Rongeurs
Effets d’une consommation chronique d’édulcorants et de sucrose sur la fragilité cutanée et la fonction vasculaire chez des souris saines ou présentant un diabète de type 2 (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Deux aimants comprimant un pli de peau du dos trois heures par jour pendant trois jours : 576 des 1 296 souris subissent ces plaies de compression, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet compare la cicatrisation selon des régimes riches en sucres ou en graisses, chez des souris rendues obèses ou diabétiques. Les animaux porteurs de plaies sont isolés pour éviter que leurs congénères les aggravent. La mise à mort finale sert à prélever la peau, le foie, l'estomac et les vaisseaux.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension des processus de cicatrisation et des réponses vasculaires de la peau dans un état pathologique tel que le diabète. Les plaies chroniques sont généralement des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques. Ces plaies persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque, pouvant entraîner de graves complications voire un décès. L’objectif de ce projet est de caractériser la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après application d’une pression chez des souris diabétiques, mâles et femelles en fonction des différents régimes alimentaires que l’on peut rencontrer dans les populations humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension de l’impact de la consommation d’édulcorants sur la fragilité cutanée ainsi que les différences de réponses vasculaires de la peau chez des personnes obèses et/ou diabétiques.
Procédures
Toutes les souris seront pesées vigiles au moment de leur arrivée à l’animalerie, puis toutes les semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation. Durée de la manipulation : 30 secondes. Toutes les souris seront dépilées au moins une fois durant la période de l’expérimentation. Afin d’éliminer les poils à la surface de la peau, les souris seront anesthésiées pendant 5 minutes. Toutes les souris recevront une injection lors de chaque test du sucre dans le sang (moins de 10 secondes). Toutes les souris subiront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie, lors des tests du sucre dans le sang (5 gouttes de sang par test). Chaque prélèvement dure moins de 5 secondes. Pour 576 souris, des plaies de compression seront réalisées, sous anesthésie générale gazeuse, par application de deux aimants en face en face sur un pli de peau du dos (3h par jour durant 3 jours pour les compressions chroniques et 3 x 2h dans une journée pour les compressions aiguës). Une mise en cage isolée des souris est nécessaire pour préserver les plaies induites et éviter des sur-blessures liées à ses congénères. 720 souris seront anesthésiées 2 fois durant toute la période de l’expérimentation. La première anesthésie durera 5 minutes pour la dépilation et la seconde anesthésie durera 50 minutes environ pour réaliser des mesures physiologiques non invasives au niveau de la peau du dos. Afin de faciliter l’entrée des molécules dans la peau des 720 souris, l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Pour 120 souris, il est nécessaire de poser un implant sous la peau du crâne ; cette pose d’implant sera réalisée sous anesthésie en même temps que la dépilation.
Impact sur les animaux
La pesée des souris pour le suivi du poids ou avant anesthésie n’induira qu’un stress minime. La manipulation des souris lors de la dépilation et de la pose d’un implant est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Les nuisances pour l’animal lors de la dépilation sont minimes. Pour les 120 souris nécessitant la pose d’un implant, une petite incision est réalisée et refermée par 2 points de suture pouvant engendrer une douleur. Lors du test de sucre dans le sang, les souris recevront une injection pouvant engendrer une légère douleur au point d’injection. Les souris auront un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue pour les mesures de glycémie (5 gouttes de sang par test du sucre dans le sang). Ces prélèvements peuvent engendrer une légère irritation au point de prélèvement. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à deux plaies de compression (3h de compression par jour durant 3 jours pour les plaies chroniques ou 3 x 2h dans une journée pour les plaies aiguës). L’induction des plaies peut engendrer une douleur. La répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de compression et le suivi des plaies par photo (5min) peut fragiliser les souris. L’induction des plaies peut engendrer une douleur et une légère perte de poids. La mise en cage isolée suite à l’induction des plaies engendre une perte d’interaction sociale, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Les souris sont isolées juste après la dépilation et jusqu’à la fin de l’expérimentation pour éviter toute sur-blessure. L’anesthésie générale par injection peut générer une douleur modérée au point d’injection. Aucune nuisance n’est attendue lors des différentes mesures réalisées sous anesthésie durant l’expérimentation. Seule la réponse à l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique (picotements locaux) ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée entre 20 secondes et 60 secondes). Ce faible courant électrique est nécessaire pour faciliter l’entrée des molécules dans la peau.
Devenir
Il sera réalisé une mise à mort en fin d’expérimentations et un prélèvement des tissus cutanés et d’organes. Cette étude vise à étudier le processus de cicatrisation selon le régime suivi (régime alimentaire contrôle associé à différents « sucres » ou régime alimentaire riche en lipides associé à différents « sucres ») ainsi que les différences de réponses de la peau en fonction de ces régimes alimentaires. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet des différents régimes alimentaires sur la peau (peau, tissus adipeux, foie, estomac, vaisseaux, plasma).
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime alimentaire enrichi en sucre/gras), notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1296 incluant les 2 sexes. Le nombre d'animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs mesures seront couplées sur chaque animal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les anesthésies seront gazeuses à l’exception de l’anesthésie pour l’étude des réponses de la peau nécessitant une anesthésie plus longue. Des analgésiques seront administrés avant toute induction de plaies et au minimum 24h après. Pour les manipulations sous anesthésie générale, les souris seront placées dans une enceinte chauffée pour maintenir un confort thermique.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous réaliserons les manipulations sur des souris âgées de 26 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé.
Production de sérum et collecte de tissus chez le hamster pour développer des outils immuno-sérologiques’
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Le projet vise à produire du sérum et des tissus de référence à partir de hamsters immunisés. 112 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit trois immunisations puis une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'espèce par sa bonne réponse immunitaire et présente les cultures cellulaires comme une piste future de réduction, la mise à mort servant à collecter sang et organes.
Objectifs
De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes, dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. le virus de la rage), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou les musaraignes, ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des tissus. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Ce projet ne nécessite pas d’analyse statistique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris et musaraignes, réservoirs de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.
Procédures
Les hamsters seront immunisés trois fois par voie intra-péritonéale ou par voie sous-cutanée (animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont celles liées au stress de la contention de l'animal, et à l'anesthésie gazeuse et celles lisées à la douleur liées aux injections par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée (légères de courtes durées mais répétées).
Devenir
Mise à mort pour collecte de sang et tissus
Remplacement
Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules en 3 dimensions. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumon, cerveau, foie, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.
Réduction
Le nombre de hamsters a été confirmé par les premiers résultats obtenus d'un précedent projet pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement de cultures de cellules en 3 dimensions, qui à moyen terme, permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Suite à l'obtention de premiers résultats, nous avons modifié le protocole d’immunisation des animaux afin d’avoir une meilleure réponse immunitaire sans qu’il soit nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux par espèce virale.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront immunisés par des suspensions non pathogènes ou faiblement réplicatives (virus inactivés, faiblement réplicatifs ou protéine virale vectorisée ou protéine adjuvée).
Choix des espèces
Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées ou adjuvées d’intérêt ont montré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.
Formation aux gestes techniques de base chez la souris : amélioration des pratiques et compétences sur le plateau d’exploration fonctionnelle
- Formation professionnelle
Issues de l'élevage interne, écartées d'autres projets ou surnuméraires et déjà destinées à la mort, 1 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Elles sont utilisées pour entraîner le personnel aux injections, prélèvements sanguins et gavages, en dehors de tout objectif de connaissance. Le porteur revendique l'absence de "méthode de remplacement" pour apprendre à ressentir les réactions de l'animal, tout en évoquant l'achat futur d'animaux factices. Toutes sont tuées à la fin, l'apprentissage incluant les gestes d'euthanasie.
Objectifs
Ce projet a pour but d’encadrer l’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques dits « de base » sur la souris, en complément aux formations réglementaires initiales et continues, pour garantir une manipulation optimale des animaux dans le cadre des projets de recherche menés sur notre site.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de nous assurer du bon niveau de technicité des utilisateurs de notre plateau, pour un bien-être optimal de nos animaux sur l’ensemble des projets réalisés dans notre structure. Par ailleurs, il permettra une meilleure reproductibilité des résultats obtenus par la suite.
Procédures
Les deux premiers lots d’animaux seront soumis à 1 à 5 injections (durée approximative 1 minute par geste, 1 geste par jour). Cela concerne maximum 475 animaux éveillés et 125 sous anesthésie. Le troisième lot d’animaux sera soumis à 1 à 3 prélèvements sanguins (durée approximative 5 minutes par geste, 1 geste par semaine). Cela concerne maximum 400 animaux dont entre 100 et 300 sous anesthésie. Le quatrième lot d’animaux sera soumis à 1 à 5 administrations orales / 4 administrations nasales de gouttes de sérum physiologique (durée approximative 5 minutes, 1 geste par jour). Cela concerne maximum 200 animaux en administration orale et 100 animaux en administration nasale. La prise de décision quant à la mise en place d'une anesthésie dépendra de la technique utilisée, des recommandations vétérinaires en la matière et du besoin de travailler avec un animal éveillé pour pouvoir interpréter son ressenti et adapter les gestes à ses réactions. Selon les besoins d'apprentissage que nous transmettrons les apprenants, certains animaux de ces quatre lots seront soumis à un prélèvement sanguin en fin d'étude : ils seront soit anesthésiés pour un prélèvement unique de sang (durée approximative 5 minutes), soit soumis à une chirurgie avec anesthésie et analgésie avant prélèvement unique de sang (durée approximative 15-20 minutes). Un dernier lot d'animaux ne sera soumis qu'à un prélèvement sanguin unique. Maximum 50 animaux seront anesthésiés pour un prélèvement unique de sang (durée approximative 5 minutes), maximum 50 animaux seront soumis à une chirurgie avec anesthésie et analgésie avant prélèvement unique de sang (durée approximative 15-20 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvements peuvent entraîner un inconfort et une douleur de courte durée au site d’administration / prélèvement (estimé à entre 5 et 15 minutes selon le geste). Les administrations peuvent entraîner un inconfort et une douleur lors de la réalisation, voire une irritation pour l'administration orale. Les animaux peuvent ressentir un stress durant les manipulations et contentions par des personnels en cours d’apprentissage des bonnes pratiques.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue du projet dans le cadre de l’apprentissage des gestes d’euthanasie et de prélèvements post-mortem.
Remplacement
Ce projet a pour objectif un apprentissage de bonnes pratiques pour les gestes réalisés sur l’animal. Notre structure propose à la communauté de ses utilisateurs des supports de formation : affichages sur les méthodes d'observation de l'animal, les critères d'évaluation et la gestion de la douleur, livret recensant les différentes techniques de préhension et de prélèvement/administration avec photographies et protocoles, vidéos des différents gestes disponibles à la demande. Cela dit, il n’existe pas à ce jour de méthode de remplacement pour pouvoir permettre aux utilisateurs d’appréhender les interactions avec le rongeur, de ressentir les réactions de l’animal lors des manipulations. Cette formation est nécessaire en complément des supports existants pour apprendre aux manipulateurs à interpréter les réactions de l’animal et à réagir correctement en conséquence.
Réduction
Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront issues de notre propre élevage. Ce seront des animaux dont le profil génétique n'est pas adéquat ou surnuméraires de la production destinée à d’autres projets, et destinés à l’euthanasie. Nous réaliserons l’apprentissage de plusieurs gestes sur un même animal pour en limiter le nombre. Avant de manipuler des animaux vivants, les apprenants pourront commencer l'acquisition des gestes sur des animaux déjà mis à mort dans le cadre d'autres projets. Nous nous assurerons de la bonne acquisition des gestes avant la manipulation d'animaux vivants, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Notre plateau envisage également à l'échelle de quelques années l'acquisition ou le développement interne d'animaux factices dans une même optique de réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les manipulations seront adaptées en fonction des techniques. Nous proposerons dès que possible l’enseignement de techniques alternatives non invasives sur l’animal. Toutes les injections se feront avec des solutions sans effet sur l’animal. Les volumes de prélèvements de sang seront effectués selon le poids de l'animal aux fréquences respectant sa physiologie. Nous mettrons en place une anesthésie gazeuse et une analgésie quand cela est recommandé pour certaines techniques engendrant une douleur chez l’animal. Le suivi du bien-être animal sera effectué quotidiennement par un personnel compétent, les utilisateurs seront également formés à ce suivi. Les animaux sont pris en charge dès leur naissance ou arrivée dans le service pour un suivi quotidien. Ils seront hébergés en groupe, dans le respect de leurs fratries respectives.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de former nos utilisateurs sur leurs gestes pratiques, nous devons donc réaliser cet apprentissage sur l’espèce qu’ils utilisent dans le cadre de leurs propres projets de recherche : la souris. Les formations seront réalisées préférentiellement sur animaux adultes, entre 6 semaines et 6 mois en nous adaptant à l’âge des animaux qui seront disponibles dans notre élevage au moment des apprentissages. Si un utilisateur souhaite toutefois acquérir ces mêmes techniques sur des animaux d’âge différent (entre 3 et 6 semaines), nous adapterons le contenu enseigné et les protocoles en fonction de la physiologie de l’animal. En effet, le but de ce projet est de former chaque utilisateur à la manipulation de l’animal dans la tranche d’âge qu’il est susceptible d’utiliser dans ses propres expériences par la suite.
Effets de la thermoneutralité sur la croissance et la reproduction de souris juvéniles en malnutrition protéique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines pour modéliser la malnutrition infantile, avec contentions quotidiennes, frottis vaginaux et un test au glucose comprenant six heures de jeûne, une incision de la queue et plusieurs prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si l'énergie dépensée pour maintenir la température du corps module la réponse au manque de protéines. Les retombées annoncées pour les 150 millions d'enfants malnutris restent lointaines, la mise à mort servant à prélever muscle et graisses.
Objectifs
La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle peut avoir des conséquences durables sur la croissance, le métabolisme (la manière dont le corps utilise l’énergie) et la puberté. Des études suggèrent que les garçons pourraient être plus touchés que les filles. Dans nos travaux précédents chez la souris, nous avons observé qu’un régime pauvre en protéines affecte davantage la croissance et le métabolisme des jeunes mâles, tandis qu’il retarde surtout la puberté chez les femelles. Ces résultats indiquent que, lorsqu’il manque de nutriments, l’organisme doit répartir son énergie entre plusieurs fonctions essentielles : grandir, maintenir son métabolisme et assurer la reproduction. Cette répartition semble différer selon le sexe. Nous avons montré que, chez les jeunes mâles, l’énergie consacrée à la reproduction joue un rôle limité dans ces effets. En revanche, une part importante de l’énergie pourrait être utilisée pour maintenir la température corporelle. L’objectif de ce projet est de comprendre si l’énergie associée au maintien de la température corporelle influence la façon dont l’organisme gère un manque de protéines, en particulier pendant la période juvénile, lorsque la croissance et la puberté demandent aussi beaucoup d’énergie. Nous mesurerons les effets d’un régime pauvre en protéines sur la croissance et sur certains paramètres du métabolisme, dans des conditions adaptées aux besoins physiologiques des souris. Ce projet permettra de mieux comprendre comment la nutrition au début de la vie peut influencer le risque ultérieur de troubles métaboliques et reproductifs, en tenant compte des différences entre sexes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’organisme répartit son énergie en cas de manque de protéines pendant l’enfance, notamment l’énergie utilisée pour maintenir la température du corps, et comment ces mécanismes peuvent différer entre les sexes. La malnutrition infantile touche malheureusement encore 150 millions d’enfants de moins de 5 ans à travers le monde. Ces connaissances aideront à mieux comprendre le fonctionnement du corps des jeunes en situation de malnutrition et pourraient, à plus long terme, contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou d’amélioration de la prise en charge en santé humaine.
Procédures
52 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Toutes les souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort transitoire. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.
Remplacement
Cette recherche vise à comprendre comment l’organisme dans son ensemble réagit à différents régimes alimentaires, en particulier en cas de manque de protéines. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules en laboratoire) capable de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent en permanence pour réguler l’état nutritionnel. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour répondre à ces questions. La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi en recherche en nutrition et permet d’étudier de façon fiable les effets d’une carence en protéines dans des conditions proches de la physiologie. L’objectif étant d’analyser des mécanismes à l’échelle de plusieurs organes, ainsi qu’au niveau moléculaire, ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’être humain.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux par groupe (14 mâles et 12 femelles) a été déterminé grâce à un calcul statistique précis, afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant la validité scientifique des conclusions. Ce calcul s’appuie sur les paramètres les plus variables entre les individus. Les analyses permettront de comparer les effets de l’alimentation, du sexe et d’autres paramètres biologiques. Enfin, pour éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux dans de futurs projets, différents organes pouvant être utiles à d’autres recherches (comme le muscle ou les graisses) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.
Raffinement
L’étude ne débutera que chez des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine de manière individuelle. Pour faciliter l’alimentation des plus jeunes, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu’elle soit facilement accessible. La quantité de nourriture consommée sera également surveillée pour s’assurer de leur bon état général. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectuées sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour comprendre le fonctionnement de l’organisme lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment la production de chaleur par l’organisme oriente la réponse à un manque de protéines dans l’alimentation. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car c’est le stade où la croissance et la reproduction se mettent en place chez la souris.
Rôle de l’inflammation dans l’infection à Mycobacterium ulcerans chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées avec la toxine mycolactone dans le coussinet plantaire ou inoculées avec la bactérie dans la queue, 3 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement modéré, toutes tuées à l'issue. L'ulcère de Buruli étudié provoque chez l'humain, surtout l'enfant, des lésions étendues. Les atteintes attendues chez les souris sont un gonflement du coussinet, une inflammation et une gêne locomotrice. Le porteur affirme que les modèles cellulaires ne sont "pas transposables à l'échelle de l'organisme entier" et conclut au caractère "indispensable" de l'animal.
Objectifs
Notre équipe s’intéresse à l’ulcère de Buruli, infection provoquée par Mycobacterium ulcerans et qui touche surtout les enfants, principalement diagnostiquée dans les zones humides de l’Afrique Centrale et de l’Ouest. Les lésions débutent généralement par un nodule qui évolue en une ulcération qui s’étend dramatiquement. Ces lésions ne sont pas douloureuses, en effet, la bactérie produit une toxine : la mycolactone, qui a un pouvoir analgésique. Au début des années 2005, la mise en place d’un traitement antibiotique a été une révolution. En effet, 50% des patients présentant des formes précoces n’ont plus besoin d’être hospitalisés puisque le traitement peut être mené en ambulatoire grâce aux dispensaires. Pour les formes tardives, la chirurgie (excision large des parties atteintes jusqu’en peau saine et greffe cutanée de parage) associée à l’antibiothérapie reste indispensable. Actuellement, la prise en charge de ces formes est le problème majeur, d’autant plus que les lésions étendues engendrent des séquelles importantes telles que déformations articulaires, rétractions tendineuses, amputations nécessitant une rééducation fonctionnelle adaptée. La prise en charge est donc pluridisciplinaire et requiert un temps d’hospitalisation très long (>3 mois) dans des centres spécialisés éloignés des domiciles des patients. Ce temps d’hospitalisation est long en raison d’une réparation tissulaire lente et représente un coût exorbitant. La prise en charge des patients pourrait donc être améliorée en diminuant ce temps. Le principal axe qui pourrait être amélioré pour atteindre cet objectif consisterait à accélérer la cicatrisation. Nous avons récemment montré que la mycolactone contenue dans des vésicules naturelles de la bactérie exacerbait la réponse inflammatoire favorisant le développement des lésions cutanées. Pour développer de nouvelles stratégies préventives prenant en compte cet effet de la mycolactone jusqu’alors inconnu, nous devons caractériser tous les mécanismes mis en jeu, tout particulièrement les voies de l’inflammation activées et identifier des composés anti-inflammatoires permettant de réduire ou d’inhiber cette inflammation. Ainsi, l’antibiothérapie de référence pourrait être complétée par un traitement anti-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seraient de caractériser les voies pro-inflammatoires induites par la mycolactone et par l’infection à Mycobacterium ulcerans et d’identifier des molécules anti-inflammatoires permettant d’inhiber cet effet. Ces molécules anti-inflammatoires pourraient ensuite être utilisées afin de compléter le traitement (antibiothérapie) afin de faciliter et d’améliorer la guérison des patients.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à l’injection de la mycolactone dans le coussinet plantaire. Ce geste sera réalisé une seule fois, par une personne habituée et les animaux seront sous anesthésie générale (isoflurane). Ce geste pourra être réalisé au maximum sur 322 (182+140) animaux et durera moins de 30 secondes par animal. L’inoculation de la bactérie dans le derme de la queue sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale et par une personne habituée à réaliser ce geste. Ce geste pourra être réalisé au maximum sur 3168 (1920 + 1248) animaux et durera moins de 30 secondes par animal. La mesure de l’inflammation se fera par mesure de l’épaisseur du coussinet plantaire à l’aide d’un pied à coulisse numérique. Pour cela, la souris vigile sera prise en contention (contention manuelle en décubitus dorsal. Ce geste est indolore et rapide à réaliser. Ce geste pourra être réalisé 24h, 48h et 72h après l’injection de mycolactone et sur 322 (182 + 140) animaux maximum et durera moins de 30 secondes par animal. L’injection des composés anti-inflammatoires et de leur véhicule sera réalisée par voie intra-péritonéale. Après mise sous contention des souris (prise de contention manuelle en décubitus dorsal), le composé sera injecté à l’aide d’une seringue de 0,5 mL équipée d’une aiguille de 30G de 8 mm de longueur. Un volume de 200μL maximum sera injecté dans le cadran inférieur droit de l’abdomen pour éviter le caecum. Pour les souris stimulées par la mycolactone, l’injection en intrapéritonéale du composé sera réalisée toutes les 24h de J- 3 avant la procédure 1 et jusqu’à J+3, soit pendant 7 jours. Ce geste pourra être réalisé sur 2200 (280 + 1920) animaux et durera moins de 30 secondes par animal. Pour les souris infectées par M. ulcerans, le composé sera administré de J20 à J45 si apparition de lésions ou jusqu’à J75 si pas de lésions L’antibiothérapie sera administrée par IP et gavage. Pour l’injection intra-péritonéale, le composé sera injecté à l’aide d’une seringue de 0,5 mL équipée d’une aiguille de 30G de 8 mm de longueur. Le composé sera administré par voie orale à l’aide s’une sonde adaptée et par une personne habituée à réaliser ce geste. L’administration de l’antibiothérapie sera réalisée toutes les 24h. Pour les souris infectées par M. ulcerans, l’antibiothérapie sera administrée de J20 à J45 si apparition de lésions ou jusqu’à J75 si pas de lésions. L’injection ou le gavage dureront moins de 30 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables qui pourraient survenir sont une surinfection (gonflement du coussinet, rougeur, changement de comportement marqué de l’animal) au site d’injection, une inflammation due aux propriétés pro-inflammatoires de la mycolactone, une altération de la démarche (boitement ou gêne locomotrice) et un stress lié à la prise de contention (geste rapide
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le bien-être animal a été une priorité dans la conception de cette étude. Cependant, à ce stade, l’utilisation d’animaux reste nécessaire. L’expérimentation animale est en effet indispensable pour identifier les cibles de l’inflammation en réponse à la mycolactone ou à la bactérie. Des modèles cellulaires permettent d’évaluer les propriétés pro-inflammatoires de la mycolactone, mais les résultats obtenus ne sont pas transposables à l’échelle de l’organisme entier. Il en est de même pour l’évaluation des molécules anti-inflammatoires.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Ce nombre permet aussi d’obtenir des quantités d’échantillons biologiques suffisantes pour les analyses de laboratoire. Le nombre maximal d’animaux prévu est de 3490 souris, il s’agit du nombre maximal, il sera probablement réduit.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, mais aussi la détresse ou l’angoisse qu’elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l’ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute angoisse lors du protocole experimental, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé pour certaines procédures.
Choix des espèces
Toutes les études portant sur la physiopathologie de M. ulcerans montrent que le modèle souris est un très bon modèle. Dans notre contexte, l’utilisation de « l’espèce souris » nous semble très pertinente puisque nous possédons différentes lignées ayant des phénotypes différents vis-à-vis de l’infection à M. ulcerans (seule espèce à notre connaissance présentant des phénotypes différents selon les lignées utilisées). Nous avons aussi la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées chez lesquelles un gène a été désactivé afin de comprendre son rôle en observant les effets de son absence. Par exemple, l’inactivation de certains gènes permet aux souris de cicatriser spontanément suite à l’infection par Mycobacterium ulcerans. De plus, de très nombreux outils pour cette espèce sont disponibles pour analyser finement les différentes phases de l’infection (outils moléculaires et immunologiques). Enfin, notre équipe possède une grande expertise quant à l’utilisation des modèles murins. Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).
Évaluation des effets sur la santé des piégeurs de NO et des alternatives aux nitrites dans les charcuteries dans un modèle rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour évaluer des alternatives aux nitrites de la charcuterie, 272 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des régimes expérimentaux pendant 21 à 100 jours, sont placés jusqu'à 46 heures en cage individuelle à métabolisme, et 144 d'entre eux reçoivent une injection déclenchant les premiers stades du cancer du côlon. Le porteur affirme que ces stades précoces "n'induisent aucune douleur". L'espèce est choisie pour arrêter l'étude avant les stades avancés, jugés plus douloureux, le côlon étant prélevé après mise à mort.
Objectifs
Sur la base d’études épidémiologiques réalisées chez l’homme et d’études mécanistiques réalisées chez l’animal, la consommation de charcuteries a été classée par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) comme étant cancérigène pour l’homme, particulièrement à cause de résultats obtenus sur la cancérogenèse colique. Les additifs nitrés (sels de nitrites et de nitrates) sont largement utilisés dans les charcuteries et sont suspectés d’être à l’origine de leur effet cancérigène sur le côlon. Ces additifs sont utilisés comme conservateurs afin de limiter le développement de bactéries pathogènes et le rancissement oxydatif des charcuteries, mais aussi pour les qualités organoleptiques particulières qu’ils confèrent à la viande (goût, couleur, texture). Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viande. Pendant la digestion, les nitrites et les nitrates des charcuteries favorisent la formation de composés nitrosés toxiques pour le côlon tandis que le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l'oxydation des lipides du régime aboutissant à la formation de composés également toxiques pour le côlon. L’objectif de ce projet est d’évaluer chez l’animal modèle l’effet de plusieurs alternatives à ces sels nitrités dans deux charcuteries largement consommées, le jambon et la saucisse de type hot-dog, sur différents paramètres liés à la cancérogenèse colique et à la peroxydation lipidique. Ces alternatives sont soit des composés qui permettent la réduction de la formation des composés nitrosés issus des nitrites tout en gardant la maîtrise des processus oxydatifs, soit des composés qui viennent en remplacement de ces sels nitrités, en ayant les mêmes propriétés de conservateurs, sans les effets délétères. Ces différents composés, déjà utilisés en alimentation humaine (extraits végétaux, fibres, vitamines) seront d’abord testés dans les deux types de charcuteries lors de phase de digestion in vitro, à différentes doses d’incorporation. Seuls les composés les plus prometteurs seront choisis pour les phases animales.
Bénéfices attendus
A l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si les alternatives aux sels nitrités que nous avons étudiées peuvent constituer de bonnes candidates pour pouvoir proposer des charcuteries qui soient respectueuses la santé du consommateur, c’est-à-dire des denrées ne provoquant plus formation de composés nitrosés toxiques durant la digestion tout en gardant la maîtrise des processus oxydatifs, mais aussi possédant des qualités organoleptiques acceptables pour le consommateur.
Procédures
272 rats recevront un régime expérimental pendant 21 jours pour 128 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 144 autres. Ces 272 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures maximum en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 144 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’une durée de moins d'une minute (préhension, injection) pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.
Devenir
Le prélèvement du côlon est nécessaire à la réalisation des analyses prévues dans le projet. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin de la période d'expérimentation.
Remplacement
Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.
Réduction
Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.
Raffinement
Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (maximum 46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urine et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à la situation humaine. De plus, ce modèle rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeurs, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les 2 études se feront sur des rats de 5 semaines à leur arrivée. A cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maitrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.
Caractérisation des causes de l’infertilité humaine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 66
8 994 animaux, 8 928 souris et 66 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour étudier l'infertilité humaine. Les femelles sont stimulées par des injections hormonales puis inséminées, afin de récupérer ovocytes et embryons. Le porteur affirme qu'aucun système de culture ne permet d'obtenir des gamètes matures et qu'il est donc impossible de remplacer l'animal vivant. Les souris femelles sont tuées pour prélever les ovocytes, les 66 rattes proposées ensuite à d'autres équipes.
Objectifs
L'infertilité touche près de 15% des couples en âge de concevoir. Les techniques de reproduction assistée actuelles consistent en (1) l'insémination intra-utérine de sperme si les spermatozoides du partenaire montrent une bonne mobilité, (2) la fécondation in vitro des ovocytes et (3) l'injection intracytoplasmique de sperme dans le cas contraire. Les ovocytes fécondés vont ensuite continuer leur développement avant d'être réimplantés dans l'utérus au stade embryonnaire. Ces techniques sont lourdes, notamment pour les patientes : stimulations hormonales pour récupérer les ovocytes, suivis échographiques, ponction ovocytaire sous anesthésie. Une amélioration du rendement de ces techniques est donc indispensable pour améliorer la prise en charge des patientes. Ce programme de recherche permettra d'évaluer l'impact d'un agent de contraste sur l'amélioration de l'infertilité féminine, d'évaluer l'impact de mutations génétiques sur la qualité spermatique et ovocytaire, de déterminer l'effet de molécules sur l'amélioration de la capacité fécondante du sperme.
Bénéfices attendus
La finalité de ce projet aura un impact direct sur la santé humaine. Les bénéfices attendus sont doubles avec (i) la réduction du nombre de Fécondation In Vitro permettant l'obtention des embryons à partir d'une seule stimulation ovarienne et (ii) si des molécules améliorent la survie et la mobilité spermatique, de proposer directement aux patientes une insémination intra-utérine de spermatozoïdes traités, la fécondation et le développment embryonnaire se faisant alors in vivo favorisant les chances de grossesse.
Procédures
Les souris femelles et les rattes seront stimulées hormonalement, cela nécessite deux injections à 48h d'intervalle. La stimulation hormonale (injection) des souris et des rattes nécessitera de les maintenir (30 secondes). Dans une des étapes où il sera nécessaire de tester un agent de contraste, les souris seront stimulées pour faciliter l'ouverture du col utérin et à J1 post-stimulation, l'agent de contraste sera injecté, une seule fois (30 secondes). L'insémination de sperme dans le vagin des femelles nécessitera de les maintenir (une à deux minutes).
Impact sur les animaux
La génération de souris génétiquement modifiée (externalisation ou gestes décrits dans d’autres projets autorisés par le Ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l’Espace) et celui de rats génétiquement modifiés (externalisation) demande le génotypage adéquat qui sera effectué à partir d'un prélèvement tissulaire de l'oreille sur animal vigile lors de l'identifiation de l'animal (gestes décrits dans d’autres projets autorisés par le Ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l’Espace). Le maintien des souris et rattes pour les injections peuvent entrainer un stress léger. L'injection en elle-même peut causer une douleur légère. L'insémination de sperme dans le vagin des souris peut entrainer un inconfort et un stress légers. Les femelles traitées avec l'agent de contraste pourraient faire une réaction allergique (difficulté respiratoire, rougeur) due à la présence d'iode dans le produit de contraste.
Devenir
La récupération des ovocytes ou autres tissus à analyser nécessite la mise à mort des souris femelles. Après la mise bas et le sevrage des ratons, les rattes seront proposées aux autres utlisateurs. Elles ne peuvent pas être réutilisées dans ce projet car les expéreinces sont uniquement réalisées sur des femelles n'ayant jamais eu de portée.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male). Il n'existe pas de système mimant le tractus génital femelle (sécrétion, interaction) permettant de faire des tests d'insémination artificielle in vitro.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué pour avoir une différence de 20% entre les groupes et une puissance statistique de 80%. Les résultats seront ensuite analysés avec des tests de Fisher ou des Anova selon le nombre de paramètres étudiés. Lorsque les gamètes sont utilisées en fécondation in vitro, la stimulation hormonale des souris permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, cela permet de réduire le nombre de souris femelles.
Raffinement
Des points limites ont été définis pour limiter toute souffrance, angoisse ou stress chez les animaux. En cas d’atteinte des points définis, des mesures correctives seront mises en place, en accord éventuellement avec le vétérinaire référent ou la SBEA. La mise à mort des animaux sera effectuée dans une pièce différente de celle de l'hébergement. Suite aux inséminations, les femelles seront placées individuellement avec un male vasectomisé pendant 24h puis rassemblées à raison de 2 souris/rattes par cage. Les injections et inséminations seront réalisées sous anesthésie/analgésie chez les rattes pour limiter leur stress et leur inconfort. Les rattes pourront être réutilisées dans d'autres projets à la suite de l'expérimentation car elles ne seront pas mises à mort.
Choix des espèces
L'étude des mécanismes de fécondation nécessite l'utilisation d'animaux car 1/ nous ne pouvons pas utiliser des ovocytes humains permettant d'étudier la fécondation par des spermatozoides humains. 2/ Il n'existe pas de système de culture cellulaire permettant d'obtenir des gamètes viables. 3/ La fécondation nécessite l'obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité, la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité en général et la fécondation en particulier. Notre étude s'intéresse à la fécondation des mammifères. Les processus moléculaires sont très similaires entre l'homme et les rongeurs. Les souris et rattes femelles seront utilisées dès 5 semaines et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les femelles répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit.
Influence à long terme d’une infection fœtale au cytomegalovirus sur le devenir d’une tumeur cérébrale ultérieure chez le rat
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées pour injecter le cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, les ratons nés subissent des tests sensorimoteurs quotidiens, puis une tumeur cérébrale leur est implantée à deux mois. 1 274 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère, tous tués à l'issue. Le porteur décrit chez les ratons des crises d'épilepsie généralisées corrélées à des morts subites. Les femelles sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, la descendance pour analyse post-mortem.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact d’une infection précoce anténatale par le CMV sur le développement futur d’une tumeur cérébrale ultérieure, aux niveaux moléculaire et cellulaire, en nous intéressant particulièrement aux cellules immunitaires du cerveau.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus (CMV) sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces mécanismes, en abordant les relations entre infection cérébrale fœtale par le CMV, immunité cérébrale retardée, et développement de tumeur cérébrale.
Procédures
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le cytomegalovirus (CMV) dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie postnatale (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Après le 60eme jour de vie postnatale (P60), certains animaux sont opérés sous anesthésie générale (durée d’environ 30 minutes) pour implanter des cellules qui provoqueront l’apparition d’une tumeur cérébrale dans le cortex. Les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques et comportementaux. La majorité des femelles gestantes (de plus de 97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de signes cliniques sont attendus. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation, et correlée à la survenue de mort subite (sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP) ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex). Le développement d’une tumeur cérébrale dans le cortex de rat adulte est associé à une dégradation de l’état général des animaux, notamment une perte d’appétit, une perte de masse corporelle, et une diminution de l’activité.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle des systèmes immunitaires cérébral foetal et maternel. Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des organoïdes cérébraux, et encore moins par bio-informatique. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (tranches aigues de cerveau), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car les animaux seront suivis au cours de notre projet, depuis les tests neurologiques néonataux, jusqu’aux enregistrements in vitro et aux analyses immunohistopathologiques réalisées chez l’adulte. Ceci aura l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Chaque rate et sa portée sont hébergées dans une cage avec nourriture et eau à volonté. Après sevrage (vers le 28e jour), les rats mâles et femelles sont séparés et hébergés à 2-4 par cage. L’environnement est systématiquement enrichi avec du papier foisonnant et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid ; les rats adultes auront en plus une buchette à ronger. Avant les chirurgies (gestantes et rats adultes), réalisées sous anesthésie générale, la douleur est systématiquement prise en charge par l’injection sous-cutanée d’analgésique et d’anti-inflammatoire, et par l’application d’analgésiques locaux. Pendant la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant, leur rythme respiratoire est surveillé en permanence. Une injection ip de sérum physiologique à 38°C est réalisée en fin d’intervention pour réhydrater les animaux. Après leur réveil, ils sont placés sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Les rats adultes ayant reçu l’injection stéréotaxique sont replacés avec leurs congénères. Un suivi post-chirurgical est réalisé afin de détecter des points-limites précoce et adaptés. Seront surveillés chez les rates gestantes l’absence d'hémorragie vaginale et la date de la mise bas (euthanasie si retard de plus de 24 heures), et chez tous les animaux, la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si besoin), la perte de poids (euthanasie si plus de 20%), l'hypothermie (froid au touché), l’apparition de signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). Si un score de points-limites est supérieur à 3, une injection d'analgésique sera pratiquée : buprénorphine ou anti-inflammatoire non stéroïdien en sous-cutanée toutes les 8 à 12 heures (doses utilisées dans l’ensemble de notre projet). Les ratons sont également suivis, avec une surveillance de la prise de poids, et l’observation de phénotypes caractéristiques de notre modèle (échec aux tests sensorimoteurs, hyperextension des membres inférieurs, crises généralisées tonico-cloniques). Ces mesures seront quotidiennes du 1er au 14eme jour de vie postnatale (P14). Après P14, seul le poids sera mesuré, une fois par semaine jusqu’au sevrage et au-delà.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études des propriétés et activités électriques des cellules nerveuses, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au 15e jour de développement embryonnaire, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro et des cellules immunitaires cérébrales sera réalisée entre le 75e et le 90e jour postnatal, période où la tumeur est susceptible d’altérer le fonctionnement cérébral pour déclencher des activités épileptiques et où les cellules immunitaires sont abondantes dans le microenvironnement tumoral.
Modèle de souris diabétiques de type II atteintes de maladie rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Les souris dont l'état se dégrade au-delà des points limites sont mises à mort. 2 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Maintenues sous régime gras, elles reçoivent un produit chimique qui détruit les cellules du pancréas pour provoquer un diabète, puis subissent l'ablation d'un rein, avec un risque de mortalité, de perte de poids, d'hypothermie et de déshydratation. Le porteur reconnaît qu'un modèle génétiquement diabétique existe, tout en maintenant le recours à la destruction chimique du pancréas.
Objectifs
Le diabète de type 2 associé à l’obésité, est associé à de nombreuses comorbidités dont la néphropathie diabétique (complication du diabète affectant les reins) qui peut atteindre un stade d’insuffisance rénale entrainant une dialyse à vie dont le seul traitement consiste en la transplantation rénale. L’altération de la fonction rénale a des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires. Aujourd’hui, les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie (taux de glucose sanguin) par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques, elles ne permettent pas de cibler les comorbidités associées au diabète tel que les maladies rénales chroniques associé au diabète. La mise en place d’un modèle animal de néphropathie diabétique permettrait de tester des molécules anti-diabétiques ou bien des molécules protectrices du rein en cours de développement. L’objectif de ce projet est de proposer un modèle préclinique présentant les caractéristiques de la néphropathie, des atteintes cardiaques et du diabète .
Bénéfices attendus
En proposant un modèle murin d’étude préclinique de néphropathie diabétique, nous aiderons à trouver un traitement pour cette comorbidité du diabète qui aujourd’hui ne dispose pas de traitements efficaces et pourtant à des conséquences dramatiques sur la vie du patient (dialyse, greffe). Également par la mise en place de modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de la pathologie et nous permettrons ainsi un gain de connaissance. Nous avons développé un modèle rat mais ce modèle murin pourrait permettre de tester des composés dont la biodisponibilité est connue uniquement chez la souris.
Procédures
Les animaux seront sous régime gras durant tout le projet. Pour provoquer un diabète, nous détruirons les cellules du pancréas par injection d'un composé chimique. Les composés (candidats médicaments, anti-diabétique) seront administrés 1 à 2 fois par jour, sur une période allant jusqu'à 2 mois. Les injections durent moins d'une minute sur animal vigile et environ 3 minutes sous anesthésie. 1 goutte de sang sera prélevée de façon hebdomadaire (cela dure moins d'une minute). En milieu et fin de période de traitement, 5 prélèvements de sang espacés de 15 minutes permettront de suivre des paramètres sanguins. Une procédure chirurgicale visant à retirer un rein sera effectuée et dure environ 30 minutes. La composition corporelle sera mesurée sous imagerie, cela dure moins de 2 minutes sur animal vigile. Une mesure de la filtration rénale est effectuée, les animaux sont anesthésiés moins de 10 minutes, nous injectons un composé fluorescent. Un moniteur est positionné sur le dos de l'animal le temps de la mesure (2h sur animal vigile). L'animal est ensuite remis dans sa cage d'origine. Des échographies cardiaques et des mesures de pression artérielle seront réalisées en milieu et fin de période de traitement, sous anesthésie générale (environ 10 minutes). En fin de projet, nous récolterons les urines sur une période de 20h pour mesurer les paramètres urinaires.
Impact sur les animaux
Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. Le diabète sera provoqué par un produit chimique altérant les cellules du pancréas. Les niveaux d’insuline sont réduits à niveau faible voire inexistant, cela altérera de façon importante la santé de l’animal. Ainsi, en phase aigüe, une mortalité peut être observée dû à la libération brutale de l’insuline dans la circulation sanguine. Pour limiter cette baisse du taux de sucre dans le sang qui peut être mortelle, du sucre est ajouté dans l’eau de boisson. L’augmentation de la consommation d'eau et de la glycémie sont les caractéristiques du diabète et pourront être observé en cours d’étude. Nous mettrons une litière spécifique et augmenterons les fréquences de change pour le confort des animaux. En phase plus tardive, une perte de poids importante, une hypothermie, une déshydratation et une diarrhée peuvent être des événements observés. Le retrait d'un rein accentuera l'altération de la fonction rénale . Le diabète est stable au-delà 14 jours et ne se détériore pas dans les 2 mois qui suivent. Le traitement chronique testé sur ce modèle préclinique aura pour but d’améliorer leur état diabétique et la fonction rénale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes cibles (cœur, rein, tibia a minima)
Remplacement
Pour trouver un traitement efficace ciblant les deux comorbidités (diabète et nephropathie) , l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. La culture de cellules rénales peut être envisagée dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les comorbidités citées sont la conséquence de ce dérèglement multi-organique. L'utilisation d'une molécule détruisant les cellules du pancréas pour induire le diabète peut être également remplacé par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe sains, non diabétiques. Enfin, nous réduisons l’effet léthal aigue en supplémentant l’eau avec du sucrose pendant la période d’injection de la molécule détruisant les cellules du pancréas.
Raffinement
L’état physique des souris est surveillé 2 fois par jour les 7 jours suivant l’injection du composé toxique, c’est-à-dire jusqu’à stabilisation du phénotype diabétique. Lors de l’installation du diabète, une double litière sera déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure . Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des souris peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier sera euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est effectuée. En cas d’hypothermie (animal froid au toucher), l’animal sera placé en armoire chauffante. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles, une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré et per-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage métabolique se fait la veille de l’euthanasie. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les souris peuvent voir leur congénère à proximité mais on met à disposition également un igloo pour leur permettre de se cacher. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques sera validé avec le vétérinaire désigné.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Ainsi, la connaissance acquise sur cette espèce permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris utilisées arrivent dans nos locaux à 22 semaines d’âges. Dans l’établissement fournisseur elles ont été mises sous régime standard (groupe contrôle sain) ou régime gras pendant 16 semaines afin de les rendre obèses. Nous les étudierons à cet âge car c'est le temps nécessaire au développement d'un diabète avec ce régime.
Rôle des cellules neutrophiles dans l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Un infarctus est provoqué chirurgicalement chez 3 264 souris, dont 735 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une opération du cœur de trente minutes, quatre échocardiographies et jusqu'à dix-sept injections, pour étudier le rôle des neutrophiles dans la réparation cardiaque. Le porteur indique que ce modèle entraîne 15 à 30 % de mortalité, qu'il décrit comme "subite et sans signe de souffrance préalable". La cicatrisation étudiée passe par une rupture du cœur ou une arythmie mortelle chez près d'un tiers des mâles.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (communément appelé "attaque cardiaque") est une cause de mortalité et d’invalidité majeure. Les mécanismes gouvernant la réparation du cœur après un infarctus ne sont pas entièrement connus. L’inflammation joue un rôle important dans la réparation du coeur après un infarctus, mais les types cellulaires et voies moléculaires impliqués restent méconnus. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de certaines cellules de l’inflammation, les neutrophiles, dans la réparation du cœur après l'infarctus. Les animaux subiront un infarctus du myocarde induit par une opération chirurgicale. La fonction cardiaque des souris sera analysée par échocardiographie, et la réparation du coeur après l'infarctus du myocarde sera étudiée. Ce projet permettra d’identifier des nouveaux acteurs inflammatoires de la réparation du coeur après un infarctus et de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une meilleure compréhension des mécanismes inflammatoires de la réparation cardiaque après infarctus. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires dépendant des neutrophiles est essentielle pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à limiter les dommages tissulaires et améliorer la cicatrisation après un infarctus du myocarde et par conséquent, limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et réduire la mortalité post-infarctus.
Procédures
Intervention chirurgicale pour induction de l’infarctus du myocarde (1 fois, 30 minutes) Echocardiographie (4 fois, 15 minutes) Injections (17 fois, quelques secondes)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress et hypothermie liés à l'anesthésie, stress lié à l’isolement de courte durée dans la phase post-opératoire et post-échocardiographie ; Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire. Le modèle d’infarctus du myocarde permanent est associé à une mortalité (environ 30% chez les mâles, 15% chez les femelles), subite et sans signe de souffrance préalable, causée par rupture cardiaque ou arythmie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure pour le prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études bio-informatique et de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, la réparation cardiaque après infarctus du myocarde impliquent l’interaction complexe de différents types cellulaires et une interaction entre différents organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers, rendant le modèle animal indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par d’une analyse statistique et à partir de notre expérience préalable sur les méthodes utilisées dans ce projet. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle".
Raffinement
Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et anti-douleurs adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure chirurgicale et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante à 37°C dès l’induction de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle puis placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie anti-douleur sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 72 heures, avec administration d'anti-douleurs. Tout au long de la procédure, les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation et de la réparation cardiaque post-infarctus du myocarde dans un organisme biologique complexe. Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé dans ce projet représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, permettant une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Nous utiliserons des souris adultes, âgées entre 8 et 12 semaines et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.
Implication de la protéase X dans les maladies vasculaires cérébrales chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
Soumises à des injections intrapéritonéales et à une chirurgie de quarante minutes, 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reproduisent une anomalie protéique observée dans les maladies des petits vaisseaux du cerveau, pour lesquelles aucun traitement n'existe. Les cerveaux sont prélevés à différents âges après la mise à mort, afin de suivre l'évolution des lésions. Le porteur conclut que ces interactions vasculaires ne peuvent être reproduites ni sur cellules isolées ni par ordinateur, et que le recours à l'animal ne peut donc "pas être substitué".
Objectifs
Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont une cause majeure d’accidents vasculaires cérébraux récurrents chez l’homme, et aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Ce projet vise à étudier le mécanisme des lésions vasculaires dans des modèles souris reproduisant une anomalie protéique fréquemment observée dans ces maladies. Des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques seront effectuées sur des cerveaux prélevés à différents âges après la mise à mort des animaux, afin d’examiner l’évolution des lésions aux divers stades de la maladie. Ces études sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques
Bénéfices attendus
Santé humaine : Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension et le traitement des maladies des petits vaisseaux cérébraux. À court terme : Valider la pertinence de 2 modèles chez la souris pour évaluer les conséquences d’une anomalie protéique fréquemment observée dans ces maladies. À moyen terme : Mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies afin de développer des approches thérapeutiques adaptées.
Procédures
Injections intrapéritonéales, moins de 5/animal, 10 secondes. Chirurgie sous analgésie et anesthésie (40 minutes)
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors des injections intrapéritonéales
Devenir
Les animaux des lots expérimentaux et de génotype d'intérêt sont mis à mort afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
La surexpression de la protéine X a été mise en évidence par l’analyse globale des protéines présentes dans les tissus. À ce jour, il n’existe pas de modèle sur cellules en culture permettant d’étudier de manière pertinente l’impact de cette surexpression sur les vaisseaux cérébraux. Les interactions entre les vaisseaux sanguins, le cerveau et la régulation du débit sanguin sont complexes et impliquent de nombreux mécanismes interdépendants. Il est donc nécessaire d’étudier ces anomalies chez l’animal vivant, afin d’analyser ces phénomènes dans un organisme intact, où l’ensemble des systèmes de régulation fonctionne de manière intégrée. En raison de cette complexité, il n’est actuellement pas possible de reproduire fidèlement ces interactions en laboratoire sur des cellules isolées ni à l’aide d’un modèle informatique. Pour ces raisons, le recours au modèle animal ne peut pas être substitué par un modèle sur cellules ou par une modélisation informatique.
Réduction
Les âges d’analyse et les tailles d’échantillons ont été définis sur la base de jeux de données issus d’expériences antérieures. Le projet est en outre structuré de manière séquentielle, permettant d’adapter la poursuite des travaux en fonction des résultats intermédiaires. Les comparaisons statistiques sont réalisées avec les tests appropriés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Afin de minimiser le risque de rejet par la mère après injection chez les souriceaux, de la sciure provenant de la cage est saupoudrée sur les souriceaux, de manière à ne pas perturber leur reconnaissance par la mère. Une grille de score ainsi qu’une liste de points limites ont été établies pour assurer le suivi du bien-être animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Souriceaux de 7 à 8 jours, prépubères, adultes de 2 mois à 9 mois pour étudier les différents stades de la maladie
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique de produits injectés par voie intravasculaire ou extravasculaire chez la souris. MODIFICATION N°01
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Le protocole sert à caractériser la diffusion de produits en vue de leur mise sur le marché. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections en plusieurs sites, jusqu'à dix acquisitions d'imagerie par jour sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, certaines voies d'administration pouvant altérer la vision ou la locomotion. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour modéliser la biodistribution dans un "organisme entier vivant", et prévoit de garder 50 souris en vie pour la formation du personnel, le reste étant tué pour prélever les organes.
Objectifs
L’autorisation de mise sur le marché d’un produit ou d'un médicament nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique permet d'améliorer les dosages et la posologie du produit ou du médicament. Elle permet également de déterminer les voies d'administrations optimales. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez la souris. Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents.. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de déterminer les dosages, la posologie, la voie d'administration et les effets sur l'organisme d'un produit ou d'un médicament sans un organisme vivantLe recours à lexpérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.
Procédures
PARAGRAPHE MODIFIE Les animaux recevront une injection le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal.LES ANIMAUX POURRONT RECEVOIR UNE INEJCTION DASN DEUX SITES D'INJECTION DISTINCTS EN MEME TEMPS. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), ET environ 5 minutes avec l’anesthésie. Des examens d'imagerie pourront également être réalisés, avec parfois injection d’un produit de révélation, sous anesthésie générale pendant une durée de 5 à 20 minutes. la fréquence des examens sera au maximum de 10 acquisitions par jour le premier jour puis, de 3 acquisitions par jour pour les 3 jours suivants, 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour et de 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 3 fois par semaine la première semaine puis 1 fois par semaine. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
PARAGRAPHE MODIFIE Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : gêne A la locomotion de l’animal, altérATION la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.
Devenir
Les animaux dont un prélèvement d’organe est nécessaire seront euthanasiés. Il sera possible de réaliser une quantification des produits ex-vivo par organe grâce à de l’imagerie optique ex-vivo ou par d’autres techniques in-vitro. Les souris dont les organes ne doivent pas être prélevés pourront soit être gardés en vie et réutilisés pour la formation du personnel.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.
Réduction
L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 6 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 minimum sera respectée (7 jours minimum en cas de transport par avion). Les animaux seront tous hébergés collectivement en cage sauf en cas particuliers scientifiquement justifiés (comme par exemple l'animal contrôle pourrait être isolé pour ne pas être contaminé par ses congénères). En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre un contact visuel et olfactif avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire sera apporté à l’animal isolé. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre, le plus rapidement possible, les mesures nécessaires soit de traitement (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux dont l’état clinique serait jugé irréversible. Le poids des animaux sera mesuré tout au long des études et pourra être complété par un score clinique basé sur l’état général de l’animal (comportement de l’animal, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou non), la présence d’écoulement nasaux et oculaires, des difficultés respiratoires) et en lien avec l’injections du produit testé (inflammation, lésion, nécrose, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture, œil-mi-clos, fermé ou glaucome). Des examens cliniques plus approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (mise en place de traitements, injection de solutions réhydratantes, etc…) à condition qu’ils n’interfèrent pas avec les produits test injectés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi : - Pour sa taille réduite et parce qu’il permet l’utilisation de technique d’imagerie du corps entier, - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des souris de plus de 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g.