Souris
Impact de l’activation des inflammasomes dans les vascularites des petits vaisseaux dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 148 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant quatre à huit injections, huit recueils d'urine et quatre prélèvements sanguins. Le modèle induit une vascularite qui peut atteindre les reins, les poumons et la peau. Le porteur consacre un long développement à justifier la mise à mort par les analyses histologiques et l'impossibilité de garantir une récupération durable. La souris est présentée comme la seule espèce scientifiquement valide, notamment pour les lignées génétiquement modifiées requises.
Objectifs
Les vascularites des petits vaisseaux sont des maladies rares mais graves, dans lesquelles le système immunitaire, qui sert normalement à nous protéger des infections, s’emballe et attaque de manière inappropriée aux vaisseaux sanguins de petit calibre et crée une inflammation. Cela peut entraîner des atteintes importantes de plusieurs organes, en particulier des reins et des poumons, avec un impact majeur sur la santé et la qualité de vie des patients. Les traitements actuellement utilisés permettent souvent de contrôler la maladie en freinant fortement le système immunitaire. Mais ces traitements peuvent entraîner des effets indésirables importants (infections, fatigue…), ce qui justifie la recherche de stratégies thérapeutiques plus ciblées et mieux tolérées. Des travaux récents suggèrent que certains mécanismes de l’inflammation, regroupés sous le terme d’« inflammasome », pourraient jouer un rôle central dans le développement et l’aggravation des vascularites des petits vaisseaux. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment l’inflammasome participe au développement des vascularites des petits vaisseaux. Pour cela, des modèles expérimentaux reconnus seront utilisés afin de reproduire certaines caractéristiques essentielles de la maladie humaine chez la souris. Différents types de souris seront étudiés, notamment des animaux présentant des modifications ciblées de certains processus inflammatoires, ainsi que des modèles permettant de visualiser l’activation de ces mécanismes dans les tissus. Certaines approches thérapeutiques ciblant spécifiquement ces voies inflammatoires seront également évaluées afin d’explorer leur capacité à limiter les lésions induites par l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre ce qui déclenche et entretient l’inflammation dans les vascularites des petits vaisseaux, en particulier le rôle d’un mécanisme appelé inflammasome. En identifiant si ce mécanisme est trop activé et comment il peut contribuer aux lésions des organes comme les reins et les poumons, nous espérons mettre en évidence les étapes clés de la maladie sur lesquelles nous pourrions développer de nouveaux traitements. À court terme, le bénéfice principal est scientifique et permettra de mieux expliquer pourquoi la maladie devient sévère chez certains patients et quels signaux inflammatoires sont les plus impliqués. Ces connaissances permettront de repérer de nouvelles cibles thérapeutiques et d’orienter des recherches futures vers des traitements ciblées. À plus long terme, si ces voies sont confirmées comme importantes, cela nous permettrait de soutenir le développement de traitements plus ciblés que les immunosuppresseurs utilisés aujourd’hui. En contrôlant mieux l’inflammation, les effets secondaires pourraient diminuer voir totalement disparaître. Ces stratégies pourraient également contribuer à réduire la dépendance aux corticoïdes et à améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
2376 souris (animaux sans traitement inhibiteur) recevront : 4 injections (≈ 2 minutes chacune) + 8 recueils d’urines (≈ 1–2 minutes) + 4 prélèvements sanguins (≈ 30 secondes à 1 minute). 2772 souris (animaux recevant un traitement inhibiteur) recevront : 8 injections (≈ 2 minutes chacune) + 8 recueils d’urines (≈ 1–2 minutes) + 4 prélèvements sanguins (≈ 30 secondes à 1 minute).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues comprennent des douleurs brèves et de faible intensité liées aux différentes injections et aux différents prélèvements, ainsi qu’un stress transitoire induit par les manipulations répétées. Le modèle utilisé peut entraîner un affaiblissement général de l’animal, une fatigue et une perte de poids, ainsi qu’une atteinte cutanée, rénale et/ou pulmonaire secondaire à la vascularite. Les atteintes rénales peuvent se traduire par une altération de la fonction rénale (hématurie, protéinurie, augmentation de la créatinine), les atteintes pulmonaires par une gêne respiratoire modérée, et les atteintes cutanées par des lésions inflammatoires localisées.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort et ne seront ni réutilisés ni replacés. Cette décision est justifiée par des considérations scientifiques, réglementaires et liées au bien-être animal. D’un point de vue scientifique, les objectifs du projet nécessitent l’analyse détaillée de plusieurs tissus, en particulier les reins et d’autres organes cibles de l’inflammation des petits vaisseaux. Ces analyses comprennent des examens histologiques, immunologiques et moléculaires, qui requièrent des prélèvements d’organes en fin de protocole et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie ou la réutilisation des animaux. Par ailleurs, les procédures mises en œuvre visent à induire une maladie inflammatoire expérimentale susceptible d’entraîner des atteintes organiques durables. Même lorsque les signes cliniques restent modérés, une récupération complète et durable des animaux ne peut être garantie. La réutilisation ou le replacement des animaux pourrait donc exposer ceux-ci à un risque accru de souffrance ultérieure et n’est pas conforme au principe de protection du bien-être animal. Enfin, le recours à une mise à mort en fin de procédure permet de limiter la durée d’exposition des animaux à la maladie expérimentale, et de réaliser les analyses nécessaires (histologie, prelvement sanguins). Des critères d’arrêt précoces sont appliqués tout au long de l’étude afin de garantir que tout animal présentant des signes de souffrance importante ou persistante est euthanasié sans délai. Ainsi, la mise à mort des animaux en fin de protocole constitue l’option la plus appropriée pour répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant les principes éthiques et réglementaires encadrant l’expérimentation animale.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la complexité des vascularites, qui reposent sur des interactions dynamiques entre les différents tissus impliqués dans la maladie. L’expérimentation animale reste donc indispensable pour étudier, dans un organisme complet, l’activation du système immunitaire et l’évaluation du potentiel thérapeutique des traitements testés.
Réduction
Les paramètres expérimentaux (doses, voies d’administration, calendrier des injections) ont été définis à partir d’études déjà publiées, afin d’éviter toute expérimentation exploratoire inutile. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au préalable par un calcul statistique prédictif. Pour réduire au maximum le nombre total de souris, chaque animal sera utilisé pour un ensemble élargi d’analyses, ce qui permet de multiplier les paramètres mesurés à partir d’un même individu. De plus, certaines données déjà disponibles, obtenues à partir de prélèvements réalisés chez les patients, orientent précisément les hypothèses à tester, réduisant ainsi le besoin d’expérimentations supplémentaires. Les groupes contrôles ne seront pas répétés dans les procédures ultérieures.
Raffinement
Toutes les interventions seront réalisées avec un souci maximal de confort et dans le respect du principe de raffinement. Les injections seront effectuées sur animaux vigiles par du personnel formé, afin de limiter la douleur et le stress. Pour les procédures nécessitant des injections répétées, les côtés d’injection seront alternés afin de préserver l’intégrité des tissus et réduire l’inconfort. L’évaluation du bien-être reposera sur un grand nombre de paramètres incluant l’apparence générale, la posture et la perte de poids. L’ensemble des paramètres surveillés vise à réduire au minimum la douleur, le stress et la souffrance, tout en maintenant la qualité scientifique des données obtenues.
Choix des espèces
LLa souris est le modèle de référence pour l’étude des vascularites auto-immunes et des mécanismes d’inflammation systémique. Elle présente une homologie remarquable avec l’homme en ce qui concerne les voies de signalisation de l’immunité innée, et les réponses du système immunitaire sont hautement conservées entre la souris et l’homme, ce qui améliore la transposabilité des données. Aucun autre modèle animal ou système en culture ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre les différents tissus impliqués. Par ailleurs, la souris est la seule espèce pour laquelle sont disponibles les lignées génétiquement modifiées nécessaires à ce projet. Ces modèles permettent d’explorer de façon spécifique et mécanistique le rôle des inflammasomes dans la physiopathologie des vascularites, ce qu’aucune autre espèce ne permet à ce jour. Ainsi, l’utilisation de la souris constitue l’approche la plus pertinente, la plus fiable et la seule scientifiquement valide pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux utilisés seront des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et où la réponse inflammatoire est stable et reproductible. L’utilisation d’animaux trop jeunes augmenterait la sensibilité aux injections et la mortalité, tandis que des animaux plus âgés présentent une variabilité accrue et un risque de maladies spontanées liés à l’âge. L’intervalle 8–12 semaines représente donc le meilleur compromis scientifique et éthique.
Etude de l’inflammation vasculaire rénale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à des gavages, des injections, une chirurgie et des séjours en cage métabolique, 1 877 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent provoquer une réaction inflammatoire et une atteinte rénale. Le projet vise à cerner le rôle d'une molécule dans l'hypertension et les vascularites auto-immunes qui touchent les reins. Le nombre d'animaux est justifié par un logiciel de calcul, le porteur indiquant avoir maximisé les analyses réalisées sur chaque individu.
Objectifs
L’inflammation des vaisseaux joue un rôle central dans le développement et la progression du risque cardiovasculaire. Elle est impliquée dans des pathologies fréquentes comme l’hypertension artérielle, mais également dans des maladies rares telles que les vascularites auto-immunes, où elle contribue à la destruction et au remodelage des parois vasculaires. Parmi les acteurs de cette réponse inflammatoire, une molécule occupe une place particulière. Son expression est souvent augmentée dans des contextes inflammatoires, ce qui suggère un rôle régulateur visant à atténuer l’inflammation vasculaire excessive. Le projet visera a évaluer le rôle de cette molécule dans deux maladies vasculaires qui touchent les reins: l'hypertension artérielle et la vascularites auto-immunes.
Bénéfices attendus
En utilisant des modèles murins qui permettent d'éteindre l'expression de la molécule que nous ciblons, nous pourrons déterminer comment cette molécule influence la réponse inflammatoire, le remodelage vasculaire et la progression des lésions rénales. Ce projet permettra des avancées des connaissances fondamentales sur les mécanismes immuno-inflammatoires impliqués dans les maladies cardiovasculaires et auto-immunes. Ce projet pourrait permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter l’inflammation vasculaire et ses conséquences.
Procédures
Gavage (5 x 1 minute), Injections (de 1 à 3 x 1 minute), Injection (2 x 20 secondes), Injection (jusqu'à 5 x 20 secondes), prélèvement urinaire en cage métabolique ( jusqu'à 5), Chirurgie (1 x 10 minutes)
Impact sur les animaux
Gavage: un stress lié à la contention et à la manipulation, ainsi qu’un risque faible d’irritation œsophagienne. Chirurgie: douleur légère à modérée au site d’implantation. Injection de produits : risque de réaction inflammatoire, atteinte rénale. Prélèvements urinaires en cage à métabolisme : inconfort lié à l’isolement temporaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements des organes
Remplacement
Les vascularites et les maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu au cours du développement de ces pathologies. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie des maladies observées chez l’Homme.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Grâce à un logiciel de calcul nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats robustes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les animaux seront élévés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, le modèle d'hypertension artérielle et les modèles de vascularites utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Nous utilisons des souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et de dsyfonction vasculaire, et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux
Rôle du système nerveux autonome dans l’étiologie de la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation SOD1 reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, 624 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 168 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La maladie leur impose une dégradation motrice progressive des membres, et 48 d'entre elles subissent en plus l'implantation chirurgicale d'une sonde cardiovasculaire. Le porteur décrit une nage génératrice de stress et applique des points limites pour la phase sévère. Les animaux sont tués en fin de procédure pour retirer le capteur télémétrique et prélever leurs organes.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs, les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles. Chez l’homme, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. Cette demande d’autorisation de protocole concerne un projet qui vise à caractériser les atteintes du système nerveux qui contrôle nos grandes fonctions telles que la digestion, la respiration, la fréquence cardiaque et la pression artérielle, grâce à un modèle de souris génétiquement modifiées qui sont atteintes de la SLA.
Bénéfices attendus
Les recherches que nous effectuons sur ce modèle animal pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou ralentir la progression de la SLA.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une demi-heure environ pour implanter une sonde permettant de suivre leurs paramètres cardiovasculaires (n=48). Les autres animaux seront maintenus en vieillissement pour des prélèvements d’organes et de sang.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Les animaux ayant été opérés pourront présenter des signes de douleur qui seront pris en charge de manière médicamenteuse. La nage peut générer du stress.
Devenir
Les animaux porteurs de la mutation SOD1 sont en procédure modérée jusqu’à P90 puis en procédure sévère de P90 à P120. Sur la base des lots décrits plus haut, 21 x12= 264 animaux seront utilisés en procédure légère (les WT) ; 10 x 12 = 120 animaux de P60 à P80 seront utilisés en phase modérée puis 14 x 12 = 168 de P90 à P120 en phase sévère. 6 groupes de 12 souris WT seront implantés avec une sonde télémétrique et seront donc en procédure modérée donc 72 souris. Totaux : 264 (procédure légère) + (120+72) = 192 en procédure modérée + 168 en procédure sévère = 624 animaux. L’ensemble des animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de retirer le capteur télémétrique ou pour prélèvements sur animal euthanasié.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. Lorsqu’on s’intéresse aux altérations physiologiques induites par la dégénérescence neuronale il est impossible de se passer d’un modèle d’étude animal mammifère et de travailler sur des invertébrés ou des cellules différenciées
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé par des méthodes statistiques ainsi que sur l’expérience que nous avons acquise au laboratoire depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Les animaux présentant un phénotype dommageable seront suivis quotidiennement. Les mâles étant agressifs entre eux (lié au fond génétique B6SJLF1), leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. Nous ne regroupons jamais des animaux de portées différentes. Nous maintenons les animaux par portée d’origine et ne les séparons pas en fonction du génotype afin de limiter le stress du regroupement et les bagarres. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Les animaliers sont formés à leur détection et préviennent les chercheurs dès les premiers signes.
Choix des espèces
L’identification de mutations génétiques à l’origine des formes héréditaires de SLA chez l’humain a permis l’élaboration de modèles murins de cette pathologie qui se développe à l’âge adulte avec l’apparition des premiers symptômes moteurs autour de 90 jours après la naissance.
Développement de nouveaux candidats médicaments : Etude comportementale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Société de services en études précliniques, l'établissement propose une offre de tests comportementaux qu'il veut étendre aux maladies du système nerveux central. 5 360 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer une vingtaine de candidats médicaments. Chaque animal peut subir jusqu'à cinq tests dont la nage forcée, une privation de nourriture, un isolement de 72 heures et l'implantation répétée de pompes osmotiques sous la peau. Le porteur mesure la résignation à l'immobilité dans la nage pour évaluer un état dépressif, et présente ces tests comme le cœur de son offre commerciale.
Objectifs
Notre établissement utilisateur est une société de services spécialisée dans les études précliniques qui fournit une offre variée de tests de comportement chez la souris. Nous souhaitons par ce projet pouvoir offrir notre expertise du comportement murin dans le domaine des maladies liées au système nerveux central (maladies neurodégénératives, maladies neurologiques ou psychiatriques ou troubles neuro-développementaux) à des acteurs scientifiques académiques ou privés. Les modèles développés dans notre société nous permettent d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur les fonctions cognitives, la mémoire, le comportement anxio-dépressif, l’activité motrice ainsi que la force motrice des animaux. Dans les pathologies telles que la maladie d’Alzheimer par exemple, on retrouve différents symptômes comme les troubles cognitifs et perte de mémoire mais également des symptômes anxieux et dépressifs. Notre objectif est donc ici de pouvoir proposer une gamme de tests comportementaux chez le rongeur permettant d’étudier l’effet d’un potentiel candidat médicament dans des maladies liées au système nerveux central. Selon la cible thérapeutique d’intérêt du candidat médicament et donc de ses propriétés pharmacologiques, il pourra être testé dans un ou plusieurs tests de comportement réalisés en routine dans notre EU afin de définir son efficacité thérapeutique dans un des domaines cités précédemment ainsi que ses potentiels effets secondaires. Le nombre estimé de candidats médicaments testés lors de ce projet est de 20.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de permettre l’avancée de potentiels candidats médicaments dans leur développement préclinique afin de développer et de rendre accessibles des nouveaux médicaments dans des pathologies touchant le système nerveux central et qui aujourd’hui ne possèdent pas de réel traitement ou des traitements ayant des effets limités avec beaucoup d’effets secondaires.
Procédures
Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (moins d’une minute, au maximum 90). Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. Un prélèvement sanguin sur animal anesthésié sera réalisé en fin d’étude d’une durée inférieure à 2 min avec un volume maximal de 0.5 ml. Les animaux seront soumis à un ou plusieurs tests de comportement (maximum 5 d’une durée de 5 min à 15 jours selon le test). Les animaux pourront être soumis à une implantation de pompe osmotique par voie sous-cutanée d’une durée de 5 minutes environ qui aura lieu au maximum 3 fois avec 2 semaines entre chaque renouvellement minimum. Selon le test comportemental, les animaux pourront être soumis à une privation de nourriture (inférieure à 24h une seule fois) ou à un isolement de 72h maximum une seule fois sur la durée de l'étude.
Impact sur les animaux
Les administrations d’un produit peuvent induire une légère douleur au site d’administration et un stress lié à la contention de l’animal. Les administrations répétées peuvent également induire des hématomes. L’implantation d’un dispositif de diffusion de candidat médicament en sous-cutané (à 3 reprises maximum au court d’une étude) implique la réalisation d’un acte chirurgical sous anesthésie générale précédée d’une analgésie de moins de 10 minutes. Les risques liés à ce type de procédure sont les suivants : douleur post-opératoire, œdème, inflammation ou hématome au point d’implantation, risque faible d’infection locale. Les tests de comportement utilisés dans ce projet peuvent induire un stress léger (ex : Test d’activité locomotrice) à modéré (ex : test de la nage forcée) de courte durée. Les animaux doivent être isolés durant une période de 72h avant le test d’hyperthermie induite par un stress. Durant les 24h qui précèdent le test d’alimentation supprimée par la nouveauté, les animaux sont soumis à une restriction alimentaire complète. L’administration de candidats médicaments peut entraîner des effets tels que l’hyperactivité, la sédation ou une myorelaxation. Les molécules administrées pour l’induction des modèles de pathologie peuvent induire des déficits de mémoire et/ou une hyperactivité.
Devenir
En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux pourront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.
Remplacement
Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : L’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la découverte de composés modulant la cible thérapeutique, l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité, leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organoïdes) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à ces étapes et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permettent de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimaux pour notre projet. Ce projet consiste à évaluer différents comportements chez l’animal représentatifs de pathologies. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Selon notre expérience, les tests statistiques utilisés dans ce projet montre la nécessité d’un nombre d’animaux par groupe égal à 12 pour observer des effets significatifs des candidats médicament (p
Raffinement
Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée avant d’inclure les animaux dans une étude. Autant que possible, les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Une stratégie d’enrichissement particulière sera mise en place pour les animaux isolés et les animaux stabulés durant plus d’un mois. Leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. Si un animal atteint un des critères prédéfinis dans notre grille de scoring à un moment donné de l'expérience, il sera immédiatement mis à mort. Lors de la chirurgie pour l’implantation de système de diffusion sous-cutanée, l’administration d’antidouleur sera réalisée afin de garantir l’analgésie. Une période de récupération minimale de 5 jours sera respectée avant le passage en test de comportement et, pour les tests de piscine de Morris ou de stress de nage forcée, la période nécessaire à la cicatrisation complète sera respectée (environ une semaine confirmée par avis vétérinaire). Les injections intrapéritonéales seront préférentiellement réalisées dans le quart inférieur gauche afin d’éviter le colon descendant situé dans le quart inférieur droit. Les administrations sous-cutanées seront réalisées sur 3 sites d’injection alternativement (entre les omoplates ou sur chacun des flancs latéraux). L’implantation d’un système de diffusion sous-cutané sera réalisée sous anesthésie générale précédée d‘une analgésie. Les animaux seront soumis à une habituation progressive à la contention et à l’instillation intranasale (suivie d’une récompense alimentaire) sur une durée de 3-4 semaines avant l’administration du candidat médicament. Après chaque séance dans la piscine de Morris et après le test de la nage forcée, les animaux sont placés dans une cage contenant un tissu sec sur tapis chauffant jusqu’à ce que l’animal soit sec. La résignation des animaux, mesurée par le temps d’immobilité, sert à évaluer un potentiel « état dépressif » ou un effet antidépresseur par exemple. Dans les deux cas, une vigilance particulière est apportée aux animaux pendant (avec des critères d’arrêt strict) et après le test. Des études in vitro et in vivo seront réalisées préalablement à ce projet pour définir les doses non toxiques, n’induisant pas de nuisances potentiellement invalidantes pour les animaux (nuisances supérieures à une hyper ou hypoactivité ou myorelaxation chez les animaux), qui seront utilisés dans notre projet.
Choix des espèces
Le choix des rongeurs se justifie par la richesse et la complexité de leur répertoire comportemental, qui permettent d’explorer de manière pertinente les fonctions motrices, cognitives et émotionnelles ciblées dans ce projet. Des espèces présentant un système nerveux central moins développé ne disposent pas d’une organisation neurobiologique ni d’expressions comportementales suffisamment élaborées pour répondre de façon fiable aux objectifs scientifiques poursuivis. De plus, la souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de transposer (par des modèles A partir de 5 semaines d’âge. Les pathologies étudiées peuvent toucher l’adolescent, l’adulte comme le sujet âgé.
Etude des propriétés pharmacocinétiques et de biodistribution d’une nouvelle classe d’anticorps thérapeutiques – modification
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
Sept prélèvements de sang en trois semaines après une injection unique : 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet mesure la durée de vie dans le sang et la répartition dans les tissus d'anticorps thérapeutiques modifiés par ajout d'un sucre. Les souris sont tuées pour prélever sang et organes et y doser ces anticorps. Le porteur s'attend à ce que la modification ne change ni les propriétés ni la distribution, une hypothèse que l'expérience sur les souris doit confirmer avant toute étude d'efficacité.
Objectifs
Les anticorps thérapeutiques (mAb) représentent aujourd’hui des outils reconnus pour des multiples pathologies telles que le cancer, les maladies auto-immunes ou inflammatoires. Cependant ces traitements nécessitent encore des améliorations importantes pour augmenter leur efficacité et éviter ou limiter les effets secondaires indésirables. Le projet concerne une nouvelle technologie visant à améliorer le potentiel thérapeutique de l’ensemble des anticorps. Cette innovation est basée sur une modification spécifique des anticorps en ajoutant un composé, un sucre appelé AMFA . Des études préliminaires in vitro ont montré que l’addition des AMFA aux anticorps ne modifie pas la capacité de lier leur cible. Grâce à leur mécanisme d’action, les anticorps-AMFA ont une meilleure efficacité thérapeutique que les anticorps natifs. En revanche, bien que les anticorps-AMFA aient été conçus pour apporter un bénéfice sans causer une modification importante à la structure de l’anticorps, les expériences in vitro ne permettent pas de savoir si la modification par les AMFA aura un impact sur la durée de vie de l’anticorps dans le sang (pharmacocinétique) et si l’anticorps-AMFA sera accumulé dans les tissus (biodistribution) de la même façon que l’anticorps non modifié. Les trois anticorps qui ont montré une meilleure efficacité in vitro ont été sélectionnés pour être testés chez la souris.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre technologie est d’améliorer des anticorps actuellement utilisés en traitement clinique. Dans ce projet, on s’attend à une conservation des propriétés et une distribution similaire dans les différents tissus des anticorps que nous avons modifiés. Par la suite, des études d’efficacité dans des modèles pertinents permettront de valider la preuve de concept de notre technologie
Procédures
Les animaux vigiles seront injectés une fois en début de procédure. Pour l’étude de pharmacocinétique, des prélèvements de sang seront réalisés (7 prélèvements de faible volume en 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les anticorps étudiés dans ce projet seront administrés à des doses déjà utilisées dans des études publiées où l’absence d’effets secondaires chez la souris est démontrée. L’injection unique d’anticorps thérapeutiques à faible dose ne devrait pas provoquer d’effets secondaires ou de douleur et le niveau de sévérité est considéré comme léger. Pour les animaux de l'étude de pharmacocinétique il y aura des prélèvements répétés d’un faible volume de sang. Ce geste est considéré de sévérité légère, mais la répétition de prélèvements (7 fois en 3 semaines) pourrait causer une nuisance de sévérité modérée.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de prélever le sang et différents tissus pour réaliser des dosages biochimiques.
Remplacement
Les anticorps thérapeutiques sont des médicaments destinés à être administrés par voie intraveineuse chez l'homme. La durée de vie de l'anticorps et les quantités distribuées dans les tissus sont des paramètres importants pour l’efficacité thérapeutique du médicament et ces informations ne peuvent être collectées qu’en suivant le comportement et le devenir de l’anticorps après son administration dans un organisme vivant complexe tel que la souris, qui est utilisée couramment pour ce type d’étude.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significatifs, une recherche bibliographique pertinente a été réalisée afin de baser les tests statistiques de manière sérieuse pour chaque mAb. Pour les études de pharmacocinétique, le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été choisi en accord avec des études publiées et à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique, de façon à pouvoir détecter une éventuelle différence de plus de 10% entre l’anticorps natif et l’anticorps-AMFA correspondant. Pour les études de biodistribution, le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été obtenu en accord avec des études publiées et à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés qui seront utilisés pour évaluer les différences significatives entre les deux courbes de pharmacocinétique et pour comparer la concentration des anticorps dans les tissus des groupes CTR, mAb et mAb-AMFA.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions d’hébergements réglementaires, avec un milieu enrichi et seront placés par 4 par cage afin de stimuler les contacts sociaux entre eux. Aussi, les animaux seront manipulés quotidiennement dès leur arrivée pour limiter le stress des animaux lors de l’expérimentation. Aucune douleur n’est attendue à la suite de l’injection des anticorps. Les animaux seront quotidiennement surveillés selon une fiche de suivi clinique standard. Si des signes de douleur de l’animal sont perçus, les animaux seront sortis de l’étude.
Choix des espèces
Pour ce projet nous avons choisi d’employer des souris BALB/c qui sont couramment utilisées dans des études de pharmacocinétique et bio-distribution des anticorps thérapeutiques. Les animaux utilisés dans l’étude seront âgés de 10 à 12 semaines, c’est-à-dire un stade adulte pour que leur système immunitaire soit à maturité et la réponse métabolique optimale.
Impact de différents modes d’exposition aux rayonnements ionisants à doses faibles et modérées sur la sénescence des cellules endothéliales chez la souris : implications macro- et microvasculaires
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Irradiées jusqu'à douze fois en caisson, ou exposées au césium par leur eau de boisson, 448 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères, toutes tuées pour prélever cœur, aorte, carotides, poumons et cerveau. Elles passent aussi des échographies sous anesthésie, des injections et de longues immobilisations destinées à mesurer le césium accumulé dans leur corps. Le projet vise à étayer la radioprotection des travailleurs du nucléaire face aux faibles doses. Le porteur affirme que ces expositions "n'entraînent pas de douleur ni d'effet secondaire", tout en prévoyant la mise à mort de tout animal perdant 20 % de son poids.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les vaisseaux sanguins réagissent au vieillissement prématuré provoqué par les rayonnements ionisants, et si ces réactions varient selon le type de vaisseau, la dose reçue et la manière dont l’exposition a lieu. Plus précisément, le projet vise d’abord à décrire comment les cellules qui tapissent les vaisseaux sanguins entrent en état de sénescence (un état de vieillissement cellulaire) après exposition aux rayonnements. Il s’agit de comparer les effets selon la dose, le mode d’exposition, et selon qu’il s’agisse de gros vaisseaux ou de petits vaisseaux, tout en identifiant les principaux mécanismes biologiques impliqués. Ensuite, le projet cherche à faire le lien entre ces mécanismes cellulaires et les conséquences concrètes sur la structure et le fonctionnement des vaisseaux sanguins. Pour cela, une chaîne d’événements sera établie, allant des dommages initiaux à l’ADN des cellules jusqu’aux altérations durables des vaisseaux. Un autre objectif important est d’identifier des indicateurs mesurables (biomarqueurs) permettant de détecter et de suivre ces effets, que ce soit au niveau des cellules, dans le sang ou directement dans les tissus vasculaires. Le projet vise également à déterminer quelles conditions d’exposition (combinaison de dose cumulée et de mode d’irradiation) sont les plus à risque pour entraîner des altérations vasculaires. Enfin, l’ensemble des résultats permettra de proposer des recommandations pratiques en radioprotection, afin de mieux prévenir les effets indésirables des rayonnements sur le système vasculaire.
Bénéfices attendus
Chez les travailleurs du nucléaire, de nouvelles données épidémiologiques suggèrent une association entre l’exposition aux RI également dans les gammes de doses faibles à modérées et l’augmentation de la mortalité due aux pathologies ischémiques et cérébro-vasculaires. Cependant, la compréhension des mécanismes sous-jacents et l’étiologie de ces pathologies dans la réponse aux faibles doses reste parcellaire et ne peut progresser qu’avec des études expérimentales. Ces dernières permettent de s’affranchir des facteurs confondants et de cibler les mécanismes sous-jacents. Les résultats de ces travaux apporteront des connaissances utiles pour conforter ou, au besoin, contribuer à faire évoluer et améliorer le système de radioprotection du travailleur du nucléaire
Procédures
Pour tous les animaux irradiés: - Irradiation (en boîte, 1 à max 12 fois, durée max 20 min) - Echographies (sous anesthésie, max 2 fois, durée max 15 min) - Injections i.p. (en vigile avec contention, durée max 1 min) Pour tous les animaux contaminés via eua de boisson: - Echographies (sous anesthésie, max 2 fois, durée max 15 min) - Injections i.p. (en vigile avec contention, durée max 1 min) - Boite à contention pour zooradiamétrie (mesure de Cs137 accumulé dans l’organisme) max 15 min. Acclimatation aux boites de contention avant les mesures de zooradiamétrie.
Impact sur les animaux
L’exposition aux doses faibles à modérées externe ainsi qu’à de faibles concentrations de Césium dans l’eau de boissons n’entrainent pas de douleur ni d’effet secondaire pour les animaux. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur, aorte, carotides, poumons et cerveaux) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
L’approche in vitro qui sera mis en place en amont des études in vivo vont permettra d’identifier la combinaison de modes et de doses d’exposition induisant les marqueurs de sénescence de la manière la plus significative et complémentaire des études in vivo. Les études in vitro vont permettre l’identification de marqueurs qui seront ensuite validées de manière fonctionnelle in vivo. Les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 448 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 16 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum.
Raffinement
Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par l’équipe du projet. Les expositions par irradiation externe ou contamination interne aux doses utilisées dans ce projet n’induisent pas d’effet nuisible majeur. Le seul point de vigilance est de diminuer le stress des souris d’une part dans les boites d’irradiation externe et d’autre part pour la procédure 3 pour la contention pour les mesures de zooradiamétrie. Pour éviter le stress les animaux seront habitués aux boites avant les irradiations ou mesure zooradiamétrique. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un dose seuil pour lequel on observe l’apparition de la senescence endothéliale chez des souris irradiées selon différents modes d’expositions en corps entier avec des rayonnements gamma et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes qui sont exposées aux rayonnements ionisants répétés comme le cas des travailleurs et la population en exposition continue en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système vasculaire est mature.
Maintien de colonies de souris dystrophiques à phénotype dommageable pour l’étude de la myopathie de Duchenne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
12 550 souris sur cinq ans vont être utilisées pour entretenir des lignées reproduisant la myopathie de Duchenne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Chaque petit de 7 à 10 jours est tatoué aux orteils et amputé d'un fragment d'oreille pour déterminer s'il porte la maladie, et les mâles atteints développent avec l'âge une fonte musculaire pouvant atteindre le stade sévère. Cet élevage sert à produire, année après année, les souris malades destinées à de futurs projets. Les géniteurs retirés, les animaux au mauvais génotype et les femelles en surnombre sont tués, la plupart des femelles étant éliminées peu après la naissance sans même être identifiées.
Objectifs
Contexte : La DMD est une maladie rare qui touche 1 garçon sur 3500 environ. Elle est causée par des mutations dans un gène du chromosome X qui code la dystrophine, une protéine essentielle aux fibres musculaires. Les patients présentent une fonte musculaire progressive. Ils perdent la marche vers l’adolescence et décèdent vers 25-30 ans. Animaux : Pour comprendre les mécanismes de la DMD et évaluer des traitements et dispositifs médicaux, nous utilisons plusieurs lignées de souris OGM modèles de la DMD, qui permettent d’étudier plusieurs facettes de la maladie. Objectif : l’objectif du projet est de prélever sur les animaux âgés de 7-10 jours un fragment de tissu de manière invasive (fragment du pavillon de l’oreille), pour génotypage par PCR. Les animaux seront identifiés en parallèle par micro-tatouage des orteils.
Bénéfices attendus
Ce projet concerne l’élevage de souris dystrophiques et le prélèvement de tissus pour déterminer si les animaux sont malades ou sains. Il va permettre de produire les individus nécessaires au renouvellement des géniteurs et aux études pour comprendre et traiter la dystrophie musculaire de Duchenne, une myopathie rare et sévère, toujours fatale à ce jour pour les garçons qui en sont atteints. Des Demandes d’Autorisations de Projet seront ensuite déposées, utilisant ces modèles pour décrire les mécanismes de la maladie, préciser les rôles de plusieurs gènes qui modulent la sévérité chez l’homme comme chez la souris, déterminer l’utilité préclinique de nouvelles procédures et outils d’exploration fonctionnelle, et évaluer l’efficacité de candidats-médicaments.
Procédures
Les animaux âgés de 7-10 jours seront systématiquement identifiés individuellement par tatouage des orteils. Ils seront manipulés pendant environ 1 minute environ pour prélever un petit fragment du pavillon de l’oreille avec du matériel stérile afin de déterminer s’ils sont sains ou malades.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress léger lors de la manipulation et une douleur légère lors du prélèvement (environ 6’270 individus sur 5 ans). Concernant les nuisances des animaux OGM, on distingue 2 catégories : Catégorie 1 : jusqu’au sevrage, les animaux n’ont aucun signe de la maladie. Jusque vers 12 mois environ, les animaux présentent des mécanismes spontanés de compensation de la maladie. Le phénotype passe lentement de normal à léger. Vers 12 mois, les reproducteurs sont retirés des accouplements. Entre 13 et 24 mois (si nécessaires dans de futurs projets), le mécanisme de compensation s’épuise et la fonte musculaire s’installe progressivement, associée à des défauts de posture (faiblesse des muscles du dos), une faiblesse respiratoire et une atteinte cardiaque. Grâce aux mesures de raffinement, le phénotype évolue lentement de léger à modéré (12-24 mois). Au-delà de 24 mois (si nécessaire dans de futurs projets), les animaux sont amaigris, voutés et moins mobiles (classe sévère). Les mesures mises en place pour assurer un hébergement en groupe et faciliter l’accès à la nourriture et à la boisson assurent une espérance de vie normale. Catégorie 2 : jusqu’au sevrage, les animaux n’ont aucun signe de la maladie. Entre 1 et 3 mois environ, les animaux présentent des mécanismes peu performants de compensation de l’atteinte musculaire. Cependant, les signes de la maladie restent imperceptibles (comme ci-dessus), associé à un phénotype léger. Entre 3 mois et 24 mois environ, les animaux montrent une fonte musculaire lentement progressive. Par rapport à la catégorie 1, la maladie est plus précoce, l’évolution plus linéaire, et la présentation clinique est plus prononcée vers la fin. Le phénotype évolue lentement de normal à sévère entre 3 et 24 mois environ.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les géniteurs retirés de la reproduction, les animaux n’ayant pas le génotype voulu et les femelles surnuméraires non utilisées dans les protocoles seront mis à mort. Une partie des animaux seront gardés en vie pour une utilisation continue en expérimentation selon des modalités décrites dans les demandes qui seront soumises séparément.
Remplacement
Les cultures de cellules musculaires ne peuvent pas répondre aux questions que nous nous posons sur les maladies qui touchent le maintien du muscle mature. En effet, les cultures de cellules ne reproduisent pas la diversité des types cellulaires et la complexité des interactions qui existent dans le muscle après la naissance. En général, les cultures de cellules musculaires permettent de reproduire le développement initial du muscle (par exemple lors du développement embryonnaire), mais elles restent trop immatures pour servir de modèles aux maladies qui touchent le muscle des patients après la naissance. En l’absence de méthodes alternatives non-animales, nous sommes contraints d’utiliser des animaux vivants pour atteindre les objectifs du projet. A notre connaissance, il s’agit de la seule approche scientifiquement valide pour augmenter nos connaissances et pour obtenir des données précliniques pertinentes susceptibles de permettre une transition vers des essais cliniques chez l’Homme pour traiter des maladies neuromusculaires à ce jour toujours fatales.
Réduction
Nous avons développé une expertise pour maintenir des colonies de souris dystrophiques en utilisant un minimum de géniteurs. Notamment, nous utilisons des accouplements collectifs datés (2-3 mâles visitent périodiquement des groupes de 4 à 8 femelles) comme alternatives aux trios conventionnels (1 mâle et 2 femelles). Cela réduit de 30-50% le nombre de géniteurs mâles nécessaires pour l’élevage. Pour limiter la production d’animaux inutiles, la production ne se déroule pas en continu mais via des campagnes de production destinées à assurer le remplacement des géniteurs et production des cohortes expérimentales (décrites séparément). Comme la maladie DMD touche les garçons, les expériences utilisent presque exclusivement des mâles. On conserve également des mâles pour la reproduction. La production des mâles (géniteurs et expériences) s’accompagne d’une production de femelles. On prélève du tissu pour déterminer si les animaux sont sains ou malades uniquement sur certaines femelles. La plupart des femelles sont éliminées peu après la naissance sans procéder à l’identification (micro-tatouage) ni au prélèvement de tissu.
Raffinement
Des points limites prédictifs et précoces sont mis en place pour mettre en évidence tout problème ou anomalie chez nos animaux et décider des mesures à prendre pour limiter leur douleur, souffrance ou angoisse. Les accouplements collectifs datés permettent de garder ensemble les 2 mâles après qu’ils ont visité un groupe de femelles : ils ne montrent pas d’agressivité l’un envers l’autre et n’ont pas besoin de passer l’essentiel de leur vie isolés. Chez les femelles dystrophiques, la gestation et la lactation peuvent causer un stress énergétique associé à du cannibalisme et un retard de croissance des petits. On évite cette situation en pratiquant des accouplements datés, qui permettent de regrouper plusieurs femelles vers la fin de la gestation. Elles reçoivent alors des abris de grande taille et un supplément d’enrichissement pour construire un nid commun pour la fin de la gestation, la mise bas et l’allaitement. Dans ces conditions, les femelles mettent bas simultanément, et maintiennent les petits dans le nid commun, ce qui limite la perte de chaleur des petits. La faible production de lait d’une femelle peut être compensée par ses congénères. Les jeunes femelles en trop sont éliminées dès que possible. Ces procédures favorisent la survie des petits nécessaires au maintien de la colonie et aux expériences, et assurent une croissance homogène. On facilite l’accès à la nourriture et à la boisson des femelles gestantes et allaitantes en plaçant des granulés directement dans la cage et en utilisant des tétines plus longues sur les biberons. Cela profite aussi aux jeunes en croissance. Par ailleurs, pour un meilleur développement, le sevrage a lieu tardivement : les petits sont laissés avec les mères pendant 4 semaines au lieu de 3 habituellement. Comme le gène responsable de la myopathie est sur le chromosome X, on peut croiser des géniteurs cliniquement sains : on peut produire les animaux utiles aux expériences en croisant des mâles sains et des femelles porteuses d’un seul chromosome X muté (elles sont saines). La progéniture contient des mâles sains et des mâles dystrophiques selon le chromosome X hérité de la mère.
Choix des espèces
Certaines souris dystrophiques utilisées ici sont depuis presque 40 ans une référence pour étudier les mécanismes de la myopathie de Duchenne et évaluer les approches thérapeutiques pour cette maladie fatale. Certains aspects (mécanismes moléculaires et défaut de structure des muscles) représentent bien la maladie humaine. Cependant, d’un point de vue clinique (perte de fonction musculaire), ces souris ont un phénotype qui évolue progressivement d’asymptomatique à léger pendant l’essentiel de leur vie. Il faut attendre des âges avancés pour qu’elles développent un phénotype modéré. La connaissance du génome de la souris et la multitude de mutants disponibles rend cette espèce particulièrement adaptée pour combiner des facteurs génétiques impliqués dans les maladies rares. Le projet utilise : 1- des petits âgés de 7 à 10 jours : Prélèvement de tissu (un petit fragment du pavillon de l’oreille) pour déterminer si les petits issus de la reproduction sont sains ou malades. A cet âge, ils ne montrent aucun signe de la maladie. 2- des adultes entre 2 et 12 mois environ : utilisation de géniteurs mâles et femelles pour maintenir des colonies de souris dystrophiques, modèles de myopathies, et produire des animaux pour de futures études. Il concerne donc des adultes en âge de se reproduire efficacement, qu’ils soient sains ou avec un phénotype dommageable (classe légère à modéré). Le projet produit aussi : 3- des animaux de 12 à 24 mois qui seraient nécessaires pour de futurs projets qui seront décrits séparément.
Étude de l’impact d’une neuroinflammation préalable sur les réponses neuro-inflammatoires, neuro-plastiques et fonctionnelles après un traumatisme cervical de la moelle épinière chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection destinée à déclencher une inflammation de la moelle épinière, l'autre subit en plus une chirurgie de 45 minutes reproduisant un traumatisme cervical, suivie d'une paralysie transitoire, d'une perte allant jusqu'à 20 % du poids et, pour 1 % des animaux, d'une automutilation de la patte. Le projet veut savoir si une inflammation préalable modifie la récupération après un tel traumatisme. Toutes sont tuées pour prélever la moelle épinière et l'analyser.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière au niveau cervical sont relativement fréquentes chez l’homme, entrainant des problèmes au niveau locomoteur ainsi qu’au niveau du contrôle neural de l’activité respiratoire et cardio-vasculaire, représentant ainsi la première cause de mortalité chez les patients. Une restauration partielle spontanée de l’activité respiratoire, cardiovasculaire ainsi que locomotrice peut être observée après lésion incomplète au niveau cervical, principalement due à une réorganisation des connexions nerveuses restantes. Cette récupération reste modeste et peut être fortement influencée par l’état médical antérieur des individus, notamment lorsqu’une maladie ou un épisode inflammatoire a déjà sollicité le système immunitaire de la moelle épinière. Dans ce cas, la réponse immunitaire à un traumatisme ultérieur ne sera pas la même que chez un individu dont le système immunitaire spinal est sollicité pour la première fois. Il est donc nécessaire d’identifier l’impact d’une atteinte inflammatoire préalable de la moelle épinière sur les processus inflammatoires et plastiques déclenchés à la suite d’un traumatisme de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Les traumatismes cervicaux de la moelle épinière entraînent des déficits respiratoires et cardiovasculaires majeurs, altérant fortement la qualité de vie des patients. Les résultats attendus de ce projet se situent à l’interface entre recherche fondamentale, recherche préclinique et applications cliniques, et visent à améliorer la compréhension des mécanismes qui limitent la réparation du système nerveux après un traumatisme de la moelle épinière. L’identification de ces processus permettra d’approfondir nos connaissances de la physiopathologie des lésions de la moelle épinière et d’orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement les mécanismes neuroinflammatoires et neuroplastiques impliqués dans la récupération. Un apport majeur de ce projet réside dans la comparaison entre les animaux présentant une neuroinflammation de la moelle épinière préalable et ceux subissant uniquement le traumatisme de la moelle épinière. Les différences attendues dans la réponse inflammatoire et dans les capacités de réparation entre ces groupes mettront en évidence l’importance de l’état immunitaire initial de la moelle épinière. Ces résultats soutiendront l’idée que le passif inflammatoire d’un patient constitue un déterminant crucial de sa trajectoire de récupération et qu’il doit être pris en compte pour optimiser les interventions thérapeutiques. À terme, ce projet contribuera ainsi à promouvoir des stratégies de médecine de précision, mieux adaptées au profil de chaque patient et potentiellement plus efficaces pour améliorer les fonctions perdues.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’une des deux procédures. Une partie des animaux recevront une injection d’un composé permettant d’induire une neuroinflammation. Différentes concentrations de ce composé seront testés afin de déterminer la concentration permettant d’induire une neuroinflammation spinale significative chez nos animaux, sans induire de phénotype pathologique délétère. Cette concentration sera déterminée dans cette procédure grâce à des tests comportementaux (maximum 2 par animal, d’une dizaine de minutes chacun), ainsi que des évaluations fonctionnelles neuromusculaires (force de contraction et excitabilité neuromusculaire, durant une dizaine de minutes chacune). L'autre partie des animaux seront injectés avec le composé à la concentration déterminée précedemment, puis recevront une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant de créer le modèle préclinique de trauma de la moelle épinière cervicale, afin de mimer la pathologie humaine. Ces animaux seront ensuite eux aussi soumis à des tests comportementaux et fonctionnels.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration en intra-péritonéal du composé testé sur souris vigile en contention. - Paralysie transitoire des pattes avant et arrière du côté lésé suite à la lésion de la moelle épinière cervicale. Cette paralysie est transitoire et disparaît en l’espace d’une semaine, permettant à l’animal de retrouver une locomotion comparable à celle observée avant la lésion spinale. - Perte de poids jusqu’à 20% du poids initial durant la première semaine après lésion de la moelle épinière cervicale. - Autophagie de la patte arrière contralatérale à la lésion spinale (1% des animaux).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle expérimental permettant d’étudier de manière pertinente et intégrée les réponses physiologiques complexes autrement qu’à travers des organismes vivants. Les connectivités neuronales et les interactions neuro-immunitaires impliquées dans ces processus ne peuvent être reproduites ni par des modèles in vitro, ni par des approches in silico. De plus, les manipulations nécessaires à l’étude de ces mécanismes, telles que l’intervention sur certains systèmes de neurotransmission ou les analyses neurochimiques en conditions physiologiques, ne peuvent pas être réalisées chez l’être humain. En l’absence d’alternative scientifiquement valable, l’utilisation de modèles animaux demeure indispensable pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
L’étude repose sur l’analyse de l’influence d’un état inflammatoire spinal préexistant sur la récupération fonctionnelle après une lésion cervicale incomplète de la moelle épinière, un concept encore peu exploré nécessitant une approche intégrative in vivo. Le protocole expérimental a été spécifiquement conçu afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, en s’appuyant sur les données déjà disponibles dans la littérature et sur l’expertise du laboratoire concernant la physiopathologie des lésions de la moelle épinière cervicales. Ces connaissances ont permis de définir précisément le niveau et la sévérité de la lésion, ainsi que les fenêtres temporelles d’analyse, afin de réduire la variabilité interindividuelle et d’éviter toute répétition expérimentale non justifiée. Par ailleurs, les mêmes animaux sont suivis longitudinalement pour l’évaluation des paramètres comportementaux et respiratoires, ce qui permet de maximiser la quantité de données obtenues par individu et de réduire le nombre total d’animaux requis tout en garantissant la robustesse statistique de l’étude.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales a été élaboré afin de minimiser la contrainte imposée aux animaux et de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Le choix d’un modèle de lésion cervicale incomplète de la moelle épinière permet d’induire des déficits fonctionnels pouvant être compensés physiologiquement chez les animaux, évitant ainsi des atteintes sévères et prolongées. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, associée à une analgésie péri- et post-opératoire adaptée, et les paramètres opératoires ont été optimisés sur la base de l’expérience du laboratoire afin de limiter la durée de la chirurgie et les manipulations. Le suivi fonctionnel repose majoritairement sur des évaluations comportementales et respiratoires non-invasives, réalisées chez les mêmes animaux au cours du temps, ce qui permet de limiter les manipulations et d’éviter des procédures supplémentaires. Enfin, l’état clinique des animaux est surveillé quotidiennement après la lésion de la moelle épinière, et les conditions d’hébergement et de manipulation sont adaptées afin de réduire le stress, favoriser la récupération fonctionnelle et assurer une prise en charge individualisée, conformément aux principes de raffinement. Des tissus de moelle épinière seront de plus récupéré après mise à mort des animaux afin poursuivre en profondeur cette étude par des expérimentations moléculaires et cellulaires.
Choix des espèces
Nous utilisons cette espèce pour plusieurs raisons : 1) Plusieurs élevages de souris de laboratoires sont disponibles 2) Grâce à leur petite taille et leur cycle de vie court, les conditions environnementales peuvent être contrôlées de la naissance à l’âge adulte 3) Les souris constituent un modèle reproductible d’étude de la neurobiologie respiratoire et cardiovasculaire 4) Les souris ont un taux de mortalité faible (moins de 2%) suite à une lésion médullaire cervicale 5) Les souris présentent une récupération motrice très rapide suite à une lésion médullaire cervicale 6) Un des aspects clés du programme de recherche concerne les voies nerveuses phréniques croisées (voies respiratoires), données publiées dans la littérature 7) Les souris et les humains partagent plusieurs caractéristiques communes dans le contrôle du système respiratoire et cardiovasculaire, ce qui en fait un bon modèle préclinique. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (âgées de 8-12 semaines) afin de s’affranchir de toutes incidences liées au développement de l’individu. La nécessité d’avoir un sujet adulte s’avère indispensable afin d’étudier de manière précise les effets de potentielles futures stratégies réparatrices qui pourront être appliquées sur des patients humains adultes.
Evaluation de l’impact sur le bien-être animal d’un hébergement en cage métabolique pendant 7 jours chez la souris : Preuve de principe en vue d’applications futures
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Placées seules en cage métabolique pendant sept jours sur une grille sans litière, 40 souris subissent un confinement classé sévère, tandis que 20 autres ne passent que des tests de comportement. Le projet mesure, par la corticostérone et des tests d'anxiété, le stress causé par ce type d'hébergement. Les 40 souris en cage métabolique sont tuées à l'issue, les 20 autres réutilisées. Présenté comme une étude sur le bien-être des animaux non-humains, il inflige ainsi à une partie d'entre eux la contrainte la plus sévère qu'il prétend documenter.
Objectifs
Dans certaines recherches biomédicales, il est nécessaire de placer les animaux en cage métabolique, permettant la récolte des urines et des fèces sur une durée déterminée. Ce type d’hébergement présente un inconfort pour l’animal impactant son bien-être et pouvant engendrer stress ou anxiété. Nous proposons dans ce projet un raffinement des conditions d’hébergement de ces cages métaboliques à différents niveaux (pièce d’hébergement et cage) ainsi qu’un suivi clinique renforcé des animaux. Ce projet permettra d’évaluer le stress et l’anxiété des animaux par la réalisation de tests de comportement lors de la fin de l’hébergement en cage métabolique soit 7 jours maximum ainsi que la récolte des fèces à différents temps au cours des 7 jours pour dosage de la corticostérone (principale hormone du stress chez les rongeurs).
Bénéfices attendus
Ce projet limité en nombre d’animaux et en durée permettra de diminuer le nombre d’animaux dans de futurs projets menés notamment sur la décorporation. En effet l’utilisation d’un même animal pour toute une étude de 7 jours sur la décorporation permet de gagner en robustesse des résultats scientifiques tout en diminuant le nombre d’animaux.
Procédures
40 animaux seront hébergés en cage métabolique (individuelle) pendant 7 jours. 60 animaux subiront 1 ou 2 tests de comportement.
Impact sur les animaux
La nuisance sera exclusivement due à l’hébergement en cage métabolique pendant 7 jour, soit un hébergement en cage individuelle sur une grille pouvant induire un inconfort pour l’animal. La nourriture en poudre pendant 7 jours peut également engendrer une perte d’appétence mais sera distribuée à volonté. Nous estimons la perte de poids que nous estimons faible à modérée (
Devenir
Les animaux qui auront été en cages métaboliques seront euthanasiés à la fin de la procédure. Ceux non placés en cages métaboliques pourront être gardés pour ré-utilisation.
Remplacement
Aucune méthode de substitution ne permet le remplacement des études in vivo de comportement qui prennent en compte la complexité physiologique et la réponse à un stress environnemental.
Réduction
Ce projet a pour objectif à long terme de réduire le nombre d’animaux par procédure pour les projets d’étude de la décorporation qui requièrent un passage en cage métabolique supérieur à 5 jours. Si l’évaluation de la contrainte d’hébergement en cage métabolisme pendant 7 jours est jugée acceptable cela permettra de diviser le nombre d’animaux pour certains projets d’étude de la décorporation d’une molécule.
Raffinement
L’inconfort de l’hébergement en cage métabolique sera contrebalancé par une augmentation de la température de la pièce 26°C (+/-2°C) et la mise à disposition d’un dôme sans base adapté à l’espèce souris dans la cage, permettant une mise à l’abri de l’animal. Les animaux auront un visu sur leurs congénères grâce aux cages transparentes. L’agression lumineuse des souris albinos sera diminuée par une lumière plus tamisée dans la pièce et la présence d’une maison rouge sans base dans les cages. Cet enrichissement permettra néanmoins la collecte d’un maximum d’urine tout en permettant à l’animal de s’y réfugier.
Choix des espèces
La souris est l’espèce qui est la plus utilisée en recherche bio médicale et au sein de notre structure. Ce projet va permettre une validation de procédure pour l’étude de la décorporation de molécules dans de futurs projets au sein de notre structure. Les animaux seront des animaux d’âge adulte, représentatifs des modèles classiquement utilisés.
Amélioration de la compréhension de la physiopathologie d’une maladie rénale auto-immune grâce à une modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Immunisées puis prélevées à répétition, 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à douze injections et subit jusqu'à quatre prises de sang et dix-sept prélèvements d'urine sous contention, au risque de douleurs, d'infections et, dans les formes sévères, d'une rétention d'eau. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'une maladie rénale auto-immune et le porteur justifie l'espèce par sa proximité physiologique avec l'humain. L'objectif tient toutefois en une phrase et ne nomme ni le modèle précis ni les substances injectées.
Objectifs
Notre projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes immunologiques responsables de l'apparition d'une maladie rénale auto-immune dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqués dans l'apparition et la progression d'une maladie rénale auto-immune. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutique plus personnalisées, visant à contrôler plus efficacement l’activité de la maladie et à limiter les rechutes chez l'Homme.
Procédures
1 à 12 injections sur animaux vigiles 30 secondes par injection; 1 à 4 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, 30 secondes par prélèvement. 4 à 17 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle, 20 secondes par prélèvement. Lorsqu'il y aura des prélèvements sanguins, ceux-ci seront réalisés le même jour que les prélèvements d'urine. 1 prélèvement sanguin terminal,30 secondes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Lors des manipulations, peuvent être sujettes à stress et angoisse voire des douleurs modérées liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les d’injections, prélèvements d’urine et de sang. Des complications peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation, d’injection ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un léger saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou stress lié à la contention. Une rétention d'eau modérée peut survenir dans les formes sévères de la maladie. Une immunodéficience peut être présente.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique
Remplacement
Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire et le système rénal auxquels nous nous intéressons.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Les souris immunodéprimées seront séparéées et hébergées dans un milieu protecteur adapté à leur statut immunitaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne (comportement, apparence générale, signes cliniques) par le personnel animalier ainsi que par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, ce modèle murin est déjà publié et développé. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature). C'est également l'age des souris dans les articles publiés.
Essais de molécules à visée thérapeutique immunitaire sur modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des molécules candidates par voie orale, sanguine, cutanée, musculaire ou abdominale pendant six semaines, avec des prélèvements de sang répétés, sans qu'aucun analgésique ne puisse leur être administré car il fausserait les mesures immunitaires. Ces essais sont menés à façon pour des laboratoires publics et privés, chaque protocole étant fixé par le partenaire. Le porteur qualifie l'ensemble de "recherche responsable" respectant les 3R, alors que le service consiste à tester en série des composés pour des tiers.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance et l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques chez la souris, dans le cadre d’études réalisées pour des laboratoires publics et privés. Ces molécules peuvent cibler différentes maladies, comme les maladies auto-immunes ou inflammatoires, ou agir sur certaines fonctions précises du système immunitaire. Les expériences consistent à administrer ces molécules à des souris saines ou présentant un modèle de maladie, afin d’étudier les effets sur leur organisme et d’identifier les réponses immunitaires associées. Les modèles utilisés sont choisis en accord avec les partenaires, selon la nature du traitement et les objectifs scientifiques recherchés. Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche responsable : toutes les procédures sont standardisées et encadrées par des protocoles validés, dans le respect de la réglementation et du bien-être animal. Le personnel impliqué est spécifiquement formé et qualifié pour garantir des manipulations sûres, des résultats fiables et la prise en compte des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). En centralisant et en harmonisant ces études, notre unité contribue à la production de données scientifiques robustes tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés et en assurant la qualité éthique et technique des expérimentations.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérance et l’efficacité de composés thérapeutiques développés par différents partenaires académiques et industriels. Ces études précliniques constituent une étape essentielle dans le développement de nouveaux médicaments, avant toute évaluation chez l’être humain. L’objectif scientifique est de déterminer si les molécules testées présentent une activité biologique mesurable et compatible avec une utilisation thérapeutique potentielle. Les données obtenues permettront d’orienter la poursuite du développement de ces candidats, soit vers des études complémentaires, soit vers des essais cliniques lorsqu’ils démontrent un profil de sécurité et d’efficacité satisfaisant. La mise en œuvre de ces expérimentations chez la souris se justifie par la pertinence de ce modèle dans l’étude du système immunitaire et des mécanismes inflammatoires, ainsi que par la possibilité de transposer certaines réponses physiologiques à l’humain. En standardisant ces études au sein d’une même structure d’appui, le projet garantit la fiabilité des résultats, la reproductibilité des analyses et le respect rigoureux du bien-être animal. Il contribue ainsi à la qualité scientifique et éthique des recherches précliniques et à la réduction du nombre global d’expérimentations nécessaires pour valider les candidats thérapeutiques.
Procédures
Administration des traitements candidats : applications de crème et/ou administrations par différentes voie systémique (orale, sanguine, cutanée, musculaire, abdominale) selon le schéma défini avec le partenaire : pendant 6 semaines maximum (durée du geste : environ 0.5 à 3min selon le geste). Une anesthésie gazeuse ou chimique peut être nécessaire suivant la voie d’administration choisie. Prélèvements sanguins (sur animaux vigiles) : le nombre de prélèvement est établi par le partenaire, chaque prélèvement est espacé d’au moins 7 jours (durée : environ 2min) (à partir de J0), et le volume de sang prélevé respectera les limites recommandées pour éviter tout risque pour l’animal. Pesées : 2 fois par semaine, durée : 2 min (à partir de J0). Observation quotidienne (quelques dizaines de secondes par cage) (à partir de J-3). Mise à mort à la fin de l’étude ou plus tôt si un point limite (critère prédéfini indiquant que l’animal ne peut plus continuer l’expérience sans souffrance majeure) est atteint.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront principalement liés à l’administration des traitements, aux anesthésies et aux prélèvements sanguins. Anesthésies : -Isoflurane : Stress lié à la répétition et irritation respiratoire légère. -Anesthésie/analgésie chimique : Récupération lente, diminution transitoire de l’activité motrice, hypothermie, baisse d’appétit, parfois respiration ralentie. Une surveillance rapprochée et des mesures de confort (tapis chauffants, hydratation) seront mises en place. Prélèvements sanguins : Gêne transitoire au point de prélèvement, stress de contention Voies d’administration des composés (préalablement testés pour toxicité par les partenaires, sans effets indésirables attendus) : -Intramusculaire : Douleur locale, gêne musculaire, risque de nécrose. -Sous-cutanée/Intradermique : Douleur modérée, irritation locale, croûtes, réaction inflammatoire locale, persistant de quelques jours à plusieurs semaines. En phase avancée, une mobilité réduite peut survenir en cas de gêne mécanique. -Intraveineuse Rétro-orbitale : Douleur légère. -Intraveineuse Caudale/Intrapéritonéale : Douleur légère, stress de contention. -Voie orale (gavage) : Stress de contention, risque d’irritation œsophagienne. -Voie orale (eau de boisson) : Altération possible du goût, réduction de la consommation. -Topique : Irritation cutanée mineure. Impact global : Chaque intervention (anesthésie, injections, prélèvements, pesées) aura un impact léger à modéré sur le bien-être de l’animal. Cependant, leur répétition ou leur accumulation pourra entraîner un stress plus marqué. Par ailleurs, une réaction systémique exceptionnelle (réponse immunitaire et inflammatoire généralisée) pourrait provoquer une perte de poids ainsi que des signes cliniques généraux et comportementaux. L’ensemble de ces effets indésirables fera l’objet d’un suivi quotidien à l’aide d’une grille de score. Le respect strict des points limites permettra d’assurer l’arrêt ou l’adaptation des procédures avant toute atteinte majeure au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de l’expérimentation. Cette étape est indispensable pour permettre le prélèvement des tissus et organes nécessaires aux analyses histologiques, biochimiques et immunologiques.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire de façon fiable le fonctionnement complet du système immunitaire. L’étude des effets des molécules thérapeutiques doit se faire dans un organisme vivant, où toutes les interactions biologiques et les mécanismes de régulation sont présents. Le modèle murin (la souris) est le plus adapté pour ces recherches, car son système immunitaire est bien connu et proche de celui de l’être humain. De plus, il existe de nombreux outils scientifiques validés permettant d’étudier avec précision les réponses immunitaires chez ce modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans chaque expérience est déterminé à partir de données issues d’expériences précédentes. Cela permet de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables sur le plan statistique, sans multiplier inutilement les essais. Avant toute expérimentation animale, des tests préliminaires réalisés in vitro (en laboratoire sur des cellules, sans animal) par nos partenaires permettent également de réduire le nombre de groupes à tester. En moyenne, chaque groupe comporte huit animaux, un nombre suffisant pour assurer la solidité des résultats tout en limitant le recours à l’animal. Le nombre total de groupes peut varier selon le type de molécule ou le nombre de doses à comparer. Les données recueillies sont ensuite analysées avec des outils statistiques adaptés, afin d’exploiter au mieux les résultats et d’éviter de répéter les expériences. Toutes les procédures sont conçues pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et optimiser la qualité scientifique des études, dans le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement).
Raffinement
Les animaux sont observés chaque jour par un personnel formé et qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de mal-être. Une grille de suivi, adaptée à chaque protocole, permet d’évaluer l’état général des souris (comportement, poids, apparence, activité). Si un seuil critique est atteint, l’animal est retiré de l’étude et mis à mort de manière éthique et respectueuse, selon des procédures validées. Les manipulations pouvant provoquer une gêne ou une douleur sont réalisées par du personnel formé et compétent sous anesthésie appropriée, généralement gazeuse, ou chimique pour les interventions plus douloureuses. Lorsqu’un traitement est administré dans l’eau, la consommation est contrôlée chaque jour. Si le goût modifié entraîne une baisse de consommation, un sirop sans sucre peut être ajouté pour garantir une bonne hydratation et un confort alimentaire suffisant. L’administration d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce projet, car ces produits modifieraient les paramètres immunitaires étudiés. Pour compenser cette contrainte, plusieurs mesures de confort sont mises en place : utilisation de tapis chauffants pendant les anesthésies, manipulation douce et calme pour limiter le stress, alimentation enrichie et hydratée après les interventions, surveillance renforcée durant les périodes sensibles. Toutes les décisions sont guidées par une grille de score et un arbre décisionnel garantissant une évaluation objective et rigoureuse du bien-être animal. Les euthanasies sont réalisées dans des conditions adaptées, à l’écart des autres animaux, afin d’éviter toute source de stress.
Choix des espèces
La souris a été choisie car il s’agit d’un mammifère dont le patrimoine génétique est très proche de celui de l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs). C’est un animal de petite taille, facile à élever et à manipuler, avec un cycle de reproduction rapide, ce qui en fait un modèle de référence en recherche biomédicale. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris est bien connu et présente de fortes similitudes avec celui de l’homme. Cela permet d’obtenir des informations utiles pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires et évaluer le potentiel de nouvelles molécules thérapeutiques avant leur utilisation chez l’humain. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines, moment où leur système immunitaire est complètement mature. L’utilisation d’animaux jeunes adultes (pesant environ 20 g) permet d’assurer des réponses immunitaires stables, de limiter les variations liées à la croissance et de garantir la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux.
Impact de l’injection multiple de nanoparticules d’Apo A1 sur la réparation cérébrale et la récupération fonctionnelle post-ischémie cérébrale chez un modèle de souris C57BL/6J
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie d'occlusion de l'artère cérébrale pendant une heure, puis sept injections quotidiennes et une ponction cardiaque terminale : 80 souris mâles vont être utilisées dans des procédures classées sévères, toutes tuées au troisième ou au septième jour. L'occlusion provoque une faiblesse musculaire, des troubles de la coordination et une perte de poids, suivis par un score clinique quotidien. Le projet évalue des nanoparticules censées limiter les dégâts cérébraux dans la phase qui suit l'accident vasculaire. Le porteur juge le modèle animal "indispensable", les cultures cellulaires ne reproduisant pas la complexité du tissu cérébral.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les effets thérapeutiques des injections répétées de nanoparticules d’Apolipoprotéine A1 (A1NPs) dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Contrairement aux approches classiques centrées sur la phase hyperaiguë (0–24h), ce protocole innovant vise à intervenir pendant la phase subaiguë (de 12h à 7 jours après l’AVC), période durant laquelle la plasticité cérébrale, la neuroinflammation et les mécanismes de cicatrisation gliale deviennent prépondérants. Ce projet s’inscrit dans une perspective translationnelle, avec pour ambition d’ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques post-aiguës, accessibles à un plus grand nombre de patients, au-delà des fenêtres thérapeutiques actuelles. En s’appuyant sur les propriétés neuroprotectrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques des A1NPs, nous visons à réduire la mort neuronale secondaire, améliorer la restauration de la barrière hémato-encéphalique (BHE), moduler la gliose réactive et stimuler la neurogenèse, afin d’optimiser la récupération fonctionnelle post-AVC. Les effets des injections seront évalués à travers des marqueurs histologiques, moléculaires et fonctionnels aux jours 3 et 7 post-AVC. En étudiant les processus clés comme la neuroinflammation, la mort cellulaire, la cicatrisation gliale et la plasticité synaptique, nous espérons mieux caractériser le potentiel thérapeutique des A1NPs et leurs mécanismes d’action dans un contexte post-lésionnel.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un fort potentiel translationnel pour le développement d’un traitement post-ischémique innovant basé sur les A1NPs. Les bénéfices attendus sont multiples : - Bénéfices scientifiques : identification des effets des A1NPs sur les phases post-aiguës de l’AVC, en particulier la réduction de la neuroinflammation, la modulation de la cicatrice gliale et la stimulation de la plasticité cérébrale. Ces résultats combleront un vide critique dans la compréhension des processus de réparation cérébrale. - Bénéfices thérapeutiques : développement d’une approche injectable simple, applicable au-delà de la fenêtre thérapeutique actuelle, et ciblant simultanément plusieurs processus pathologiques de l’AVC. Cette stratégie pourrait significativement améliorer la prise en charge des patients n’ayant pas accès à des traitements aigus. - Bénéfices méthodologiques : validation d’un protocole rigoureux et reproductible pour tester l’efficacité de traitements combinant effets anti-inflammatoires, anti-fibrotiques et neuroprotecteurs. À terme, ce projet pourrait justifier des études cliniques sur les A1NPs et contribuer à la réduction des séquelles invalidantes de l’AVC, qui constitue une priorité de santé publique mondiale.
Procédures
Chaque animal sera soumis aux étapes suivantes : Chirurgie d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) Type : procédure invasive classée « sévère » Durée : 30–45 minutes Description : occlusion transitoire (60 min) par monofilament, sous anesthésie et analgésie, suivie d’une reperfusion. Fréquence : 1 fois par animal répétées Type : procédure modérée Produit : molécule vs contrôle Durée : ~5 minutes par injection Fréquence : 1 injection/jour pendant 7 jours (12 h post-AVC à J7), soit 7 injections par animal Évaluations comportementales non invasives Tests comportementaux : score neurologique, coordination motrice, activité spontanée Durée cumulée : 15–20 minutes/jour Fréquence : 1 fois/jour pendant 7 jours Procédure terminale Type : procédure « sans réveil » Durée : 10–15 minutes Méthode : analgésie, anesthésie générale, ponction cardiaque, prélèvements cérébraux et sanguins Fréquence : 1 fois par animal, à J3 ou J7
Impact sur les animaux
Le modèle MCAO entraîne une ischémie cérébrale transitoire, responsable de déficits neurologiques modérés à sévères : faiblesse musculaire, troubles de la coordination, perte de poids. Ces effets sont suivis quotidiennement par un scoring clinique. Les principales nuisances sont : Douleur postopératoire : contrôlée par buprénorphine systématique Risque hémorragique : limité par une chirurgie microdissection sous microscope, hémostase et instruments stériles Risque infectieux : réduit par antisepsie rigoureuse et surveillance du site opératoire Déficits neurologiques : compensés par enrichissement, accès facilité à l’eau et nourriture, surveillance rapprochée Les injections IV, bien que répétées, sont brèves et réalisées sous anesthésie légère. Les tests comportementaux sont non invasifs et précédés d’une habituation. Le nombre d’animaux (80) est calculé pour assurer la puissance statistique tout en respectant les principes des 3R.
Devenir
À l’issue du protocole expérimental, l’ensemble des animaux inclus dans le projet seront euthanasiés, conformément aux objectifs scientifiques et éthiques du projet. Cette décision est justifiée par la nature même de l’expérimentation, la sévérité du modèle utilisé (AVC ischémique), et les impératifs liés aux prélèvements nécessaires pour les analyses. Le protocole repose sur l’induction d’un accident vasculaire cérébral (MCAO) suivi d’un traitement expérimental par A1NPs. Cette procédure engendre des déficits neurologiques plus ou moins marqués, une altération du comportement locomoteur, ainsi que des modifications histopathologiques cérébrales profondes. Il n’est donc pas envisageable de conserver les animaux à long terme, ni de les réutiliser dans d’autres projets, en raison de leur état clinique post-procédure et de l’impact physiologique des traitements reçus. Par ailleurs, les objectifs scientifiques exigent la réalisation de prélèvements tissulaires (cerveau) et sanguins à des fins d’analyses histologiques, moléculaires et biochimiques. Ces prélèvements ne peuvent être réalisés qu’en fin de vie, après une euthanasie conforme aux standards éthiques. Une perfusion intracardiaque pourra également être réalisée dans certains cas pour optimiser la qualité des coupes histologiques, ce qui implique obligatoirement une euthanasie terminale.
Remplacement
Il existe des modèles in vitro de déprivation en glucose et en dioxygène mimant l’AVC dans la littérature. Mais ces modèles ne miment pas les conditions complexes d’une ischémie cérébrale in vivo puisqu’ils ne prennent pas en compte la complexité physiologique du tissu cérébral. Des tests in vivo ont déjà été réalisés afin de trouver le temps d’occlusion optimale, induisant un moindre taux de mortalité chez les souris. Seul le modèle animal permet donc de reproduire des conditions mimant au mieux une ischémie cérébrale chez l’homme tout en prenant en compte la complexité des types cellulaires recrutés et activés lors d’un AVC. Il apparaît alors indispensable d’avoir recours au modèle animal pour tester nos différentes hypothèses.
Réduction
L’ensemble des expériences ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible, permettant également de réaliser des études statistiques fiables. Les études précédentes au laboratoire, nous permettent d’estimer la variabilité de ces expérimentations et de proposer le nombre optimal d’animaux nous permettant d’avoir une puissance statistique suffisante pour pouvoir valider ou non les hypothèses testées. Un nombre maximum de 80 animaux sera utilisé dans ce projet (à savoir que ce nombre ne sera pas atteint si les points critiques établis par les règlementations éthiques étaient atteints ou si les tests statistiques sont suffisamment forts pour garantir nos résultats). Nous utiliserons des souris mâles pour cette étude car c’est un bon modèle de physiopathologie et nous avons utilisé ce modèle sur nos précédentes études
Raffinement
Les animaux seront placés dans des conditions optimales (les souris seront au nombre de 4 par cage). L’atmosphère sera contrôlée en température et humidité. Ils auront à disposition nourriture et boisson ad libidum. Un enrichissement adapté à ce type d’expérimentations sera mis en place. Une anesthésie générale est prévue avant toute manipulation invasive. Dans un souci de réduction de la douleur, toutes les mesures seront prises pendant les expérimentations (anesthésie, analgésie). Des points limites et des critères d’arrêt sont prévus suivant un tableau de scoring adapté à notre modèle. . De plus, suivant le stade du cycle œstral de la souris femelle, la taille de l'AVC peut être différente et nous avons besoin de contrôler ce paramètre facilement. Donc dans un 1er temps nous allons nous intéresser aux souris mâles dans un souci de réduction et si les résultats sont concluants nous pourrons inclure des femelles synchronisés pour les prochaines études. La souris représente une espèce validée dans ces modèles d’ischémie cérébrale, permettant de plus l’évaluation du handicap post-infarctus. Il existe aussi une similarité du réseau vasculaire cérébral avec l’anatomie humaine (polygone de Willis).
Choix des espèces
La souris a été choisie en raison de sa pertinence reconnue dans les modèles d’AVC ischémique. Son réseau vasculaire, notamment au niveau du polygone de Willis, est proche de celui de l’homme, permettant de reproduire fidèlement les infarctus corticaux humains. Ce modèle est largement validé et utilisé, ce qui facilite la comparaison des résultats et renforce la valeur translationnelle du projet. Le modèle MCAO chez cette souche permet d’analyser avec précision les processus ciblés par notre étude : neuroinflammation, gliose, fibrose et plasticité cérébrale. Notre équipe dispose d’une solide expertise avec ce modèle, ce qui assure une maîtrise technique et limite la variabilité interindividuelle. Le choix de la souris plutôt que du rat s’explique par une meilleure standardisation génétique, une variabilité moindre et une charge animale réduite. Enfin, seules des souris mâles sont utilisées afin de limiter les biais liés au cycle œstral et d’optimiser la reproductibilité. Les animaux utilisés seront exclusivement des souris mâles adultes âgées de 10 semaines, stade où le système neurologique, immunitaire et vasculaire est pleinement mature. Ce choix est scientifiquement pertinent car il permet une modélisation fidèle de l’AVC ischémique humain : les processus étudiés (neuroinflammation, mort cellulaire secondaire, gliose, plasticité) sont comparables à ceux observés chez l’adulte humain. L’emploi de souris juvéniles ou âgées introduirait une variabilité physiopathologique incompatible avec nos objectifs. L’âge de 10 semaines réduit la variabilité expérimentale : les jeunes présentent une plasticité accrue, les âgés des comorbidités influençant la réponse au traitement. Les souris adultes offrent au contraire un poids stabilisé, une immunocompétence homogène et une réponse vasculaire standardisée, assurant la reproductibilité. Enfin, ce stade présente des avantages techniques et éthiques : chirurgie plus précise et tests comportementaux fiables. Ce choix optimise la validité scientifique et le bien-être animal, conformément aux 3R.