Rats

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont contaminés par gavage au césium-137, reçoivent un antidote, puis passent en cage à métabolisme et en tube de contention pour une spectrométrie, avant le prélèvement de leurs organes. L'étude cale un modèle de contamination interne en vue de tester un décorporant, notamment dans un contexte d'"actes de malveillance". Le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" pour étudier la rétention du césium, tout en reconnaissant que des méthodes in vitro ont servi en amont.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre en place un modèle de contamination interne chez le rat. Il permettra de tester l’efficacité d’un nouvel antidote. Pour être plus efficace que les produits disponibles, cet antidote se présentera sous une autre forme d’administration. Si les résultats obtenus par ce modèle expérimental pilote sont concluants, il sera possible de répondre à des appels à projets en lien avec les actes de malveillance. Si ces études nous permettent de conclure, des études complémentaires seront réalisées pour l’enregistrement et l’obtention d’une nouvelle Autorisation de Mise sur le Marché (AMM).

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre en place un modèle expérimental de contamination interne chez le rat afin de pouvoir tester ultérieurement l’efficacité d’une nouvelle formule de décorporation. Selon les résultats obtenus, nous pourrons compléter ces résultats par des études précliniques nécessaires sur la tolérance. Enfin, si la tolérance attendue est confirmée, nous complèterons par la suite les études nécessaires pour l’obtention d’une nouvelle AMM.

Procédures

Pour l’ensemble des animaux, 40 rats : - gavage à jeun du Cs-137 et de l’antidote oral - injection iv de l’antidote injectable - La collecte des urines et des fèces sera réalisée par passage en cage à métabolisme (durant 24 heures) 4 jours avant contamination puis 24h et 72h après contamination (3 collectes). - Une mesure corps entier par spectrométrie gamma (zooradiamétrie) sera effectuée 4 jours avant contamination, juste après contamination et 24h et 72h après contamination (4 mesures d’environ 20 minutes réalisées en tube à contention après une période d’habituation des animaux).

Impact sur les animaux

Les différentes traitements (injections iv, gavages) peuvent générer du stress dû à la contention et aux interventions pratiquées, un inconfort mineur, une hémorragie ou un hématome ou encore une douleur en cas de geste non maitrisé. Le passage en cages métaboliques peut générer stress et inconfort ; de même pour le passage en tubes à contention. D’après le recul acquis au laboratoire, la contamination à la dose utilisée de Cs-137 ne génère pas de conséquences cliniques notables particulièrement pendant la durée de l’expérimentation (72 heures). L’administration à la dose pharmacologique des 2 produits ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux. En termes de toxicité, il existe des informations disponibles et publiées sur le Cs-137 et le produit de référence. Des données confidentielles concernant la solution injectable ont en outre été transmises au laboratoire.

Devenir

Le prélèvement des organes sera fait post-mortem (les organes sélectionnés sont des cibles biologiques connues du Cs-137). Les prélèvements concernent tous les animaux du projet

Remplacement

Afin d’étudier la décorporation du Cs-137 et sa rétention au sein d’un organisme biologique complexe, le modèle animal reste indispensable et il n’est pas encore remplaçable totalement par des méthodes alternatives. Cependant des méthodes alternatives (in vitro) ont permis en amont du projet de sélectionner la molécule candidate.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum la souffrance animale, une habituation au système de spectrométrie gamma sera réalisée au cours de la phase d’acclimatation pour limiter le stress généré. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est un modèle d’études précliniques utilisé en contamination interne au Cs-137. Les animaux employés dans cette étude pilote seront âgés de 3 mois (stade adulte). Ils permettront de faire la preuve de concept de l’efficacité du modèle expérimental.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant un mois, puis sont soumis une fois à une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer un stress, avant que leurs organes soient prélevés pour des mesures électrophysiologiques. Le porteur présente ce travail comme une prestation pour des "clients" des industries pharmaceutique et biotechnologique évaluant leurs molécules. Il affirme que l'usage de tissus fraîchement prélevés est "nécessaire" car la complexité des réseaux neuronaux ne se reproduit pas in silico.

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). Le développement de modèles rongeurs génétiquement modifié (GM) permettent de créer des mammifères mimant des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) à l’échelle d’une tranche et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Nous induirons donc un stress chez le rat et enregistreront l’effet de molécule d’intérêt, soit par une exposition, in vivo, au préalable, ou soit par une exposition, ex vivo, sur nos tranches ou cellules. Nous pourrons alors déterminer les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet : - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés une fois par jour, au maximum et pendant 3 minutes, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est d’un mois. Les contentions répétées nécessaires à ces différentes injections génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée ou soit par intrapéritonéale. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures, au maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; + effets secondaires potentiels des molécules *-Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée d’une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Les réactions, après un stimulus générant du stress, sont complexes et mettent en jeu les organes sensoriels, les nerfs sensoriels et une intégration au niveau le système nerveux central, permettant une réaction adaptée. Parce qu’il n’est pas envisageable de réaliser sur l’homme les tests que nous proposons et que la gestion de stress pathologique présente un intérêt de recherche important, nous évaluons et et/ou caractérisons des molécules d’intérêt dans le traitement du stress induit chez le rat. Il nous est nécessaire de réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Et ces réseaux doivent être en situation de stress. Pour cela nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un rat préalablement stressé. De plus, nos techniques nous obligent à l’utilisation de tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Par nos techniques, nous réalisons plusieurs tranches pour une noyau cérébral donné, chaque tranche peut subir un protocole particulier. Nous pouvons, par exemple, à partir d’un même cerveau tester plusieurs concentrations d’un même composé, ou plusieurs composés, ou plusieurs protocoles d’enregistrement, chaque protocole répondant à une question particulière. Alors, notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses au stimulus stressant dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en proposant quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (2 rats adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront quatre jours d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 2 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes (minimum 6 semaines d’âge) ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

80 rats Wistar âgés de 18 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour une solution bactérienne et subissent quinze prélèvements de sang sur animal vigile, une restriction alimentaire entraînant environ 10 % de perte de poids et une mise en cage individuelle. Le porteur teste un probiotique censé limiter la fonte musculaire, présenté comme un futur produit à destination des séniors. Il affirme qu'évaluer l'effet sur le muscle rend "nécessaire" le passage par l'animal.

Objectifs

Le projet vise à valider in vivo la capacité d'un probiotique (Limosilactobacillus muscosae seul ou en association avec L. casei) à limiter la fonte musculaire chez des rats dénutris, animaux modèles du syndrome de fragilité de l'Homme.

Bénéfices attendus

Le projet participera au développement d'un nouveau probiotique à destination des séniors favorisant la sensibilité à l'insuline et améliorant la régulation de la glycémie. Cet effet santé du probiotique permettra de limiter la fonte musculaire liée à l'âge (sarcopénie) et donc de limiter la dépendance des personnes âgées fragiles.

Procédures

Les animaux recevront une solution bactérienne quotidiennement et subiront des mesures de composition corporelle, de mesure de leur métabolisme protéique et l'analyse de leur sensibilité à l'insuline. ceci impliquera au total 15 prélèvements de sang sur animaux vigiles répartis sur la durée du projet de 1 mois.

Impact sur les animaux

Perte de poids (environ 10%) associée à une restriction alimentaire. Stress associé à une mise en cage individuelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, des prélèvements d'organes devant être effectués pour analyses.

Remplacement

Ce projet vise à valider cette propriété in vivo et à tester son efficacité sur la masse musculaire. L'action d'un probiotique est à la fois directe (sur les cellules intestinales) mais aussi indirecte (sur d'autres organes via des médiateurs). Pour tester l'effet de ce probiotique sur le métabolisme musculaire, il est donc nécessaire de passer par une expérimentation sur animaux modèles.

Réduction

Pour ce projet 80 animaux seront utilisés. Ils seront répartis en 5 groupes de 16 animaux. Le nombre d'animaux a été limité au nombre minimum nous permettant d'avoir des résultats significativement différents entre les groupes, ce nombre a été déterminé par test statistique et grâce à l'expérience du laboratoire sur l'utilisation de ce modèle animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un enrichissement de leur milieu de vie et seront observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite l’animalier alertera les responsables de l’étude. Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des rats Wistar âgés de 18 mois. Notre laboratoire possède une forte expérience d'utilisation du rat âgé en tant que modèle de la sarcopénie humaine. Le rat est un animal de choix pour les études sur le vieillissement, son espérance de vie étant de 24 mois.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire puis des prélèvements sanguins répétés, pour mesurer le comportement de molécules candidates-médicaments. Le porteur reconnaît l'existence de modèles cellulaires de criblage mais affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer un "organisme vivant" et décrit ces analyses comme "incontournables". Tous les rats sont tués, l'administration de molécules empêchant selon lui leur réemploi.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal. En effet, il est indispensable d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques (PK), pharmacodynamiques (PD) et d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination (ADME) des molécules car ce sont des éléments cruciaux pour la sélection de candidats médicaments. Les analyses de PK, PD et de métabolisme ont considérablement amélioré le taux de succès de la recherche et du développement de médicaments ces vingt dernières années pour trois raisons principales : (i) ces études ont été incorporées en routine dès les phases précoces de découverte de nouvelles molécules, (ii) les scientifiques ont une meilleure connaissance des enzymes et des transporteurs impliqués dans le métabolisme des médicaments ainsi que des différences entre les espèces et individus, (iii) des stratégies d'optimisation des propriétés métaboliques et pharmacocinétiques des molécules ont été établies et appliquées à la recherche et au développement de médicaments. Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées. Il s'agit notamment d'évaluer des paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 20 minutes). Les animaux seront anesthésiés pour effectué l'administration des molécules pharmaceutiques (durée d'intervention 10 minutes). Le sang des animaux vigiles sera prélevé plusieurs fois au cours de la procédure, l'animal sera alors contenu pour retirer le capuchon en métal et effectuer le prélèvement et le flush du cathéter (durée d'intervention 3 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation du cathéter chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h, c'est pourquoi une analgésie de type buprénorphine sera systématiquement appliquée en post-chirurgical pour pallier à une éventuelle souffrance. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau des zones incisées, une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée. En cas d'infection majeure, l'animal sera soumis à un traitement par antibiothérapie. Une observation clinique quotidienne sera également mise en place afin d'évaluer l'état général des animaux opérés.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental.

Remplacement

Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées. Il s'agit notamment d'évaluer des paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules.

Réduction

Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est déterminé et est réduit à son minimum pour chaque groupe. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La pose d'un cathéter veineux va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre d'anesthésie et de ponction lors du prélèvement sanguin chez ce dernier. Les expérimentateurs sont exclusivement des personnels formés à l'expérimentation animale et maîtrisent les bons gestes garantissant le bien-être animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour soulager les animaux. Les points finaux seront évalués quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...) et le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites ont été établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation du cathéter malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation du cathéter malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet (rat) est recommandée par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Cette espèce est la plus utilisée et il s'agit d'un excellent modèle pour ce type d'études. Ainsi, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans cette espèce. Les multiples homologies de séquences entre le rat et l'Homme rendent ce modèle prédictif du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, il présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire.

76 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies, un amincissement du crâne et une injection d'un vasoconstricteur dans le cerveau pour provoquer un accident vasculaire, puis quatre à cinq anesthésies consécutives pour des séances d'imagerie. Le porteur reconnaît un risque de dépression respiratoire lié à cette succession d'anesthésies et d'hémorragie lors de l'amincissement du crâne. Les rats sont gardés vivants trois à quatre jours puis tués pour prélever le cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Disposer de modèles animaux bien caractérisés est nécessaire à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. De plus, leur utilité en recherche translationelle est renforcée lorsque l’effet thérapeutique peut être mesuré par la même méthode d’imagerie chez l’animal et le patient. L’objectif global du projet est de caractériser par imagerie in vivo le modèle d’AVCi expérimental consistant en une injection intra-cérébrale d'un vasoconstricteur (endothelin-1) chez le rongeur. Plus précisement, il s’agit d’étudier la dynamique de la formation de la lésion ischémique lors de l’injection intra-cérébrale du vasoconstricteur ainsi que la réaction neuroinflammatoire qui s’ensuit. Pour cela seront mises en œuvre différentes méthodes d’imagerie, i) récemment développées, ii) en voie de transfert clinique, et iii) susceptibles d’apporter un nouvel éclairage sur la physiopathologie de ce modèle animal : ultrasons fonctionnels (fUS), permettant de visualiser l’activité cérébrale grâce aux variations de volume sanguin cérébral, et IRM moléculaire ou cellulaire, utilisant un agent de contraste à base de particules d’oxyde de fer, respectivement spécifique d’un récepteur sur-exprimé en condition inflammatoire (sur la paroi des vaisseaux) ou d’un type cellulaire (macrophages/microglies). Ces deux méthodes sont donc particulièrement adaptées à ce modèle où l’infarct ischémique dérive d’une réaction vasculaire (vasoconstriction) induite localement par l’endothelin-1. En résumé, ce projet consiste en une caractérisation renouvelée d’un modèle d’AVCi chez le rat grâce à de nouvelles méthodes d’imagerie. Il comprend 3 procédures de sévérité modérée, et a une durée de 4 ans.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la dynamique de formation de l’infarct, et la réaction inflammatoire associée, dans un modèle animal plus simple à mettre en œuvre et à standardiser que le modèle classique d’occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’homme puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

Deux chirurgies : amincissement du crâne (30 min) et injection stéréotaxique (45 min), sous anesthésie générale. Deux à trois sessions d'imagerie (ultrasons et IRM), de durée moyenne

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux chirurgies (amincissement du crâne et injection stéréotaxique intracérébrale), ainsi que des sessions d’imagerie (ultrasons et IRM). Cette succession d’anesthésies générales sur 4 à 5 jours consécutifs comporte des risques de dépression respiratoire et peut affecter leur état général. L’emploi systématique d’un anesthésique gazeux (isoflurane) et une surveillance étroite au réveil permet de contrôler ces effets. Suite à la chirurgie permettant de réaliser le modèle d’ischémie cérébrale, une perte de poids minime (

Devenir

Euthanasie pour prélèvement post-mortem du cerveau et analyses complémentaires.

Remplacement

Ce projet consiste en une étude à l’échelle du cerveau entier, dont les mécanismes physiopathologiques (ischémie et inflammation associée) et les méthodes d’imagerie sélectionnées (US & IRM) ne peuvent être actuellement adaptés et étudiés sur un système in vitro. Ce projet vient compléter notre connaissance d’un modèle animal utilisé depuis les années 90. L’utilisation du modèle animal adéquat conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des mammifères de plus grande taille (cochon, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographie de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 10 animaux (5 mâles et 5 femelles) seront typiquement utilisés, avec une analyse intermédiaire à 6 animaux. Si la variabilité est faible, notamment dans les groupes contrôles (injection sans endothelin-1), alors l’inclusion sera stoppée. Il n’y a pas de mortalité directement liée à l'infarct ischémique, qui est de taille limitée en comparaison du modèle d‘AVC le plus utilisé (occlusion artérielle mécanique). L’imagerie longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion au cours du suivi à la taille de l’atteinte initiale chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Plus spécifiquement dans ce projet, des méthodes d’imagerie innovantes vont permettre de mieux décrire la cascade physiopathologique dans ce modèle d’AVC. Si la variabilité du modèle s’avère plus importante que décrite dans la littérature, celle-ci pourra être mieux contrôlée car à l’imagerie réalisée très précocement (pendant ou juste après l’occlusion). Les chirurgies sont réalisées sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal en plus de la nourriture et boisson habituelles, et les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’aggressivité constatée).

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Ce modèle est aussi pertinent car la taille du cerveau est suffisante pour la mise en place de l’imagerie ultrasonore et IRM de manière efficace et le modèle ET-1 est très bien défini chez le rat. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : maturité cérébrale atteinte.