Rats
Développement d’un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système sympathique chez le rat.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
730 rats vont être utilisés, 630 opérés puis tués sans réveil et 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal subit une chirurgie pouvant durer quatre heures, avec laparotomie, pose d'un ballonnet gastrique, laminectomie puis trois heures de stimulation et d'enregistrement nerveux. L'objectif est de développer un dispositif médical contre l'obésité par stimulation du système nerveux sympathique, en vue d'un développement clinique. Le porteur affirme qu'"il n'existe aucune méthode in vitro validée" et que l'obésité impose l'étude d'un organisme vivant.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer un traitement (dispositif médical) contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux chez le rat. Il existe de nombreux arguments et données scientifiques en faveur de l’existence d’une neuromodulation du système nerveux pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés par le système nerveux semblent jouer un rôle important dans la prise alimentaire. Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. En effet, les traitements les plus efficaces sont les approches chirurgicales lourdes comme la réduction de l’estomac, la technique du court-circuit des aliments, visent à limiter le volume de l’estomac pour réduire les prises alimentaires. Cependant, ces traitements sont très invasifs et entraînent de nombreux effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical, permettant par électrostimulation du système nerveux la régulation de la prise alimentaire, pourrait être un outil très prometteur pour lutter contre l’obésité. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par l'Agence fédérale américaine des produits alimentaires et des médicaments pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds (chirurgie de l'obésité), engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires pourraient apporter des solutions plus satisfaisantes pour les patients souffrant d’obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale qui n’excèdera pas 4h afin de réaliser les stimulations/enregistrements du système nerveux. Les durées sont : - injection de l'analgésie 30 secondes, -l'anesthésie à l'isoflurane 5 minutes, chimique injection 30 secondes - laparatomie et identification des nerfs cibles 20 minutes, - pose d'un ballonnet gastrique 20 minutes - laminectomie 20 minutes - stimulation et enregistrement 3h Au préalable une mise à jeun entre 14h et 20h pourra être effectuée pour les animaux de la procédure 1. Les animaux ne seront pas réveillés et seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Les 2 procédures de ce projet décrivent des actes chirurgicaux. Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale, un certain niveau de douleur est attendu nécessitant des protocoles d’anesthésie / analgésie adaptés à l’espèce de façon à limiter au maximum la douleur. La chirurgie et les stimulations/enregistrements seront menés dans le respect de la règle des 3R.
Devenir
Les procédures comportent des chirurgies lourdes et invasives, il n’est pas envisagé de réveiller les animaux. Ils seront tous mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables grâce à l’utilisation de tests statistiques.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par le personnel de l’établissement utilisateur. A la fin de la période d’acclimatation, les animaux seront observés 2 fois par semaine minimum par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés selon la fiche annexée à ce projet. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude /ou du vétérinaire désigné. Lors des expérimentations, réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux seront sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
L’espèce rat sera utilisée en raison des données scientifiques démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Ce modèle sera par la suite transposé à l’humain. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 8 semaines)
Lipiodol et Hystérosalpingographie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 300
Lapins : 500
1 000 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures couvrant tous les niveaux de souffrance, du plus léger au plus sévère, la plupart tués à l'issue et 120 réutilisés dans d'autres procédures. Ils subissent des accouplements, une synchronisation hormonale, des frottis vaginaux répétés, l'administration intra-utérine d'un produit de contraste par voie basse ou chirurgicale et une induction d'endométriose. L'objectif est de comprendre comment le Lipiodol, un produit de contraste iodé, améliore la fertilité féminine. Le porteur affirme que ce mécanisme ne peut s'étudier in vitro et conclut à une "nécessité" du recours à l'animal.
Objectifs
L'hystérosalpingographie est un examen radiographique (aux rayons X) de l’utérus et des trompes utérines généralement indiqué dans les bilans de d’infertilité féminine afin de vérifier la perméabilité des trompes de Fallope et la normalité de la cavité utérine. Elle consiste en une instillation de produit de contraste iodé (radio opaque) dans l’utérus et les trompes via une canule accolée au col de l'utérus. L'absence de passage du produit de contraste depuis les trompes de Fallope dans la cavité péritonéale signe une obstruction tubaire. Cette obstruction tubaire rend compte d’une infertilité féminine dans environ 35% des cas. Des travaux cliniques ont montré que l’hystérosalpingographie, quand elle est réalisée au moyen de l’injection d’une huile iodée, le Lipiodol, se traduit par une augmentation de la fertilité par rapport à la même technique réalisée au moyen de produits de contraste iodés hydrosolubles. Le mécanisme de cet effet n’est pas connu. Il existe quelques hypothèses dans la littérature. L’objet de ce projet est l’élucidation de ce mécanisme et des éventuelles conséquences endocrinologues (thyroïdiennes notamment) de l'administration d'un produit iodé ou huileux.
Bénéfices attendus
Les différentes études de ce projet seront réalisées dans le but de comprendre le rôle du Lipiodol dans l’amélioration de la fertilité et son mode d’action. Plusieurs hypothèses seront isolées et testées afin de connaître précisément le mécanisme du Lipiodol. Si un mécanisme est identifié, des essais cliniques pourront être lancés afin de confirmer l’effet en clinique. L’utilisation du Lipiodol pourra alors être revue et adaptée au mieux, pour les patientes chez lesquelles un effet pourrait être observé. En effet selon le mécanisme, il est possible que la totalité des causes d’infertilité féminines ne soit compatible avec une amélioration de la fertilité par l’administration du Lipiodol. Les patientes présentant un trouble de la fertilité pourraient donc par la suite bénéficier d’une meilleure prise en charge aboutissant à une augmentation des taux de grossesses, et évitant le recours aux procédures les plus invasives (fécondation in vitro ou autre).
Procédures
Imagerie RX, IRM ou échographie (15 minutes environ), accouplement, synchronisation du cycle œstral par supplémentation hormonale (une injection en vigile), frottis vaginal (2 minutes, en vigile): pourra être répété au cours de l’étude, avec un temps de récupération adapté entre chaque procédure. Administration intra-utérine d’un produit de contraste par voies basses ou chirurgie : une fois (1 heure au plus) puis suivi de quelques semaines par imagerie (15 minutes environ), sauf en cas de mise au point ou d’intérêt scientifique de répéter l’administration Induction d’endométriose : une chirurgie (1 heure environ), puis suivi clinique de quelques semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie RX, IRM ou échographie, d’accouplement, de synchronisation ou d’identification par frottis vaginal du cycle oestral sont légères. Les nuisances attendues sur les animaux suite à ces procédures sont un potentiel inconfort au réveil dû à la durée de l’anesthésie ou lors de l’injection pour les procédures le nécessitant, ou du stress lors des contentions. La mise sous lampe chauffante ou sur tapis chauffant pendant les procédures d’anesthésie sera mis en place afin de maintenir la température corporelle, ainsi qu’au réveil. La procédure d’administration d’un produit par instillation intra-utérine, peut induire un inconfort gynécologique de l’animal, une irritation ou inflammation locale suite à l’insertion des cathéters, à la dilatation des trompes par l’injection du produit, ou à son écoulement. La procédure d’administration intra-utérine d'un produit par une procédure chirurgicale, et la procédure d’induction d’un modèle d’endométriose impliquent une chirurgie sous conditions stériles suivie d’une suture. Malgré la prise en charge analgésique post-opératoire, une démangeaison et/ou une douleur peuvent se manifester au niveau de la suture à cause de la tension des tissus et la cicatrisation. Une moindre activité et prise de nourriture peuvent être observées pendant quelques jours, suite à la chirurgie et l’anesthésie. Une collerette pourra être placée sur l’animal s’il touche trop leur plaie, et une hydratation pourra être envisagée au cas par cas si besoin. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une prise en charge adaptée à chaque observation sera mise en place.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie. A l’issue d’une étude (succession de plusieurs procédures), une mise à mort peut être réalisée sous anesthésie profonde à des fins d’analyse histologique ou de dosage, afin par exemple de caractériser la biodistribution et le mode d’action des produits testés.
Remplacement
La fertilité est le résultat de multiple processus complexes et interconnectés. Le mécanisme d’action du Lipiodol sur la fertilité est inconnu. L’étude de son effet est alors difficilement réalisable sur des modèles simplifiés in vitro. De plus, le Lipiodol n'est pas soluble dans les milieux de culture. Il semble donc nécessaire d'effectuer des études in vivo plus proche de la pratique clinique afin de mieux comprendre les effets induits par la présence de Lipiodol. Le recours au modèle animal apparaît donc comme une nécessité, au moins pour une partie des études. L’une des hypothèses mécanistiques de l’effet pro-fertilisant du Lipiodol est l’effet mécanique, par un meilleur débouchage des trompes, un effet viscosité du produit ou autre. Afin de remplacer le recours à des animaux, l’étude de cette hypothèse sera faite uniquement in vitro. Des études de cultures cellulaires in vitro pourront aussi être effectuées en complément afin d'étudier par exemple plus en détails la réponse immunologique sur un certain type cellulaire.
Réduction
Analyse bibliographique préclinique en amont pour ne pas refaire ce qui a déjà été fait, identifier les pistes à suivre, les erreurs à éviter, et faciliter les phases de mise au point. Macro-analyse de la littérature clinique pour en tirer les produits et donc paramètres qui semblent corréler avec les résultats de fertilité (guide vers une hypothèse mécanistique plutôt qu’une autre), et les pathologies répondant le mieux à l’amélioration de la fertilité après HSG (modèle le plus adapté). Recherche et contact d’équipes à contacter spécialistes dans les différents domaines (HSG clinique et préclinique, endométriose, fertilité et PMA) pour nous guider dans nos recherches (aide technique, pertinence des études, modèles, paramètres à suivre). Réutilisation des animaux pour les mises au point : - Lorsque cela est possible, premiers essais sur animaux post-mortem ou sans réveil d’animaux qui doivent être euthanasiés dans d’autres projets - Lors des étapes suivantes de mise au point, avec réveil, réutilisation d’un animal plusieurs fois si pertinent (échec précédent, non interférence avec les paramètres évalués) et procédure légère ou modérée - Un délai de 14 jours sera respecté avant réutilisation afin de permettre à l’animal de récupérer pour les HSG Lapins. Pour les souris, l’essai du passage du col et éventuellement l’injection vigile intra-utérine et contrôle par imagerie pourra être réalisé jusqu’à 3 fois par semaine, suivi d’un repos de 7 jours si une réutilisation pour le même usage est envisagée. Pour le protocole de synchronisation oestral des souris, un délai de 2 semaines sera respecté entre 2 administrations hormonales. Réutilisation des animaux au sein des études : - un échec de procédure légère ou modérée (par exemple échec d’administration intra-utérine d’un produit par voie naturelle) mènera à la réutilisation de l’animal pour un second essai, après temps de récupération nécessaire, à condition que les points limites ne soient pas atteints et si le protocole d’étude le permet. - suivi longitudinal de la distribution du produit en imagerie sur un même animal plutôt que par dosage sur prélèvement, pour réduire le nombre d’animaux en étude. - Les animaux dont l’euthanasie n’est pas nécessaire pour la finalité de l’étude pourront être réutilisés pour des mises au point de techniques/modèles, dans un autre projet, pour la formation, le prélèvement de matrices pour mises au point de techniques d'analyses.
Raffinement
Surveillance et relevé quotidien de l’état clinique, pesée régulière et scoring adapté à chaque protocole afin de quantifier l’état clinique, envisager un traitement et déterminer un score « point limite ». Enrichissement des cages d’hébergement : • Balle et bâtons en bois à ronger (lapins) • Bâtons à ronger, tubes en plexiglass pour l’abri, frisures de papier kraft pour le nid (rongeurs en groupes sociaux). Système de maintien de la température et monitoring de paramètres physiologiques lors des anesthésies. Anesthésie et analgésie : •Chez la Souris, l’administration intrautérine sera idéalement vigile en simple contention, comme cela est fait dans le cadre de l’insémination artificielle. La mise au point sera réalisée en premier lieu sous anesthésie gazeuse. Une habituation des animaux à la contention sera réalisée avant le début de la procédure afin de réduire le stress. •Chez la Ratte, si l’administration par voies naturelles est possible, elle se fera sous anesthésie gazeuse. •Dans les deux cas, si des signes de gêne ou de douleur apparaissent, une administration d’antispasmodique ou d'analgésique sera mise en place en curatif et/ou en préventif selon la fréquence d’observation de ces symptômes et la durée d’action de ces médicaments. •Chez la Lapine, la procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse de préférence, après administration d’un mélange d'un analgésique, d'un myorelaxant et sédatif, et d'un tranquillisant et sédatif. Une fois endormie, un antispasmodique sera administré afin de faciliter l’accès aux trompes en réduisant les spasmes tubaires. L’ensemble de cette médication devrait assurer le bon déroulement de la procédure et limiter les lésions éventuelles du tissu. Pour l’administration du produit par voie chirurgicale, ou chirurgie en vue de l’induction d’un modèle d’endométriose, une analgésie sera réalisée en pré-opératoire ainsi qu’en post-opératoire. Une nouvelle administration sera effectuée ultérieurement en cas de signe de souffrance les jours qui suivent. Mise en place d’une alimentation adaptée post chirurgie : •chez la Lapine, gel hydratant, quartiers de pommes, foin •chez le Rongeur, pellets placés dans la sciure plutôt qu’en hauteur, gels hydratants, friandises.
Choix des espèces
Notre espèce de choix est le Rat car c’est l’animal qui est classiquement utilisé dans les études de fertilité (réglementaires). De plus, des études de biodistribution et de toxicité à visée réglementaire seront effectuées sur cette espèce. Cela nous permettra de comparer certains résultats et d’être complémentaire à ces travaux destinés aux Autorités de Santé. Si la mise au point du modèle n’est techniquement pas possible chez le Rat, nous pourrons effectuer des études chez la Souris ou le Lapin, comme cela a aussi pu être fait dans la littérature. Ce sont également des espèces utilisées dans le domaine de l’étude de la reproduction. Les animaux seront des jeunes adultes, idéalement sexuellement matures. Pour les rats : 8-16 semaines. Pour les souris : 7-14 semaines. Pour les lapins : 3-8 mois. Pour la génération F1 : de la naissance jusqu’au sevrage.
Etude de pharmacocinétique : prélèvements répétés de sang chez le rat lors d’une infusion intraveineuse d’un candidat médicament
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation de cathéter vasculaire, des infusions intraveineuses et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur 24 heures, parfois par ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour établir le profil pharmacocinétique de candidats médicaments. Le porteur agit comme prestataire de services et réalise ces études pour des clients de l'industrie pharmaceutique. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes in vitro et la modélisation restent limitées et que l'évaluation in vivo demeure "incontournable".
Objectifs
Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme (c’est-à-dire comment l’organisme procède à sa transformation) et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration sous forme d’infusion intraveineuse, voie d’administration rencontrée lors de protocoles expérimentaux aigues réalisés au cours de procédures chirurgicales. Ainsi, ces études pharmacocinétiques permettront de mieux définir les doses à utiliser dans d’autres projets.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations par voie intra-péritonéale et sous-cutanée. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via la veine de la queue, soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire. Certains prélèvements pourront être réalisés en terminal par ponction intracardiaque sur animal anesthésié. Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24h avec un maximum de 8 prélèvements sur cette période, mais ils pourront également être étalés sur 72h. Les animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires suivies d’une infusion des composés à tester. La durée de la chirurgie est d’environ 10-15 minutes. Les durées d’infusions n’excèderont pas 2 heures (1 heure si réveil de l’animal).
Impact sur les animaux
L’administration des anesthésiques et analgésiques nécessitera que les animaux soient maintenus en contention et les injections impliqueront l’introduction d’une aiguille. Afin d’effectuer l’infusion intraveineuse des composés, un cathéter sera implanté dans une veine au cours d’une chirurgie réalisée sous anesthésie générale. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 24h. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure 1.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Aucune analyse statistique sera réalisée dans ce projet.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent, formé et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie appropriée. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie nécessaire pour l’implantation du cathéter sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire.
Choix des espèces
Le développement préclinique de nouveaux composés fait usage de nombreux modèles animaux de pathologies. Les études pharmacocinétiques permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant (absorption, distribution métabolisme et élimination). Ainsi, en vue de réalisation d’études précliniques d’efficacité chez les rongeurs, les connaissances des données pharmacocinétiques pour un nouveau composé représentent des informations clé au regard de sa biodisponibilité selon la dose administrée, la voie d’administration utilisées, l’impact de l‘anesthésie, l’espèce d’intérêt, …. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont des rats de tous âges, mâles ou femelles, soit environ 150 à 600g L’âge, la souche et le sexe des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester.
Role de la dérégulation de la voie BMP dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de monocrotaline pour induire une hypertension pulmonaire, puis des traitements par injections, avec deux anesthésies pour échographie cardiaque et cathétérisme, avant d'être tué pour prélever poumons et cœur. Le porteur qualifie de bénins les effets attendus car la maladie est étudiée à un stade précoce, et applique une crème anesthésiante aux points d'injection. Sur le remplacement, il indique disposer de résultats sur cellules humaines mais vouloir les valider dans trois modèles animaux d'hypertension pulmonaire.
Objectifs
L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme).
Impact sur les animaux
La procédure appliquée à ce projet nécessite d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Pour limiter ces nuisances, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie transthoracique, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie transthoracique et cathétérisme. Nous veillerons donc au bon réveil de l'animal et évaluerons son bien-être et prendrons, si nécessaire, les mesures développées dans la description de la procédure. La première injection de la procédure est réalisée avec la monocrotaline, une molécule naturelle extraite de la plante Crotalaria. Cette molécule est connue pour induire une hypertension pulmonaire modérée chez le rat. Les effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce. Nous avons également des données qui valident la non toxicité cellulaires de nos molécules pour les différents traitements du projet. D’ailleurs, une étude publiée récemment a démontré l’innocuité et l’efficacité de ce type de molécules pour lutter contre le métabolisme du glucose et des lipides dans le cadre de modèles animaux axés sur l’étude de l’obésité.
Devenir
Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche pour des analyses histologiques et moléculaires.
Raffinement
Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.
Évaluation de molécules à visée thérapeutique dans des modèles murins de neuropathie périphérique induite par une atteinte du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 612
1 224 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une ligature, un écrasement ou une compression du nerf sciatique pour provoquer une douleur neuropathique, évaluée ensuite par la réponse à des stimuli mécaniques ou thermiques. Le porteur indique qu'aucun antidouleur n'est envisageable puisqu'il s'agit d'un modèle de douleur, et qu'un animal en douleur très importante sera tué immédiatement. Sur le remplacement, il juge le modèle animal "incontournable" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne prend en compte l'"organisme entier".
Objectifs
Les neuropathies périphériques sont des atteintes du système nerveux somatosensoriel dont les causes sont nombreuses. Les douleurs neuropathiques périphériques sont la conséquence d’une lésion du système nerveux périphérique et peuvent concerner un plexus (arrachement du plexus brachial), une racine (sciatique) ou une atteinte tronculaire (atteinte du médian, du péronier ou atteinte plus diffuse des nerfs périphériques). Elles sont caractérisées par des paresthésies (fourmillements, jambes sans repos), des engourdissements, des douleurs diffuses musculaires et névralgiques (déchirures, broiement), des sensations de brûlures causées par une hyperalgésie thermique (hyper-réactivité à des variations de température), souvent concomitante à une hypersensibilité aux stimuli mécaniques; ces douleurs sont ressenties aux extrémités des membres et sont extrêmement invalidantes. Des phénomènes de douleurs neuropathiques sont observées aujourd’hui chez 8 % de la population générale et constituent de ce fait un enjeu clinique important. Cependant, les traitements thérapeutiques actuels pour diminuer la douleur chez ces personnes sont insuffisants et peu efficaces sur la durée, du fait également des effets indésirables qu’ils génèrent. Il est donc nécessaire d’identifier de nouvelles thérapies pour prévenir et/ou traiter la neuropathie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché une molécule permettant aux patients atteints de cette pathologie de réduire voire effacer l'inconfort associées à cette pathologie, ainsi que de retrouver une sensibilité aux niveaux des membres atteints.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie, ainsi qu'une chirurgie (ligature, écrasement ou compression du nerf sciatique). Cette chirurgie aura lieu une seule fois dans la vie de l'animal et durera environ 20minutes. La sensibilité et/ou la douleur sera évaluée suite à cette chirurgie soit par évaluation du temps de réponse à un stimuli mécanique et/ou thermique selon la thématique.
Impact sur les animaux
Les chirurgies effectuées pour induire les douleurs peuvent générer des douleurs chez l'animal en post-opératoire. L'utilisation d'anti-douleur n'est pas evisageable dans ce cas particulier puisqu'il s'agit de modèle de douleur. L'environnement sera fortement enrichit pour augmenter le confort de l'animal, sa surveillance sera quotidienne. Si une observation clinique permettait de révèlait une douleur très importante chez l'animal alors ce dernier sera mis à mort immédiatement.
Devenir
3 lots de 40 animaux issus des procédures 1, 2 et 3 seront inclus dans les procédures 4 et 5 pour imagerie puis seront mis à mort . Tous les autres animaux des autres procédures seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux de neuropathies périphériques est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement lors de certaines maladies chroniques ou traitements thérapeutiques lourds. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergés selon la directive 2010/63 avec un milieu enrichi (coton, igloos...). Des points limites ont également été définis et seront appliqués si l'état clinique des animaux le nécessite.
Choix des espèces
La souris et le rat se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la douleur et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. De jeunes adultes (6-10 semaines) seront utilisés dans ce projet, il s’agit de jeunes animaux qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études
Induction d’une anosmie à long terme chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de méthimazole pour détruire sa muqueuse olfactive et le rendre anosmique, puis passe un test de discrimination de deux odeurs sous restriction alimentaire, avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique que la perte d'odorat peut perturber la prise alimentaire et le poids, suivis quotidiennement. L'objectif affiché est de valider ce modèle d'anosmie pour tester ensuite des implants olfactifs.
Objectifs
L'anosmie, ou perte complète de l’odorat, est une maladie qui affecte gravement la qualité de vie, étant donné l’importance de ce sens pour la prise alimentaire et les interactions sociales. L'anosmie est également liée à un risque accru de dépression et de décès, et peut handicaper les individus face aux dangers (nourriture avariée, fuite de gaz…). On estime que 5% de la population générale est anosmique. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté le nombre de personnes touchées par la perte d'odorat et a sensibilisé le grand public à ce sujet. Toutefois, il n'existe actuellement aucun traitement pour l'anosmie de longue durée, en dehors de l'entraînement olfactif, dont le bénéfice est significatif (surtout pour les anosmies causées par une infection virale) mais limité. L'implant olfactif représente une approche prometteuse pour traiter l'anosmie, toutefois il est nécessaire d'évaluer un tel dispositif sur des modèles animaux in vivo. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des implants olfactifs qui seraient adaptables chez l'homme. L'anosmie sera induite pharmacologiquement par injection de méthimazole, composé connu pour produire une altération de la muqueuse olfactive. Nous avons choisi le rat, qui a un système olfactif dont l’organisation est proche de celle de l’Humain et qui permettra de tester l'efficacité d'un implant olfactif.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider un modèle d'anosmie induite chez le rat. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des dispositifs de récupération olfactive.
Procédures
Les rats recevront une injection intra-peritoneale en début de protocole (1 injection/animal) qui doit altérer la muqueuse olfactive et diminuer significativement leur odorat. Afin de tester l'efficacité de cette méthode, les rats seront soumis à un test olfactif dans lequel ils doivent discriminer 2 odeurs. Pour cela, ils sont soumis à un test olfactif dans une cage dédiée à laquelle ils seront habitués au préalable. Deux odeurs sont présentées l'une récompensée par une boulette de sucre, l'autre non récompensée. Quand le rat sait quelle odeur prédit une récompense (son comportement l'indique) alors on considère qu'il discrimine bien les deux odeurs. Pour que le rat soit motivé à aller chercher sa récompense, on réduit sa nourriture. Cette réduction peut conduire à une perte de poids que l'on contrôle. La restriction dure environ 10 jours , le test olfactif 5 à 10 jours environ.
Impact sur les animaux
Le composé injecté peut présenter une toxicité qui devra être évaluée pré et post-mortem. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement.
Devenir
Analyse des tissus après euthanasie après 3 jours de traitement afin de voir si l'injection a bien conduit à une altération de la muqueuse olfactive: 12 rats traités / 12 rats véhicule maximum Analyse comportementale puis analyse histologique après euthanasie après 30 jours de traitement pour évaluer la durabilité du traitement: 16 rats traités / 16 rats véhicule maximum
Remplacement
Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le comportement de l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux. Pour une première approche histologique (3 jours), l'analyse est qualitative et un nombre d'animaux réduit sera utilisé. Cette procédure nous permettra de tester avec un nombre réduit d'animaux les éventuels effets indésirables et l'efficacité de notre traitement avant de décider si nous pouvons réaliser notre projet. Pour les test olfactifs, des tests statistiques montrent qu'une différence en fonction du traitement peut être observée avec un nombre d'animaux de 6 traités versus 6 controles. Nous prévoyons 2 groupes.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Le bien-être animal est pour nous primordial vis-à-vis de l’animal mais aussi de nos expérimentations. Le stress modifie les capacités olfactives des animaux, ainsi les résultats de comportement ne peuvent être valable que si l’animal est bien portant. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement. Les tests olfactifs seront réalisés en condition de restriction alimentaire en s'assurant au préalable que l'état des animaux le permet. L’eau est disponible à volonté. Des points limites spécifique d’évaluation de la douleur à chaque procédure sera mise en place. Nous proposerons un autre type de nourriture si nous notons une dénutrition (gel nutritif ou nourriture enrichie en graisse et en sucre). Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% malgré un régime adapté il est sera euthanasié s'il n'y a pas d'amélioration de son état. Une quantité de nourriture, mesurée par rapport au poids de l'animal, est donnée chaque jour aux animaux à heure fixe. Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% il est remis sur un régime à volonté et le test est arrêté jusqu'à récupération. S’il y a l’apparition d’un mal être sévère (poil hérissé, catatonie, trouble du comportement...) et/ou une perte de poids de l’animal supérieure à 15% sans reprise malgré des soins particuliers (surveillance, nourriture en gel, réchauffement le cas échéant) au bout de 3-4 jours, l’animal sera euthanasié. Si une douleur est visible, elle sera soulagée par un analgésique, si la douleur persiste plus de 2 jours, l'animal sera euthanasié. Les cages sont agrémentées d’un nid végétal et d'objets pour le confort de l'animal.
Choix des espèces
Les rats ont de très bonnes capacités olfactives, ils peuvent apprendre facilement les odeurs. Le système olfactif est très conservé avec l'évolution, et les rats ont un système olfactif très similaire à celui de l'homme et sont de bons modèles pour tester l'implant olfactif sur lequel nous allons travailler. Les animaux sont utilisés à l'age adulte pour ne pas intérférer avec le développement.
Identification et caractérisation de biomarqueurs en imagerie dans les modèles rongeurs de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit dans le cerveau des injections de toxines qui détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, certains recevant en plus une canule intracérébrale, puis subit des tests comportementaux incluant une restriction alimentaire et un choc électrique de 0,7 mA. Le porteur indique que les lésions provoquent un déficit moteur ou cognitif et une perte de poids chez les animaux les plus atteints, et que tous seront tués après les évaluations d'imagerie. L'objectif est d'identifier des marqueurs en IRM, les retombées cliniques restant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et sont des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en pratique clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie (Caractérisation comportementale). Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques (Administration intra-cérébrale ou périphérique). Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes). Certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois)
Impact sur les animaux
Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.
Raffinement
Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises (Raffinement).
Choix des espèces
Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique dans un modèle de protéinurie de surcharge protéique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 250
750 rongeurs, 500 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit l'ablation d'un rein sous anesthésie puis des injections quotidiennes de protéine pendant quinze jours pour provoquer une atteinte rénale, avant de recevoir des molécules fournies par des clients pour tester des candidats médicaments contre le lupus. Le porteur indique ne connaître ni la nature ni les effets secondaires de ces molécules et précise qu'aucun analgésique ne peut être administré pour ne pas fausser les mesures inflammatoires. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune thérapie efficace n'existe et conclut qu'un modèle animal est "nécessaire".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle de protéinurie de surcharge protéique chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de lupus érythémateux disséminé.
Procédures
Tous les animaux vont subir une néphrectomie sous anesthésie générale (environ 20 – 30 min de chirurgie) et récupérer ensuite pendant 1 semaine avant toute nouvelle procédure. L’induction de la néphropathie se fait par des injections i.p. quotidiennes pendant 15 jours de BSA (environ 1 min par animal par jour). Concernant les traitements avec les molécules à tester, cela est dépendant de notre sponsor que ce soit la voie d’administration et le nombre de jour de traitement. Quel que soit la voie d’administration, les animaux seront dérangés pendant 1 à 2 min par jour pour l’administration du composé et seront remis immédiatement dans leur cage d’hébergement. Selon les demandes des clients, des prélèvements sanguins sur animal vigil pourront être réalisés (via la veine de la queue, environ 5 min pour réaliser le geste technique) ou sur animal anesthésié (en rétro-orbital ou à la veine abdominale pour un prélèvement terminal). Les procédures de cages à métabolisme et de la filtration glomérulaire sont des procédures non invasives pour l’animal. Concernant les cages à métabolisme, les animaux seront placés individuellement pendant 24H dans ces cages et seront remis ensuite avec leurs congénères. Pour la mesure de la filtration glomérulaire, les animaux sont légèrement anesthésiés (5 minutes) pour scotcher le capteur d’enregistrement et sont ensuite placés dans une cage individuelle pendant 2H30 pour l’enregistrement. Ils sont ensuite remis dans leur cage d’hébergement avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront soit gardés en vie pour suivre une autre procédure, soit euthanasiés.
Remplacement
A l’heure actuelle, seule la thérapie de remplacement d’organe (dialyse ou transplantation) permet de traiter les dommages glomérulaires et la fibrose. Aucune thérapie efficace n’existe pour prévenir ou traiter ces lésions. Cela rend donc nécessaire l’utilisation d’un modèle animal afin de mimer au mieux la situation clinique chez l’homme et de trouver des candidats médicaments efficaces pour le traitement des néphropathies.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Dans ce projet, 2 procédures sont non invasives pour l’animal (cages métaboliques et mesure de la filtration glomérulaire ; procédures 4 et 5 respectivement). De plus, pour les cages à métabolismes (procédure 4), avant toute expérimentation, les animaux sont habitués aux cages pendant 2 h minimum, réduisant ainsi le stress de l’animal pour les expérimentations. De plus, afin de limiter le stress, les animaux sont anesthésiés pour les fixations de l’enregistreur pour la mesure de la filtration glomérulaire.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Aucun analgésique ne peut être utilisé dans cette procédure pour ne pas interférer avec l’effet des molécules à tester sur les paramètres inflammatoires.
Choix des espèces
Le modèle de néphropathie par induction d’une protéinurie de surcharge protéique suite à l’administration de BSA chez la souris et chez le rat est décrit comme un modèle expérimental pour évaluer l’effet de molécules sur la glomérulonéphrite. Les animaux vont présenter une inflammation et une fibrose rénale comparables à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront soit des souris au moins âgées de 8 semaines soit des rats pesant entre 150 et 250g (6 semaines environ). Les souches des rats et des souris dépendront des demandes client mais classiquement nous utiliserons des rats Sprague-Dawley et des souris C57BL6.
Evaluation de médicaments bloquant spécifiquement un récepteur des messagers chimiques activant les neurones en tant qu’antiépileptique au cours du développement chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 ratons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de 10 à 15 jours, ils reçoivent par chirurgie une électrode sur le crâne, puis une injection déclenche des crises épileptiques avec convulsions tonico-cloniques ou des spasmes, pour tester trois médicaments contre l'épilepsie du nourrisson. Le porteur affirme que la perte de conscience pendant les crises limite la souffrance et que les spasmes ne seraient pas douloureux, chaque raton étant tué après l'enregistrement pour des prélèvements. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni numérique ne reproduit le tissu cérébral en développement.
Objectifs
Le terme épilepsie recouvre un groupe de pathologies neurologiques se caractérisant par des crises épileptiques (convulsions et perte de conscience principalement) spontanées et récurrentes. Elles sont dues à une activité électrique anormale du cerveau. On estime à environ 70 millions le nombre de patients atteints dans le monde. Il s’agit aussi de l’atteinte neurologique chronique la plus fréquente chez le nourrisson et l’enfant. On estime que plus de la moitié des formes d’épilepsies infantiles sont résistantes aux traitements médicamenteux. Enfin, plus de 50% des enfants ayant déclaré une épilepsie avant l’âge de 1 an présenteront des troubles de la mémoire ou de l'apprentissage, responsable de déficiences intellectuelles perceptibles à l’âge adulte et ce même si l’épilepsie est traitée par des médicaments. Le développement de nouvelles voies de traitement adaptées aux nourrissons est donc nécessaire. Au cours de la première année de vie, le cerveau est plus à risque de générer des crises d’épilepsies. En effet, la communication entre les cellules nerveuses est très active et peu contrôlée. Cela est dû à l’un des récepteurs aux messagers chimiques activant les neurones, dont une forme très active est très présente au début de la vie. Cette forme active de récepteur pourrait être impliquée dans le risque important d’apparition de crises d’épilepsie chez les nourrissons. En effet, elle est notamment retrouvée en grande quantité dans le cerveau de ratons après induction de crises épileptiques expérimentales. De plus, des premières études avec des médicaments ciblant ce récepteur en particulier ont montré une bonne efficacité malgré des effets secondaires, dans des modèles d’épilepsie expérimentales chez le raton. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 3 médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active de ce récepteur dans deux modèles d’épilepsies infantiles dont un modèle de spasmes qui est le syndrome le plus fréquent.
Bénéfices attendus
Il est important de noter qu'il existe actuellement très peu de médicaments anti-épileptiques utilisés chez les nourrissons, de par le faible nombre d'études visant à mettre sur le marché des médicaments pour ces derniers. De plus, les médicaments disponibles ont été mis sur le marché il y a longtemps, reflétant des exigences réglementaires anciennes. Il y a donc un besoin crucial en de nouveaux médicaments adaptés aux nourrissons. Ce projet s'inscrit dans cette dynamique et il a pour but de valider l’utilisation de médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active d’un récepteur aux messager chimiques activant les neurones, présents en grande quantité chez le nourrisson, comme traitement de l'épilepsie infantile, et notamment du syndrome de spasmes spécifiques au nourrisson.
Procédures
Des ratons âgés de 10 jours de vie et de 15 jours de vie seront utilisés dans ce projet qui comporte deux expériences, chacune en 3 parties. Chaque raton ne participera qu’à une seule des deux expériences. L'expérience 1 comportera : 1) la pose d'une électrode électroencéphalographique (EEG) par chirurgie sur le crane de l'animal anesthésié, durée de 30 à 45 minutes; 2) le traitement de l'animal vigile par un des 3 médicaments testés ou du sérum physiologique, 24h après la chirurgie, par une unique injection dans le ventre, durée d'environ 5 min; 3) l'induction d'une crise épileptique séquentielle chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule induisant des convulsions. Les manifestations de cette crise seront enregistrées pendant 1h : comportement de l’animal (contractions musculaires et convulsiosn) par vidéo et activité électrique du cerveau via l’électrode EEG. (implantée 1 jour avant). L'expérience 2 comportera les deux mêmes premières parties que l’expérience 1 (pose l'électrode EEG et traitement). La troisième partie consistera en l'induction de spasmes épileptiques chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule excitatrice des neurones. Les manifestations des spasmes seront suivies comme pour l’expérience 1 mais pendant 1h30 : comportement enregistré en vidéo et activité électrique du cerveau enregistré par l’électrode EEG.
Impact sur les animaux
Les nuisances qui peuvent apparaitre chez l’animal impliqué dans ce projet sont les mêmes pour les deux expériences. Ainsi, la pose de l'électrode EEG chez l'animal anesthésié par chirurgie pourrait provoquer l'apparition de douleurs ou d'infection cutanée en post-opératoire. Ce sont cependant deux éléments extrêmement rares. Nous utiliserons deux modèles d'épilepsie induites qui peuvent chacun être la responsable de l’apparition de stress ou de douleurs. Dans le modèle de crise épileptique séquentielle (expérience 1), l'animal expérimentera des secousses musculaires involontaires et brèves (myoclonies) puis le raidissement et la contraction de l'ensemble de ses muscles (crise tonico-clonique). Cependant ces manifestations comportementales sont associées à une perte de conscience qui limite grandement l'apparition de souffrance chez l'animal. En ce qui concerne le second modèle d'épilepsie, modèle de spasmes épileptiques, l'animal expérimentera des mouvements de replis et/ou de contractions de ses membres et des contractions des autres muscles. Ces manifestations pourraient être à l'origine d'un stress mais ne seront pas douloureuses car elles sont beaucoup moins intenses que celles du premier modèle.
Devenir
Le devenir de tous les ratons est le même qu'ils aient été utilisés dans le modèle de crises épileptiques séquentielles ou de spasmes épileptiques. A l'issu de l'enregistrement des manifestations comportementales et des signaux EEG (1h ou 1h30 selon le modèle d’épilepsie) induite dans les deux modèles d’épilepsie expérimentale, le raton est euthanasié afin de réaliser des prélèvements biologiques, nécessaire pour évaluer l'effet du traitement médicamenteux.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel de médicaments agissant sur une forme très active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses dans le cerveau. Cette forme est présente de façon abondante au début du développement et diminue par la suite. Il est donc nécessaire d'évaluer l'effet des médicaments à deux âges différents chez l'animal (10 et 15 jours de vie), correspondant à une expression différente de ce récepteur. De plus, l'évaluation de l'effet des médicaments doit se faire avec des paramètres qui sont le plus proche de ceux utilisés lors du traitement des malades. Il faut donc évaluer l'effet sur les manifestations comportementales classiques des crises épileptiques séquentielles et des spasmes épileptiques ainsi que sur le tissu cérébral après l'induction de ces deux types d'épilepsies. Or, il n'existe pas à leur heure actuelle de modèle reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui modélisent de façon complète et fiable le tissu cérébral en développement, ni qui permettrait d'obtenir le type de données évoquées ci-avant. Cela justifie donc l'approche d'expérimentation animale que nous proposons.
Réduction
Le principe de réduction a été pris en compte pour définir le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet. Ainsi, nous avons prévu de réaliser nos deux expériences avec dans un premier temps des groupes de 7 ratons par âge (un groupe de ratons âgés de 10 jour et un autre âgés de 15 jours) et par traitement (1 groupe par médicament évalué et 1 groupe avec du sérum physiologique comme contrôle) pour un total de 8 groupes, soit 56 ratons pour chaque modèle d'épilepsie donc 112 ratons au total. Une fois les données obtenues pour l'ensemble de ces animaux, nous évaluerons l'efficacité de chaque médicament au moyen de tests statistiques. Si les résultats semblent concluants ou qu'ils pourraient le devenir en augmentant le nombre d'animaux étudiés, nous réaliserons une seconde série d'expériences avec de nouveaux des groupes de 7 ratons. L'évaluation statistique intermédiaire se fera pour chaque traitement de façon indépendante afin de poursuivre les expériences que pour les médicaments prometteurs et ainsi réduire au mieux le nombre d'animaux impliqués dans ce projet de recherche. Ainsi, le nombre maximum d’animaux pouvant être impliqué dans le projet sera de 224 ratons.
Raffinement
Le bien-être de l'animal et son maintien ont été pris en compte lors de la conception de ce projet. Ainsi, nous suivons l'animal tout au long de sa vie et de son inclusion dans notre projet de recherche au moyen d'une grille de scores permettant de quantifier l’apparition de stress, inconfort ou douleur. Ce suivi permet de mettre en place, si besoin, une prise en charge de la douleur par exemple si elle apparait après à la pose de l'électrode EEG par chirurgie. De plus, nous avons prévu d'utiliser tous les ratons d'une même portée ce qui permet de conserver des conditions d'hébergement "naturel" et de ne pas induire de stress. Ainsi une mère et ses petits sont hébergés dans une cage contenant litière, eau et croquette à disposition. Du papier est mis à disposition de la mère afin qu'elle bâtisse un nid ainsi qu'un tunnel en plastique pouvant aussi lui servir de nid. Ce tunnel est fait d'un plastique transparent rouge que l'animal considère opaque mais qui permet son observation et le suivi des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de crise épileptique séquentielle et celui des spasmes épileptiques infantiles sont deux modèles reconnus dans la littérature scientifique, couramment utilisé dans les études précliniques évaluant des médicaments contre l'épilepsie. Ces deux modèles sont décrits dans la littérature scientifique chez le rat, rongeur plus grand que la souris donc plus facile à manipuler et plus résistant aux effets néfastes des modèles. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui permettraient d’évaluer de façon fidèle l’effet de molécules bloquant spécifiquement la forme active d’un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses et ce à différents moments du développement cérébral. Ainsi, le rat est l’animal le plus pertinent dans ce projet expérimental. L’objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le potentiel de médicaments ciblant la forme la plus active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses comme anti-épileptique pour le nourrisson. Pour cela, il faut évaluer l'effet de ces médicaments au cours du développement du cerveau puisque l'expression de la forme active du récepteur diminue avec celui-ci. Nous allons donc utiliser des ratons âgés de 10 jours et des ratons âgés de 15 jours qui présentent une forte et une faible expression respectivement de la forme active du récepteur que nous ciblons avec les médicaments. De plus, les deux âges étudiés correspondent à deux étapes du développement du cerveau chez l'Homme, à savoir le nourrisson et le bébé d'environ 1 an, ce qui nous permettra de comparer l'efficacité des médicaments au cours du développement.
Formation du personnel sur des procédures expérimentales non-invasives et invasives appliquées sur les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 500
5 000 rongeurs, 4 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner le personnel d'un prestataire de recherche préclinique à des gestes techniques, chaque animal recevant jusqu'à quinze administrations par injection ou gavage et cinq prélèvements sanguins avant d'être tué. Le porteur présente le projet comme un moyen de réduire à terme la souffrance des animaux en fiabilisant les gestes, et indique employer en priorité des animaux surnuméraires. Sur le remplacement, il affirme utiliser d'abord une formation théorique et des supports non vivants pour limiter le recours aux animaux vivants.
Objectifs
La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi les connaissances théorique et pratique des méthodes expérimentales sur le modèle animal. Ce projet de formation vise à réutiliser les animaux surnuméraires non-utilisés ou non -randomisés dans des études dans un souci de réduction. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation s’adresse aux personnes réalisant les procédures expérimentales dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société – prestataire de services en recherche préclinique. Le vétérinaire ou son délégué assure la formation théorique en anesthésie, analgésie, euthanasie et sur le suivi clinique et notamment sur la reconnaissance des signes de souffrance. Les responsables formation qui ont la délégation du responsable de l’établissement assurent la validation des compétences en anesthésie, analgésie et euthanasie. Chaque technicien de recherche suivra un programme de formation, dont une partie nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Dans le cadre de ce programme, chaque technicien doit prendre connaissance et maitriser les techniques d’administration des produits, les techniques de prélèvement sur rongeurs (souris et rats) et les techniques d’imagerie. La formation de chaque technicien sera encadrée par le personnel formé (tuteur) avec les compétences reconnues. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La bonne maitrise des procédures expérimentales non-invasives et invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles.
Bénéfices attendus
Le tutorat pour chaque compétence et la validation du tutorat sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique, ... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale. De plus, la formation continue des techniciens nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelle procédure/technique dans le but d’un raffinement.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, des gavages et des prélèvements sanguins. Le nombre d’actions est limité : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 Administrations ou utilisations autres (tonte, imagerie, tatouages) • 5 Prélèvements Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus et en l’absence de points limites atteints. Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes en moins de 30 secondes. Les procédures non-invasives et faiblement invasives comme le gavage, les injections intrapéritonéales et sous cutanées sont réalisées sur les animaux vigiles. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur. Certaines procédures (injections intra-veineuse, intra-musculaire, intra-rectale, prélèvements de sang), nécessitent l’anesthésie gazeuse (isoflurane) pour la contention des animaux.
Impact sur les animaux
La réalisation de procédures expérimentales non maitrisées peut induire une augmentation du stress, une angoisse ou une douleur.
Devenir
A l’issue de cette procédure les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Application du principe de Remplacement : Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos permettra de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal. L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.
Réduction
Application du principe de Réduction : Pour former le personnel, nous utiliserons principalement et en priorité les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1 et les documents de référence validés par le comité éthique)
Raffinement
Application du principe de Raffinement : Pour cette formation seront utilisés exclusivement les animaux en bon état général. L’état des animaux sera régulièrement évalué, si besoin par le vétérinaire ou par la personne chargée du bien- être des animaux. Toutes les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis seront respectés. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus et une souffrance qui peut perdurer, le tuteur ou la SBEA pourra prendre la décision d’euthanasier l’animal. Les administrations seront avec du sérum physiologique parfois supplémentés par un colorant compatible avec les injections pour les validations de la bonne administration. Les prélèvements sanguins respecteront les recommandations du comité d’éthique. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, l’anesthésie sera privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence du comité d’éthique seront appliqués.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expérience précliniques. L’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences. Animaux adultes. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société
Evaluation de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
48 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ions perchlorates dans l'eau de boisson pendant huit semaines, puis une colite est provoquée par instillation intrarectale d'un mélange d'acide et d'éthanol, l'animal étant maintenu allongé quinze minutes, avant une mise à mort trois jours plus tard. Le porteur teste l'hypothèse d'un lien entre pollution aux perchlorates et maladie de Crohn, et qualifie de "très modérée" la colite obtenue. Sur le remplacement, il affirme l'absence de méthode alternative et juge "indispensables" douze rats mâles par groupe.
Objectifs
Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive du rat.
Bénéfices attendus
Nous n'avons pour le moment aucune information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse.
Procédures
Les animaux seront soumis pendant 8 semaines à des ions perchlorates administrés par le biais de l'eau de boisson ou non dans le cas des contrôles. Au bout de 8 semaines, une inflammation expérimentale du colon (colite) sera induite par administration d'un mélange d'acide et d'éthanol 50% par voie intrarectale (n=24 animaux au total). L'administration intrarectale du mélange d'acide et d'éthanol se fait très progressivement pendant environ 1 min. Les animaux doivent ensuite être maintenus allongés sur le dos, le tête orientée vers le bas, pendant 15 min supplémentaires afin de prévenir une éjection rapide du produit. Les animaux témoins "colite" (groupes Contrôles et Perchlorates) recevront 100µl en intrarectal d'un mélange sérum physiologique/éthanol. Tous les animaux seront mis à mort 3 jours après l'induction de la colite ou leurs témoins respectifs (solvant).
Impact sur les animaux
Nous n'attendons aucune nuisance particulière sur les animaux. Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 8 semaines. Le modèle de colite expérimentale à la dose utilisée est un modèle de colite très modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale.
Remplacement
Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité. impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=48; n=12/groupe expérimental, 4 groupes) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. S’agissant d’une étude exploratoire « preuve de concept », aucun résultat expérimental n’est disponible à ce jour. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure dans lequel les populations mâles et femelles seront étudiées. En conséquence, 12 animaux mâles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.
Raffinement
Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique et d'anti-inflammatoire qui auraient pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables mais ces traitements pourront être administrés avant induction de la colite si nécessaire. Nous fournissons en annexe une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose utilisée est une dose faible permettant d'induire une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat sont observés, excepté une perte de poids et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas d'un dépassement d'un score de 9, l'animal sera isolé de ses congénères et mis à mort par une injection d'euthanasiant chimique. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier. Des points limites ont été mis en place, ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années à cette espèce. Les animaux mâles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 8 semaines consécutives.
Caractérisation de la modulation astrocytaire dans un modèle de neuroinflammation chez le rat in vivo
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit un amincissement du crâne d'une heure puis deux injections dans le cerveau avec perçage bilatéral du crâne, avant des séances d'imagerie cérébrale par ultrasons ou par TEP, pour étudier le rôle des astrocytes dans une neuroinflammation provoquée. Le porteur signale comme nuisances possibles une hémorragie lors de la chirurgie et une mise à jeun de quatre heures, et indique qu'une perfusion intracardiaque tue tous les animaux en fin de procédure pour les analyses. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle in vitro ou mathématique n'est "pas pertinent" pour construire cet outil d'imagerie préclinique.
Objectifs
Les besoins thérapeutiques liées aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant des cellules autres que les neurones. Ainsi, les cellules gliales, composant 50% des cellules cérébrales de l’Homme, sont dorénavant considérées comme des acteurs à part entière dans la transmission des signaux chimiques et la régulation des neurones. Parmi les cellules gliales, les astrocytes contribuent à cette ‘gliotransmission’, représentant ainsi une nouvelle cible pharmacologique d’intérêt pour l’élaboration de nouveaux médicaments. Le projet aura pour but d’exposer le potentiel des modalités de neuroimagerie (tomographie par émission de positons (TEP), et imagerie par ultrasons à haute résolution (fUS) dans l’exploration des contributions des réseaux neurogliaux dans un modèle de neuroinflammation in vivo. D’un point de vue métabolique et moléculaire, la TEP représente une technique d’imagerie de pointe pour l’étude pharmacologique relatif au fonctionnement cérébral. Elle repose sur l’utilisation de radiotraceurs intégrés à des molécules cibles tels que le glucose et permet l’étude de la distribution ainsi que de la cinétique des molécules étudiées. L’imagerie fUS récemment développée, est basées sur l’utilisation d’ondes ultrasonores et nous permet d’évaluer et de cartographier l’activité cérébrale par la mesure des variations du volume sanguin cérébral local. L’expertise dans ces différentes méthodes d’imagerie, et leurs associations dans le cadre d’études pharmacologiques, permettent d’envisager des perspectives de recherches innovantes. Plusieurs molécules seront utilisées à la fois pour créer une inflammation cérébrale locale mais également pour moduler l’activité des astrocytes. En bref, l’objectif principal sera d’identifier et de caractériser la modulation astrocytaire dans les données d’imagerie multimodale fUS et TEP obtenues chez le rat présentant une neuroinflammation locale.
Bénéfices attendus
La gliopharmacologie (par analogie à la neuropharmacologie) est un nouvel enjeu pour les médicaments de demain, il est primordial d’avoir à disposition des approches in vivo permettant l’étude de l’activité de ces cellules. Ainsi ce projet permettra de caractériser les contributions des astrocytes dans les données de neuroimagerie dans un contexte d’inflammation cérébrale et d’élaborer des nouveaux outils permettant le développement de nouveaux médicaments, plus spécifiques présentant moins d’effets secondaires.
Procédures
Procédure 1 (Deux interventions + deux acquisions d’imagerie fUS) : 1) Amincissement du crâne (durée : 60 minutes) -Réalisé sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur les animaux impliqués dans la procédure 1 uniquement : soit 60 rats -Chaque animal subit cette chirurgie qu’une seule fois 2) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane)+ 15 min par côté nécessaire à l’injection). 3) Sessions d’imagerie fUS (durée : 80 minutes) – Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane+médétomidine) – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie deux fois. Procédure 2 (Deux interventions + une acquisition d’imagerie TEP) : 1) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure: soit 48 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane) + 15 min par côté nécessaire à l’injection. 2) Mise à jeun 4h avant l’imagerie TEP pour la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. 3) Session d’imagerie TEP (durée : 75minutes) – Réalisée dans un état éveillé pour l’injection et la captation du radiotraceur et sous anesthésie générale (isoflurane) pour l’acquistion TEP – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie une seule fois.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie fUS nécessiteront chez le rat de réaliser une fenêtre d’amincissement afin de visualiser les structures d’intérêt. De plus, les animaux subiront des injections de molécules modulatrices dans un état d’anesthésie générale. Une nuisance possible serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum). Pour les procédures d’imagerie TEP, une mise à jeun (4h avant l’acquisition) est nécessaire et constitue également une nuisance potentielle pour l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, l’ensemble des animaux subiront une perfusion intracardiaque nécessaire pour l’analyse immunohistochimique et biochimique post-mortem.
Remplacement
L’ensemble du projet et des procédures ont été choisis après une lecture minutieuse de la littérature actuelle, avec une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. S’agissant d’un projet dont l’objectif final est de construire un outil préclinique in vivo, l’utilisation d’un modèle in vitro ou d’un modèle mathématique n’est pas pertinente, ni cohérente avec l’état actuel des connaissances.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de calcul de puissance statistique compte tenu de la taille des effets observés et de la variabilité connue. Dans le cadre de l’imagerie fUS, les animaux réaliseront deux passages, ce qui permettra d’obtenir des informations importantes avec un aspect longitudinal sur un même individu, en limitant ainsi le nombre d’animaux, sans compromettre les résultats. De plus, pour l’imagerie TEP, contrairement à l’imagerie fUS, l’accumulation des interventions et des anesthésies est moins importante ; ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux par groupe dans la procédure correspondante à cette modalité.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement grâce à une grille de score et des points limites adaptés. La douleur sera réduite au maximum par l’administration d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signe de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, la mise à mort serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres.
Choix des espèces
Souvent préconisé pour l’utilisation des dispositifs d’imagerie, le rat constitue un modèle animal pour lesquelles ils existent déjà des données précliniques impliquant l’utilisation des molécules utilisées et des différentes modalités d’imagerie utilisés au sein de ce projet. De plus, la taille du cerveau du rat est plus favorable en imagerie (TEP et fUS) que d’autres modèles animaux. Rats adultes afin d’étudier les contributions astrocytaires et neuronales au sein de réseaux neurogliaux pleinement développés.