condition normale ou sous l'influence de substances psychoactives telles que la cocaïne. Identifier les circuits neuronaux des comportements conflictuels est clé afin d'empêcher le phénomène de rechute. Ce projet se focalise sur des structures cérébrales critiques dans ces deux types de comportement, à savoir l'hippocampe, le noyau paraventriculaire du thalamus ainsi que de leur cible cérébrale commune : le nucleus accumbens. Bien que ces structures aient déjà été impliquées dans les comportements addictifs aux substances psychoactives, il reste à comprendre leur interaction pendant les comportements d'approche, d'évitement, et de rechute chez la souris. Afin d'atteindre l’objectif général, nous réaliserons une étude anatomo-fonctionnelle de ces structures cérébrales à plusieurs moments clés des comportements d'approche ou d'évitement. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.
Bénéfices attendus
Les expériences proposées amélioreront notre compréhension sur le phénomène de rechute, en examinant comment les informations contenues dans l’environnement peuvent déclencher des comportements inadaptés précipitant la recherche compulsive de cocaïne. Les neurones du noyau accumbens participant à ce circuit en recevant des informations de l'hippocampe et du thalamus paraventriculaire pourraient représenter une cible thérapeutique pour prévenir les rechutes chez les patients atteints d’addiction à la cocaïne, et plus largement aux drogues d’abus.
Procédures
Ce projet implique 3 procédures expérimentales décrites en item 4 Toutes les procédures (1, classe légère, 2 à 3, classe modérée) comprennent le comportement d’évitement (4h sur une journée, les animaux recevront un maximum de 1 injection de substance psychoactive et de saline), un comportement de récompense avec une substance psychoactive ou une solution saline (entre 15 min et 1h par jour, sur 4 jours, les animaux recevront un maximum de 4 injections de la substance psychoactive, et de 4 injections de saline) et la perfusion intracardiaque (7 min). Les procédures 2 et 3 comprennent la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (45-60 min sous anesthésie générale) et peut comprendre une injection d'un composé chimique ou d'une solution saline (étude pharmacogénétique, CNO). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique additionnelle pour l’implantation de fibres optiques (1 ou 2 fibres, 60-90 min) pour les études d’optogénétique et de photométrie de fibre.
Impact sur les animaux
Le comportement de récompense à la cocaïne, d’évitement et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.6 mA) est inférieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures dont la douleur est prise en charge tout le long de l'expérience, via l’usage d’anesthésiques et analgésiques, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).
Devenir
Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement conflictuel chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques sous-tendant les comportements conflictuels restent inconnus.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 1950 souris adultes (mâles et femelles) sur une période de 5 ans (Annexe Chronogramme). Plan d'expériences: Afin de réduire le nombre d’animaux, toutes les souris de chaque groupe serviront aux immunomarquages après la phase de comportement. Statistiques : le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance (voir 3.4.10). Pour comparer 2 groupes, nous utiliserons un t-test de Student ou un test non-paramétrique. Pour comparer plus de 2 groupes, nous utiliserons une analyse de variance (ANOVA) à 1 ou 2 facteurs. Dans le cas des mesures répétées (évaluation des performances mnésiques), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra de plus d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences où les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être (Annexe Points Limites). Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 10 mois.
HTAM IL1: Etude du rôle de l’inflammasome dans l’hypertension artérielle maligne chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe et des séjours en cage métabolique, avant un prélèvement sanguin terminal, pour reproduire une hypertension artérielle maligne. Le porteur reconnaît de possibles atteintes du cœur, des reins et de la rétine, ainsi que des douleurs post-opératoires. Les bénéfices, identifier les patients à risque et de nouvelles cibles, sont formulés au conditionnel.
Objectifs
L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.
Bénéfices attendus
Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Caractérisation d’un modèle de souris des mouvements anormaux liés à la mutation de l’Adenylyl cyclase 5
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 044 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles passent les tests comportementaux du rotarod et de l'open-field pendant neuf jours, 864 d'entre elles recevant en plus trois injections intrapéritonéales quotidiennes, pour caractériser un modèle de mouvements anormaux lié à une mutation du gène ADCY5 et tester une molécule. Le porteur décrit un stress possible lié aux injections et au nouvel environnement, ainsi qu'une légère perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle le plus utilisé" pour ces maladies du mouvement.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de déterminer le phénotype de ces souris et de caractériser les anomalies de fonction de l’AC5 (gain de fonction ou perte de fonction) consécutives à cette mutation, et les conséquences sur les voies de signalisation dans lesquelles l’AC5 est impliquée. Nous avons choisi de commencer par une évaluation comportementale motrice et une évaluation de l’effet de KW6002 par deux procédures comportant le test de l’open field et du rotarod, qui font l’objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Bénéfices tant scientifiques que théreputiques. Mise en évidence des anomalies motrices similaires à celles observées chez les petients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficeront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvir de nouveaux traitement et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rares et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.
Procédures
Pas de prélèvement ni de chirurgie. Tous les animaux décrits dans les procédures N°1 et N°2 (nombre maximum 1044) vont passer des tests comportementaux rotarod et openfield d’une durée totale de 9 jours. Les temps passés sur l’appareil rotarod et dans l’appareil openfield pour chaque animal sont environ 35 min et 10 min respectivement. Les animaux décrits dans la procédure N°2 (nombre maximum 864) recevront des injections intrapéritonéales tous les jours au cours des tests comportementaux d’une durée totale de 9 jours. Chaque animal reçoit 3 injections par jour dont 1 injection avant chaque test openfield et 1 injection avant le test rotarod. Chaque injection dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. Les injections intrapéritonéales ainsi que le nouvel environnement dans l’appareil openfield pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux. Une légère perte du poids (jusquà 1g) pourrait arriver chez certains animaux notamment ceux qui présentent une meilleure capacité motrice durant le test du rotarod. Mais ce phénomène s’arrête quand le test est fini. Les animaux reprennent leur poids très rapidement. Une fatigue liée aux tâches d’apprentissage pourrait apparaître pendant la réalisation de la tâche, mais qui n’induirait qu’un arrêt de la participation à la tâche par l’animal sans conséquence négative pour lui, il sera replacé dans sa cage. Toutes les précautions nécessaires seront prises afin d’éviter le stress. L’animal est manipulé tous les jours pendant deux semaines avant commencer les protocoles. L’animal sera placé aussi dans l’appareil afin d’acclimater. Les expérimentateurs vérifient quotidiennement l’état d’animal notamment les signes du stress
Devenir
A la fin des procédures, il y aura une euthanasie réglementaire pour des analyses biochimiques au niveau cérébrale pour l'étude des anomalies neurobiologiques en lien avec les anomalies.
Remplacement
Notre projet propose de disséquer les bases moléculaires du rôle de la mutation d’ADCY5 dans le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés. D’une façon générale, nous nous efforçons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.
Réduction
Concernant la réduction, des expériences précédentes nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Le nombre total d’animaux est de 1044 au maximum. Quand cela sera possible et afin de réduire leur nombre, les mêmes animaux sont utilisés dans les deux tests comportementaux rotarod et openfield. – Nos connaissances sur le modèle étudié, notamment sur les potentielles doses fonctionnelles de KW6002, nous permettront de limiter le nombre de doses à essayer et d’animaux nécessaires pour générer des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée tous les 7-10 jours. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum, un carré de coton pour nidifier est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien. L’évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l’aspect des souris et leur comportement. Les points limites seront pour l’apparence et la posture : poil ébouriffé, perte excessive de poils, blessure cutanée, automutilation, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie. Pour les comportements anormaux ces points limites seront : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, apathie, prostration, diminution de l’appétit et amaigrissement, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Ces contrôles seront enregistrés et doivent permettre de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux (injection d’antalgiques) si trouble mineur ou passage, ou bien mise à mort règlementaire par CO2. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l’homme. La souris est un modèle reconnu d’étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux, particulièrement pertinents dans l’étude de la pathologie étudiée ici. Dans nos études, les souris transgéniques portent la même mutation que chez les patients. Les animaux utilisés seront adultes âgés au-delà de 8 semaines. Cette partie du projet s’intéresse à la cause et les traitements des mouvements anormaux liés aux mutations du gène ADCY5, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes
Identification et manipulation des réseaux neuronaux encodant pour la valeur, la valence et la prépondérance des émotions de peur chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures de souffrance modérée et l'autre moitié sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cérébrales puis une perfusion intracardiaque et un prélèvement du cerveau, pour cartographier les circuits neuronaux de la peur au moyen d'outils comportementaux, électrophysiologiques et optogénétiques. Le porteur déclare pourtant "aucun" effet indésirable attendu, alors que 768 souris sont classées en souffrance sévère. Il conclut qu'il "n'existe pas de méthode alternative", une culture cellulaire ne contenant pas les connexions neuronales étudiées.
Objectifs
L’objectif principal de ce protocole est double. Premièrement, développer et valider un protocole de comportement chez la souris libre de ses mouvements pour distinguer les termes de valeur, de valence et de la prépondérance. Deuxièmement, l’identification et la manipulation des réseaux neuronaux qui encodent les signaux mentionnés ci- dessus. Ces objectifs seront atteints en utilisant une combinaison d’outils comportementaux, électrophysiologiques, pharmacologiques et optogénétiques.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole pour dissocier simultanément la valeur, la valence et la prépondérance nous permettra d’étudier comment les réseaux neuronaux dédiés encodent ces différents signaux. Cela nous permettra de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l’anxiété ou le trouble de stress post-traumatique où la prise de décision de ces signaux est souvent inadaptée.
Procédures
Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicales Prélèvements de tissus : touds les animaux sont soulmisd au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation
Impact sur les animaux
aucun
Devenir
Euthanaise de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau
Remplacement
L'identification et la manipulation des circuits impliqués dans l’encodage de valence, valeur et prépondérance de signaux de peur nécessitent l'utilisation d'un cerveau intact chez l'animal vigile. De plus, des méthodes telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neuronales qui sont le sujet de nos travaux. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 8 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 1536 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans le comportement de peur. De plus, nous utilisons ici des modèles transgéniques divers ce qui présente un intérêt scientifique fort. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Etude de la biodistribution de nouveaux nanomédicaments.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
4 401 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent des injections de nanomédicaments par voie sanguine, orale ou nasale, avec suivi par imagerie ou prélèvement d'organes, pour étudier la distribution de ces particules dans l'organisme. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu, afin de "ne pas altérer les résultats" de l'expérimentation. Il présente le recours aux animaux comme "indispensable", affirmant qu'il n'existe pas de système alternatif.
Objectifs
Il s’agit d’un projet visant à évaluer le comportement de nouveaux nanomédicaments enzymatiques dans l’organisme (localisation et élimination). Les enzymes sont des molécules actives qui permettent la conversion de substances en d’autres afin d’éviter l’accumulation de substances toxiques ou de permettre la production de molécules essentielles. Malgré les bénéfices apportés par les médicaments enzymatiques, l’une de leur limitation est le manque de localisation spécifique dans l’organisme. Des stratégies de ciblage sont nécessaires pour optimiser leur efficacité. Nous avons développé une plateforme technologique permettant l’immobilisation et la protection d’enzymes sur des nanoparticules de silice dont la surface peut être modifiée afin d’induire une localisation précise des nanomédicaments dans l’organisme. Ces nanomédicaments ont des applications dans des pathologies diverses et donc des sites d’action variés (ex : intestin, cerveau,…). Les nanoparticules doivent donc présenter des caractéristiques leur permettant d’atteindre les organes cibles afin d’apporter les enzymes au niveau des organes malades. Du site d’action des nanomédicament découle une voie d’administration, d’où cette étude visant à comprendre le chemin parcouru par les nanomédicaments après leur administration dans un organisme. Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules, des reconstitutions de paroi d’organes et sur des échantillons de sang ont montré que notre médicament n’est pas nocif. Cependant une caractérisation plus approfondie de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) D’obtenir des données sur le comportement des nanomédicaments en fonction de leurs propriétés physiques et de leur voie d’administration. 2) De définir les spécifications de surface optimale permettant d’apporter le nanomédicament dans d’un organe précis 3) De valider des techniques d’imagerie pour étudier le comportement des nanomédicaments dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient nous permettre 1) de comprendre et visualiser le chemin parcouru par les nanomédicaments dans l’organisme en fonction de leurs spécifications, et 2) de sélectionner les spécifications adéquates pour atteindre les organes cibles (en fonction des domaines d’application). Ces données sont des informations majeures pour le développement spécifique de nouveaux nanomédicaments enzymatiques pour lesquels les traitements actuels ne sont pas satisfaisants. A plus large échelle, cette étude permettra de valider notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.
Procédures
Ce projet sera réalisé sur le modèle de souris CD-1. En fonction des résultats des études préliminaires, les analyses seront préférentiellement réalisées par imagerie. Néanmoins, si l’imagerie ne permet pas d’obtenir des résultats conclusifs, les analyses seront réalisées sur les organes. Le nombre d’animaux concernés par chaque geste seront donc présentés sous forme d’un nombre minimum (dans le cas où l’étude pourrait être réalisée par imagerie), et d’un nombre maximum (dans le cas où l’étude nécessiterait un prélèvement d’organes). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Injection de nanomédicaments dans la circulation sanguine Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiés (anesthésie gazeuse), une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 2) Injection de nanomédicaments par voie orale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 3) Injection de nanomédicaments par voie nasale Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est min : 267, max : 1467. 4) Analyse des animaux par imagerie Les analyses des souris par imagerie requièrent une anesthésie légère avant la prise d’images de manière à ce que l’animal reste immobile lors de l’acquisition des scans. Chaque souris sera analysée six fois au cours de l’étude. Dans le cas des analyses par imagerie, le nombre d’animaux nécessaire est de 801. 5) Analyses des organes des animaux L’analyse des organes des animaux nécessite que ceux-ci subissent une sédation profonde. Ce geste sera réalisé une fois par animal durant le temps de l’étude. Pour rappel, ce type d’analyse est optionnel et ne sera réalisé qu’en cas d’impossibilité de réaliser les études par imagerie. Dans ce cas le nombre d’animaux concernés est de 4401.
Impact sur les animaux
Les études de biodistribution précédemment décrites seront réalisées sur des temps cours. Après administration des nanomédicaments, les animaux seront gardés au maximum pendant 96h. De plus, des expériences préliminaires ont montré une parfaite tolérance des animaux suite à l’administration des nanomédicaments. L’ensemble de ces informations suggèrent que les substances administrées (nanomédicaments) n’induiront pas de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Les études de biodistribution requièrent une manipulation des animaux pour l’administration des nanomédicaments (voies orale, systémique ou nasale) et les analyses par imagerie. Celles-ci pourraient engendrer un léger stress chez les animaux. Tout sera mis en œuvre pour habituer les animaux à être manipulé et ainsi limiter un éventuel stress.
Devenir
Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera effectuée par administration d’une surdose d’anesthésique.
Remplacement
Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Le comportement des nanomédicaments dans l’organisme est un processus complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y a contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe. D’autre part, ce projet débute par des études de faisabilité dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le suivi des nanomédicaments dans l’organisme en utilisant l’imagerie comme alternative. Des efforts particuliers seront faits pour valider les techniques d’imagerie et ainsi limiter le nombre de souris utilisées dans ce projet.
Raffinement
Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas altérer les résultats de l'expérimentation en cours.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos études sur le modèle de souris CD-1 pour assurer la continuité avec les expériences précédemment réalisées. Les informations relatives aux doses et volumes injectés peuvent ainsi être réutiliser et évitent des étapes de mises au point supplémentaires, limitant ainsi le nombre d’animaux requis.
Etudes d’innocuité d’un médicament vétérinaire destiné aux chiens, chats, chevaux chez des espèces alternatives
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 50
Autres oiseaux : 375
50 souris, 50 cobayes et 375 canaris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils reçoivent une à deux administrations d'un médicament vétérinaire destiné aux chiens, chats et chevaux, présentés comme des "espèces alternatives" à ces animaux plus gros, puis sont euthanasiés pour prélèvements. Le porteur indique que l'administration "peut occasionner un stress et un inconfort" et fixe la perte de poids de 20 % comme point limite. Il justifie l'usage du canari par une "exigence réglementaire" et le recours aux rongeurs par l'impossibilité de tester l'innocuité in vitro.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un produit sur des rongeurs (cobayes ou souris) ou canaris ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement via des études de diffusibilité).
Bénéfices attendus
Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des produits présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations.
Procédures
Les études d’innocuité permettent de voir si le produit présente des effets secondaires sur l’animal par des analyses de laboratoire et des examens cliniques. Les cobayes reçoivent maximum 2 administrations à 2 semaines d'intervalle. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée maximale d'une phase animale est de 7 semaines en fonction du produit administré et de l'avancement du projet. Les paramètres cliniques (par exemple, l’état général, examen de la zone d’injection, poids, température rectale) sont suivis. Pour les souris, une seule administration est effectuée. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée maximale de la phase animale est de 28 jours. Les paramètres cliniques mesurés sont l'état général, les signes locaux et généraux et éventuellement des pesées. Pour les canaris, 1 seule administration est effectué. Aucun prélèvement n'est effectué. La durée de la phase animale est de 2 semaines. Les paramètres mesurés sont l'état général et les signes locaux.
Impact sur les animaux
L’administration du produit peut occasionner un stress et un inconfort chez l'animal.
Devenir
Les animaux peuvent faire l’objet de prélèvements post mortem et sont donc euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, si l’animal atteint des points limites pendant l’étude, il est euthanasié.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Pour les rongeurs (cobaye, souris) les points limites sont : respiration agonique, perte de poids de 20%, absence de réactions aux stimulis. Pour les oiseaux (canaris), les points limites sont décubitus, perte de poids de 20%, absence de réactions aux stimulis. Dans le cas d'atteinte de point limite, les animaux sont immédiatement euthanasiés pour raison éthique. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’innocuité et la diffusibilité d’un produit ne peuvent pas être testées in vitro. L’utilisation du canari dans les études d’innocuité est une exigence règlementaire. La diffusibilité doit être réalisée dans les organismes cibles ou sensibles (canari) pour que les conclusions soient valides. Les procédures utilisant des rongeurs (cobayes et souris) sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés). Pour la procédure utilisant des canaris, l’innocuité est testée sur les adultes (>1an) qui est un modèle stable pour réaliser les études. Cela permet de réduire les problèmes zootechniques (comme par exemple une mortalité non liée aux produits administrés) plus présents chez des jeunes canaris.
Rôle du cortex insulaire dans l’effet protecteur d’un traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à l'auto-administration de cocaïne, à des chirurgies cérébrales, à des prélèvements vaginaux quotidiens chez les femelles et à un stress pharmacologique à la yohimbine, pour étudier l'effet de la progestérone sur la rechute. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité après la cocaïne, ainsi que des effets de la yohimbine comparables à ceux observés chez l'humain. Les retombées thérapeutiques contre la rechute sont renvoyées au "long terme".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.
Procédures
Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.
Impact sur les animaux
La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.
Raffinement
La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.
Choix des espèces
Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.
Caractérisation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin du syndrome du QT long de type 3.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.
Procédures
Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.
Devenir
Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.