Rats
Développement de modèle de fibrose évoluant vers la cirrhose hépatique chez le rat. Application à l’évaluation de propriétés thérapeutiques de composés dans la décompensation aigue de la cirrhose.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils subissent une vingtaine de gavages, une intoxication du foie sensibilisée au phénobarbital et, pour une partie, une ligature et perforation du cæcum, pour reproduire une cirrhose décompensée avec état de choc et détresse cardio-respiratoire. Le porteur revendique de reproduire une gravité qu'il juge sévère et indique avoir écarté la buprénorphine, jugée délétère pour son modèle, ce qui revient à priver d'analgésie les rats du volet inflammatoire. Il affirme qu'aucun système in vitro ne remplace l'animal entier à ce stade préclinique et renvoie au conditionnel les traitements espérés contre la défaillance du foie.
Objectifs
La décompensation de la cirrhose est caractérisée par la jaunisse, l’œdème, l’ascite et des troubles du système nerveux central, elle conduit à la mort dans un délai de 5 ans. La transplantation hépatique doit être envisagée pour maintenir le patient en vie. Chez un malade chronique du foie, elle est appelée défaillance hépatique aigüe, elle provoque des défaillances d’autres organes (reins), qui sont souvent fatales. La décompensation aigue est provoquée par une inflammation induite par une infection microbienne ou prise abondante d’alcool. La recherche de moyens médicaux est nécessaire et nécessite des modèles animaux pour les développer. Notre projet vise donc à développer le modèle décrit proche de la situation vécue par les malades de cirrhose et à évaluer la capacité de nouveaux médicaments à améliorer leur état général. Pour satisfaire à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable. Les procédures seront appliquées par des personnes habilitées, dans un hébergement adapté et bénéficiant de l’enrichissement du milieu, respectant au maximum le bien-être des animaux. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires et de ne pas altérer les résultats de l'étude, des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de totalement remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro mais la sélection des composés est effectuée in vitro ce qui participe partiellement à l’emploi de méthodes alternatives. Ainsi le nombre total de souris prévu est de 1380 animaux sur 5 années.
Bénéfices attendus
Lors de défaillance hépatique aigue, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les multiples troubles qui affectent les autres organes le plus précocement possible. Aujourd’hui on utilise des traitements qui vont agir sur la pression sanguine, l’infection, les hémorragies du système digestif, ou le dysfonctionnement des reins à l’aide de corticoïdes. Le but est de préserver les fonctions vitales dans les meilleures conditions afin de conserver les chances de succès de la greffe du foie. Les traitements que nous espérons proposer visent à agir simultanément très tôy sur les mécanisme qui sont à l’origine des défaillances multiples des organes. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Les animaux recevront 20 gavages par sonde oro gastrique (volume de 2ml/kg), chaque gavage prendra 15 secondes au cours d’une période de 12 semaines Les animaux subiront 1seul prélèvement sanguin intermédiaire à la fin de la période d’induction de la fibrose (en 10 semaines) et un second prélèvement sanguin à la fin de la procédure ( à la douzième semaine) , ils seront pratiqués sous anesthésie, la durée totale d’un acte (anesthésie et prise de sang) prend 5minutes . Les animaux recevront 1 injection intrapéritonéale au moment du déclenchement de l'ACLF (injection LPS ou Bactéries à la fin de la douzième semaine), elle sera pratiquée sur animaux vigiles contraints. La durée d’un acte est de 30 seconde. Les gestes suivants seront réalisés aux animaux qui subiront une chirurgie abdominale : • rasage de la fourrure (état vigile) durée 3 minutes • 1 injection péritonéale d'agents anesthésiques, (la durée d’un acte est de 30 secondes.) • laparotomie, ligature et percement du cécum, suture du plan musculaire et du plan cutané (sous anesthésie). La durée totale de l’acte chirurgical sur l’animal anesthésié est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La rupture des fonctions hépatiques représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez l'animal présente dans sa phase finale des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure au moment du prélevement terminal pour recueil des organes en vue d'analyses histologiques et génomiques
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée in vitro, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Ces études pilotes permettent sur la base des effets et résultats obtenus d'établir une approche statistique du choix des effectifs par un calcul de la puissance statistique.
Raffinement
L'utilisation du phénobarbital en temps qu'agent sensibilisateur à l'agent hépatotoxique à pour but d'homogénéiser, raccourcir le délai d'exposition et réduire les riques de mortalité, permettre de réduire le nombre d'animaux et la durée d'inconfort des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères , nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur introduirait un biais expérimental. Nous avons fait l'étude des effets de buprénorphine dans un de ces modèle qui se sont avérés délétères. Dans un premier temps une étude bibliographique plus approfondie sur l'emploi de moyen analgésique d'autres classes médicamenteuses est menée. Pour le modèle chirurgical , nous employons en prémédication la lidocaine localement et la buprénorphine pour la prise en charge de la douleur causée par l'acte chirurgical, la médication permet d'améliorer le bien être de l'animal en phase post-op et de réduire la durée de la période de récupération.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Très jeunes rats à l’arrivage (environs 21 jours, âge du sevrage), la taille optimale du rat pour commencer le traitement au phénobarbital a été déterminée à 100 g dans la littérature scientique.
Surrénalectomie chez les rongeurs de laboratoire pour une utilisation à des fins scientifiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système urogénital
Rats : 600
2 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vivants vers d'autres laboratoires et les autres tués. Chaque animal subit sous anesthésie une ablation des glandes surrénales de 30 minutes, puis son eau de boisson est remplacée par du sérum physiologique pour compenser la chute de sodium. Le porteur indique une douleur chirurgicale et post-opératoire, une hyponatrémie et une déshydratation. Ce projet prépare à la demande des rongeurs sans glandes surrénales, décrits comme "préparés en vue de leur utilisation", pour d'autres projets de recherche.
Objectifs
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but d'avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats et souris (environs 400/an).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale (hormones de stress, hormones minéralocorticoides, glucocorticoides et androgènes) intervenant dans la régulation du métabolisme, de la pression artérielle ...
Procédures
Chaque animal subira sous anesthésie, une ablation des glandes surrénales, pour une durée maximale de 30 minutes. Après la chirurgie et durant toute la vie de l'animal, l'eau de boisson sera intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, également l'hyponatrémie (baisse de sodium dans l'organisme) et la deshydratation.
Devenir
La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés, les autres seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).
Remplacement
Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales
Réduction
Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins adaptés et l'eau de boisson intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie, afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres systèmes métaboliques proches de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connue ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.
Remédiation ou prévention de l’émergence de troubles neurodéveloppementaux par l’exercice, l’irisine ou la lactoferrine chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. 110 femelles gestantes subissent une réduction de l'irrigation de l'utérus puis sont tuées au sevrage, et 540 ratons subissent soit cette privation avant la naissance, soit une immobilisation des pattes arrière 18 heures par jour de la naissance au sevrage. Le porteur indique une spasticité, des douleurs, un retard de croissance et des troubles moteurs et cognitifs induits par ces modèles. Le projet teste l'exercice, une protéine musculaire et la lactoferrine du lait bovin pour prévenir des troubles neurodéveloppementaux, les rats étant ensuite opérés sans réveil pour des enregistrements avant prélèvement des tissus.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TND) chez l’enfant liés à la prématurité ou à l’hypo-activité physique sont croissants. Le microbiote chez ces enfants est perturbé, tout comme la communication entre les sytèmes immunitaires, intestinaux et nerveux, conduisant à plus d’inflammation précoce et à l’apparition de TND divers. Ces troubles neurodéveloppementaux et intestinaux semblent exister dans nos modèles animaux. Nous cherchons ici à prévenir ou remédier précocément à l’apparition de ces TND par plusieurs traitements. Les objectifs de ce projet visent à déterminer l’impact de traitements comme 1) la lactoferrine issue du lait bovin, aux propriétés immunitaires bénéfiques, anti-inflammatoires et facilitatrices du métabolisme du fer, 2) l’exercice physique et l’enrichissement, et 3) l’irisine, une substance neuroprotectrice produite par les muscles et médiatrice des effets bénéfiques de l’exercice, sur i) le microbiote, la perméabilité hémato-intestinale/encéphalique, ii) les processus inflammatoires, et iii) la structure et les fonctions cérébrales, tels que réflexes et comportements sensorimoteurs, comportements cognififs et fonctions exécutives, et les corrélats électrophysiologiques de ces troubles, que l’on observe dans nos 2 modèles animaux: 1) de prématurité basé sur une hypoperfusion intra-utérine (Lot 1: 270 animaux) ou 2) de troubles de l’acquistion de la coordination, basé sur une restriction sensorimotrice (Lot 2: 270 animaux) au cours du développement.
Bénéfices attendus
Composant majeur du colostrum et du lait humain, la lactoferrine bovine (bLf) est une glycoprotéine aux propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques et facilitatrices du métabolisme du fer. L’administration prénatale de cette glycoprotéine vise à contribuer au développement harmonieux du microbiote, diminuer l’inflammation par une réduction de la perméabilité des barrières hémato-intestinale/encéphalique, améliorer le développement cérébral en minimisant les lésions cérébrales diffuses, observées dans notre modèle de prématurité et réduire les troubles divers du comportement que l’on retrouve dans nos 2 modèles animaux. La bLf est actuellement utilisée dans des essais cliniques chez les enfants prématurés et a montré des effets bénéfiques sur les infections, la mortalité et les comorbidités chez ces enfants, ainsi que l’absence d’effets secondaires. Notre étude préclinique vise à améliorer les connaissances concernant les effets de la bLf sur le développement cérébral et les mécanismes d’action, avec une portée à terme sur le développement de prochains essais cliniques. La sédentarité et l’hypo-activité physique en général, comme l’indiquent de nombreuses ONG ou l’OMS, induisent de multiples troubles du développement du métabolisme et du cerveau. De même, les enfants prématurés ou atteints de troubles de la coordination qui présentent généralement une hypo-activité, de moindres interactions sociales et avec l’environnement développent de multiples troubles du neurodéveloppement (TND). Ce programme de recherche vise à étudier la remédiation précoce des TND observés dans nos 2 modèles animaux induits par un programme d’enrichissement de l’environnement pour favoriser et multiplier les interactions sociales et environnementales et des exercices physiques controlés qui contribuent au développement neuromusculaire harmonieux. L’irisine, une substance sécrétée par les muscles en exercice, favorise la neuroprotection et le développement cérébral harmonieux. Nous étudierons les effets bénéfiques potentiels de l’administration de l’irisine pour contrer l’apparition des TND dans nos 2 modèles animaux. L’irisine commence à être étudiée intensivement et nos données précliniques permettront d’étudier les effets de l’irisine chez des enfants atteints de TND qui présentent une hypo-activité physique et de faibles interactions sociales et avec l’environnement par le biais d’essais cliniques.
Procédures
Les femelles gestantes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine) seront soumises à une sténose des artères utérines au jour embryonnaire 17 (E17) sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, puis seront mises à mort au sevrage par anesthésie gazeuse suivie d’une dose léthale d’euthasol car non réutilisables pour d’autres gestations. Les ratons issus des femelles du lot 2 (restriction sensorimotrice) subiront une restriction de mouvements par immobilisation des pattes postérieures durant 18h par jour de la naissance au jour du sevrage (30 jours). Les femelles du lot 2 seront mises à mort après plusieurs gestations successives, de manière comparable à celles du lot 1. Les femelles gestantes et/ou allaitantes des lots 1 et 2 seront soumises à 2 diètes alimentaires (supplémentation en lactoferrine ou un régime isocalorique) durant la période prénatale ou postnatale, ou sur les 2 périodes selon le groupe expérimental. Chaque groupe expérimental de ratons des lots 1 et 2 subira après sevrage un des traitements suivants : Un enrichisssement et des exercices physiques consistant à élever une dizaine de rats du même sexe dans une grande cage où est disposée une roue d’activité, l’administration d’irisine ou de solution saline isotonique par injection intrapéritonéale, des tests comportementaux variés, tels que le test de la nage de l’âge de 14 à 28 jours, un test de locomotion acrobatique sur échelle inclinée ou automatique le lond d’un corridor (Catwalk), le test d’agrippement pour mesurer la force de préhension, le test de l’open-field dans une arène vide, le von Frey électronique pour mesurer le niveau de sensibilité tactile, le test nociceptif pour déterminer la latence de retrait lors de l’application de stimulus thermique, le test de l’elevated plus maze pour évaluer le niveau de désinhibition des animaux, le test de reconnaissance d’objets pour tester les capacités mnésiques. Chaque animal des lots 1 et 2 subira également un prélèvement sanguin à l’âge de 1 et 2 mois. Enfin à lâge de 3 mois, chaque animal subira de manière terminale une chirurgie cranienne et des muscles sous anesthésie gazeuse profonde pour effectuer ensuite des enregistrements électrophysiologiques, un dernier prélèvement sanguin, puis après mise à mort par injection léthale d’euthasol le prélèvement des tissus intestinaux, musculaires et du système nerveux. Les animaux subiront également le contrôle quotidien du poids et les manipulations correspondant aux différentes interventions citées.
Impact sur les animaux
La MIUH (hypoperfusion intra-utérine) à E17 et la restriction de mouvements lors de la SMR induisent une inflammation systémique au cours du développement, un neurodéveloppement atypique, la présence de lésions cérébrales, un retard de croissance, des troubles sensorimoteurs, locomoteurs avec une mobilité réduite, comportementaux et cognitifs, ainsi que des signes de spasticité. La spasticité correspond à des spasmes et co-contractions de muscles antagonistes, liée à une hyperréflexie ou hyperexcitabilité du réseau spinal, qui peut conduire à des douleurs. Les nuisances principales dans nos 2 modèles sont liées à la présence de spasticité (i.e. réduction de la mobilité) et un retard de croissance, que nous contrôlons régulièrement. Ce retard de croissance est compensé graduellement au cours du temps dans nos 2 modèles. La spasticité et les troubles locomoteurs, comportementaux et cognitifs perdurent chez les animaux adultes. Les traitements proposés (lactoferrine, exercices et enrichissement, administration d’irisine) dans ce projet de recherche visent à limiter l’inflammation, réduire les lésions cérébrales, améliorer le neurodéveloppement, la mobilité et la perte de poids, donc leur bien-être et limiter ainsi les nuisances induites, comme nous cherchons à effectuer chez l’enfant atteint de troubles du neurodéveloppement (TND). Nous cherchons également à évaluer l'impact de ces interventions (MIUH, SMR et supplémentations en lactoferrine) sur le microbiote intestinal, dont l'altération peut aussi conduire à des nuisances, telles qu'une dysbiose. D’autre part, les animaux subissent également de nombreuses interventions dans ce projet, comme des anesthésies, injections et prélèvements sanguins répétés ou réguliers en sous-cutané (sc) ou intrapéritonéal (ip), une supplémentation alimentaire en lactoferrine bovine ou en caséine (diète isocalorique), des tests comportementaux, le contrôle quotidien du poids, l’implantation des puces RFID, et les manipulations de l’animal correspondantes qui peuvent entraîner des nuisances et des effets indésirables, telles que du stress, une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les femelles gestantes des lots 1 et 2 (n = 110) seront mises à mort après une ou plusieurs reproductions et les 540 ratons issus de ces femelles seront soumis à partir de l'âge de 3 mois à une chirurgie avec anesthésie profonde sans réveil pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques, puis après mise à mort des prélèvements de tissus sanguins, nerveux, intestinaux et musculaires une fois la session d'enregistrements achevée pour chaque animal.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre après une une hypoxie-ischémie intra-utérine ou une restriction de mouvements au cours du développement sont proches de celui de l’humain. Ces mécanismes ne peuvent être étudiés sur des cultures cellulaires ou in silico, mais uniquement sur un modèle animal vivant, pas de remplacement possible en l’état.
Réduction
Réduire le nombre d’animaux. Autant que possible, ce sont les mêmes animaux qui sont engagés dans les différents tests sensorimoteurs et comportementaux, ainsi que dans les analyses électrophysiologiques et neuro-anatomiques des réseaux neuronaux correspondants. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum (n = 15 animaux max. par groupe expérimental) tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux expérimentaux, traités et les animaux contrôles). Nous chercherons notamment à réduire le nombre de femelles gestantes nécessaires à produire les ratons hypotrophes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine ou MIUH) et si c'est possible se limiter à 10-12 animaux par groupe lorsque les bornes de significativité sont atteintes, en utilisant des tests paramétriques (ANOVAS à mesures répétées avec 1 ou 2 facteurs indépendants) et non-paramétriques (Tests de Wilcoxon, Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney) selon la distribution des résultats.
Raffinement
Dans tous les cas, les procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur le bien être et les points limites. Des points limites sont établis afin de réduire toute source d'angoisse et de souffrance et d'assurer le bien être animal. Le suivi des points limites et l'observation régulière de l'état général des rats dès la naissance permettent d'arrêter à tout moment l'expérience pour éviter l'angoisse et la souffrance de l'animal (voir Annexe 2 pour les détails des observations et interventions adaptées). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, 2 à 3 animaux sont regroupés par cage pour un enrichissement social et disposent de nourriture, d’eau ad libitum et d’objets pour compléter l’enrichissement dans les conditions standard. Nous nous efforçons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés, notamment une relaxation des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental. Les analgésiques et anesthésiques utilisés sont adaptés aux expérimentations et conformes à la législation en vigueur.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l’accès in vivo aux modifications d’activité neuronale dans l’encéphale et la moelle épinière dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail expérimental sur l’animal entier et vivant anesthésié. Nous utilisons des rats Sprague-Dawley jeunes et adultes, mâles et femelles car nous ne pouvons pas effectuer l'hypoperfusion intra-utérine (MIUH) chez la souris, un modèle bien trop petit et délicat, ni la restriction sensorimotrice au cours du développement chez la souris, car les souris femelles allaitantes éliminent leurs souriceaux à la suite de telles manipulations. Les rates sont bien plus conservatrices et protectrices avec leur progéniture que les souris qui tendent à éliminer plus facilement leur progéniture. D'autre part, les microchirurgies (ex: sténose par pose de micrcoils) et les enregistrements électrophysiologiques ne peuvent être conduits chez la souris, car modèle trop réduit en taille et trop fragile, comparativement au rat qui est définitivement le meilleur choix dans notre cas. Comme cette étude porte sur le neurodéveloppement structurel et fonctionnel après expérimentation prénatale (Lot 1 = MIUH: sténose jour embryonnaire 17) ou postnatale (lot 2 = SMR de la naissance au sevrage: 1 mois), nous effectuons des traitements pré- et postnataux (1 semaine avant la naissance au sevrage), des tests fonctionnels sensorimoteurs et comportementaux étalés de la naissance à l'âge adulte, des prélèvements sanguins à 1 et 2 mois, et enfin une analyse électrophysiologique finale à partir de 3 mois, suivie de prélèvements des tissus sanguin, nerveux et musculaires une fois l'animal mort.
Evaluation de l’efficacité de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’attaque thromboembolique chez le rat (acronyme : AVC-MATER-2023)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
306 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie du cou de 40 minutes pour injecter des caillots dans une artère et provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de traitements, de prélèvements sanguins et de tests comportementaux jusqu'au 21e jour. Le porteur indique un déficit sensorimoteur, des lésions cérébrales et des signes de paralysie, certains animaux atteignant des points limites imposant une mise à mort anticipée. Il affirme qu'il paraît "indispensable" de développer de nouveaux médicaments et écarte les méthodes in vitro ou in silico, jugées incapables de reproduire la complexité de l'AVC.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la 2ème cause de mortalité dans le monde. Environ 80% des AVC sont induits par une interruption de la circulation sanguine dans le cerveau. A l’heure actuelle, le rt-PA est le seul médicament préconisé dans cette pathologie. Toutefois, ce traitement possède de nombreuses limites : efficacité limitée et risque de complication avec aggravation des symptômes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter des caillots dans une artère pour induire l’accident vasculaire cérébral. Cet acte chirurgical durera 40 minutes sous anesthésie générale. Deux heures plus tard, sur animaux vigiles, un traitement sera administré. Avant et après chirurgie, un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s’étalant de J1 à J21 post AVC, seront réalisés pour une durée totale de 20 minutes maximum. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d’organes sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux induits, nécessaire durant les 48h suivant la chirurgie, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture ou le cathéter nécessaire au traitement, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le modèle par définition reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entrainer des pertes d’équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion et une atteinte des fonctions motrices. L’AVC est un évènement grave chez un patient et sa survie est engagée. Le modèle d’étude chez l’animal présente, lors de l’induction et durant les 48 premières heures suivant l’induction, des signes cliniques d’inconfort manifestes (paralysie). Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé et une mise à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Pour évaluer les effets de notre composé, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 3 ou 21 jours après l’induction de l’AVC, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Sur la base de notre expérience de ce modèle, le nombre de rats utilisé pour chaque étude est réduit au minimum et révisé à la baisse au fur et à mesure de nos expériences tout en garantissant une interprétation statistique et scientifique des résultats. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations du cerveau post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. En effet, l’analyse des expériences passées a révélé qu’environ 10% à 20% des animaux ne se réveillent pas après la chirurgie et que 40% à 60% des animaux étaient exclus des études (intensité des troubles et des lésions cérébrales trop fortes ou trop faibles).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec des feuilles de papier absorbant comme enrichissement, auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintient de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale) ainsi qu’après. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Pour pallier aux problèmes liés aux signes cliniques du modèle (perte d’équilibre, faiblesse musculaire, atteinte des fonctions motrices), les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chirurgie et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et durant les 48h suivantes. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. La remise en cage par 3 ne sera réalisée que lorsque la récupération des animaux sera suffisante (reprise de poids après la perte attendue liée à la chirurgie. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.
Choix des espèces
Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l'AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des rats mâles Wistar Han de 350-400g et des rats femelles Wistar Han de 200-225g à l’arrivée au laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Effet d’une thérapie cellulaire sur les symptômes liés au diabète chez un modèle de diabète de type 1 induit par la streptozotocine chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les rend diabétiques par une injection de streptozotocine, puis on leur implante par chirurgie abdominale des îlots pancréatiques encapsulés dans un polymère développé par un laboratoire partenaire. Le porteur indique que l'hébergement individuel constitue une nuisance pour ces animaux sociaux, s'ajoutant à l'état diabétique et aux douleurs post-opératoires. L'étude teste la formulation d'un laboratoire pharmaceutique client, les rats étant tués pour prélever pancréas, tissu adipeux et reins.
Objectifs
Le laboratoire pharmaceutique partenaire développe des formulations pour des composés déjà utilisés en clinique humaine dans le domaine des troubles métaboliques (obésité, diabète...) et qui permettent d'en améliorer leur biodisponibilité et leur efficacité (meilleures propriétés pharmacocinétiques) tout en améliorant la qualité de vie des patients (par amélioration de la posologie). Parmi ses axes de recherche, le laboratoire a développé des formulations sous forme de polymères permettant d'encapsuler des ilots de Langherans exogènes. Des données préliminaires, réalisées in vitro, indiquent que les polymères développés sont capables : 1) d'autoriser la détection des taux de glucose par les cellules beta des ilots de Langerhans 2) d'autoriser la sécrétion de l'insuline par ces mêmes cellules et son relargage en dehors du polymère 3) d'améliorer la survie des cellules béta transplantées, notamment par une réduction de l'action du système immunitaire de l'hôte. Le présent projet vise à tester l'impact de leurs polymères sur l'efficacité d'une thérapie cellulaire à base d'ilots de Langerhans de rat chez un modèle de rat rendu diabétique de type 1 par une administration unique de streptozotocine.
Bénéfices attendus
De nos jours, les options thérapeutiques dont nous disposons face au diabète sont relativement nombreuse. Néanmoins, une des difficultés rencontrées aujourd'hui provient du fait que les composés anti-diabétiques ne permettent pas une régulation optimale et continue de la glycémie. L'une des approches actuelles pour contourner ce problème consiste à développer des technologies se rapprochant d'un "pancréas artificiel". Les approches les plus évoluées dans ce domaine consistent en des implants d'ilots de Langerhans exogènes. Une telle approche permettrait à l'implant d'être directement sensible aux variations de glycémie de l'organisme et d'y répondre en adaptant sa sécrétion d'insuline notamment. Ces approches restent cependant pour l'heure grandement théoriques, notamment du fait de la difficulté de contourner les rejets d'implants et de la mort cellulaire au sein de ce dernier. Notre client est très actif dans ce domaine de développement et propose une approche innovante consistant à empaqueter les implants dans une formulation à base de polymères stables afin de contourner les difficultés mentionnées ci-dessus. Notre étude préclinique fait suite à une série d'études préliminaires réalisées in vitro et vise à démontrer l'efficacité de ce procédé. Si les résultats s'avèrent positifs, la solution de notre client serait testée en conditions cliniques. A terme, une telle approche pourrait fournir une option de thérapie cellulaire proche d'un "Pancréas artificiel" dans la lutte contre le diabète et améliorer considérablement la prise en charge à long terme des patients diabétiques de type 1.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Administration de Streptozotocine pour induction du diabète (administration unique). / 2) Mesures régulières de prise alimentaire et poids corporel (2/3 fois par semaine sur la durée de l'étude, sauf après administration de STZ où la mesure sera quotidienne pendant 5 jours). / 3) Chirurgie d'implantation des ilots de Langerhans enrobés (durée 20-30 minutes). / 4) Mesures de glycémie (6 mesures à l'éat nourri et 5 mesures après 5h de mises à jeun. / 5) Un test de tolérance au glucose intrapéritonéal. /5) Une mesure de composition corporelle par RMN (durée de la mesure: 2 minutes environ).
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel, nécessaire pour des raisons scientifiques (les mesures de prise alimentaire individuelles sont des données clés de l'étude) et pratiques (les rats diabétiques ont une production d'urine extrêmement importante obligeant un change des cages tous les deux jours pour un seul animal), constitue une nuisance pour les rats qui sont des animaux sociaux. L'administration de Streptozotocine induit une destruction partielle du Pancréas et un état diabétique qui constitue une nuisance chez les animaux. La procédure implique une chirurgie abdominale pour administrer les implants qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les prélèvements sanguins, seuls ou au cours de l'IPGTT, bien que pratiqués en bout de queue et avec des volumes très limités peuvent engendrer des nuisances. Enfin, la mesure de composition corporelle, peut engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses génomiques et histologiques sur le pancréas, le tissu adipeux et les reins qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’une thérapie cellulaire basée sur l'implantation d'ilots de Langerhans sur la régulation glycémique. Notamment, la capacité de sécrétion d'insuline par l'implant et son efficacité d'action dans un organisme entier ainsi que l'impact du système immunitaire de l'hôte sur la survie des cellules beta sont des paramètres nécessaires à considérer dans le système d'étude.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de rat diabétique de type 1 et sur l'analyse des paramètres d'intérêt de la présente étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction : 1) du fait qu'environ 25-30% des animaux sont résistants à l'induction du diabète par la STZ. 2) qu'environ 5-10% des animaux sont susceptibles de sur-réagir à l'administration de STZ dans les 4 jours suivants son administration et être exclu de l'étude suite au dépassement des points limites établis. 2) des paramètres d'intérêt majeur de notre étude. Le n a ainsi été adapté de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés dans notre modèle d'étude.
Raffinement
Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Ils seront hébergés dans des cages enrichies de briquettes de bois et de tube en cartons spécifiques pour rongeur. Après administration du STZ, les rats devenant diabétiques et présentant une polyurie très importante, les fond de cages et les litières seront changés tous les deux jours. Une attention particulière sera portée à l'état de remplissage des biberons du fait de l'état polydipsique des animaux diabétiques (vérification matin et soir). Après administration de STZ, et après la chirurgie d'implantation, les animaux seront observés de façon renforcée (4 visites / jour au minimum) afin de détecter tout inconfort ou toute atteinte d'un des points limite établis. Concernant la chirurgie d'implantation, celle-ci sera réalisée sur tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux et une couverture péri-opératoire par de la Buprénorphine sera mise en place (une dose avant chirurgie, une dose en fin de chirurgie et une troisième dose le soir de la chirurgie). Le nombre de prélèvements sanguins nécessaires au cours de l'étude étant nombreux, nous avons limité au minimum les volumes de prélèvements à chaque point (entre 10 et 30 µl de sang). Nous limiterons à 5h la durée de mise à jeun préalable avant les mesures de glycémie dites "à jeun" afin d'induire un minimum de perturbation aux animaux. Par ailleurs, la moitié des dosages de glycémie se feront à l'état nourri. Enfin, pendant l'intégralité de l'étude, une fiche de score de souffrance sera établie de façon quotidienne afin d'être en mesure de réagir le plus rapidement possible à toute altération de l'état de santé des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de diabète de type 1 chez le rat par administration de streptozotocine est extrêmement bien documenté dans la littérature et utilisé de façon courante dans les études précliniques visant au développement de thérapie anti-diabétiques. Par ailleurs, les ilots de Langerhans utilisés dans les implants développés par notre client sont des ilots prélevés chez le rat, justifiant de maintenir ce modèle dans notre étude. Les animaux seront livrés à un âge de 6 semaines, et recevront l'implant à l'âge de 9 semaine, soit au stade jeune adulte. Cet âge a été choisi afin de mimer au mieux la population humaine à laquelle le produit en développement sera destiné.
Implantation de cathéters chez les rongeurs de laboratoire pour une utilisation à des fins scientifiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Rats : 2800
Hamsters dorés : 400
4 000 souris, rats et hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de pose de cathéter vasculaire ou non vasculaire, jusqu'à 45 minutes, suivie d'un hébergement individuel de deux à six jours. Le porteur reconnaît une douleur pendant et après la chirurgie et un inconfort lié à l'isolement. Il présente cette prestation comme préparant des rongeurs cathétérisés expédiés vers d'autres laboratoires, et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme.
Objectifs
Les rongeurs sont les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux dans les domaines tels que l'oncologie, les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, etc. Ce projet a pour but d’avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans des études expérimentales. Plusieurs prestations sont réalisées chaque année sur rats, souris et hamsters concernant l'implantation de cathéters (vasculaire : 400/an et non vasculaire : 400/an).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, le projet diminue le stress car il évite les appareils de contention, allège et diminue la contention manuelle. Il empèche également la douleur provoquée par des injections ou des prélèvements, unique ou répétés.
Procédures
Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurgie de pose de cathtéter(s) vasculaire ou/et non vasculaire, pour une durée maximum de 45 minutes. Suite à la chirurgie, l'animal sera hébergé individuellement, pour une durée comprise entre 2 et 6 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, et également l'hébergement en individuel, pouvant générer inconfort et stress.
Devenir
La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche
Remplacement
Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales.
Réduction
Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimun) et devront peser au moins 100 g (pour les rats), 20 g (pour les souris) et 60 g pour les hamsters. L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sur deux jours une chirurgie du dos induisant une plaie cutanée chronique avec arrêt de l'irrigation sanguine, puis des traitements par plasma froid trois fois par semaine et un maintien en cage individuelle. Le porteur indique que l'induction de la plaie peut causer une souffrance limitée dans le temps et qu'un excès d'espèces réactives pourrait provoquer une nécrose des tissus, constituant un point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de suivre la cicatrisation sur plusieurs semaines et conclut que le recours au rat est nécessaire.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmas froids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette première étude dans le cadre d'un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids de "nouvelle génération" sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat, et de comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social. Un prélèvement de sang de 3 ml environ sera réalisé sur les 20 rats lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, effectué en moins d’une minute avant leur euthanasie, pour réaliser des analyses sanguines.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Transfert d’embryons sur rongeurs de laboratoire pseudogestantes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 10400
83 200 souris et rats vont être utilisés, la plupart tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'environ quinze minutes sous anesthésie générale, pour servir de mères porteuses. Le porteur indique que ces femelles réimplantées sont tuées au sevrage des petits, sauf quelques-unes gardées comme sentinelles sanitaires, et que 156 rates sont réutilisées. Il justifie la voie chirurgicale par un taux de naissance 2,5 fois supérieur à la méthode non invasive, qu'il juge sans réelle "valeur ajoutée éthique".
Objectifs
Ces transferts d’embryons ont pour but de mettre à disposition de la communauté scientifique des animaux sains. En effet, la présence de contaminants dans les colonies de rongeurs de laboratoire peut introduire un biais dans les résultats obtenus et leur analyse, ainsi qu'avoir des conséquences néfastes sur le bien être de ces animaux. La cryoconservation et le transfert d’embryons permettent de réduire considérablement les populations de rongeurs de laboratoire, en ciblant la naissance d'une majorité d'animaux d'intérêt scientifique. En effet, à partir d’embryons décongelés, de sperme suivi d’une fécondation IN VITRO ou encore de collecte d’embryons post accouplements naturels, les embryons collectés et lavés en milieux stériles appropriés sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes qui vont en assurer le développement IN UTERO et leur élevage jusqu’au sevrage. Enfin, au-delà des 2 arguments cités ci-dessus, le transfert d’embryons permet également d’autres améliorations telles que le retour à un microbiote caractérisable, améliorer les conditions d’élevage, sécuriser sanitairement les échanges lors de collaboration,… Ce projet est donc un élément de base dans la gestion et l'élevage des colonies de rongeurs de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'obtenir rapidement des rongeurs d'intérêt scientifique et de haute qualité sanitaire issus de femelles réimplantées ayant la capacité de donner les meilleurs taux de naissances possibles post transfert embryonnaire par voie chirurgicales.
Procédures
Les animaux subissent une procédure chirurgicale unique d'une durée moyenne de 15 minutes après anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie de transfert d'embryon est composée d’un protocole chirurgicale unique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum.
Devenir
Les femelles réimplantées seront mises à morts au sevrage des petits sauf quelques-unes qui seront utilisées en tant que sentinelles pour le contrôle du statut sanitaire des portées. Les animaux sevrés seront envoyés au donneur d’ordre pour des fins scientifiques.
Remplacement
Des solutions commerciales de kits de transfert d'embryons par voie naturelle sont proposées par différentes compagnies. Les méthodes dites "non invasives" (par voies naturelles) offrent des taux de naissance de l'ordre de 2.5 fois moins comparativement à la méthode chirurgicale. Cela nécessite donc l'utilisation d'un plus grand nombre de donneuses d'embryons et de mères porteuses pour obtenir un même résultat. Les taux de naissances obtenus et les spécificités techniques associées à leur utilisation ne permettent donc pas encore une réelle valeur ajoutée éthique pour les transferts d'embryons par des quantités réduites d'animaux au strict minium pour atteindre les objectifs scientifiques souhaités. Les transferts d'embryons dans des femelles pseudgestantes B6CBA/F1 permettent également la réalisation de shéma d'accouplement (IN VIVO ou IN VITRO) avec des taux d'animaux d'intérêts supérieurs à ceux issus d'accouplements naturels. Ces transferts évitent ainsi de nombreux accouplements naturels pour une cible finale en terme de nombre d'animaux d'intérêt identique dont les femelles du modèle ne pourraient pas: ovuler, assurer une gestation ou encore allaiter correctement.
Réduction
L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles réimplantées pour atteindre des objectifs fixés par les utilisateurs finaux. Les revitalisations de modèles maintenus au format congelé lorsqu'ils ne sont pas en études actives, les décontaminations par transfert embryonnaires, les expansions rapide de colonies par fécondation IN VITRO,... sont toutes des solutions qui répondent complètement aux 3R et à l'objectif de réduction d'animaux en élevage. La production d’animaux expérimentaux par des méthodes alternatives, intégrant des transfert d’embryons, permet de rationaliser les besoins des chercheurs : - en évitant les élevages permanents desquels une infime partie des animaux produits est utilisée. - en offrant une homogénéité des lots, une qualité génétique et sanitaire supérieure, et un microbiote standardisé. - en permettant de réduire la quantité d’animaux produite aux uniques besoins. Un élevage moyen d’un modèle produit environ 500 animaux par an, ce qui arriverait à une quantité de 2 500 000 animaux nés sur 5 ans pour 1000 modèles. Pour le même nombre de modèle, le transfert embryonnaire pour produire les lots d’animaux expérimentaux sur 83 700 mères porteuses permet une réduction minimale de 10 fois la quantité d’animaux produite en élevage continue. Cette méthode répond efficacement aux attentes d’une démarche 3R.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application d'une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux avec une grille d’évaluation adaptée pour déceler tout signe clinique et atteinte des points limites, par un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et par un protocole analgésique maitrisé lors de la chirurgie. D'après notre historique, les taux de gestations et taux de naissance sont similaires à ceux d'accouplements naturels et nous avons une absence de mortalité post chirurgie. Ces éléments témoignent d'une procédure maitrisée.
Choix des espèces
L’espèce choisie doit être identique à celle du modèle scientifique et pour lesquel le recours à cette technique est nécessaire. Parmi les rongeurs, les espèces les plus utilisées par la communauté scientifique sont les souris et les rats. Pour les souris, nous avons choisi l’hybride B6CBA/F1 qui est la plus reconnue scientifiquement pour ses qualités reproductrices pour assurer une gestation et un sevrage d'un plus grand nombre de petits avec un gabarit homogène et donc une standardisation optimale du process. Pour les rats, la souche Sprague Dawley est reconnue comme étant la plus appropriée pour cette même technique et pour ses qualités reproductrices. L’âge est déterminé par l'âge de maturité des fonds génétiques et la faculté des animaux utilisés à mener à bien la production d’une portée jusqu’à son sevrage : -Rats: Sprague Dawley de 10 à 12 semaines -Souris: B6CBA/F1 de 10 à 15 semaines
Rôle du glucose et de son transporteur neuronal GLUT3 dans l’activation cérébrale et les performances cognitives chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de 35 minutes avec injection d'une molécule dans le cerveau, la moitié un test de reconnaissance d'objets, et cent d'entre eux une injection intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique attendre une perte transitoire de discrimination des textures par les vibrisses et une perte de poids légère après la chirurgie. Il présente une cible thérapeutique contre Alzheimer ou les AVC comme retombée à terme, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle du glucose dans la mémoire.
Objectifs
Pour fonctionner et assurer des tâches complexes, telles que l’apprentissage et la mémoire, les neurones ont besoin d’énergie. Historiquement, il était admis que le glucose est le seul nutriment principal des neurones, mais des travaux récents suggèrent fortement que le lactate, un métabolite du glucose produit principalement par les astrocytes (cellules du cerveau autres que les neurones), pourrait être également une source d’énergie pour les neurones. De plus, les astrocytes sont idéalement positionnés entre les vaisseaux et les neurones, cette position clé leur permet notamment de réguler de manière adaptée l’information entre les cellules au niveau du cerveau. Le but de ce projet est de mieux comprendre et de définir dans le cerveau, si la source d’énergie des neurones en activité, est le glucose et/ou le lactate. Pour répondre à cet objectif, nous allons évaluer la contribution et le rôle du glucose dans l'apprentissage et la mémoire, chez des rats privés ou non d’un transporteur au glucose. Cette évaluation sera réalisée chez le rat, par l’analyse des capacités d’apprentissage, de reconnaissance et de mémorisation des textures de certains objets de son environnement.
Bénéfices attendus
Notre projet va nous permettre de mieux comprendre le rôle du glucose et du lactate dans l’apprentissage et la mémoire. Cette meilleure compréhension, nous permettra de définir une cible thérapeutique, qui pourra ensuite être évalué dans un protocole thérapeutique chez le rat. A terme cette thérapie sera envisagée pour une évaluation chez l'homme afin d'améliorer la prise en charge des troubles cérébraux répandus comme la maladie d'Alzheimer (15% de personnes atteintes parmi les plus de 80 ans) ou les Accidents Vasculaire Cérébraux AVC (3ème cause de décès après les maladies cardiovasculaires et le cancer).
Procédures
Sur animaux vigiles : Pour tous les animaux, 17 pesées (1 min par pesée). Chez une partie des animaux (160 animaux), 4 injections sous cutanée d’un antalgique avant et après la chirurgie (1 min par injection). Chez 50% des animaux (100 animaux), un test de comportement, reconnaissance d'objets (6 sessions de 10 min). Chez tous les animaux (200 animaux), 1 injection intra-péritonéale d’un mélange anesthésique/analgésique. Sur animal anesthésié : Chez une partie des animaux (160 animaux), 1 application oculaire de pommade ophtalmique afin de prévenir une sécheresse oculaire, 1 acte chirurgical (durée de 35min) sous anesthésie et analgésie avec injection d'une molécule dans le cerveau pour en étudier son effet, 1 injection transdermique et 1 application locale d'antalgique à l'endroit de l'incision chirurgicale. Chez 50% des animaux (100 animaux), 1 chirurgie pour injection intracardiaque avant mise à mort alors que l'animal est encore anesthésié.
Impact sur les animaux
Suite à l'injection, l'effet indésirable attendu sur les animaux est, une perte de la discrimination via les vibrisses entre les différentes textures des objets chez les animaux recevant notamment une molécule contrôle affectant les capacités de reconnaissance des textures. Suite à la chirurgie les effets indésirables attendus sur les animaux sont un inconfort transitoire ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire dans les premières 48h-72h après chirurgie.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biologiques et métaboliques.
Remplacement
Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes dans le cerveau et permettre l’étude du comportement. Il est donc nécessaire de recourir à un modèle animal.
Réduction
Concernant la réduction, nous réalisons en amont, des expériences sur des neurones en culture in vitro afin de valider l'utilisation des réactifs nécessaires au projet. Cette phase d'étude in vitro limitera le nombre de rats utilisés dans le projet. Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.
Raffinement
Le raffinement de cette étude a été pris en compte, les animaux seront hébergés dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce (matériel de nidification et tunnel) afin d'éviter l'ennui et complété par un suivi quotidien de leur état de santé. Les animaux en pré, per et post-chirurgie feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe) et des « actions » seront mises en place, sans délai, en cas de « problème(s) » observé(s). Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie centrale et locale sur tapis chauffant, par un personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale et à la chirurgie, et les animaux bénéficieront d’une prise en charge antalgique pré, per et post-chirurgie afin de réduire au maximum la douleur. Concernant le test du comportement, durant toute la période du test les animaux seront manipulés par la même personne à laquelle ils seront habitués ce qui diminue leur stress. De plus ce test de comportement est considéré comme un enrichissement vu qu’il se base sur le fait de la mise en contact de l’animal avec un objet nouveau qui stimule sa curiosité procurant ainsi un bien-être à l'animal. Enfin, nous avons mis en place une grille de score ainsi que des points-limites adaptés, qui nous permettront d’avoir une prise en charge afin d’arrêter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le choix porté sur le rat Wistar repose sur les critères principaux suivants : 1) L'aspect translationnel, presque tous les gènes humains liés aux maladies neurodégénératives sont équivalents chez le rat. Le rat Wistar présente un répertoire comportemental plus élaboré et proche de l'homme. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. 3) La maîtrise, l’expertise et la validation de la chirurgie dans ce modèle de rat, ainsi que les études de comportement. Les rats arriveront dans l’animalerie à 7 semaines d’âge, puis la procédure chirurgicale sera réalisée chez les animaux après 14 jours d’acclimatation (rats âgés de 9 semaines). Puis 3 semaines après, le test du comportement sera réalisé chez ces rats âgés de 12 semaines, âge adulte pour lequel le cerveau est complètement développé pour avoir une homogénéité de réponse des cellules cérébrales. Le test du comportement sera réalisé durant 1 semaine.
Études de pharmacocinétique de formulations destinées aux animaux
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Chats : 250
Chiens : 250
900 animaux non-humains, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, chats et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des administrations répétées de formulations vétérinaires par voies variées et de multiples prélèvements de sang, jusqu'à dix chez les chiens et chats sur 48 heures. Le porteur indique que les rongeurs sont tués en fin d'étude tandis que les 250 chiens et 250 chats sont réutilisés puis proposés à l'adoption. Il qualifie ces études de "stricte nécessité" réglementaire, ne pouvant selon lui être remplacées pour la mise sur le marché des produits.
Objectifs
Lors de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le screening de substances actives ou le choix des ingrédients de la formulation est basé entre autres sur leur propriétés pharmacocinétiques. La connaissance des principes actifs et/ou ingrédients (bibliographie, historique des études etc...), l’usage de méthodes alternatives in silico et in vitro ainsi que de la modélisation pharmacocinétique permet une première sélection mais la complexité d’une formulation (mélange d’excipients, pH, volume injecté, etc.) nécessite une ou plusieurs évaluations préliminaires avant le choix définitif de la formulation (sélection ou optimisation de formulations) et de son utilisation (posologie, voie d’administration). En amont des essais sur espèces cibles, il est possible de réaliser des études sur des rongeurs. Si les résultats sont concluants, le produit pourra être testé sur la ou les espèces cibles.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produits.
Procédures
●Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 10 prélèvements sur 48h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. - Rongeurs : 1 minute par prélèvement . Souris, rats : maximum 1% du volume circulant total sur 24h et maximum 15% du volume circulant total sur une période de 28 jours. - Hamsters, cobayes : maximum 5 prélèvements par 48 h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. ●Prélèvements avec écouvillons : nasal, salive, larmes. Chiens et Chats : 1 minute par prélèvement. Rongeurs : 1 minute par prélèvement sur animal anesthésié. ●Prélèvements non invasifs : poils : sans restriction de nombre. Des administrations de produits pour toutes les voies : -1 traitement par voie (durée environ 5 minutes chez les carnivores et 1 minute chez les rongeurs. Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), gingivale, parentérale (entre autres sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch), auriculaire.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : écouvillon oral), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.
Devenir
Pour les rongeurs, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Pour les carnivores, l’ensemble des animaux sont ré-utilisés puis proposés à l’adoption.
Remplacement
Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant lors d’études préliminaires.
Réduction
Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : - soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée - soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets sur les 5 ans à venir et des animaux déjà utilisés sur ceux-ci. Les études peuvent être réalisées selon différents designs : - design croisé (cross-over) : tous les animaux reçoivent successivement tous les traitements (test et référence) dans un ordre aléatoire. L’essai croisé utilise le sujet comme son propre témoin ; - design en parallèle : chaque groupe d’animaux reçoit un seul type de traitement. L’essai en parallèle utilise généralement un groupe témoin versus un ou des groupes traités car les groupes sont indépendants entre eux ; - design par étapes : quand le nombre de sujets est important, l’étude peut être réalisée en deux étapes avec un nombre inférieur de sujets. Si la première étape (plus de 50% des sujets totaux) ne permet pas de répondre à la question, la seconde étape est réalisée avec le nombre de sujets pour compléter le nombre total. Entre chaque période de traitement, une période d’attente sera définie pour permettre aux animaux de récupérer et/ou permettre l’élimination du produit administré précédemment (principe actif et métabolites) ou de son effet pharmacologique. Des tests statistiques seront adaptés à chaque design d'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. - Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal - Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. - Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). - Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies. - En cas d’obligation d'héberger les animaux individuellement, des mesures complémentaires seront mises en place: une présence augmentée du personnel, possibilité pour les animaux de voir, sentir et entendre leurs congénères, augmentation du nombre de jouets dans l’hébergement, un suivi renforcé par les vétérinaires avec une attention particulière sur le comportement des animaux.
Choix des espèces
De façon réglementaire, les études de pharmacocinétique doivent être menées sur la ou les espèces de destination. Il est possible d’utiliser les rongeurs dans les études préliminaires de sélection de nouvelles molécules, formulations, voies d’administration ou posologie si pertinentes et avant les études sur espèces de destination. Les études sont réalisées chez des animaux sevrés, représentatifs de l’espèce de destination et de son statut physiologique, ceci comprenant entre autres l’âge ou la maturité sexuelle. Ces choix sont faits selon l’utilisation future du produit.
Comparaison de l’intégration de la sensibilité méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une craniotomie pour implanter une canule, puis jusqu'à quatre injections de molécules inflammatoires sur les méninges pour reproduire une crise de migraine, avec mesure de la sensibilité par filaments de von Frey. Le porteur indique que le modèle provoque une douleur ressentie deux heures après chaque injection et impose un isolement en cage individuelle de deux semaines pour éviter l'arrachage des canules. Les retombées annoncées, de nouveaux traitements tenant compte des différences femmes/hommes, sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de comparer l'activation cérébrale entre sexes.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier l’activation des voies de la douleur par des stimulations méningées qui miment le mal de tête ressenti lors de la migraine, en utilisant des marqueurs d’activation neuronale. Nous souhaitons comparer l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un modèle animal mimant l'inflammation qui semble avoir lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. En effet, pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d’intégration de la douleur ressentie lors des migraines au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans cette pathologie nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, mieux comprendre la pathologie peut nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste en une craniotomie pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections (au maximum) tous les 2 ou 3 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h (4 fois maximum) ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal toutes les 15 min pendant 4 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure quelques secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois : cela dure 5 min.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure moins d’une seconde. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau: les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.
Raffinement
Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain (IASP). Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc pour permettre aux animaux de faire un nid.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Effets de la chirurgie bariatrique sur l’amélioration des fonctions cardio-vasculaires, hépatiques, métaboliques et osseuses de la femelle rat obèse et sur sa descendance
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère. Des femelles rendues obèses subissent une chirurgie bariatrique classée sévère, puis elles et leur descendance passent prises de sang, scanners osseux, échographies et tests de glycémie avant d'être tuées pour prélèvement de multiples organes. L'étude évalue les effets de cette chirurgie avant la grossesse sur les mères et leurs petits. Le porteur affirme que les répercussions d'une chirurgie ne peuvent être évaluées ni sur cellules en culture ni en biobanque, "sans alternative" au recours aux animaux non-humains.
Objectifs
Ce projet continue une recherche déjà en cours afin de la poursuivre et de l'achever, au vu des retards pris durant la crise sanitaire du Covid 19. Son objectif global est d'établir, dans un modèle d'obésité induite par la nourriture grasse et sucrée chez le rat, les effets à court et long terme de la chirurgie bariatrique (ou "chirurgie de l'obésité") des mères avant leur grossesse sur leur propre santé, mais aussi sur celle de leur descendance. Nous allons ainsi: 1. Evaluer les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse sur le statut nutritionnel et métabolique (diabète et cholestérol), sur les risques cardiaques et vasculaires (hypertension, risques d'infarctus du myocarde), sur le devenir hépatique (maladie du foie gras), sur la fragilité osseuse (ostéoporose) et sur les capacités de lactation des mères. 2. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation normale. 3. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation grasse et sucrée au sevrage, afin de rechercher des effets protecteurs ou délétères de la chirurgie bariatrique maternelle sur le développement précoce d'altérations métaboliques, cardio-vasculaires ou hépatiques. 4. Identifier des biomarqueurs de risque de l'obésité chez les descendants, et évaluer leurs modifications potentielles induite par la chirurgie bariatrique maternelle.
Bénéfices attendus
Amélioration des connaissances sur les répercussions de la chirurgie bariatrique faite avant la grossesse sur la santé globale des mères opérées, avant, pendant et après la gestation et l'allaitement. Analyse des risques potentiels induits à court et long terme chez leurs descendants, dans un environnement nutritionnellement normal ou hypercaloriqueet en prenant en compte l'existence de possibles différences en fonction du sexe, d'une susceptibilité au développement d'une obésité, d'anomalies du métabolisme du sucre et des lipides, de stéatose hépatique, d'anomalies cardiaques et vasculaires précoces, et de fragilisation osseuse. Recherche de facteurs pouvant expliquer le ou les profils à risque identifiés et de biomarqeurs de risques, pouvant être utilisés secondairement en clinique pour des stratégies de prévention primaire dans le cadre d'une médecine personnalisée. Ces résultats pourront être validés en clinique par des tests faits sur les biocollections locales, sans contrainte supplémentaires sur des animaux ou des patients.
Procédures
Les mères seront soumises à une procédure chirurgicale (une heure maximum d'intervention), dont seules les procédures de chirurgie bariatrique sont classées en procédures sévères, et à deux prises de sang, effectuées sous anesthésie générale, avec un intervalle de plus de 3 mois. Elles auront également, sur la durée totale de suivi de 8 mois, deux passages de moins de 24 heures en cage isolée pour quantifier les calories ingérées, 4 scanners osseux d'une durée de 30 minutes (test indolore, réalisé sous anesthésie générale courte), 3 échographies cardiaques de 10 minutes, 3 séries de tests de glycémies, et deux séries de prises de tension artérielle. Les descendants auront, dans les 15 jours précédant leur euthanasie, une mesure de tension artérielle, une échographie cardiaque, un scanner osseux, une mise en cage isolée de moins de 24h, une prise de sang (sous anesthésie générale), et un test de glycémies.
Impact sur les animaux
Stress induit par la mise en cage d'isolement des animaux d'une durée inférieures à 24 heures, réalisé une fois par animal, et minimisé par intégration dans la cage de petit tunnel comme objet de distraction. Douleur post-opératoire après chirurgie bariatrique durant environ 48-72 heures, avec risque de nausées, prévenus par l'administration systématique de médicaments anti-douleurs et anti-émétiques et surveillance rapprochés pluri-quotidienne des animaux dans les trois jours postopératoires. Les mesures de glycémie à la queue de l'animal occasionnent une douleur très brève initiale lors de la première ponction, non accessible à une antalgie orale ou intra-veineuse, et minimisée par le maintien de l'animal dans sa cage avec ses congénères qui permet de diminuer son stress lors de l'examen.
Devenir
Les femelles obèses opérées et leurs descendants inclus dans les groupes de suivi longitudinal seront euthanasiés pour prélèvement multi-organes afin de réaliser dessus des analyses fonctionnelles et histologiques sur les différents tissus. Ces dernières permettront de déterminer s'il existe des anomalies du tissu osseux (résistance), du coeur (facteurs favorisant les infarctus), des artères (plaques d'athérosclérose, anomalies du fonctionnement favorisant l'hypertension artérielle), de la graisse (quantification, analyse de la morphologie des cellules de graisse) et du foie (accumulation de tissus gras, fibrose, voire cellules cancéreuses).
Remplacement
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en culture ou des analyses de tissus en biobanque, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires par groupe a été calculé par analyse statistique en amont au plus juste, portant à 12 (6 mâles et 6 femelles) le nombre d'animaux par groupe d'âge d'analyse.
Raffinement
La gestion du bien-être animal sera assurée par un habitat optimisé, et groupes de 3 à 5 individus, avec des objets de stimulation dans la cage, une surveillance clinique quotidienne, et l'utilisation de médicaments antidouleurs adaptés à tout geste potentiellement douloureux. Tous ces gestes seront limités au maximum et effectués sous anesthésie générale . Les situations non douloureuses mais stressantes seront également limitées en nombre et dans leur durée.
Choix des espèces
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en cultures, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible. Il a été démontré que les modèles de rongeurs pouvaient reproduire fidèlement le profil de patients avec une obésité induite et les effets de la chirurgie bariatrique. Leur rapidité d'évolution et de reproduction, en comparaison avec l'observation de cohortes humaines, devrait en outre nous permettre d'obtenir des résultats rapidement, et de mener dans les cinq ans à une bonne identification des profils des descendants à risque métabolique particulier. Les femelles rat Sprague-Dawley seront incluse dans le protocle de régime obésogène, en vue d'une chirurgie bariatrique ou sham à 7 semaines de vie, afin d'avoir un âge compatible avec un bon taux de fertilité au terme du protocole (obésité induite + chirurgie bariatrique, 10 semaines +/- 1 au total). Leurs descendants seront inclus dans le protocole de suivi longitudinal au moment du sevrage. Les mâles reproducteurs auront aux alentours de 12 semaines de vie.