Rongeurs

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation de cellules dans la rate puis une injection intraveineuse de cellules immunitaires humaines, avant dissection de la rate, pour tester une thérapie cellulaire contre le cytomégalovirus. Le porteur signale de possibles douleurs post-opératoires, prises en charge par un antalgique. Il qualifie ce modèle d'"indispensable" pour prédire l'efficacité chez les patients, faute de méthode in vitro jugée suffisamment prédictive.

Objectifs

L’infection au cytomégalovirus humain est l’infection virale la plus fréquente et dangereuse chez les patients recevant des greffes. En effet le système immunitaire de ces patients est diminué, et il n’est plus capable d’éliminer le virus. Pour lutter contre le cytomégalovirus, les stratégies de vaccination n’ont pas montré d’efficacité convaincante jusqu’à présent. De nouveaux traitements sont donc envisagés, notamment l’injection de cellules immunitaires aux patients, capables de reconnaitre le virus et de l’éliminer. On parle alors de thérapie cellulaire. Nous avons mis au point une thérapie cellulaire permettant de contrôler efficacement l’infection par le cytomégalovirus humain dans des modèles in vitro. Néanmoins, pour pouvoir évaluer cette thérapie en essai clinique chez les patients, il faut au préalable démontrer son efficacité préclinique in vivo. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser un modèle in vivo d’infection au cytomégalovirus humain chez des souris. Ce modèle permettra d’évaluer la capacité des cellules immunitaires injectées aux souris à éliminer définitivement l’infection virale. Le nombre minimal d’animaux nécessaire à la démonstration sera utilisé, et leur bonne santé sera évaluée tout au long de l’expérimentation, selon la législation actuelle. Ce projet est justifié par l’absence de méthodes alternatives suffisamment prédictives de l’efficacité de cette thérapie chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet constituera la première évaluation préclinique de l’efficacité de cette thérapie cellulaire. Cette démonstration in vivo est obligatoire afin de proposer ensuite cette thérapie cellulaire à des patients transplantés présentant une infection au cytomégalovirus humain. Si les résultats obtenus dans ce modèle préclinique sont probants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en phases cliniques et plus généralement à un fort bénéfice futur pour la prise en charge de ces patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique chirurgie permettant l’implantation de cellules dans leur rate (animaux anesthésiés, durée de 10min) et en suivant à une unique injection intraveineuse de cellules immunitaires (animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

La chirurgie réalisée dans ce projet est bien tolérée par les animaux qui se réveillent rapidement sans effets secondaires majeurs. Cependant, un inconfort ou des douleurs post-opératoires sont possibles, qui seront prises en charge par traitement antalgique.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, toutes les souris concernées par ce projet (120 souris) devront être euthanasiées pour permettre la dissection de leur rate, et ainsi l'étude de l’efficacité de la thérapie cellulaire.

Remplacement

Des méthodes d’analyse in vitro ont déjà été mises en place pour ce projet et ont donné des résultats probants sur l’efficacité de la thérapie cellulaire. Cependant l’utilisation de ce modèle animal préclinique est indispensable pour prédire l’efficacité de la thérapie chez les patients, et répondre à plusieurs questions ne pouvant être élucidées in silico et in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été défini d’un point de vue statistique afin de réduire leur nombre au maximum. Nous avons en effet déterminé par des tests statistiques qu’un lot de 10 souris par groupe est nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement exploitables.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Ils seront hébergés en cage collective avec enrichissement de leur environnement et application de points limites précoces adaptés à ce protocole. Ces points limites nous permettront de prendre les décisions qui s’imposent face à la souffrance ou l’inconfort de nos animaux.

Choix des espèces

Les souris NSG qui seront utilisées pour cette étude présentent une forte immunodépression. Cela permettra le transfert cellules humaines, sans que celles-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Les souris seront incluses dans le protocole expérimental à l’âge adulte de 8 à 10 semaines.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales puis de cellules CAR-T, avec suivi de la croissance de la tumeur par imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins, jusqu'à une ponction intracardiaque terminale. Le porteur reconnaît l'apparition de tumeurs et de possibles difficultés respiratoires liées à des métastases pulmonaires. Il présente ce modèle murin comme un "prérequis indispensable" avant un éventuel essai clinique, tout en reconnaissant qu'aucun modèle animal n'existe encore pour cette stratégie.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules tumorales. Après réinjection aux patients, ces cellules dites "CAR-T" sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Les CAR-T cells représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certains cancers du sang réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète au traitement par la thérapie CAR-T cell, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules CAR-T, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie CAR-T cell, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices des CAR-T pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Avant administration des cellules progénitrices CAR-ProT et évaluation de l’effet thérapeutique, il est nécessaire de valider dans un premier temps le modèle animal pour le développement de tumeur de lymphome et la régression tumorale en injectant des cellules CAR-T matures, connues pour leur capacité d’élimination de tumeur in vivo. Si cette 1ère étude est concluante, une 2è étude sera réalisée avec les cellules progénitrices CAR-ProT et fera l’objet d’une 2è demande d’autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Si le modèle animal, tel qu’il est décrit dans ce projet, permet de démontrer une réponse antitumorale avec une dose faible de cellules CAR-T classiques, nous pourrons ensuite continuer l’étude avec des cellules progénitrices CAR-ProTcell. Cette deuxième partie du projet fera l’objet d’une deuxième demande d’autorisation. A notre connaissance aucun modèle animal n’est établi à ce jour pour répondre aux besoins de nos études avec des cellules progénitrices humaines nécessitant de poursuivre leur différenciation in vivo en cellules effectrices. Le modèle doit être adapté à l’évaluation des fonctions anti-tumorales des progéniteurs des CAR-T génétiquement modifiés. Ce modèle murin représente par conséquent un prérequis indispensable afin de tester in vivo notre stratégie thérapeutique dans des conditions proches de celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable avant l’application éventuelle de notre stratégie thérapeutique innovante dans un essai clinique. Les résultats de ce projet permettront ainsi la validation du potentiel de notre plateforme et l’acquisition de données indispensables au développement clinique d’une thérapie innovante, à fort potentiel translationnel.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections par voie intraveineuse (1X à l'age de 8 semaines); - des injections par voie intrapéritonéale et des anesthésies sous isoflurane pour suivre laecroissance tumorale par imagerie (2X/semaine, sur une durée de 1 mois environ); - des prélèvements sanguins, toutes les 2 semaines (sur une durée de 1 mois environ, soit 3X maximum); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, sous anesthésie profonde, sub-léthale).

Impact sur les animaux

Les cellules CAR-T matures pourraient occasionner au long cours une réaction des lymphocytes humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules hématopoiétiques humaines. La durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet effet indésirable. Par ailleurs, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Par ailleurs, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations phénotypiques et moléculaires du produit final par des méthodes de type séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire et par cytométrie de masse. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les cellules T matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules souches hématopietiques avec des cellules stromales. Bien que ce modèle permette d’obtenir des cellules T exprimant des marqueurs CD3 de différentiation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénotransplantation, réceptif aux cellules hématopoïétiques humaines, permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs lymphoides dans l’environnement thymique. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet consiste à utiliser des cellules CAR-T matures et à valider le modèle tumoral avec une décision de poursuivre ou non à l’issue de cette étape avec les cellules progénitrices des CAR-T. Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal de base choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, y compris pour la greffe des progéniteurs lymphoïdes. D’autre part, le rendement de la reconstitution hématopoïétique est supérieur chez les souris femelles. Nous utiliserons donc de préférence des souris femelles dans nos protocoles permettant d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental en fonction de la différence relative attendue. En utilisant des tests statistiques non paramétriques de type Kruskal Wallis, Mann Whitney ou Wilcoxon, selon le design expérimental et le paramètre mesuré, nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux si ces différences existent.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes NOD/SCID/gc- (NSG) sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire des souris NSG permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris NSG, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules hématopoïétiques sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. L’étude de la thymopoïèse et de la régénération thymique humaine chez ces souris nous permettra ainsi d’évaluer les progéniteurs lymphoïdes greffés dans un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris NSG adultes de 8 semaines, permettant une bonne prise de greffe des cellules tumorales et des CAR-T matures.

2 220 souris et 2 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, qui détruit le pancréas, pour reproduire une rétinopathie et une atteinte de la cornée, avec examens oculaires sous anesthésie et désépithélisation cornéenne. Le porteur décrit une soif et des urines accrues, une perte de tonus et un poids réduit, les rats malades ne pesant après un mois que 50 à 60 % du poids des rats témoins. L'objectif affiché est de mettre au point un "modèle expérimental" pour tester de futurs traitements, le recours à l'animal étant présenté comme "nécessaire" faute de pouvoir mimer la maladie autrement.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle expérimental de rétinopathie diabétique et également d’un modèle de cicatrisation cornéenne chez le rat ou la souris afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'oeil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une détérioration des capillaires sanguins de la rétine. Ils perdent leur étanchéité conduisant à des hémorragies et des exsudats, lésant la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète est également responsable d’une dégradation de la cornée, le tissu transparent en avant de l’oeil, il ralentit notamment la cicatrisation cornéenne en cas de blessure, causant l’apparition d’opacités qui altèrent la vision.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritoneale de streptozotocine. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Pour la partie sur l'étude de la cicatrisation cornéenne, une désepithelisation cornéenne se fera sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

L'euthanasie des animaux est réalisée en fin d'étude pour analyse des tissus.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la rétinopathie ou de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. Bien que différentes souches de rat pigmenté ou albinos soient utilisées dans la littérature, les rats Brown Norway semblent avoir une sensibilité supérieure et plus durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète, et les souris C57bl6 semblent repondre le mieux à l'induction par la streptozotocine. Nous choisirons ces souches, mais n’excluons pas de modifier ce choix en fonction des résultats, des échanges avec collaborateurs extérieurs ou nouvelles données de la bibliographie, les rats Wistar, Sprague Dawley et long Evans sont également largement utilisés dans la bibliographie. De même pour l’étude de la cornée diabétique la souris pigmentée ou le rat albinos sont utilisés. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabètes conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 3 jours.

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de PCP pendant dix jours pour reproduire un modèle de schizophrénie, puis des injections de petites molécules et des tests comportementaux légers, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le PCP diminue l'appétit et les interactions sociales, cette baisse d'interaction étant précisément le paramètre mesuré. Il affirme que le recours à la souris est "guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques" et que l'expérimentation humaine "ne peut atteindre ce niveau de résolution".

Objectifs

La schizophrénie touche 1% de la population. Les traitements actuels en contrôlent mal les symptômes et ont de lourds effets secondaires. Des activateurs du récepteur mGlu2 du glutamate sont actuellement en étude clinique mais les premières molécules ont échoué du fait d’une interférence avec les antipsychotiques atypiques actuels. Si les molécules mGlu2 restent de bons candidats pour un traitement de première intention, cela amène d’importantes questions. Ce projet cherche à 1) décrypter la signalisation du récepteur mGlu2 dans le cerveau avec l’espoir de trouver de nouveaux régulateurs / effecteurs, 2) caractériser l’altération de ces nouveaux régulateurs et effecteurs dans des modèles précliniques établis de la schizophrénie, 3) déterminer l’impact des antipsychotiques actuels sur ces nouveaux effecteurs et régulateurs pour comprendre l’interférence entre les deux classes d’antipsychotiques 4) déterminer l’importance des nouveaux régulateurs et effecteurs dans la capacité du récepteur mGlu2 à reverser des déficits comportementaux de modèles précliniques de schizophrénie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter une meilleure compréhension du mode d’action d’une nouvelle génération prometteuse d’antipsychotiques et de son interférence avec les antipsychotiques atypiques actuellement utilisés.

Procédures

Des animaux vigiles recevront des injections sous cutanées de PCP (1 injection par jour pendant 10 jours), des injections intrapéritonéales de petites molécules (1 injection qui met 30 min à agir) et soit seront sacrifiés pour prélévements biochimiques/immunofluorescence soit passeront des tests comportementaux de classe légère (2 jours pour l'ensemble des tests).

Impact sur les animaux

Les lignées KO 5-HT2A , KO mGlu2 et le modèle chimique PCP ont des phénotypes non dommageables. D'anciennes publications sur le modèle PCP décrivent une diminution d'appétit et une diminution d'interaction sociale. La diminution d'interaction sociale est justement l'un des paramètres que l'on cherche à mesurer dans le modèle PCP et qui est réversé par les antipsychotiques glutamatergiques. Contrairement aux publications initiales, les dernières publications sur le modèle PCP subchronique (doi.org/10.1016/j.pbb.2018.09.007) et le suivi de poids lors de notre dernier projet (1316-7251_iExplore-RAM-O1-F-003) ne montrent pas de variation de poids par rapport aux souris Véhicule. Dans nos mains le modèle PCP n'a jamais atteint les points limites que nous continuerons de surveiller. Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieure à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Comme l'injection répétée de PCP induit une diminution de l'interaction sociale et de l'appétit nous la classons comme modérée.

Devenir

procédure 1: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses biochimiques et protéomiques. procédure 2: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau nécessaire aux analyses par immunofluorescence. procédure 3: tous les animaux de cette procédure seront mis à mort pour prélèvements biochimiques pour réutilisation possible dans d'autres projets.

Remplacement

Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Nos principales grilles de lecture sont la protéomique, l'immunofluorescence et les tests comportementaux. La protéomique permet de caractériser et quantifier en relatif des milliers de protéines en une seule expérience. L'immunofluorescence permet de réaliser une multitude de combinaisons de marqueurs à partir d'un animal. Le modèle PCP décrit dans la saisine est un modèle d’étude privilégié du fait de sa robustesse dans l’établissement du phénotype « schizophrénie » (100 % des individus) et de la réponse aux antipsychotiques. Nos méthodes statistiques concernant des données de protéomique (significance B), de biochimie et d’immunofluorescence (Anova) ont déjà été éprouvées et publiées à maintes reprises par nous et/ou des collègues du domaine.

Raffinement

Les manipulations envisagées ne présentent pas de douleur d'un niveau supérieur à une piqure d'aiguille et nous ne devrions pas avoir besoin de recourir à des antalgiques/analgésiques. Le PCP injecté aux animaux a lui même été initialement développé comme un analgésique. Avant les premières injections les souris seront habituées à la manipulation quotidiennement pendant 1 semaine pour effacer les stress de transport et de manipulation. Les lignées choisies et le modèle chimique PCP ont un phénotype non dommageable. La répétition des injections sous cutanées journalières au même point pouvant entrainer une inflammation et une gêne pour l'animal nous déplacerons chaque jour le point d'injection sous cutanée. Pour les souris prétraitées en IP journalières, les injections seront décalées chaque jour de bas en haut du ventre de l'animal coté droit pour ne pas risquer de percer la vessie ou le caecum. Les animaux pour les expériences de comportement (procédure 3) passeront l'ensemble des tests comportementaux du moins stressant au plus stressant. Les souris sont hébergées en groupes de 4 à l'intérieur desquels elles ne reçoivent pas les mêmes traitements, ce qui élimine le stress d'isolement et la propagation de la douleur sociale. Les cages présentent un enrichissement intermédiaire (petite maison, alvéole de boite à oeufs et serpentin en carton) qui stimule l'activité et limite l'agressivité. la fréquence d'observation est assurée, au minimum une fois par jour, par les animaliers de la zone d'expérimentation animale et par le chercheur (qui se rend chaque jour dans la zone d'expérimentation animale pour ce traitement et/ou pour d'autres expériences). Notre projet pour 5 ans impliquant une équipe de 3 personnes nécessitera 1120 souris issues de plusieurs lignées spécifiques déjà élevées dans nos animaleries. Les procédures décrites dans ce document ne nécessiteront aucune mise au point et sont standards dans l’étude de la réponse aux antipsychotiques.

Choix des espèces

Comme il est impossible de rendre compte de l’hétérogénéité et de la complexité du cerveau et de la circuiterie neuronale dans des cultures cellulaires, nous aurons recours à des modèles animaux pour étudier in vivo la réponse biochimique aux antipsychotiques. Ces analyses biochimiques impliquant le prélèvement du cerveau, elles sont impossibles directement chez l’Homme. Les réponses comportementales aux antipsychotiques ne peuvent être mesurées que sur l’organisme conscient, excluant un travail sur cultures cellulaires. Le modèle souris est particulièrement adapté au projet car il est un standard dans la mesure de l’action des antipsychotiques toutes générations confondues avec des tests comportementaux bien établis pour cette espèce, ce qui limitera les mises au point et donc le nombre d’animaux utilisés. De nombreux modèles génétiques et de nombreux outils moléculaires sont disponibles pour la souris et permettront de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. L’expérimentation humaine ne peut atteindre ce niveau de résolution. Enfin, l'état actuel des connaissances ne permet pas une modélisation informatique des phénomènes cérébraux impliqués dans l’action des antipsychotiques. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une exposition à l'hypoxie intermittente pendant six semaines, pour certaines une implantation d'électrodes cérébrales, des tests de mémoire, des injections et des gavages, pour comparer les lésions cérébrales de l'apnée du sommeil et de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique une perte de poids transitoire, ainsi qu'une douleur et un stress liés à la chirurgie et aux contentions répétées. Il affirme que la compréhension des échanges entre régions cérébrales ne peut se faire que sur "animal entier".

Objectifs

L'hypoxie intermittente, modèle expérimental du syndrome d'apnées du sommeil, induirait il des lésions cérébrales comparables à celles retrouvées dans la maladie d'Alzheimer? Les troubles du sommeil sont fréquents chez les personnes âgées. Ces dernières années, des études à la fois chez l’homme et chez les rongeurs ont mis en évidence une association entre sommeil perturbé et la maladie d’Alzheimer mais les mécanismes sous-jacents restent encore en grande partie inconnus. Le syndrome d’apnées du sommeil (SAS) est l’une des causes des troubles du sommeil et il est caractérisé par une obstruction répétée des voies aériennes supérieures, entrainant une diminution fluctuante du taux d’oxygène sanguin (hypoxémie intermittente), un sommeil fragmenté et des signes tels que la somnolence et des troubles de la concentration/attention/mémoire. Le SAS doublerait le risque de démence chez l’homme, et serait associé au dépôt cérébral des protéines amyloïdes ß (Aß) retrouvées dans la maladie d’Alzheimer. Dans les modèles animaux, l’hypoxie intermittente (IH) entraine une anomalie électrophysiologique (plasticité synaptique) au niveau de l’hippocampe du cerveau, une perte des neurones et une production d’Aß. Par ailleurs, les troubles cognitifs présentés par les patients souffrants de SAS touchent la mémoire (hippocampe) et l’attention/concentration (cortex préfrontal). Or, la maladie d’Alzheimer est caractérisée au niveau physiopathologique par une altération des connexions entre les différentes régions cérébrales, notamment entre l’hippocampe et le cortex préfrontal. En utilisant l’électrophysiologie, notre objectif est d’analyser l’effet de l’hypoxie intermittente chronique sur le cerveau à plusieurs niveaux, en comparant entre le modèle souris SAS (hypoxie intermittente) et le modèle transgénique Alzheimer: 1) sur la connexion entre l'hippocampe et le cortex préfrontal, 2) sur les lésions cérébrales potentiellement induites par l’hypoxie intermittente, 3) si l'hypoxie intermittente est associée à la sénescence cérébrale (vieillissement), étude de l'effet du traitement contre la sénescence pour un éventuel effet contrecarrant l'effet délétère de l'hypoxie intermittente sur le cerveau.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, ces études cherchent à préciser le fonctionnement cérébral (échanges d’information entre 2 régions importantes du cerveau, touchées dans la maladie d'alzheimer mais aussi dans le SAS). Leur réalisation sur le modèle murin des apnées du sommeil par l’hypoxie intermittente a pour but de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des déficits cognitifs induits par l’hypoxie intermittente et de comparer avec les lésions cérébrales dans le modèle de la maladie d’Alzheimer. De plus ces études apporteront une évaluation originale de l’effet additif de l’hypoxie intermittente sur la pathologie Alzheimer. A long terme, à défaut d'avoir à l'heure actuelle un traitement guérissant la maladie d'Alzheimer, le projet permettra d'avoir des résultats sur le plan biologique avant de se prononcer sur l'effet potentiel thérapeutique/préventif du traitement des apnées du sommeil pour prévenir/ralentir le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Au total 728 souris seront analysées dont: - sur 192 souris: intervention chirurgicale sous anesthésie générale et antalgique (électrodes implantés dans le cerveau pendant 2-3h), et après un temps de récupération après la chirurgie de 2 semaines, les souris vont être exposées soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines et enregistrement de l'activité cérébrale sur l'animal vigil dans les 10 jour suivants; (par exemple chez l'Homme, des enregistrements intracérébraux sont également réalisés chez certains patients avec une épilepsie grave). - 392 souris: après exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les différentes lésions du cerveau. - et si l'hypoxie entraine une sénescence cellulaire (« vieillissement »), 144 souris : traitement d'un produit sénolytique (contre la sénescence) pendant l'exposition soit à l'hypoxie soit à la normoxie pendant 6 semaines, réalisation d'un test de mémoire puis prélèvement cérébral après euthanasie pour analyser les lésions cérébrales.

Impact sur les animaux

perte de poids transitoire en début d'hypoxie intermittente (procédure 1); douleur, stress, angoisse lors de la chirurgie (procédure 2) et de la perfusion intracardiaque (procédure 5) ; restrictions alimentaires pour le conditionnement du comportement, (procédure 2) ; la douleur des injections intrapéritonéales pour le EDu (procédure 4) ; les contentions répétées pour le gavage (procédure 6) Ces effets indésirables seront remédiés par l'anesthésie et les antlagiques avant et après l'intervention

Devenir

Sur 536 animaux, nous réaliserons l'étape finale expérimentale pour prélever leur cerveau, permettant de l'analyser et rechercher les différentes lésions cérébrales. Les 192 autres animaux, après l'enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire, seront euthanasiés de façon réglementaire.

Remplacement

La compréhension de la logique des échanges d’informations au niveau du cerveau entre 2 régions (l’hippocampe et le cortex préfrontal) ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier, non anesthésié, dans un état de vigilance et des conditions comportementales précises (enregistrement de leur activité cérébrale pendant la réalisation d'un test de mémoire,). L’analyse des lésions cérébrales pour corréler avec les données électrophysiologiques ne peut faire l’objet de recherches que sur un animal entier. Compte tenu de l'analyse à plusieurs échelles (lésions cérébrales et impact sur le test du comportement), de façon intégrative, une méthode de remplacement n'est pas envisageable.

Réduction

Le développement de méthodes de traitement des signaux très sophistiquées ainsi que l’analyse statistique multivariables des résultats ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ces études.

Raffinement

L’anesthésie générale lors de la mise en place des électrodes, la sédation rapide et profonde avec un euthanasiant (avec un analgésique) pour l’étude d’immunohistochimie/perfusion intracardiaque, l’utilisation d’analgésie adéquate pour chaque procédure, la procédure d’euthanasie dans une pièce dédiée à cet objectif, l’enrichissement du milieu (coton maison en carton, baton à ronger etc), ainsi qu’une procédure quotidienne d’observation et d’examen, sont les pratiques expérimentales destinées à réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux utilisés dans ce projet. Les animaux sont regroupés par 5 (sauf pour la procédure 2, dérogation de l'hébergement décrite dans la procédure) dans des cages contenant un lit de litière, des morceaux de coton pour la nidification ainsi qu’une maison en carton qui leur permet à la fois de s’y cacher et de faire leur dent. Les animaux provenant de l’extérieur sont placés dans ces cages et ne sont manipulés au minima une semaine après leur arrivée (respect d'une semaine d'acclimatation) , afin de faciliter au mieux l’acclimatation à leur nouvel environnement. Pour chaque procédure, seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures... 4.La pesée des animaux se fera de façon hebdomadaire, et renforcée en post opératoire aiguë avec une augmentation de la fréquence des pesées /48h pendant la 1ère semaine post op »

Choix des espèces

L’immense majorité des études portant sur ce sujet est réalisée chez le rongeur, notamment chez la souris du fait de la possibilité de développer des modèles génétiquement modifiés (modèle de maladie d’Alzheimer qui sera comparé avec les résultats des souris non transgéniques dites WT, en hypoxie intermittente). En effet les souris transgéniques portant la mutation humaine de la maladie d'Alzheimer permet de reproduire des lésions cérébrales semblables à la maladie d'Alzheimer et un trouble de la mémoire. Ces lésions cérébrale se développent progressivement dans le modèle transgénique que nous allons étudier. De plus, il ets également important de travailler l'effet de l'âge/vieillissement, car un des facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer est l'âge. Enfin, il ets important de connaitre si l'impact de l'hypoxie intermittente varie en fonction du stade de la vie, ainsi que l'effet potentiel du traitement sénolytique. C'est pourquoi nous avons besoin d'étudier sur plueurs groupes d'âge les animaux. Au début de l’expérimentation (procédure 1) les animaux seront âgés de 1.5 mois, de 10.5 mois et de 20,5 mois respectivement, pour que les expériences 1 à 6 citées dans le projet soient réalisées chez des souris mâles de 3 mois, 12 mois et 22 mois, pour comparer entre le profil électrophysiologique induit par le modèle Alzheimer et celui induit par l’hypoxie intermittente. D’après les études publiées sur ces souris transgéniques Alzheimer et les données publiées chez le modèle hypoxie intermittente, dans la très grande majorité des cas des souris C57BL6 âgés

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion cérébrale est provoquée par injection de 6-OHDA pour modéliser la maladie de Parkinson, puis les souris subissent quatorze tests de douleur, dont le test de von Frey, l'immersion de la queue, la plaque chaude et le test à la formaline. Le porteur précise que la douleur liée au modèle "ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude". Il affirme que la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale possible seulement sur "animal vivant et vigile".

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire compacte. Cette maladie est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant la douleur, sont très communs. Les symptômes douloureux peuvent être observés chez environ 85 % des patients Parkinsoniens. Le seuil de douleur est également altéré chez les patients Parkinsoniens, présentant ou non des symptômes de douleur. Ces douleurs sont négativement associées avec la qualité de vie des patients. Ces symptômes de douleurs sont donc un souci majeur dans la prise en charge de la maladie. Les douleurs associées à la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, la cible ou les cibles de ces dysfonctionnement douloureux ne sont pour l’heure pas encore connues dans le cadre de la maladie de Parkinson. Notre objectif est d’étudier en utilisant des approches lésionnelles et comportementales si une structure cérébrale, le striatum joue un rôle dans ces dysfonctionnements douloureux. Nous proposons donc ici une expérience préliminaire permettant caractériser les altérations des réponses nociceptives observées, chez la souris, dans un modèle classique de la maladie de parkinson : l’injection de 6- hydroxydopamine (6-OHDA) dans le striatum. Ces injections permettent à la fois de détruire les terminaisons dopaminergiques dans le striatum ainsi que les corps cellulaires des neurones dopaminergiques à l’origine de ces projections dans la substance noire compacte. Ces injections seront réalisées de façon unilatérale chez des souris mâles et femelles C57BL/6j et des groupes contrôles pseudo opéré y seront associés.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de caractériser un modèle murin (valide chez les mâles et les femelles) de la maladie de parkinson, bien caractérisé sur les symptômes moteurs mais où les altérations des seuils nociceptifs ne sont pas connues. Or des symptômes douloureux bien caractérisés pourraient être prédictifs dans l’évolution de la maladie chez l’Homme. Cela nous permettra également par la suite d'étudier les structures ou réseaux du système nerveux central à la base de ces altérations et de potentiellement révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les douleurs spécifiquement chez le patient parkinsonien. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique lésionnelle d'une durée d'1h30 environ. Les animaux développeront des douleurs suite à la modélisation de la maladie de Parkinson. Avant la chirurgie à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 le test d’immersion de la queue, à J4 un deuxième test de von Frey et à J5 un deuxième test d’immersion de la queue. 15J après la chirurgie, à J1 les animaux auront un test de von Frey, à J2 un test de la plaque chaude, à J3 un tail pressure test, à J4 le test du plantar, à J5 le test de l’acétone, à J9 un test de von Frey, à J10 un test de la plaque chaude incrémentée, à J11 le test d’immersion de la queue, à J12 le rotarod et à J13 le test de la formaline.

Impact sur les animaux

La présence de douleur liée à la modélisation de la maladie de Parkinson qui ne peut être soulagée car c'est l'objectif de l'étude. Les lésions dopaminergiques peuvent entrainer une perte de poids d'environ 5% attendue. Ces animaux vont développer des œdèmes inflammatoires (test de la formaline) nécessaires à l'expérimentation qui seront suivis et mesurés quotidiennement (taille de l'œdème, présence d'un érythème, d'une plaie ouverte ou d'une nécrose). Cet œdème sera d’environ 1 cm de diamètre et diminue dans les premières 24h après l’injection pour disparaître complètement 3 jours après maximum. Les animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs au nombre de 14 au total (4 tests avant la chirurgie pour l'obtention de valeurs de base, puis 1 test par jour pendant 5 jours et cela 2 semaines).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque à l'issue de la procédure 2.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur dans la maladie de parkinson nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Un calcul statistique « power analysis » a été réalisé pour définir un nombre d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats valides au plan statistique (multiple ANOVA) : ce nombre est de 10 animaux par groupe au minimum. Afin de garantir un nombre minimum de 10 animaux par groupe (nombre nécessaire donné par notre calcul statistique de power analyse qui a été réalisé sur la base de nos connaissances techniques et des études antérieures), il est nécessaire d’utiliser un nombre maximum de 20 animaux au total par groupe. En effet, la possibilité d’une mauvaise localisation de la lésion (25% d’erreur environ) et la variabilité comportementale interindividuelle, nous oblige à prévoir un nombre d’animaux 2 fois supérieur à celui attendu au final. La mise au point des sites d’injection a déjà été réalisé sur des études antérieures. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés la procédure expérimentale détaillée ci-après fera partie d’un enchainement et utilisera les mêmes animaux, ce qui en réduira grandement l’effectif.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit (lumière allumée de 8h à 20h). Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle lésionnel de maladie de Parkinson utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris. De plus, pour de futures études, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise la question des mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette comorbidité maladie de Parkinson/douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 6 semaines, poids supérieur à 20g).