Rats
Rôle du glucose et du lactate en tant que substrat énergétique neuronal lors de l’activation cérébrale et les performances cognitives chez le rat (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir si les neurones puisent leur énergie dans le glucose ou dans le lactate, 224 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour récupérer leur cerveau. Ils subissent une chirurgie de 75 minutes sous anesthésie avec deux injections, puis, trois semaines plus tard, six jours de test de comportement, et enfin une séance d'imagerie de 30 minutes sous anesthésie. Le porteur prévoit une douleur postopératoire et une perte de poids dans les 48 à 72 heures suivant l'opération. Il ne nomme ni le test de comportement ni le contenu des deux injections, alors qu'il compare des rats "privés de transporteurs" à des témoins.
Objectifs
Le cerveau a besoins d’énergie pour fonctionner, notamment pour apprendre, mémoriser et percevoir son environnement. Le glucose est traditionnellement considéré comme la principale source d’énergie des neurones. Cependant, des études récentes suggèrent que le lactate, produit par les astrocytes (cellule de soutien du cerveau), pourrait également être utilisé par les neurones comme source d’énergie. L’objectif de ce projet est de déterminer si, lors de l’activation cérébrale, les neurones utilisent préférentiellement le glucose ou le lactate. Pour cela, nous étudierons chez le rat les capacités d’apprentissage et de mémoire ainsi que l’activité cérébrale lors de stimulation sensorielles. Des techniques d’imagerie permettront d’évaluer l’activité cérébrale et les niveaux de glucose et lactate dans les régions cérébrales activées. Ce projet permettra de mieux comprendre comment les neurones produisent et utilisent l’énergie nécessaire à leur fonctionnement. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à mieux comprendre les maladies associées à des perturbations du métabolismes énergétique cérébrale, notamment certaines maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébral et les interactions entre les différentes cellules qui constituent le cerveau. Ces interactions sont cruciales d’un point de vue fondamental. À plus long terme, la compréhension de ces processus pourrait aussi permettre de développer des stratégies thérapeutiques pour certaines maladies dans lesquelles ce métabolisme énergétique est dérégulé (accident vasculaire cérébral, maladie d’Alzheimer, …).
Procédures
EU1 : Des chirurgies seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésiant chez les rats (1 intervention de deux injections/rat ; 75 min/rat). Après 3 semaines post-chirurgie, le test de comportement sera réalisé sur tous les rats (1 session de 10 minutes/jour, sur 6 jours). EU2 : Après le test de comportement, les rats anesthésiés seront soumis à des techniques d'imagerie (une session de 30 min/animal) pour visualiser les zones cérébrales activées.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Chirurgie : un inconfort transitoire au réveil et une douleur post-opératoire, une perte de poids légère et transitoire dans les premières 48h-72h de l’intervention. - IRM : un inconfort transitoire, un changement important du rythme cardiaque et/ou respiratoire peut survenir du fait de la variabilité inter-animaux de la sensibilité aux anesthésiques.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour les analyses moléculaires, protéiques et métaboliques.
Remplacement
Les différentes cellules du cerveau peuvent être étudiées en laboratoire, mais ces modèles ne reproduisent pas la complexité et fonctionnement d’un cerveau entier. Notre objectif étant de comprendre comment le cerveau fournit l’énergie nécessaire à l’activité des neurones, il est nécessaire d’étudier ces mécanismes dans un cerveau intact. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire cette complexité.
Réduction
Concernant la réduction, nous avons réalisé en amont des expériences sur des cellules en culture afin de valider l'utilisation des réactifs nécessaires au projet. Cette phase d'étude limitera le nombre de rats utilisés dans le projet. Des études précédentes menées par l’équipe nous ont permis de déterminer les effectifs d’animaux nécessaires pour mettre en évidence les différences significatives entre les individus contrôles et ceux qui sont privés de transporteurs du métabolisme énergétique cérébral. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte tout au long du projet par une surveillance régulière des rats selon une grille de bien-être qui aide à identifier des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. Le poids corporel et l’état général du rat seront suivis régulièrement par une pesée hebdomadaire. À la suite de l’intervention chirurgicale, une surveillance renforcée sera mise en place pendant les 7 jours postopératoires, avec une pesée quotidienne afin d’évaluer l’état général des animaux et leur récupération. Toute variation significative du poids ou toute altération de l’état général fera l’objet d’une évaluation et, le cas échéant, de la mise en œuvre de mesures adaptées. Une prise en charge antalgique postopératoire est prévue afin de prévenir et de limiter autant que possible la douleur et l’inconfort liés à l’intervention chirurgicale.
Choix des espèces
Les rats de la souche sauvage sont utilisés depuis plusieurs années pour des études sur le métabolisme cérébral dans notre laboratoire, ainsi nous maîtrisons l’expertise des actes chirurgicaux et la manipulation de ce modèle de rat. Dans cette étude, les rats seront utilisés à l’âge de 10 semaines car le métabolisme énergétique cérébral est différent à des stades plus précoces.
Évaluation in vivo de la biocompatibilité et de la stabilité d’un implant cérébral BRAIN-GUIDE (BG) chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Ce projet remplit une obligation réglementaire : un test de biocompatibilité exigé par la norme ISO avant toute implantation chez l'humain du BRAIN-GUIDE, un implant cérébral censé favoriser la régénération après un traumatisme crânien. 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau. Chacun subit une chirurgie de 30 minutes sous anesthésie générale pour la pose de l'implant dans le cerveau, puis reste suivi 7 ou 91 jours, avec des risques de douleur, d'infection, d'inflammation et d'œdème. L'objectif annonce une "analyse comportementale", que les procédures ne mentionnent plus et dont aucun test n'est nommé.
Objectifs
Évaluer la réponse tissulaire locale et la biocompatibilité induite par l’implantation d'un implant régénératif dans le cerveau de rat en comparaison avec un matériau de référence contrôle à court-terme, 7 jours, et à long-terme, 91 jours, avec une analyse comportementale et histologique, selon les exigences de la norme ISO et du règlement européen en vigueur. Essai obligatoire avant toute implantation chez l'homme.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche propose une approche thérapeutique innovante destinée à favoriser la régénération cérébrale à la suite d’un traumatisme crânien. L’évaluation de la biocompatibilité du dispositif selon les exigences des normes en vigueur, permettra d’envisager son potentiel de transposition clinique. Une régénération cérébrale pourrait diminuer le handicap chez ces patients.
Procédures
L'ensemble des animaux impliqués sera soumis à 1 chirurgie sous anesthésie générale pour la pose de l'implant (durée 30 min) au niveau cérébral. La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Nuisances inhérentes à la chirurgie : risque de douleur et de complications, inconfort, complications post-opératoires avec inflammations locales / œdèmes, risque d'infection.
Devenir
La procédure se termine par une mise à mort des animaux pour effectuer l'analyse histologique.
Remplacement
Nous n’avons pas pu trouver de tests in vitro permettant le remplacement de cette expérimentation. Les tests in vitro et in vivo d'ores et déjà réalisés sur le BRAIN-GUIDE ont servi à montrer la non-cytotoxicité, la non-irritabilité, la non-sensibilisation cutanée, la non-pyrogénicité et l'absence d'endotoxines.
Réduction
Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes de 10 individus. La norme exige n=8 par groupe. Afin d'être sûr d'attendre ce nombre (mortalité, tumeurs spontanées), n=10 rats par groupe sont prévus. Les tests statistiques sont adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Le principe fondamental des 5 libertés est respecté sur toute la durée de l’étude. L'alimentation est disponible en permanence, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l'état de santé général des animaux est assuré par le personnel de zootechnie régulièrement. Les chirurgies se font sous anesthésie, analgésie, et gel oculaire. Une attention particulière est portée aux animaux opérés, qui font l'objet d'une surveillance quotidienne par le personnel compétent. Au besoin, cette surveillance inclut l'observation de la plaie, du poids corporel, de la mobilité, de l'état du pelage et du comportement des animaux et fait l'objet d'un scoring clinique en supplément de l'évaluation prévue à 1 jour, 7 jours post-transplantation et une fois par mois jusqu’à 91 jours. La valeur du score détermine l'action à réaliser sur l'animal pour une prise en charge de la douleur, une notification de surveillance accrue, une exclusion de l'étude ou une mise à mort. La prise en charge de la douleur est mise en place avec des protocoles stricts validés, prenant en compte le principe de douleur et son impact sur les animaux et les résultats de l'étude. Un enrichissement environnemental est intégré au protocole, comprenant divers éléments pour stimuler cognitivement les rats (tunnels, boule de fouille, boule traversante), ainsi qu'une composante sociale.
Choix des espèces
Les rats adultes sont un modèle privilégié pour l'étude de la récupération fonctionnelle après lésion et greffe d’implants. Ils présentent une organisation cérébrale comparable à celle de l’humain, permettant de reproduire certains mécanismes impliqués dans diverses affections neurologiques telles que les maladies neurodégénératives, l’AVC et le traumatisme crânien : déficits sensorimoteurs handicapant les patients dans la vie de tous les jours. Ce modèle permet une évaluation des effets biologiques, qui ne peuvent être appréhendées par des méthodes in vitro.
Modèle d’entéropathie induite par l’indométacine chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 730
Le projet vise d'abord à mettre au point une méthode pour altérer l'intestin avec l'indométacine, un anti-inflammatoire, afin d'y tester ensuite des composés censés protéger la paroi intestinale dans les maladies du foie. 1 460 rongeurs, 730 souris et 730 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur sang, leur intestin et d'autres organes. Ils reçoivent plusieurs doses d'indométacine, des traitements par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, un jeûne de 16 heures pour les rats et de 6 heures pour les souris, et passent jusqu'à 20 minutes dans une enceinte à 38 °C avant certaines injections. Un second protocole au méthotrexate doit provoquer des lésions plus profondes. Le porteur mentionne des "critères d'arrêt prédéfinis" sans en donner aucun.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à l’aggravation brutale des maladies du foie, en particulier chez les patients atteints de cirrhose. Dans ces situations, une altération rapide de la paroi de l’intestin peut se produire, rendant celui-ci plus perméable. Cette perte de « barrière » permet à des bactéries ou à des substances issues de l’intestin de passer dans le sang et d’atteindre le foie, ce qui peut déclencher ou aggraver une inflammation et contribuer à la détérioration de l’état de santé. L’objectif de ce projet est de développer un modèle expérimental permettant de reproduire ces altérations précoces de la perméabilité intestinale sur une courte durée. Ce modèle aidera à mieux comprendre les premières étapes de ce phénomène et à évaluer de nouveaux traitements visant à protéger l’intestin, limiter le passage de substances nocives dans l’organisme et ainsi ralentir ou prévenir l’aggravation des maladies du foie.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisant l’indométacine permet de provoquer une altération rapide et temporaire du fonctionnement normal de l’intestin. Il est particulièrement utile pour étudier les premières étapes de la perte de l’effet barrière de l’intestin et pour évaluer des traitements capables de restaurer rapidement cette fonction protectrice. Un second modèle utilisant le méthotrexate sera développé en parallèle afin d’étudier des lésions plus profondes de la paroi intestinale. La comparaison de ces deux modèles permettra de mieux comprendre comment les traitements agissent. Un composé efficace uniquement dans le modèle à l’indométacine pourrait agir principalement sur les perturbations précoces et réversibles du fonctionnement intestinal. À l’inverse, un composé efficace dans les deux modèles pourrait à la fois améliorer le fonctionnement de l’intestin et protéger sa structure. De tels effets pourraient limiter le passage de substances indésirables depuis l’intestin vers l’organisme et contribuer à réduire l’inflammation associée aux maladies du foie.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs administrations d’indométacine afin de provoquer une altération temporaire du fonctionnement de l’intestin. Selon les procédures, ils recevront également des traitements ou leurs véhicules par différentes voies d’administration (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse). Les administrations durent généralement moins d’une minute. Dans certaines situations, les animaux pourront être placés jusqu’à 20 minutes dans une enceinte thermostatique maintenue à 38 °C afin de faciliter certaines injections intraveineuses. Les animaux seront soumis à une courte période sans nourriture (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), pouvant entraîner un inconfort léger et temporaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse de courte durée. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés profondément puis mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses biologiques et tissulaires nécessaires aux objectifs scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Après l’administration de l’indométacine, les animaux peuvent présenter une diminution temporaire de leur activité, une baisse de leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’une perte de poids modérée. Des troubles digestifs légers à modérés peuvent également être observés, notamment une gêne abdominale ou des modifications de l’aspect des selles. Ces effets sont attendus, généralement temporaires et font l’objet d’une surveillance régulière tout au long de l’étude. Pour certaines évaluations, les animaux seront soumis à une courte période sans nourriture (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), pouvant entraîner un inconfort léger et passager. Ils recevront ensuite un marqueur par voie orale, suivi d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie de courte durée afin d’évaluer le fonctionnement de la barrière intestinale.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses prévues dans le projet. Ces analyses nécessitent des prélèvements sanguins et le recueil de différents organes et tissus, notamment au niveau intestinal. Les informations obtenues à partir de ces prélèvements permettent de répondre aux objectifs scientifiques de l’étude tout en maximisant les données recueillies sur chaque animal utilisé. En raison de la nature de ces prélèvements, les animaux ne pourront pas être réutilisés à l’issue de l’étude.
Remplacement
Des méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires, sont utilisées en amont pour sélectionner les composés les plus prometteurs et limiter le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l'ensemble des interactions qui existent dans un organisme vivant entre l'intestin, les bactéries naturellement présentes dans le tube digestif, le système immunitaire et les autres organes, notamment le foie. Elles ne permettent pas non plus d'évaluer comment un médicament est absorbé, transformé et éliminé par l'organisme. L'utilisation d'animaux reste donc nécessaire pour étudier les conséquences d'une altération de la fonction protectrice de l'intestin et pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dans des conditions se rapprochant de la maladie. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de répondre à l'ensemble des objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en utilisant le plus petit effectif possible. Les effectifs reposent sur les connaissances acquises à partir de la littérature scientifique ainsi que sur l’expérience de l’établissement avec ce type de modèle. Les études seront conçues de manière à recueillir un maximum d’informations à partir de chaque animal utilisé. Lors des phases de mise au point du modèle, une approche progressive sera appliquée afin d’ajuster les effectifs aux besoins réels du projet et d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Cette stratégie permet de respecter le principe de réduction du nombre d’animaux utilisé tout en garantissant la qualité des résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux, avec un hébergement social et un enrichissement de leur environnement. Leur état de santé et leur bien-être sont surveillés tout au long de l’étude. Afin de limiter les effets des procédures expérimentales, un complément alimentaire appétent et nutritif pourra être mis à disposition pour favoriser le maintien de l’état général et la récupération des animaux. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier portant notamment sur leur comportement, leur activité, leur poids et leur consommation alimentaire et hydrique. Des critères d’arrêt prédéfinis sont appliqués afin d’identifier rapidement toute dégradation de leur état de santé et de mettre en œuvre les mesures appropriées, pouvant aller jusqu’à une euthanasie anticipée si nécessaire. Les procédures ont été conçues pour limiter le stress, les manipulations et les contraintes imposées aux animaux, tout en permettant d’atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Choix des espèces
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans les altérations du fonctionnement de l’intestin observées dans certaines maladies digestives et hépatiques. Les rats et les souris sont couramment utilisés en recherche biomédicale car ils présentent de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques, immunitaires et métaboliques avec l'espèce humaine, tout en permettant l’étude intégrée des interactions complexes entre l’intestin, le foie et la réponse inflammatoire dans un organisme vivant. Le choix de l’une ou l’autre espèce dépendra des caractéristiques des composés étudiés ainsi que des connaissances acquises au cours des études précédentes. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, âge auquel les fonctions digestives, immunitaires et métaboliques sont pleinement développées, permettant une évaluation fiable des mécanismes étudiés. Les rats seront âgés de 6 à 7 semaines à leur arrivée dans l’établissement et les souris de 6 à 8 semaines.
Intérêt de l’utilisation de l’astaxanthine avec des vésicules extracellulaires de cellules stromales mesenchymateuses pour améliorer la réparation de l’os diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 192
Ouverture du crâne pour y implanter un hydrogel chez des rats, implants sous la peau du dos chez des souris, puis pour les rats une chirurgie du thorax en fin de protocole, décrite comme "une procédure douloureuse" : 234 rongeurs, 192 rats et 42 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever les implants et les os du crâne. Le gel associe de l'astaxanthine à des vésicules issues de cellules souches, testées pour la réparation osseuse chez les personnes diabétiques. Rats et souris passent aussi cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Les rats portent un diabète d'origine génétique avec obésité et sont étudiés entre 16 et 20 semaines, à un stade où, selon le porteur, "plusieurs complications liées au diabète sont présentes".
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui touche environ 4 millions de personnes en France. En plus de ses nombreuses complications, cette maladie fragilise les os, ralentit la guérison des fractures et rend la réparation osseuse plus difficile. De plus en plus de patients diabétiques doivent subir des opérations chirurgicales des os. Chez ces patients, les complications après l’intervention sont plus fréquentes, ce qui représente également un coût important pour le système de santé et la société. Aujourd’hui, réparer correctement un os chez une personne atteinte de diabète reste un véritable défi médical. De nouvelles recherches sont donc nécessaires pour trouver des traitements plus efficaces Dans ce projet, nous voulons tester une nouvelle approche qui combine : des petites vésicules produites par les cellules souches, qui favorisent la réparation des tissus, et un antioxydant naturel, l’astaxanthine, qui aide à limiter les effets nocifs du stress oxydatif ( phénomène lié à une production excessive de molécules nocives appelées radicaux libres, qui endommagent les cellules et les tissus). Les deux seront intégrés dans un gel spécial qui inséré dans la fracturé se dégrade en libérant les substances utiles. L’objectif est de recréer un environnement favorable à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et à la formation de l’os. Pour cette étude, nous utiliserons un modèle de rat diabétique et obèse qui reproduit plusieurs caractéristiques du diabète de type 2 humain, et présente des difficultés de réparation osseuse. Il permet donc d’évaluer de manière fiable l’efficacité du traitement, avant d’envisager l'application chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du contrôle du stress oxydatif dans la réparation de l’os diabétique. À long terme un tel projet permettra de mettre sur pied des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.
Procédures
Pour les souris: 1-Implantations sous cutanées d'hydrogels : animal sous anesthésie générale (AG) ( 1X ; durée 30 min) ; 2-Imagerie sur animal vivant : AG (5X ; durée 15 min) ; 3- Injection en sous cutanée (SC) d’un médicament antidouleur : animal vigile (AV) (6X ; durée 2 min) ; 4- injection intrapéritonéale (IP) d’anesthésiques chimiques : AV (1X; durée 2 min) ; 5- inhalation d’un anesthésique gazeux : AV ( 5X ; durée 15 min). Pour les rats : 1- Craniotomies avec implantation d’un hydrogel : AG (1X ; durée 30 min) ; 2- Imagerie sur animal vivant : AG (5X ; durée 15 min) ; 3- Chirurgie du thorax suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent qui permet de voir les vaisseaux sanguins : AG (1X ; durée 10 min) ; 4-Injection en sous-cutanée d’un médicament antidouleur: AG (7X ; durée 2 min) ; 5- Injection IP d’anesthésiques chimiques : AG (2X ; durée 2 min) ; injection IP d’un antidote à un des produits anesthésiques : AG (2X ; durée 2 min) ; 6- inhalation d’un anesthésique gazeux : AV (10X ; durée 15 min).
Impact sur les animaux
L’implantation sous- cutané chez les souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, saignement, stress, œdème. La chirurgie sur le crâne de rat peut entrainer aussi un comportement anormal. Ces effets indésirables seront susceptibles d’être observés pendant l’intervention chirurgicale et au cours des trois jours suivant l’intervention. Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entraine aucune séquelle après le réveil.La chirurgie du thorax est une procédure douloureuse.
Devenir
Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.
Remplacement
La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnants tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages, ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant, ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et du sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin afin d’obtenir des résultats scientifiques fiables tout en respectant le principe des « 3R » : réduire le nombre d’animaux utilisés, améliorer leurs conditions de vie et remplacer l’animal lorsque cela est possible. Les résultats de nos précédentes études montrent qu’un minimum de 6 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir des données solides. Afin de prendre en compte d’éventuelles pertes liées aux interventions ou aux analyses, ce nombre a été porté à 8 animaux par groupe. Plusieurs mesures ont été mises en place pour limiter autant que possible le nombre total d’animaux utilisés : (i) chez les souris, quatre implants seront placés sur un même animal afin d’étudier plusieurs conditions simultanément. Cela permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en conservant une bonne qualité scientifique. (ii) certaines analyses, comme l’étude de l’inflammation et celle de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, seront réalisées sur les mêmes animaux. Cette approche permet d’obtenir davantage d’informations à partir d’un même individu et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Dans le même objectif de réduction, seules les approches de traitement les plus prometteurs chez la souris— c’est-à-dire celles favorisant le mieux la réparation osseuse tout en provoquant peu d’inflammation, seront ensuite testées chez le rat. Enfin, plusieurs techniques d’analyse (analyses biologiques et méthodes d’imagerie) seront combinées chez un même animal afin de maximiser les informations scientifiques obtenues. De cette manière, chaque animal contribue au maximum à l’avancée des connaissances scientifiques tout en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) les animaux recevront une goutte de gel oculaire dans les yeux pour éviter le dessèchement et seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une médication antidouleur (analgésique) préventive sera mise en place 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés, puis le dos sera rasé et nettoyé avec une solution antiseptique. Une analgésie post-opératoire se fera pendant 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuse, une analgésie pré- et post-opératoire se fera ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés en cage seul jusqu’au lendemain matin dans une pièce « Post-op » réglée à 26 °C, puis remis par 3 en conditions standards d’hébergement avec en plus de l'aliment standard un gel nutritif de récupération pendant 3 jours. Pour l’imagerie microscanner, les souris et les rats seront anesthésiés et seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’injection de l’agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessite une chirurgie du thorax qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication contre la douleur 20 min avant l’anesthésie. Une surveillance post-chirurgicales des points limites spécifiques sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal au moins deux fois par jour pendant les 3 premiers jours postopératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Une observation quotidienne des animaux par le personnel de l’animalerie sera effectuée.
Choix des espèces
Des souris âgées de 9 semaines seront utilisées pour évaluer, chez l’animal, la capacité d’un antioxydant associé à de petites vésicules produites par des cellules souches à favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et la formation d’os. Ce modèle de souris est bien connu et déjà utilisé au laboratoire. Il permet notamment de vérifier que les traitements sont compatibles avec le bon fonctionnement général de l’organisme. À cet âge, leur croissance est terminée, ce qui permet d’éviter que la croissance naturelle de l’animal n’interfère avec les résultats de l’étude. Pour étudier les conséquences du diabète de type 2, nous utiliserons également un modèle de rat présentant un diabète d’origine génétique. Ce modèle est couramment utilisé pour reproduire certaines caractéristiques du diabète de type 2 observées chez l’être humain. Les rats seront étudiés entre 16 et 20 semaines, période correspondant à un stade avancé de la maladie, au cours duquel plusieurs complications liées au diabète sont présentes. Des études précédentes utilisant ce même modèle ont montré que les animaux pouvaient vivre jusqu’à un âge avancé dans les conditions habituelles de l’animalerie, sans nécessiter de soins supplémentaires particuliers. Chez les rats diabétiques, le diabète entraîne des modifications de la structure de l’os, ralentit sa réparation et diminue le nombre de vaisseaux sanguins présents dans les tissus osseux. Ces changements sont particulièrement visibles après 20 semaines de vie. Ce modèle permet donc d’étudier les difficultés de réparation osseuse associées à un diabète avancé et d’évaluer de nouvelles approches susceptibles de favoriser la réparation de l’os. Des rats sains seront utilisés comme groupe témoin. Ils ne présentent pas la modification génétique responsable du diabète et ne développent pas spontanément cette maladie. Ils permettront ainsi de comparer les effets du diabète sur l’os avec ceux observés chez des animaux sains.
Etude du devenir des microplastiques inhalés dans un modèle de maladie broncho-pulmonaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Pour suivre le trajet des microplastiques inhalés dans des poumons malades, 110 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. Sous anesthésie, chacun reçoit cinq instillations de particules dans la trachée en cinq semaines, un composé qui déclenche une inflammation des poumons, et des échographies du cœur. Les mesures respiratoires finales se font par trachéotomie, sans réveil. Une perte de poids ou une détresse respiratoire sévère déclenche la mise à mort, sans que le seuil de poids soit chiffré.
Objectifs
L’air que nous respirons est de plus en plus pollué : fumées d’usines, poussières fines, et surtout microplastiques (des morceaux de plastique invisibles à l’œil nu). En France, nous en inhalons 30 000 par jour, et jusqu’à 2,8 millions en Chine ! Pourtant, on ne connaît pas encore bien leurs effets sur la santé. Que se passe-t-il dans notre corps ? Ces particules, une fois respirées, peuvent s’enfoncer profondément dans les poumons, affaiblir nos défenses immunitaires, provoquer des inflammations ou des maladies comme l’asthme ou la BronchoPneumopathie Chronique Obstructive (BPCO, une maladie pulmonaire chronique), et enfin passer dans le sang, avec des risques encore mal compris pour le cœur et les vaisseaux sanguins. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1/Comment le corps (poumons et système cardiovasculaire) réagit-il à ces microplastiques, chez une personne en bonne santé ou atteinte de BPCO ? 2/ Où ces particules se propagent-elles dans l’organisme ? 3/ Quels sont les effets sur le fonctionnement des poumons et du cœur ? Les résultats seront comparés à des analyses de tissus pulmonaires de patients atteints de BPCO, pour mieux comprendre les risques réels.
Bénéfices attendus
Le projet vise à étudier la distribution des particules fines d’origine microplastique dans l'organisme et d’approfondir notre compréhension des mécanismes impliqués dans les effets cardiopulmonaires. Cette étude permettra d’identifier les altérations inflammatoires, structurelles et fonctionnelles induites par ces particules, en mettant en évidence leur impact sur les voies physiopathologiques sous-jacentes. Elle contribuera également à mieux cerner les risques associés à une exposition chronique, offrant ainsi des perspectives pour l’évaluation des dangers environnementaux et la mise en place de stratégies de prévention en santé publique. Les résultats obtenus avec le modèle animal seront mis en perspective avec des données obtenues sur des biopsies humaines de patients BPCO.
Procédures
Quand l’animal est éveillé, on observera sa respiration pendant environ 15 minutes dans un espace dédié. Sous anesthésie, on introduira des particules dans la trachée (environ 10 minutes par administration, soit 5 administrations par animal réparties sur 5 semaines) et on lui administrera un composé qui induira une inflammation pulmonaire. On examinera son cœur à l’aide d’échographie sous anesthésie, pendant environ 15 minutes par animal. Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. L’animal ne se réveillera pas après ces mesures, qui durent environ dix minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort, par exemple lorsqu’ils sont manipulés, maintenus dans les chambres d’exploration, ou lors de mesures et prélèvements. Une agitation excessive ou persistante est surveillée pour garantir leur bien-être. Les animaux peuvent présenter des symptômes transitoires liés au modèle de maladie respiratoire chronique, tels qu'une gêne respiratoire modérée, une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l'activité physique et une perte de poids. Une perte de poids ou l'apparition de signes de détresse respiratoire sévère constituent des points limites et entraîneront l'euthanasie de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Différents organes (cœur, poumons, muscles, vaisseaux sanguins) seront prélevés pour d’autres études. Ce processus est essentiel pour obtenir une compréhension détaillée des éventuelles altérations tissulaires et pour évaluer les atteintes pulmonaires et cardiaques consécutives à l’exposition aux microplastiques.
Remplacement
La BPCO est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle rat BPCO permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage des poumons. Parallèlement à ce protocole in vivo, des études in vitro sur les cellules pulmonaires de patients BPCO pourront être réalisées afin de valider les observations réalisées chez les animaux.
Réduction
Nous avons conçu ce projet de manière à utiliser le moins d'animaux possible. Plusieurs mesures et analyses seront réalisées sur chaque animal afin d'obtenir un maximum d'informations à partir d'un même individu. Cette approche permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la qualité scientifique des résultats. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes
Raffinement
Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en inconfort, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Des protocoles d’habituation ont été mis en place pour que les animaux s’habituent aux procédures et réduire leur stress. Afin d’éviter tout inconfort, les animaux seront analgésiés puis anesthésiés lors des procédures. L’analgésie sera maintenue post-opératoire si nécessaire en fonction de l’état des animaux par rapport aux points limites.
Choix des espèces
Ce projet s'interesse à l'interaction entre le coeur et les poumons. Le modèle de rat est largement utilisé et bien caractérisé sur le plan cardiovasculaire. Sa physiologie cardiaque présente de nombreuses similitudes avec celle de l’Homme, tant sur le plan de la régulation que de l’organisation anatomique et fonctionnelle du cœur, permettant l’étude approfondie des mécanismes impliqués, de l’échelle moléculaire aux mesures in vivo. Les études seront réalisées sur des rats adultes mâles et femelles âgés de 8 semaines
Développement d’un modèle de prélèvement de sang total hépariné chez le rat pour la réalisation d’essais pharmacologiques et immunologiques ex vivo
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une partie du sang peut provenir de rats témoins déjà engagés dans d'autres procédures, mais ce projet utilise à lui seul 100 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent de l'héparine, en deux injections dans l'abdomen à 16 heures d'intervalle ou en une injection dans la queue après jusqu'à 15 minutes dans une enceinte chauffée à 38 °C. Sous anesthésie, ils subissent ensuite un prélèvement terminal destiné à récupérer "un maximum de sang", pour mettre au point un essai ex vivo sur la réponse inflammatoire, que le porteur appelle un "modèle" dans son titre. Il présente cet essai comme une "approche intermédiaire" qui limiterait le recours à des "modèles animaux plus complexes".
Objectifs
Le sang transporte de nombreuses cellules et protéines impliquées dans les mécanismes de l’inflammation et dans la réponse de l’organisme aux médicaments. Pour mieux comprendre ces phénomènes et évaluer de nouveaux traitements, les chercheurs utilisent parfois du sang total prélevé sur des animaux de laboratoire. L’objectif de ce projet est de recueillir du sang total chez le rat tout en évitant sa coagulation. Pour cela, un anticoagulant appelé héparine est administré avant le prélèvement. Le sang obtenu pourra ensuite être utilisé pour réaliser des essais ex vivo en laboratoire pour évaluer l'efficacité de médicaments sur la réponse inflammatoire.
Bénéfices attendus
Cette procédure permettra la mise en place d’un essai de sang total (whole blood assay) robuste et reproductible permettant la réalisation d'essais pharmacologiques ex-vivo conservant l’ensemble des compartiments cellulaires sanguins, pour étudier par exemple, les réactions inflammatoires ou tester l’effet de nouvelles molécules. Cette approche permet d’obtenir de nombreuses informations biologiques à partir d’un seul prélèvement sanguin et contribue à améliorer la valeur prédictive des études précliniques réalisées sur un plus grans nombre de sujets.
Procédures
Les animaux subiront soit 2 injections à 16h d'intervalle dans la cavité abdominale soit une injection en intraveineuse unique dans la veine de la queue. Les animaux seront ensuite anesthésiés profondément avant de subir un prélèvement sanguin terminal suivi de l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sont limitées à deux injections d’héparine pour l'intrapéritonéale ou à une injection unique en intraveineuse, suivies d’un prélèvement terminal sous anesthésie générale. Les effets indésirables possibles sont: une gêne transitoire liée à l’injection, un allongement du temps de coagulation induit par l’héparine, faible risque de saignement local au site d’injection. Dans le cas de l’injection IV, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C, une compresse de lidocaïne sera appliquée sur la queue avant l'injection pour éviter toute douleur. Le prélèvement sanguin est réalisé exclusivement sous anesthésie profonde et constitue une procédure terminale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après anesthésie à la fin de la procédure, le but étant de récupérer un maximum de sang afin de réaliser des expériences in vitro.
Remplacement
Aucune méthode in vitro ne permet actuellement de reproduire simultanément les interactions entre leucocytes, érythrocytes, plaquettes, protéines plasmatiques et système du complément. Le whole blood assay constitue néanmoins une approche intermédiaire permettant de générer un grand nombre de données en limitant le recours à des modèles animaux plus complexes. Ainsi, le sang d'un seul rat permet, par l'utilisation de méthode in vitro réalisée en plaque de dosages, d'effectuer des tests de stimuli et composés d'intérêt plutôt que de tester directement sur des animaux.
Réduction
Un unique prélèvement sanguin permet la réalisation de nombreux essais pharmacologiques, le test simultané de plusieurs concentrations, l’évaluation de plusieurs composés ou stimuli biologiques. Cette approche réduit significativement le nombre d’animaux requis. Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de 5 jours minimum au sein de notre animalerie et seront hébergés avec d'autres congénères afin de conserver leur mode de vie en groupe social. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de sizzle compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Les animaux sont anesthésiés par voie aérienne ( induction gazeuse en boite) pour permettre la réalisation du prélèvement sanguin. Aucun geste ni action douloureuse n'est appliqué qui justifierait l'application de méthodes analgésiques.
Choix des espèces
Le rat est largement utilisé dans les études pharmacologiques et immunologiques. Son volume sanguin permet d’obtenir suffisamment de sang total pour réaliser de nombreuses analyses à partir d’un seul prélèvement. Cette caractéristique contribue directement à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les réponses inflammatoires du rat sont également bien caractérisées, ce qui en fait un modèle adapté aux essais de sang total ex vivo. Les animaux utilisés seront des animaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Mise en place et caractérisation du modèle de cholestase hépatique par ligature du canal biliaire commun chez le rat. Application à l’évaluation de composés dans la défaillance hépatique aigüe.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Ouverts à l'abdomen pour une ligature du canal biliaire, 1 040 rats développent ensuite une jaunisse et une fibrose du foie. Ils sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur affirme que les rats "se remettent très bien de la chirurgie", puis décrit dans le même paragraphe un possible gonflement de l'abdomen par déchirement du sac résiduel. Trois à quatre semaines après l'opération, une injection de LPS mimant une infection bactérienne majeure provoque prostration et troubles de la température, et chaque rat est observé jusqu'à 24 heures : mis à mort au point limite, sa durée de survie servant de mesure, ou tué à la fin s'il survit.
Objectifs
La cirrhose hépatique est une maladie chronique caractérisée par le développement progressif d’une fibrose hépatique, conduisant à une altération de l’architecture du foie, à des perturbations de la circulation sanguine intra-hépatique et, à terme, à une insuffisance hépatique. Les patients peuvent évoluer vers une décompensation aiguë, pouvant conduire à une insuffisance hépatique aiguë sur maladie chronique (ACLF, Acute-on-Chronic Liver Failure), syndrome grave associé à des défaillances multiples d’organes et à une mortalité élevée. La fibrose résulte d’agressions hépatiques répétées ou continues entraînant une accumulation excessive de matrice extracellulaire et la formation d’un tissu cicatriciel non fonctionnel. Parmi les causes de fibrose, la cholestase induite par une obstruction des voies biliaires provoque une accumulation d’acides biliaires toxiques, responsable de lésions hépatiques, d’inflammation et d’une progression rapide vers la cirrhose. Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la décompensation de la cirrhose et de développer de nouvelles approches thérapeutiques, des modèles expérimentaux reproduisant les principales caractéristiques de la maladie humaine sont nécessaires. La ligature du canal cholédoque chez le rat est un modèle reconnu permettant d’induire rapidement une fibrose hépatique et une cirrhose présentant des similitudes avec la cirrhose biliaire humaine, constituant ainsi une étape essentielle pour l’étude de l’ACLF.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence une efficacité de nos molécules d'intérêt afin d'améliorer la qualité de vie des patients atteints d'ACLF, de diminuer l'inflammation, de retarder voire stopper la défaillance multi-organes et de prolonger la survie des patients.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie d'une durée de 30mn par animal, lors de laquelle ils seront ouverts au niveau de l'abdomen pour effectuer une ligature du canal biliaire. Cette dernière se fait sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésie avec un dérivé morphinique. L'analgésie se poursuivra au cours des 3 jours suivant l'opération. 2 semaines après la chirurgie, ils auront un prélèvement de sang toujours sous anesthésie de l'ordre de 0.75 à 1mL. 3 à 4 semaines post chirurgie, ils subiront le challenge ACLF par injection d'un agent précipitant. Le traitement avec la molécule testée sera appliqué soit par voie orale, soit par voie intrapéritonéale, pour ces voies l'administration dure environ 5s, soit par voie intraveineuse et durera environ 10 à 15s. Des micro-prélèvements à la veine de la queue ou à la veine saphène (intérieur de la cuisse) pourront être réalisés, ils seront de très faible volume, de l'ordre de quelques gouttes, d'une durée de 10s chacun et seront de 6 au maximum. Enfin, après anesthésie générale, le sang des animaux sera prélevé avant mise à mort sous sédation.
Impact sur les animaux
Le modèle est réalisé en deux phases : 1) La première phase correspond à la chirurgie lors de laquelle la ligature du canal biliaire est réalisée, entrainant par la suite ,une accumulation de bile au niveau hépatique responsable du développement de la fibrose. La chirurgie est réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie est prévue en amont et en aval de la chirurgie, la prise en charge de la douleur est assurée et les animaux se remettent très bien de la chirurgie. Ils développent ensuite une jaunisse. L’intervention qui est réalisée peut dans certains cas provoquer le gonflement de l’abdomen de l’animal, cela peut être le reflet du déchirement du sac résiduel qui se forme après l’opération. 2) La seconde phase qui correspond à la précipitation de l'ACLF par injection du composé qui mime un infection bactérienne majeure (LPS) est par définition aigue. Elle génère rapidement des signes de stress et d'inconfort chez le rat (trouble de la régulation de la température corporelle, prostration, pâleur des muqueuses etc). Ces effets sont évalués et scorés à la fois dans le but de grader la sévérité ce qui reflète aussi un effet pharmacologique du produit testé, et pour évaluer les points d'arrêts anticipés ou points limites.
Devenir
A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux seront observés au cours d'une période de 24heures maximum après le déclenchement de la phase aigue de la défaillance multi organe. Cette phase d'observation se traduira soit par la mise à mort de l'animal pour atteinte des points limites (avec mesure de la durée de survie = étude de survie) soit par une mise à mort pour les animaux survivants. La justification repose sur l'objectif de ce projet qui consiste à évaluer les effets de composés sensés réduire la mortalité lors de défaillance aigue de l'organisme. Les animaux qui survivent seront mis à mort et seront nécropsiés.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles un outil translationnel très pertinent. Nous ne disposons pas actuellement de modèles in vitro ayant des caractéristiques permettant d'évaluer les propriétés de composé sur l'ACLF. Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, et même sur des modèles de tyoe organoïdes contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global ».
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La chimie des médicaments peut produire des familles de composés chimiques très importante, la stratégie de sélection de produits intéressants à l’aide de tests in vitro exclut une très grande majorité des produits et diminue donc drastiquement le nombre de tests à réaliser chez l’animal.
Raffinement
Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse sur tapis chauffant. L'anesthésiant est mélangé à de l'oxygène au lieu d'air pour permettre une meilleure oxygénation de l'animal. Une pré-médication est réalisée en amont, 30mn avant le début de la chirurgie. Les animaux reçoivent également une injection en sous-cutané de Ringer Lactate afin d'éviter toute deshydratation et en reçoivent potentiellement une seconde en sortie de chirurgie si nécessaire. Un anesthésique local est appliqué au niveau de la laparotomie. Le principal raffinement dans ce projet se traduit par la méthode d'administration de l'analgésie en post op grâce à l'implantation de pompes osmotiques permettant une diffusion lente et constante d'un dérivé morphinique durant 48h. Des gels nutritifs sont fournis pour aider à la récupération après la chirurgie. La température de la zone d'hébergement est relevée à 22°C toujours pour que les animaux se remettent au mieux de la chirurgie. Les animaux sont identifiés à l'aide de puce RFID permettant la prise de température facile lors de l'épisode d'ACLF. Lors de l'épisode d'ACLF, les animaux sont observés selon une grille de scoring permettant d'évaluer les points d'arrêt anticipés précoces.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les rats sont agés de 5 à 6 semaines (poids 250-275g), à ce stade la masse adipeuse n'est pas trop élevée.
Etude des projections ascendantes du cervelet dans l’apprentissage moteur et cognitif en condition physiologique et pathologique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux périodes de rationnement alimentaire, l'une de 19 jours, l'autre de 14 ou 28 jours, précèdent les tests cognitifs. 560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale, une partie développe des troubles moteurs induits pour reproduire la maladie de Parkinson, et certains reçoivent du pramipexole par injection quotidienne pendant 17 jours. Les tests visent la motricité, l'apprentissage moteur et l'apprentissage cognitif, sans que les tâches elles-mêmes soient nommées. Pour justifier l'espèce, le porteur décrit le rat comme "clairement le plus adapté" à son projet et cite les outils technologiques développés autour de lui.
Objectifs
Le projet vise à étudier l’implication du cervelet dans l’apprentissage moteur et cognitif en conditions physiologique et pathologique, dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui entraîne d’importants troubles moteurs mais aussi cognitifs. Les traitements de la maladie de Parkinson peuvent également amener des effets secondaires cognitifs, appelés troubles du contrôle des impulsions, qui se manifestent par des addictions comportementales (jeu pathologique, achats compulsifs, consommation compulsive de nourriture) et qui affectent jusqu’à un tiers des patients. Les réseaux neuronaux impliquant le striatum, le cervelet, le thalamus et le cortex sont fortement impactés par la maladie de Parkinson et participent à l’émergence des troubles moteurs et potentiellement cognitifs associés à la maladie de Parkinson. Dans un premier temps, nous allons caractériser le rôle de ce réseau dans des tâches d’apprentissage moteur et cognitif et dans un second temps, utiliser un modèle de rats de la maladie de Parkinson impactant une zone clé pour la régulation des mouvements. L’étude du réseau du cervelet et du cerveau (striatum, thalamus, cortex) s’effectuera par des enregistrements de l’activité neuronale. L’apprentissage moteur et cognitif seront ensuite mesurés. L’activité neuronale de nos régions d’intérêt sera enregistrée pendant les tâches comportementales afin de comprendre comment ces réseaux sont impliqués et impactés dans le développement de la maladie de Parkinson. Puis, dans le cadre des troubles du contrôle des impulsions, un traitement au pramipexole, molécule régulièrement prescrite aux patients parkinsoniens, sera adminsitré et nous étudierons le rôle du réseau dans le développement de ces troubles. Ce projet pourra aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques des fonctions et dysfonctions cognitives liés à la maladie de Parkinson et pourrait aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse à une problématique majeure de santé publique, la maladie de Parkison qui enregistre, en France, environ 27 000 nouveaux par an (France Parkinson). Nous cherchons ici à mieux comprendre l’implication du cervelet dans les fonctions et dysfonctions motrices et cognitives liées à cette maladie. Cette approche permettra de caractériser les modifications neurobiologiques induites par le modèle de la maladie de Parkison et par le traitement au pramipexole sur l’ensemble du réseau du cervelet et leur rôle dans le développement des troubles de l’apprentissage moteur et cognitif. Ces expérimentations permettront d’établir un lien direct entre dysfonctionnements neuronaux et déficits moteurs ou cognitifs. Connaitre les mécanismes neurobiologiques associés aux troubles comportementaux dans la maladie de Parkinson pourra permettre de développer des stratégies thérapeutiques plus adaptées et spécifiques de ces symptômes.
Procédures
Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (1 fois, durée de 2h). Tous les animaux suivront des tests comportementaux (animal vigile) : fonctions motrices (quelques minutes sur 3 jours, répété toutes les semaines) apprentissage moteur (1h par jours sur 5 jours), apprentissage cognitf (45 minutes par jour sur 7 jours répété 2 à 3 fois). Les tests cognitifs nécessitent deux périodes de rationnement alimentaire (la première dure 19 jours et la deuxième 14 ou 28 jours, selon la procédure). Certains animaux recevront un traitement par injection (1 fois par jour pendant 17 jours). L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie générale en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux induisent un léger stress de quelques minutes du au changement d’environnement au cours de la réalisation du test. Un léger stress et une sensation de faim des animaux sont attendus durant le rationnement alimentaire durant les jours précédant le test comportemental. Pendant la chirurgie, le risque de douleurs et d’hypothermie n’est pas à entièrement exclure. Le réveil peut causer un stress pendant plusieurs minutes et une perte de poids peut être observé dans les jours suivant la chirurgie. L’induction de la maladie de parkinson va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. Une contention de quelques secondes, nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques, induit un léger stress en début de session. L’administration du traitement induit également une douleur de courte durée suite à l’injection de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour analyse histologique.
Remplacement
Nous nous intéressons à l’intégration et aux modifications de réseaux neuronaux et de systémes entiers sur le comportement, ce qui ne peut pas être étudié en l'état actuel des technologies et techniques, par des approches de modélisations informatiques in silico ou basées sur des cultures cellulaires in vitro. Nous réalisons donc exclusivement des approches in vivo sur l’animal en comportement.
Réduction
Nos expérimentations nécessitent l’utilisation d’un total de 560 rats mâles et femelles. La taille des échantillons a été établie grâce à un calcul de puisssance et prend en compte des marges liés à des problèmes de chirurgie et de fonctionnement des systèmes d’enregistrement, estimées par nos précédentes expériences. Cet effectif nous permettra de procéder aux tests statistiques nécessaires et d’acquérir des résultats fiables.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Après leur arrivée, les animaux sont aclimatés pendant jours à leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés avec eau et nourriture ad libitum (en dehors des périodes de rationnement alimentaire) et par 2. Un enrichissement avec des bâtons de bois et des matériaux pour la construction de nid ainsi que pour le rongeage, est mis dans les cages d'hébergement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation aux expérimentateurs. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale, avec régulation de la température corporelle par tapis chauffant, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion de ceux-ci.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). C’est un modèle très largement utilisé en neurophysiologie et est clairement le plus adapté à notre projet. Ces rats permettent de réaliser des analyses physio-anatomiques poussées (jusqu’à l’échelle du neurone unique) tout en restant pertinent du point de vue de la neurophysiologie humaine (la grande majorité des structures cérébrales de ces animaux ont un équivalent chez l’homme). Ils permettent d’étudier des fonctions de haut niveau au cœur de ce projet, en particulier la cognition. Les outils technologiques développés autour de ces animaux nous offrent également un contexte optimal pour réaliser des expériences à fort rendement scientifique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment des premiers tests comportementaux) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.
Évaluation de l’implication des transporteurs membranaires d’influx et d’efflux dans les propriétés ADME d’un candidat médicament chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 260
Ce projet mesure comment un candidat médicament passe dans l'organisme puis en est éliminé, dernière étape avant les premiers essais chez l'être humain. Au total, 890 rongeurs, 630 souris et 260 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont génétiquement modifiés pour ne pas produire une protéine de transport, d'autres reçoivent de l'Elacridar pour la bloquer quand les lignées modifiées sont indisponibles ou "trop coûteux", puis le produit leur est donné jusqu'à une fois par jour pendant un mois, avec jusqu'à sept microprélèvements de sang. Le porteur mentionne des "effets indésirables du produit" parmi les nuisances, sans dire lesquels.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre comment un futur médicament est absorbé par l'organisme, distribué dans les différents organes, transformé, puis éliminé. Ces étapes sont essentielles pour s'assurer qu'un médicament est efficace et qu'il peut être utilisé en toute sécurité. Une attention particulière sera portée à certaines protéines présentes dans l'organisme qui agissent comme des « portes d'entrée » ou des « pompes » pour les médicaments. Elles contrôlent leur passage dans des organes tels que l'intestin, le foie, les reins ou le cerveau et peuvent influencer leur efficacité ou leurs effets indésirables. L'objectif est de déterminer le rôle de ces protéines dans le devenir des médicaments, d'identifier d'éventuelles interactions avec d'autres traitements et de mieux anticiper les situations où l'utilisation d'un médicament pourrait nécessiter des précautions particulières, par exemple chez des personnes souffrant de maladies du foie ou des reins. Pour cela, nous comparerons le comportement du médicament chez des animaux présentant naturellement ces protéines et chez des animaux spécialement développés pour ne pas produire l'une d'elles. Dans certains cas, lorsque ces modèles ne sont pas disponibles, une substance permettant de bloquer temporairement l'action de cette protéine sera utilisée. Après l'administration du médicament, une ou plusieurs fois selon les besoins de l'étude (jusqu'à une administration par jour pendant un mois maximum), des prélèvements de sang et d'autres tissus seront réalisés à différents moments afin de mesurer la quantité de médicament présente dans l'organisme. Ce projet s'inscrit dans les dernières étapes de la recherche avant les essais chez l'être humain. Les résultats permettront de compléter les études déjà réalisées en laboratoire et d'améliorer les connaissances sur l'utilisation future de ces médicaments chez les patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre comment les futurs médicaments se comportent dans l’organisme et quels facteurs peuvent influencer leur efficacité ou leur sécurité. Cette étude permettra notamment d’identifier le rôle de certaines protéines naturelles de l’organisme qui peuvent modifier le passage et l’élimination des médicaments. Ces informations aideront à prévoir d’éventuelles interactions avec d’autres traitements et à mieux adapter l’utilisation des médicaments chez certains patients, notamment ceux présentant des problèmes de fonctionnement du foie ou des reins. Les résultats obtenus apporteront des données scientifiques importantes pour préparer les futures étapes du développement des médicaments, avant leur évaluation chez l’être humain. Ces études chez l’animal permettent d’obtenir une vision globale du fonctionnement d’un organisme vivant, avec l’ensemble des interactions entre les différents organes, ce qui ne peut pas être reproduit totalement par des modèles réalisés uniquement en laboratoire sur des cellules. Enfin, les données recueillies permettront de comparer plusieurs molécules en développement afin d’identifier celles qui présentent le meilleur potentiel pour poursuivre leur développement en tant que futurs traitements.
Procédures
Le médicament étudié pourra être administré soit par voie orale, soit par injection. L’administration sera réalisée sur une courte durée (environ 1 à 3 minutes). Dans le cas d’administrations répétées par voie orale, le traitement pourra être donné une fois par jour pendant une durée maximale d’un mois. Les administrations par voie intraveineuse seront effectuées sous anesthésie générale profonde, pour une durée limitée (maximum 5 minutes), afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les animaux pourront faire l’objet de prélèvements sanguins de courte durée (environ 2 minutes). Lorsque plusieurs prélèvements seront nécessaires, ceux-ci seront espacés et réalisés dans une limite maximale de 7 microprélèvements par animal. À la fin de l’étude, les prélèvements nécessaires à l’analyse pourront être réalisés sous anesthésie générale profonde.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention, l'administration du produit à tester, aux prélèvements sanguins, à la mise en boite pour l'anesthésie gazeuse et dans la boite chauffante (avant les injections intravéneuses) pouvant induire un stress chez l'animal et aux effets indésirables du produit.
Devenir
Différent tissus étant récupérés pour analyse, chaque animal sera donc mis à mort.
Remplacement
Dans le cadre de la mise au point de nouveaux médicaments, ce projet nécessite l’utilisation de rongeurs (rats ou souris), car il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment fiable permettant de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant. Les études réalisées uniquement en laboratoire sur des cellules ne permettent pas de comprendre pleinement comment un médicament se comporte dans un organisme entier, avec les interactions entre les différents organes et et les mécanismes biologiques complexes qui peuvent influencer son efficacité, son absorption et son élimination. Avant une éventuelle utilisation chez l’être humain, les études chez l’animal constituent une étape importante pour évaluer le comportement du médicament dans l’organisme, notamment sa distribution dans les différents organes et son élimination. Les modèles de rats ou de souris utilisés dans ce projet sont actuellement les modèles les plus adaptés et bien décrits scientifiquement pour étudier le rôle de certaines protéines de transport impliquées dans le devenir des médicaments. Lorsque certains modèles génétiquement modifiés ne sont pas disponibles ou trop coûteux, une substance capable de bloquer temporairement l’action de ces protéines pourra être utilisée. Cette même substance sera également utilisé plus tard pour des tests chez l'homme afin d'évaluer l'implication de ce transporteur. Les molécules étudiées auront déjà fait l’objet de nombreuses évaluations en laboratoire avant cette étape afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs et présentant le meilleur profil de sécurité. Ainsi, ce projet ne sera pas utilisé pour tester un grand nombre de nouvelles molécules au hasard, mais interviendra uniquement à une étape avancée du développement, après l’identification d’un ou des candidats médicaments présentant un potentiel thérapeutique intéressant pour l'homme. Les résultats obtenus permettront d’accompagner son développement avant les premières évaluations chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera limité au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires. Le nombre d’animaux choisi permet de tenir compte des différences naturelles entre les individus et de réaliser des analyses scientifiques permettant de vérifier que les résultats obtenus sont fiables et interprétables. D’après l’expérience acquise au laboratoire sur plus de 20 ans, l’utilisation de 3 à 5 animaux par groupe permet généralement d’obtenir des résultats suffisamment précis et reproductibles. Plusieurs prélèvements à différents moments seront réalisés afin de suivre l’évolution du médicament dans l’organisme au cours du temps. Ces mesures permettent de mieux comprendre son absorption, sa diffusion dans le corps et son élimination. Les résultats obtenus feront l’objet d’analyses statistiques adaptées afin de comparer les différents groupes d’animaux et de déterminer si les différences observées sont liées au traitement étudié ou simplement aux variations naturelles entre les individus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant l'expérimentation pour s'habituer à leur nouvel environnement et diminuer le stress. Chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (tunnel pour se cacher). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin. Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal soit durant le temps d'acclimatation, soit durant l'expérimentation. Les traitements se feront par du personnel formé et avec du matériel adéquat pour chaque espèce (canule pour gavage, taille cage, nombre d'animaux dans chaque cage,...). Des récompenses (ex : graînes de tournesol) pourront également être proposés lors des traitements répétés.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet seront uniquement des rongeurs adultes de petite taille (rats ou souris) présentant les caractéristiques recherchées pour l’étude. Ces modèles sont privilégiés car ils permettent d’obtenir des résultats fiables avec un nombre limité d’animaux et de réduire les quantités de médicament nécessaires. Ces animaux sont également des modèles bien étudiés et présentent des similitudes avec l’être humain, ce qui permet de mieux comprendre le comportement des futurs médicaments avant leur éventuelle utilisation chez les patients. Les résultats obtenus pourront être comparés à ceux issus d’autres études réalisées chez des animaux ne présentant pas cette modification génétique, afin de mieux identifier l’influence du transporteur étudié sur le devenir du médicament dans l’organisme. Lorsque l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’est pas possible, une substance appelée Elacridar pourra être utilisée pour bloquer temporairement l’action d’une protéine de transport spécifique. L’utilisation de cette approche est bien documentée dans la littérature scientifique chez le rat et la souris depuis plusieurs années.
Rôle de l’exercice physique dans un modèle inflammatoire et un modèle de récidive post-opératoire chez le rat HLA-B27 avec et sans nouveau traitement
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 840
Une perte de poids de 10 à 15 % et un arrêt du transit sont attendus après l'ablation d'une partie de l'intestin, une résection iléo-cæcale. Au total, 1 320 rongeurs, 840 rats et 480 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le porteur classe toutes au niveau de souffrance sévère. Ils subissent une colite induite chimiquement, au TNBS ou au DSS, ou cette chirurgie, et plusieurs protocoles d'exercice, pour tester l'effet de la course et de molécules candidates sur les maladies inflammatoires de l'intestin. Les rats opérés sont des transgéniques HLA-B27, choisis parce qu'ils développent une colite spontanée vers douze semaines, et le résumé décrit les procédures en une seule phrase : "Les animaux subiront une chirurgie d'une partie d'un organe."
Objectifs
Cette étude a pour objectif de comparer différents protocoles d’exercice dans des modèles expérimentaux d’inflammation intestinale avec et sans traitement : 1 - dans un modèle de colite chez le rat, 2 - dans un modèle de colite chez la souris et 3- dans un modèle de récidive post-opératoire après résection iléocaecale chez un rat transgénique . Il sera ainsi possible d’identifier les mécanismes protecteurs ou délétères associés à l’activité physique et d’optimiser les recommandations en matière d’exercice pour les patients atteints de Maladies Inflammatoires Chronique de l'Intestin. Les molécules candidats utilisées seront des pré et probiotiques mais également des molécules ciblant les voies de l'inflammation et de la fibrose. Ces molécules seront au préalable testées sur des cellules puis séléctionnées afin de limiter aux mieux le nombre d'animaux utiliser (Réduire). Il n'est cependant pas possible de mettre en place un modèle in-vitro concernant l'activité physique (Remplacer). Plusieurs études cliniques suggérent que l'activité physique comme la course à pieds modérée peut apporter des effets bénéfiques. Les procédures seront donc définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance (Raffiner). Le nombre total d'animaux sur les 5 ans à venir est estimé à 1320 animaux.
Bénéfices attendus
Des études précliniques ont mis en évidence l'influence de l'intensité et du type d'activité physique sur le contrôle de l'inflammation intestinale. Elles montrent que l'exercice forcé à haute intensité aggrave l'inflammation et les lésions intestinales, tandis que l'exercice volontaire et modéré exerce des effets protecteurs. Cependant, il n'existe pas de données directes et spécifiques de l'effet de l'activité physique sur la récidive post-opératoire dans la maladie de Crohn. Nous voudrions montrer avec ce travail d'une part les bénéfices et les mécanismes associés de l'activité physique chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Et d'autre part, selectionner des molécules candidates permettant d'améliorer et d'approfondir la connaissance des mécanismes d'action dans la physiopathologie des maladies inflammatoires digestives.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie d'une partie d'un organe.
Impact sur les animaux
L'induction des colites ainsi que les gestes de la chirurgie sont totalement maitrisés.Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être au cours des procédures (vocalisation, prostration, poil hérissé, perte de masse corporelle supérieure ou égale à 20 % ) par rapport à la masse initiale, sera euthanasié. Les animaux en phase expérimentale seront observés et pesés quotidiennement pour une attention particulière de ces points limites. Le nombre d’animaux estimé tient compte de la règle des 3R et respecte au mieux le bien-être animal en limitant la douleur. Une baisse de poids de 10 à 15% est attendue suite chirurgie et ainsi qu'un arrêt du transit mais tout doit revenir à la normale dans la semaine qui suit l'opération (récupération du poids initial et transit repris avec fécès dans la cage). Aucun effet indésirable attendu pendant ou après la distension colorectale ou l'endoscopie des rats. Concernant le poids des animaux avec colite, une baisse de poids d'environ 10 à 15% maximum est attendue aussi bien pour les rats TNBS que pour les souris avec DSS.
Devenir
Pour chacune des procédures les animaux seront tous euthanasiés
Remplacement
Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire la physiopathologie complexe de la maladie de Crohn, et ainsi utiliser les mêmes techniques chirurgicales et d’imagerie que chez l’homme. Aucun modèle in vitro n’est possible dans ce contexte. De même, une activité physique ne peut être effectuée que sur un modèle in vivo.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons. Le nombre d’animaux par groupe est de n = 10, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminées grâce à la littérature et suite à nos expériences pilotes).
Raffinement
Les conditions d'hébergement respecteront les exigences de l'animalerie de l'Institut Pasteur de Lille pour le respect de l'animal. Il y aura 2 à 3 rats par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et enrichissement du milieu. Les animaux ont un cycle de lumière jour/nuit de 12H (lumière allumée de 7H à 19H) et sont en portoir ventilé avec température (20-24°c) et taux d'humidité (30-70°c) contrôlés. Afin de limiter le stress des rats, leur milieu sera enrichi avec du matériel de nidification afin que les animaux puissent s'y cacher. Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant leur souffrance. Tout animal montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié par dislocation cervicale pour les souris et par boite CO2 pour les rats. Les souris et les rats avec colite induite sont observés et pesés quotidiennement pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris) -une perte de poids supérieure ou égale à 20%. Les rats opérés recevront un analgésique en pré-opératoire et toutes les 12H durant 72H. Ces derniers seront observés 3 fois par jour et pesés 3 fois par semaine pour une attention particulière aux points limites de l'annexe 3 : analyse des rats 5 jours après l'opération si - score de 0 : tout est normal, - score de 1 : perte de poids mineure et reprise du transit, - score de 2 : perte de poids importante, prostration et aucune reprise du transit, le rat continuera à être surveillé 3 fois par jour, l'antalgique continué au delà de 72H puis euthanasie si aucune amélioration, - score de 3 après 5 jours, l'animal sera euthanasié car perte de poids supérieure ou égale à 20% et suspicion de sténose souvent due à une complication chirurgicale.
Choix des espèces
La souris et le rat représentent les modèles les plus accessibles et les plus pertinents pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud; en particulier, le système immunitaire complexe et la diversité des microbiotes qui sont relativement proches. Les modèles de colite dans ces éspèces sont bien validés. Une cinquantaine de modèles de colite sont décrits chez les rongeurs, mais un seul d’entre eux concerne la récidive post-chirurgicale. Ce modèle a été décrit en 2011 chez la souris IL-10 KO, après résection iléo-caecale et anastomose iléo-colique. Le modèle de colite chez le rat transgénique HLA B27 est intéressant car: - colite spontanée autour de leur 12ème semaine de vie - animal plus gros que la souris ne nécessitant pas de microchirurgie Pour les procédures de colites TNBS et DSS, ce seront des animaux adultes agés de 8-10 semaines (pesant entre 24 et 26 g pour les souris et 250-275g pour les rats), offrant ainsi une physiologie digestive mâture. Pour la procédure de résection iléocaecale, nous utiliserons des rats âgés de 8 semaines car il est impératif de les faire commencer à courir avant l'installation de la colite à leur 10ème semaine de vie.
Caractérisation comportementale et moléculaire des effets de substances psychoactives chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués pour que leur cerveau soit disséqué, 2 040 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à neuf injections de cocaïne, de morphine, de MDPV ou de sérum physiologique, puis passent un test de préférence de place conditionnée, un labyrinthe en Y, une croix surélevée, et un test de préférence au sucrose qui les isole 48 heures. Mâles et femelles sont comparés dans leur réponse à ces drogues et dans la rechute. Le porteur justifie le choix du rat par sa docilité, une espèce "bien adaptée aux manipulations répétées", et par un cerveau plus gros que celui de la souris, qui facilite les dissections.
Objectifs
L’addiction aux drogues représente un problème important de santé publique. Certaines substances, comme la cocaïne ou la morphine, peuvent entraîner une dépendance et avoir des conséquences graves sur la santé, la vie sociale et le bien-être des personnes concernées. Malgré les traitements existants, de nombreuses personnes rechutent après avoir arrêté leur consommation. Les drogues modifient durablement le fonctionnement du cerveau, en particulier dans les régions impliquées dans le plaisir, la motivation, l’apprentissage et la mémoire. Ces modifications favorisent la poursuite de la consommation et augmentent le risque de rechute. Des différences ont également été observées entre les hommes et les femmes dans leur sensibilité aux effets des drogues et dans leur risque de rechute, mais les mécanismes responsables de ces différences restent encore mal connus. Afin de mieux comprendre ces phénomènes, ce projet utilisera un modèle animal largement reconnu dans la recherche sur l’addiction. Sur une durée de cinq ans, il permettra d’étudier chez le rat comment la cocaïne, la morphine et la MDPV modifient le comportement et le fonctionnement du cerveau, d’identifier les mécanismes impliqués dans la rechute après l’arrêt de la consommation, et de mieux comprendre les différences observées entre mâles et femelles face aux drogues.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’addiction aux drogues. Les substances étudiées, notamment la cocaïne, la MDPV et la morphine, sont associées à des conséquences importantes sur la santé et à un risque élevé de rechute après l’arrêt de la consommation. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ces substances modifient le fonctionnement du cerveau et influencent les comportements liés à la recherche et à la consommation de drogue. Il permettra également d’étudier les conséquences de ces substances sur certaines fonctions telles que la mémoire, les émotions et les comportements associés à l’anxiété, ainsi que les différences observées entre mâles et femelles. À plus long terme, les connaissances acquises pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement et du maintien des addictions chez l’être humain. Ces résultats pourraient participer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques et au développement de stratégies visant à prévenir les rechutes et à améliorer la prise en charge des personnes souffrant de troubles liés à l’usage de substances psychoactives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations répétées de substances. Les interventions prévues sont : 8 injections de sérum physiologique ou de drogue au cours de la phase de conditionnement ; 1 injection supplémentaire pour les animaux participant à la phase de rechute ; test de préférence de place conditionnée : prétest, test, séances de retrait et test de rechute (18 à 30 minutes par session) ; tests comportementaux complémentaires : labyrinthe en Y (10 minutes ou 2 × 5 minutes), croix surélevée (5 minutes) ; test de préférence au sucrose avec hébergement individuel temporaire pendant 48 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans ce projet sont principalement liées aux injections répétées de substances psychoactives ainsi qu’aux procédures comportementales réalisées chez les animaux vigiles. Les injections peuvent entraîner un stress léger ainsi qu’une douleur légère et transitoire de quelques secondes au moment de l’injection. L’administration des psychostimulants peut induire une augmentation transitoire de l’activité locomotrice, de la température corporelle ainsi qu’une augmentation du rythme cardiaque. L’administration de morphine peut entraîner une diminution transitoire de l’activité locomotrice, une légère hypothermie ainsi qu’une faible dépression respiratoire. L’intensité et la durée de ces effets varient selon la substance administrée et la sensibilité des animaux. Pour une partie des animaux, une phase de retrait puis une phase de rappel seront réalisées après arrêt du traitement. La phase de retrait peut être associée à un stress léger lié à l’arrêt de l’exposition à la substance. La phase de rappel nécessitera une administration supplémentaire de drogue ou de sérum physiologique pouvant entraîner un stress léger et une douleur transitoire liée à l’injection. Les tests comportementaux sont non invasifs et peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux, à leur exposition à un nouvel environnement ainsi qu’à un isolement temporaire lors de certaines évaluations comportementales. Dans le cadre des procédures terminales, les animaux seront anesthésiés profondément avant la mise à mort conformément à la réglementation en vigueur. L’administration des anesthésiques entraînera une perte progressive de conscience et l’abolition des réflexes nociceptifs avant la mise à mort.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de certaines régions cérébrales.
Remplacement
Les mécanismes impliqués dans l’addiction reposent sur des interactions complexes entre le comportement, l’environnement et le fonctionnement du cerveau. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante uniquement à l’aide de cellules cultivées en laboratoire ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques, mais elles ne permettent pas d’observer des comportements complexes tels que la recherche de drogue, la motivation à consommer ou la rechute. L’utilisation d’un animal vivant est donc nécessaire pour étudier simultanément les effets des drogues sur le comportement, la mémoire, les émotions et le fonctionnement du cerveau. Le rat est un modèle couramment utilisé dans la recherche sur les addictions car certains circuits cérébraux impliqués dans la récompense et la motivation fonctionnent de manière comparable à ceux de l’être humain. Les rats Sprague-Dawley ont été choisis car ils sont largement utilisés dans ce type d’étude, sont faciles à manipuler et présentent une bonne adaptation aux tests comportementaux. Leur utilisation fréquente dans la littérature permet également de comparer plus facilement les résultats obtenus avec ceux d’autres études.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant le principe de réduction des 3R. Les effectifs expérimentaux ont été déterminés à partir des données de la littérature scientifique, des expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire ainsi que de calculs de puissance statistique lorsque cela était nécessaire. Pour les différents tests comportementaux et prélèvements à réaliser dans les procédures expérimentales, les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, certaines évaluations comportementales ne seront pas reproduites pour l'étude comportementale, des données équivalentes ayant déjà été obtenues précédemment au laboratoire, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans le but d’appliquer le principe de raffinement, une surveillance régulière des animaux ainsi que des visites quotidiennes au sein de l’animalerie seront mises en place afin d’identifier rapidement toute situation de douleur, de souffrance ou d’altération du bien-être animal. Des points limites adaptés seront appliqués tout au long des procédures expérimentales. Afin de limiter le stress lié aux manipulations et aux conditions expérimentales, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à l’animalerie ainsi que d’une habituation progressive à l’expérimentateur. Les rats, espèce sociale, seront hébergés par deux afin de limiter le stress lié à l’isolement. Les cages comprendront une litière adaptée à base de copeaux de bois assurant le confort des animaux. Dans le cadre de ce projet portant sur les comportements addictifs, les conditions d’hébergement seront standardisées entre les groupes expérimentaux afin de limiter l’influence de facteurs environnementaux sur les paramètres comportementaux étudiés.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle de référence dans le domaine des neurosciences et de l’étude des troubles psychiatriques, notamment des addictions. En tant que mammifère vertébré, il possède des circuits cérébraux impliqués dans la récompense, la motivation et les comportements liés à la recherche de drogue présentant une forte proximité fonctionnelle avec ceux de l’humain. Le rat est également une espèce docile et sociable, bien adaptée aux manipulations répétées et aux études comportementales. Les modèles d’addiction chez le rat, notamment les paradigmes de préférence de place conditionnée, sont largement validés et utilisés dans la littérature scientifique. Enfin, comparativement à d’autres modèles comme la souris, le rat possède un volume cérébral plus important facilitant les dissections de structures cérébrales spécifiques et les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes, âgés de 8 à 9 semaines au début des expérimentations. Ce stade de développement a été choisi car il correspond à une période de maturation cérébrale et comportementale stable, largement utilisée dans les études précliniques portant sur les drogues d’abus et les comportements addictifs. L’utilisation de jeunes adultes permet de limiter les variations physiologiques liées au développement ou au vieillissement pouvant influencer les réponses comportementales et neurobiologiques étudiées. Ce choix est également fondé sur les données de la littérature scientifique ainsi que sur les expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire dans des paradigmes similaires de préférence de place conditionnée et d’étude des phénomènes de rechute. L’utilisation d’animaux du même âge permet ainsi de garantir la comparabilité, la reproductibilité et la robustesse des résultats obtenus. Par ailleurs, les rats jeunes adultes présentent une bonne tolérance aux manipulations expérimentales répétées et sont particulièrement adaptés aux études comportementales réalisées dans ce projet.
Effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicaments sur le bas appareil urinaire chez le rongeur dans un modèle mimant la ménopause. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 720
Ovariectomisées, opérées deux à quatre fois, soumises à jusqu'à trois distensions vaginales de quatre heures sous anesthésie, 720 rates et 720 souris seront toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le laboratoire teste pour des clients des candidats médicaments contre les symptômes de la ménopause, dont il dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles", à raison de trois études par an et par espèce. Les 1 440 rongeurs passent aussi jusqu'à deux sessions de 24 heures par semaine seuls en cage à métabolisme, pendant six mois au plus. Le porteur qualifie la distension vaginale de geste non douloureux, sans analgésique, alors qu'elle sert à provoquer des traumatismes des tissus pelviens et peut laisser une incontinence. Il fixe huit rongeurs par groupe sans aucun test statistique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.
Procédures
Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. DES ADMINISTRATIONS PARTICULIERES SOUS ANESTHESIE POURRONT DURER JUSQU’A 3H MAXIMUM. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. LES ANIMAUX SUBIRONT 3 DISTENSIONS VAGINALES MAXIMUM DE 4H AU MAXIMUM AVEC AU MOINS 1 SEMAINE ENTRE CHAQUE (SOUS ANESTHESIE). Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être. L’AJOUT D’UNE DISTENSION VAGINALE POUR INDUIRE DES TRAUMATISMES TISSULAIRES PELVIENS IMPLIQUE UNE PROCEDURE EXPERIMENTALE NON DOULOUREUSE MAIS LONGUE SOUS ANESTHESIE, CE QUI PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL ET DES TROUBLES URINAIRES PAR LA SUITE (AUGMENTATION DE LA FREQUENCE DES MICTIONS, INCONTINENCE). L’AJOUT D’UNE VOIE D’ADMINISTRATION NON DOULOUREUSE SOUS ANESTHESIE PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL, NOTAMMENT LORS DE SON REVEIL. De plus, les animaux vont être mis dans des cages à métabolisme donc isolés de leurs congénères pendant un certain temps pouvant induire un état de stress. Le modèle utilisé ici est un modèle mimant « la ménopause » et plus particulièrement son influence sur la fonction vésicale. Les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l’Homme à savoir une augmentation des mictions par jour avec de faible volume urinaire voir une incontinence.
Devenir
Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES SE FERONT SOUS ANESTHESIE EN UTILISANT DES PLAQUES CHAUFFANTES THERMOREGULEES POUR EVITER TOUTE HYPOTHERMIE ET UTILISATION DE GEL OCCULAIRE POUR EVITER LA DESHYDRATATION DES YEUX LORS DE L’ANESTHESIE. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES NE NECESSITENT PAS L’UTILISATION D’ANALGESIQUE (GESTES NON DOULOUREUX).
Choix des espèces
Ces procédures seront effectuées chez l’animal sauvage et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes. Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter une ‘imprégnation hormonale’ MAIS POURRONT EGALEMENT AVOIR 10-12 SEMAINES LORS DE CETTE CHIRURGIE SELON LES DEMANDES CLIENTS (DEMANDE D’UN DE NOS CLIENT).. Le traitement hormonal sera administré vers semaines et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.