Rats

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe osmotique est implantée sous la peau par chirurgie, puis les rats subissent pendant cinq jours des prélèvements sanguins quotidiens représentant 3,5 à 7 % de leur volume sanguin et des injections sous-cutanées, pour tester de nouvelles molécules contre l'hyponatrémie. Le porteur affirme avoir déjà prouvé l'efficacité de sa molécule brevetée et renvoie au conditionnel l'intérêt pour les patients, avec moins d'effets indésirables que le Tolvaptan. Sur le remplacement, il indique qu'il serait "nécessaire" de démontrer l'efficacité chez l'animal avant l'Homme et retient le rat comme modèle reconnu par la communauté internationale.

Objectifs

L’hyponatrémie, c’est-à-dire la diminution de la concentration de sodium du sang, est une pathologie fréquente, en particulier en hospitalisation. C’est un problème de santé publique puisqu’elle augmente la mortalité quelle que soit la pathologie responsable. Le Tolvaptan est un médicament, utilisé en clinique chez l’Homme dans cette pathologie. Toutefois, son utilisation est limitée, notamment du fait d’un risque de correction trop rapide de l’hyponatrémie et d’une toxicité au niveau du foie. Il paraît donc nécessaire de rechercher de nouvelles options thérapeutiques. Une nouvelle molécule a été développée dans notre laboratoire. Cette molécule est plus sélective et plus puissante que le Tolvaptan. De plus, cette molécule est moins toxique pour le foie. Nous avons déjà prouvé l’efficacité de notre molécule chez l’animal contre cette pathologie par de premières expériences. Nous voudrions maintenant valider chez le rongeur des versions de cette molécule optimisées en laboratoire et brevetées en 2021.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’effet, chez le rat, de nouvelles molécules pour traiter l’hyponatrémie qui devraient présenter moins d’effets indésirables que les traitements actuels, afin d’envisager une utilisation de ces produits chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale courte (d’une durée d’environ 10 minutes) pour mettre en place une pompe osmotique sous-cutanée. Les animaux vont être placés en cage individuelle permettant de recueillir les urines et les fèces pendant 5 jours. Pendant ces 5 jours, les animaux vont être soumis à des prélèvements sanguins (d’une durée d’environ 3 minutes) quotidiens d’un volume de sang correspondant à environ 3.5-7% de leur volume sanguin total chaque jour. Pendant les 3 derniers jours, les animaux vont être injectés quotidiennement par voie sous-cutanée (d’une durée inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle d’hyponatrémie nécessitera l’administration continue sous-cutanée par pompe osmotique d’une molécule, l’apport d’une nourriture semi-liquide et l’hébergement dans des cages spéciales permettant de récupérer les urines. Les effets indésirables relatifs à l’implantation de la pompe osmotique sous-cutanée sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie et dureront au maximum 2 jours. Les effets indésirables relatifs à l’apport d’une nourriture semi-liquide et à l’hébergement dans des cages spéciales sont potentiellement un stress pour les animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Le traitement par les molécules candidates nécessitera des injections sous-cutanées quotidiennes. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets dureront au maximum 5 jours. Les dosages de la natrémie nécessiteront des prélèvement sanguins quotidiens. Les effets indésirables relatifs à ces prélèvements quotidiens sont potentiellement une douleur et une hypovolémie. Ces effets dureront au maximum 5 jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 à la fin de la procédure afin de réaliser une autopsie.

Remplacement

L’objet de ce travail est d’étudier l’efficacité de nouveaux composés, jamais administrés chez l’Homme. Il existe donc un objectif clinique à court terme. Les expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de valider l’affinité et la sélectivité des molécules pour leur cible. Avant d’évaluer l’effet de ces produits chez l’Homme, il est nécessaire de démontrer leur efficacité chez l’animal. Le modèle expérimental que nous avons choisi constitue un modèle pathologique fiable qui a déjà été utilisé pour développer des traitements chez l’Homme dans l’hyponatrémie.

Réduction

Nous allons réaliser notre étude sur un modèle déjà publié et bien décrit dans la littérature, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point du modèle. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous avons calculé le nombre d’animaux nécessaire par groupe via l’utilisation d’un test statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures. De plus, les résultats des expériences seront analysés au fur et à mesure afin de modifier si besoin les doses de produit utilisées et donc ne pas utiliser inutilement des animaux. Au total, 240 animaux au maximum seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes dans un milieu enrichi pendant au minimum 8 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, des analgésiques injectables par voie sous-cutanée seront délivrés. Pendant toute chirurgie, les animaux seront maintenus à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre dans un milieu enrichi et étroitement surveillés pendant au moins 48h. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements et administrations sous-cutanées quotidiens, une pommade analgésique sera appliquée sur le site d’injection, 10 minutes avant la piqûre. La localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Les animaux devront être placés dans des cages spéciales permettant le recueil de leurs urines au cours du temps. Le temps passé dans ces cages sera réduit au minimum (5 jours) et une observation quotidienne de tous les animaux sera réalisée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux prélèvements quotidiens, les animaux seront anesthésiés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce préalablement utilisée pour des expérimentations in vitro, ex vivo et in vivo dans le laboratoire pour tester l’effet des antagonistes des récepteurs à la vasopressine sur différents paramètres rénaux et cardiovasculaires. Conserver la même espèce animale permet d’éviter de renouveler certaines expériences et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. De plus, le modèle utilisé correspond à ceux préalablement décrits dans la littérature pour évaluer l’effet des traitements dans l’hyponatrémie. Il s’agit du modèle reconnu par la communauté internationale comme le plus adapté aux pathologies humaines. Les rats utilisés dans ce projet seront à un stade de développement similaire à celui utilisé dans les protocoles de la littérature, c’est-à-dire des rats âgés de plus de 6 semaines. Cela permettra la comparaison des résultats expérimentaux obtenus aux données de la littérature.

30 souris et 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils servent à entraîner le personnel d'animalerie aux injections, aux prélèvements sanguins et à la pose de cathéter, chaque animal étant réutilisé jusqu'à six fois sur trois mois. Le porteur indique que ces manipulations répétées peuvent provoquer un stress, et que les gestes sont réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. L'objet déclaré du projet n'est pas de produire des connaissances mais de maintenir les compétences techniques des soigneurs.

Objectifs

Au cours des différentes procédures, le personnel qualifié de l’animalerie pourra maitriser et s’entrainer régulièrement aux injections, prélèvements de sang et pose de cathéter sur animaux vigiles et/ou anesthésiés couramment pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Cela inclu la préparation de l’animal, l’analgésie, l’anesthésie, l’asepsie, la maîtrise et le contrôle des paramètres physiologique pendant toute la durée de l’intervention et le réveil de l’animal.

Bénéfices attendus

Grâce a cet entrainement, le personnel qualifié de l’animalerie aura les compétences adéquates pour réaliser des administrations et prélèvements de sang principalement demandés par les utilisateurs de l’établissement utilisateur. Le temps d’anesthésie générale sera raccourci avec l’entrainement ce qui limitera le stress chez l’animal.

Procédures

Liste des interventions effectuées sur tous les animaux (rats et souris) à une fréquence de 1 fois toute les 2 semaines sur 3 mois maximum : - Anesthésie par injection intrapéritonéale (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine (64.5/5.4 mg/kg ; 0.15-0.2 ml/100 g de poids vif). - Injection en intra-musculaire et en sous-cutanée de sérum physiologique - Prélèvements de sang dans la veine mandibulaire, la veine sublinguale et la veine caudale (pose de cathéter).

Impact sur les animaux

Les animaux d’entrainement seront utilisés à plusieurs reprises (maximum 6 fois sur une durée de 3 mois) afin de limiter le nombre d’animaux, donc un stress chez l’animal peut être observé.

Devenir

Proposé à l’adoption

Remplacement

Le personnel concerné s’entraine dans un premier temps sur des animaux euthanasiés. Lorsque la technique est acquise sur animal euthanasié, il est nécessaire de travailler sur des animaux anesthésiés afin d’appréhender les éventuelles complications que l’animal vivant peut présenter au cours d’une anesthésie et d’une chirurgie (ex : arrêt respiratoire, hémorragie).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour toute la durée du projet est le nombre minimum nécessaire permettant l’entrainement de 3 personnes : nous prévoyons au maximum 30 rats et 30 souris sur les 5 ans du projet : 60 animaux au maximum sur la totalité du projet.

Raffinement

Les injections via les différentes voies décrites dans ce projet (IP, SC etIM) seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Après l’induction de l’anésthésie, le personnel s’entrainera aux injections dans les minutes qui suivent afin de limiter le stress de l’anesthésie (si l’animal se réveil, il sera replacé dans la boite en plexiglas). Les prélèvements de sang et pose de cathéter seront réalisés sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Pour la pose de cathéter en veine caudale, l’anesthésie sera maintenue sous masque à isoflurane à 2-3%. Pour le prélèvement de sang via la veine mandibulaire et la veine sublinguale, l’anesthésie sera maintenue par injection intrapéritonéal (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine. Les différentes voies d’injections et les différentes voies de prélèvement ne seront pas toutes effectuées sur le même animal. Entrainement à une seule voie de prélèvement de sang par animal. L’animal sera réutilisé que 2 semaines après avoir été manipulé et au maximum 6 fois sur une durée de 3 mois si son état général le permet afin de laisser le temps à l’animal de récupérer et d’éviter un stress trop récurrent. Tout au long de l’expérimentation, les rats/souris seront observés et les paramètres physiologiques contrôlés (température, respiration). Des points limites sont définis dans la partie procédure expérimentale afin de préserver le bien-être des animaux Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée après réception et les rats/souris sont hébergés en groupes sociaux harmonieux, dans un environnement enrichi afin de limiter les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement : tunnels en carton, sizzle pads et bûchettes de peuplier. La taille des aiguilles et des cathéters est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car cette espèce est la plus couramment utilisée dans les différentes procédures pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Adulte : 8-12 semaines, 160-300 g, ce qui permettra de travailler sur des poumons entièrement développé et fonctionnel pour la procédure 1 et sur un système cérébral stable, mature pour la procédure 2.

Deux défauts osseux sont creusés sous anesthésie dans la voûte crânienne de chaque rat pour y tester des implants en titane destinés à reconstruire le crâne. 20 rats de plus de 22 semaines vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et passent six scanners sous anesthésie en douze semaines. Le porteur présente le rat comme l'espèce animale la moins évoluée parmi celles assez grandes pour la chirurgie, puis comme "très proche de la physiopathologie humaine". Il affirme aussi, avant toute expérience, que ces implants permettent une reconstruction complète "sans complications". Tous les rats sont tués à la fin pour l'analyse histologique de l'os reconstruit.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier le potentiel de nouveaux implants en titane pour aider à la reconstruction osseuse du crâne.

Bénéfices attendus

Les implants en titane permettent une reconstruction osseuse complète du defect, sans complications. Ils limiteront également les complications de reconstruction liées aux infections post-opératoires.

Procédures

Les animaux subiront une création de défauts osseux au niveau de la voûte crânienne (sous anesthésie chimique). La durée de l'intervention est estimée à 20-25 minutes. Il y aura deux defauts osseux par rat. La reconstruction osseuse sera suivie, par imagerie tomodensitométrique, pour tous ces animaux à 2, 4, 6, 8, 10 et 12 semaines après l'opération (sous anesthésie volatile). La durée de l'imagerie est estimée à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. L'intégrité de la dure-mère sera particlulièrement surveillée lors de l'intervention. A la moindre atteinte, l'animal sera écarté de l'étude. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalués et pris en charge par l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des analyses histologiques de l'os reconstruit et de la zone environnante.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de structuration à tester et d'évaluer le risque potentiel d'inflammation post-implantation. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de reformation osseuse sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux, deux implants seront testés sur un même animal. L'expérimentation se déroulera en 2 séries d'animaux successives. La première série comprendra 3 animaux de chaques paire de configuration (i.e. Two-tier+vide; Two-tier+poli; HTE+vide; HTE+poli). Le nombre d’animaux total pourra être réduit si l’effet attendu est suffisamment important, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, après la première série. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 10 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des différentes structurations. Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test T soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les animaux seront anesthésiés par anesthésie volatile pendant les sessions d'imagerie tomodensitométrique. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluee et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. En effet, la physiologie de la reconstruction osseuse et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modele permet ainsi la realisation d’etudes precliniques de chirurgie reconstructrice avec evaluation radiologique et histologique. Rats matures, âgés de plus de 22 semaines pour exclure un effet potentiel de croissance.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Parmi eux des rats diabétiques, ils reçoivent des injections d'insuline et de glucagon provoquant des hypo- et hyperglycémies transitoires, ainsi que des prélèvements de sang répétés, avant mise à mort par exsanguination sous anesthésie. Le projet met au point une mesure non invasive de la glycémie, présentée comme un progrès face aux dispositifs actuels douloureux pour les patients. Le porteur affirme qu'un substitut de sang a déjà été testé "sans succès" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

La mesure de la glycémie au quotidien chez les patients diabétiques est réalisée par prélèvements de sang au bout du doigt, ou par pose d’un capteur sur le bras avec insertion dans le derme d’une fibre de quelques millimètres de long. Ces dispositifs, quoique indispensables pour le suivi quotidien des patients traités par insuline, sont invasifs, perforant la peau et pouvant donner lieu à des réactions inflammatoires, et pour ce qui concerne les prélèvements au bout du doigt, douloureux. Une technologie de mesure de la glycémie non invasive serait un vrai plus pour la prise en charge des patients. Pour développer un tel système, des mesures des paramètres biochimiques seront effectuées sur prélèvements de sang de rat.

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie qui concerne des millions de personnes dans le monde. La mesure de la glycémie plusieurs fois par jour est indispensable à tous les patients traités par injection d’insuline. Les technologies actuelles sont invasives, douloureuses de par leur répétitions quotidiennes (5-10 prélèvement au bout du doigt) ou bimensuel (pose de capteurs), entrainant des inflammations locales et/ou une allergie (colle du capteur).. Le développement de nouvelles technologies non invasives de mesure de la glycémie permettra de réduire la douleur et l’inflammation causée par les systèmes existants.

Procédures

3 prélèvements de sang sous anesthésie, d’une durée de quelques minutes. Injections sous cutanées d’une durée de quelques secondes. Piqures pour recueillir une goutte de sang, d’une durée de moins d’une seconde. Prélèvement intracardiaque et euthanasie par exsanguino-perfusion sous anesthésie, d’une durée de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Douleur transitoire de type piqûre d’aiguille pour les injections de glucagon ou d’insuline ou pour les mesures de glycémie (1 goutte). Douleur due au prélèvement sanguin (réalisé sous anesthésie. Hypoglycémie modérée transitoire (30-40 min) après injection d’insuline. Hyperglycémie modérée transitoire (30-40 min) après injection de glucagon .

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour récupérer un volume important de sang pour les réaliser des analyses biochimiques complètes, ainsi que pour récupérer des pièces anatomiques d’intérêt, permettant de compléter précisément le profil des animaux.peuvent être réutilisés pour une action de formation ou pour obtenir des pièces anatomiques, à l’issue de l’étude.

Remplacement

Les paramètres biochimiques mesurés ne peuvent se faire correctement sur du liquide de substitution du sang, qui ne contient pas tous les éléments du sang circulant (cellules, protéines …). Cette possibilité a déjà été testée, sans succès. Le recours à l’animal est donc nécessaire.

Réduction

Les meilleures conditions de prélèvements pour réaliser les mesures biochimiques (avec ou sans anticoagulant) seront évalués sur 3 animaux. Les autres étapes comporteront 6 animaux par lots, nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques sur les résultats. Seul un lot de 3 animaux témoins non diabétiques seront utilisés pour comparer avec les rats de la même espèce diabétiques (n=6), car il n’y a pas de raison de penser qu’ils soient différents des rats non diabétiques de l’espèce Fisher.

Raffinement

Les animaux recevront un traitement antalgique 30 minutes avant le prélèvement, puis les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale. Normalement, une hypoglycémie est rapidement résorbée par le métabolisme de l’animal, sous 40-60 min. Une surveillance sera cependant réalisée, après le prélèvement sanguin suivant l’injection d’insuline, pour le cas où l’animal présenterait une hypoglycémie sévère entrainant des symptômes de détresse (animal amorphe, frissonnant). Dans ce cas, il recevra une solution glucosée concentrée en sous cutanée. L’hyperglycémie n’entraîne pas de symptômes de détresse et est rapidement résorbée chez l’animal normal, c’est l’état général normal du rat diabétique.

Choix des espèces

Le rat est plus gros que la souris et permet de prélever plus de volume sanguin à chaque prélèvement. Des animaux adultes, ayant terminés leur croissance, seront utilisés afin de comparer avec les rats diabétiques malades à partir de 14 semaines d’âge minimum. Les rats diabétiques sont nécessaires car présentant une glycémie naturelle plus élevée. Les rats Lund MetS auront plus de 14 semaines, âge où l’hyperglycémie est installée, chez le rat diabétique. Les animaux trop jeunes ne présentent pas un taux de glycémie élevée.

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

11 520 rongeurs, 9 120 souris et 2 400 rats, vont subir chacun jusqu'à deux chirurgies de trente minutes, l'une pour induire la maladie étudiée, l'autre pour administrer une thérapie génique censée relancer la dégradation des agrégats d'α-synucléine dans les neurones. Tous sont tués à l'issue pour une étude histologique du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et passent un test locomoteur que le porteur qualifie de "non invasif et non contraignant" sans le nommer. Il affirme viser un traitement curatif, et écrit espérer "éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives". Pour justifier un effectif de 11 520 rongeurs, il cite seulement des études pilotes et un nombre de rongeurs qu'il dit "minimum mais suffisant".

Objectifs

Les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP) ou l’atrophie multisystématisée (AMS) sont caractérisées par l’agrégation d'une protéine mutée dans différents types cellulaires. Ces agrégats, toxiques pour les cellules, provoquent après accumulation des symptômes moteurs tels qu’une rigidité musculaire, une difficulté/incapacité à initier le mouvement , mais aussi des symptômes non-moteurs comme un état dépressif ou des troubles digestifs. Actuellement, ces maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de nettoyage des neurones en permettant ainsi de dégrader les agrégats protéiques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson touche plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans. Au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif (et non symptomatique) est un des grands axes de la recherche. Ce projet novateur ayant pour but de développer un traitement curatif a certains types de maladies neurodégénératives, grâce à des outils permettant de rétablir le fonctionnement des voies de dégradation de protéines agrégées de façon anormales par les neurones. Nous espérons, grâce à notre traitement rétablir l’activité de dégradation et de "nettoyage" dans les neurones et donc éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux subissent deux intervention chirurgicales au maximum, avec une durée de 30 minutes, qui correspondent à la création des modèles et le traitement. Une étude de comportement simple locomoteur, non invasif et non contraignant sera réalisée pendant ce projet, afin d'avoir un suivi de l'évolution du modèle et de l'impact du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent au maximum deux chirurgies d'une durée de 30 minutes maximum chacune, correspondant à l'induction du modèle et au traitement. Les effets indésirables sont directement liés à la chirurgie, mais sont bien encadrés par une analgésie et une anesthésie controlées et par un suivi des animaux postopératoire sur 3 jours minimum. De plus ces modèles neurodégénératifs n'entrainent pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau et ainsi de déterminer l'éfficacité du traitement.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation d’α-synucléine et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal.

Réduction

Des études pilotes ont été effectuées au préalable pour confirmer l’activation des lysosomes après injection de plasmide TFEB, et pour confirmer l’absence de toxicité chez l'animal

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs afin de détecter tout inconfort ou souffrance en observant l’aspect physique, l’état du poil, la vigueur, la nutrition, l’hydratation et le comportement social des animaux. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'asepsie pendant la période opératoire. Et les animaux reçoivent un couverture analgésique une demi-heure avant l’intervention et après l’intervention ainsi que le lendemain . Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil (0 mauvais, 1 moyen, 2 bon). Les points limites adaptés sont pour les deux espèces : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé, difficulté à récupérer le poids initial, dans les jours suivant la chirurgie. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude. Si malgré les soins concernant la chirurgie (plaie), les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, si une lésion cutanée s’étend et s’infecte, une décision d’euthanasie est prise par l'expérimentateur en accord avec le personnel zootechnique. Si un constat de stéréotypie est fait, des éléments d’enrichissement comme des roues sont proposés à l’animal. Si cela n’améliore pas son état au bout de 48h, il sera mis à mort selon la règlementation en fonction de l'espèce. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. Tests statistiques : toutes nos études sont réalisées avec un nombre d’animaux minimum mais suffisant pour pouvoir obtenir des résultats qui sont statistiquement représentatifs, et ainsi limiter la répétition des d’études.

Choix des espèces

La souris permet de travailler les modèles de type pathologies humaines, une fois ces modèles bien établis , ils sont transposables au rat, espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, cette espèce permet d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Pour toutes les cohortes, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines pour les rats et 8 semines pour les souris)