Souris

Les souris qui perdent 20 % de leur poids ou atteignent un score clinique de 9 sont mises à mort. 30 souris immunodéficientes NSG sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection de cellules souches humaines pour lui reconstruire un système immunitaire humain, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaires toutes les deux semaines, alternés d'un œil à l'autre. Le porteur signale un risque de réaction du greffon contre l'hôte et retient ce modèle pour éviter le recours au sang de cordon.

Objectifs

Les cellules souches pluripotentes induites sont des cellules souches qui ont la capacité, selon les conditions de leur environnement, de s’orienter vers différents types de lignées cellulaires et notamment vers la voie immunitaire. Ce projet a pour objectif d’utiliser ces capacités, afin de recréer un système immunitaire humain chez des souris (= humanisation) immuno-déficientes (sans système immunitaire) à partir de cellules souches pluripotentes provenant de cellules humaines. L’utilisation de ces cellules va permettre de standardiser un protocole pour la création d’un modèle murin humanisé sans recourir à des cellules issues de sang de cordon humain, couramment utilisées pour l’humanisation, d’avoir un stock conséquent de cellules pour l’humanisation et de pouvoir recréer chez la souris un système immunitaire personnalisé (à partir de cellules reprogrammées issues de cellules de patients).

Bénéfices attendus

Pour comprendre le développement du système immunitaire humain et essayer d’analyser son comportement par rapport à différentes situations, beaucoup de travaux ont été effectués in vitro sur différents modèles cellulaires. Mais les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble notamment dans le cas de la recherche sur les rejets de greffe, l’impact d’un médicament ou autre. C’est pourquoi, pour observer le développement de ces cellules et leurs fonctionnalités, des modèles de souris et de rats humanisés (qui ont un système immunitaire humain) ont été développés. Ces modèles murins humanisés se font aujourd’hui essentiellement par l’injection de cellules issues de sang de cordon ombilicale qui est du matériel cher et précieux dû aux stocks limités. Aussi il est nécessaire souvent d’avoir recours à plusieurs donneurs pour un même protocole pouvant entrainer une variabilité dans les résultats. Ainsi ce projet permettrait d’avoir un modèle de souris humanisé standardisé par des cellules ayant la même origine dans un stade de développement contrôlé. Le stock important permettra également d’en réduire le coût et d’avoir un n plus important pour nos projets. Un autre axe de développement peut être l’étude de maladies génétiques impactant le système immunitaire. Effectivement, des iPSC peuvent être générées à partir de cellules d’un patient touché par une maladie génétique. Alors on pourrait orienter ces cellules vers le stade hématopoïétique avec notre protocole de culture cellulaire et les injecter chez l’animal. Ainsi nous aurions un modèle murin avec un système immunitaire humain comportant la mutation ou le fond génétique spécifique d’une maladie. Par ailleurs, on peut envisager également une modification génétique directement in vitro sur nos iPSC d’individus sains (nos iPSC de travail) afin d’avoir des modèles murins avec des cellules humaines ayant une mutation génétique spécifique.

Procédures

L'humanisation des animaux se fera via l'injection en intraveineux de cellules iPSC. Des prélèvements sanguins auront lieu au bout de 3 mois après l'humanisation sur animal endormi au niveau du sinus retro-orbital. Les prélèvements auront lieu toutes les 2 semaines alternativement à l'oeil gauche puis à l'oeil droit jusqu'à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris NSG qui sont des animaux immunodéficients et par ce fait, sont très sensibles aux infections. Pour ce protocole, les souris pourront avoir une douleur localisée et momentanée au niveau du site d’injection de la greffe. Elles pourront ressentir un stress dû aux manipulations et prélèvements répétés (pesée, prélèvement de sang) ainsi qu’à l’irradiation. L’injection des cellules en soi, peut être rejetée ou bien provoquer la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Ainsi, les souris seront examinées quotidiennement pour évaluer la présence de symptômes.

Devenir

A l'issu de la procédure tout les animaux seront mis mort afin de faire des prélèvements

Remplacement

Beaucoup d’étude sur le système immunitaire ont été réalisées in vitro mais de par sa complexité il est essentiel de l’étudier in vivo dans son ensemble. Et pour cela, un des moyens d’étudier le système immunitaire humain est d’utiliser des modèles murins humanisés, c’est-à-dire, ayant un système immunitaire humain. C’est donc dans ces perspectives d’étude du système immunitaire que nous souhaitons créer ce modèle murin à partir de cellules issues d’iPSC. Mais avant cela, notre laboratoire a réalisé beaucoup d’études uniquement in vitro pour ce projet afin de trouver le bon protocole de culture cellulaire et le passage chez l’animal se fait uniquement avec des cellules dont les propriétés sont celles souhaitées par notre équipe pour le développement du système immun humain chez la souris. Aucun autre test sera réalisé avec des cellules n’ayant pas ces propriétés pour ne pas utiliser d’animaux inutilement.

Réduction

L’efficacité de notre modèle de souris humanisées sera étudiée par le biais de tests statistiques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement analysables et de sorte d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Ce nombre prend aussi en compte le risque de GVHD et de rejet de greffe. Ce nombre de groupes de souris a été défini par la loi normale. Pour juger de l’efficacité de notre protocole, des prélèvements sanguins seront faits afin d’analyser, via la cytométrie en flux, les différentes populations immunitaires chez les animaux. Afin de comparer les groupes entre eux l’analyse des populations se fera via le test one way RM ANOVA

Raffinement

Les souris NSG seront distribuées par 5 maximum par cage avec des moyens d’enrichissement propre à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Les souris étant immunodéficientes, les cages seront entreposées sur un portoir ventilé et les animaux manipulés sous hottes avec des équipements de protection adaptés pour éviter toute infection. Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler un éventuel problème chez une souris (blessure, forte souffrance non observée auparavant) par les expérimentateurs ou les animaliers. De plus pour déceler les signes éventuels d’une GVHD ou de rejet de greffe, une observation plus attentive sera effectuée une fois par semaine selon une liste de symptômes permettant d’évaluer ces processus avec une grille de score (voir tableau annexe). Le même jour, les animaux seront pesés (pesée une fois par semaine) afin de constater une éventuelle perte de poids. Une souris avec l’un des symptômes suivants : perte de 20% du poids par rapport à J0, un refus d’alimentation, une incapacité de mouvement, une voussure sévère du dos ou une diarrhée sanguinolente, aura atteint un point limite et sera mise à mort. L’atteinte d’un score clinique de 9 points ou plus est également considéré comme un point limite. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Concernant les injections, un système de contention adapté sera utilisé et une pommade anesthésiante sera appliquée avant l’introduction de la seringue. Après le prélèvement, du collyre à la lidocaïne sera déposé sur les yeux. Un change de litière (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé. Un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise au rythme jour/nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gant.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : *La souris présente une facilité d'hébergement et de manipulation. *Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe des cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules humaines seraient rejetées par le système immunitaire murin. Les animaux utilisés auront 5 semaines en début de protocole. C’est l’âge idéale décrit dans la littérature et selon l’expérience de notre laboratoire pour injecter des cellules humaines chez des souris.

Pour valider un nouvel appareil d'imagerie de la plateforme, 18 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chaque animal porte une tumeur implantée, reçoit des injections dont une par voie rétro-orbitaire et subit cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur reconnaît une finalité strictement technique, sans bénéfice thérapeutique pour les animaux utilisés. Il annonce que cette validation réduira à terme le nombre d'animaux des projets ultérieurs.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le bon fonctionnement, la sensibilité et les limites d’un nouvel imageur récemment installé sur la plateforme. De plus, nous comparerons les résultats obtenus avec l’appareil déjà en place pour valider la continuité de nos résultats. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle standardisé et déjà décrit. Ces appareils permettent de réaliser des mesures en bioluminescence et en fluorescence. La validation reposera sur : 1- une lignée cellulaire de cancer du sein exprimant la luciférase pour la technologie de bioluminescence 2- le suivi d’un marqueur fluorescent de référence 3- une démonstration in vitro puis in vivo (preuve de concept). Ce projet a pour objectif une finalité technique et méthodologique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la validation technique et méthodologique d’un nouvel imageur destiné à l’imagerie optique par bioluminescence et fluorescence. Cette validation permettra de garantir la fiabilité, la sensibilité et les limites d’utilisation de l’équipement avant son emploi dans des projets de recherche impliquant des modèles animaux. Les résultats obtenus fourniront un cadre de référence standardisé pour les futurs utilisateurs de la plateforme, facilitant le choix des marqueurs, des paramètres d’acquisition et des conditions expérimentales adaptées, et contribuant ainsi à une meilleure qualité et reproductibilité des données générées. Sur le plan de l’éthique animale, ce projet permettra, à moyen terme, une optimisation des protocoles d’imagerie, conduisant à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans les projets ultérieurs grâce à une meilleure anticipation des limites techniques et à l’utilisation de modalités d’imagerie adaptées. Enfin, ce travail renforcera les capacités technologiques de la plateforme et favorisera le développement de projets de recherche translationnelle reposant sur des approches d’imagerie non invasives, sans finalité thérapeutique directe pour les animaux inclus dans ce projet.

Procédures

Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sur la zone d’injection et à imager. Cette opération dure une dizaine de minute. Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée unique. Cette procédure dure une minute. Un tiers des animaux peuvent être soumis à une injection intra-veineuse au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. Un autre tiers des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute/souris). Tous les animaux seront soumis à 5 séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 5 minutes/souris). Trois prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux avant, pendant et à la fin des tests. Ce geste dure environ une minute. Afin de réaliser le suivi et de collecter les données, 3 fois par semaine, les animaux seront pesés et tenus en contention afin de mesurer la tumeur au pied à coulisse. Cette procédure dure environ 2 minutes/souris/

Impact sur les animaux

Les procédures prévues dans le cadre de ce projet sont limitées à des interventions standardisées et couramment utilisées en expérimentation animale, incluant l’injection de cellules tumorales, l’administration de traceurs, l’anesthésie gazeuse transitoire et des séances d’imagerie non invasive. Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations et aux anesthésies répétées de courte durée, susceptibles d’entraîner un stress transitoire chez les animaux. L’implantation tumorale peut conduire à une gêne progressive liée à la croissance de la masse tumorale sous-cutanée ; toutefois, cette évolution est bien maîtrisée et strictement surveillée. Aucun effet indésirable spécifique n’est attendu suite à l’administration de la D-luciférine ou du fluorophore Cy5 aux doses utilisées, ces produits étant largement décrits comme bien tolérés. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier, incluant l’évaluation de l’état général et la mesure du volume tumoral. Des critères d’arrêt anticipé seront appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive, notamment en cas de croissance tumorale rapide, de signes de nécrose, de perte d’état général ou de comportement anormal. Les animaux vont ressentir un stress lors de la contention pour la prise de sang et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour le prélèvement.

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie après les interventions intermédiaires (injection cellulaire, pesées, mesures tumorales, prélèvements sanguins, séances d’imagerie) afin de permettre l’évaluation longitudinale des signaux bioluminescents et fluorescents. À l’issue de l’expérimentation, ou dès l’atteinte des points limites prédéfinis (volume tumoral maximal autorisé, altération de l’état général, ulcération tumorale, détresse), les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tumeurs, conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Le recours au modèle animal est précédé d’une phase de validation in vitro, permettant de vérifier le bon fonctionnement de l’imageur, la détectabilité des signaux et les paramètres d’acquisition dans des conditions contrôlées. Cette étape permet de limiter le recours aux animaux et d’écarter les conditions non adaptées avant toute expérimentation in vivo. Aucune alternative non animale ne permet cependant de reproduire les conditions physiologiques nécessaires à la validation complète de l’imagerie in vivo (comme l’interaction du signal avec la peau ou les organes).

Réduction

Le nombre d’animaux sera strictement limité au minimum nécessaire pour évaluer les performances du nouvel imageur et démontrer que les données produites par celui-ci sont compatibles avec les données obtenues par le service auparavant. Les mêmes animaux seront utilisés pour les acquisitions de bioluminescences et de fluorescences. La maîtrise préalable du modèle tumoral utilisé permet en outre d’optimiser les conditions expérimentales et d’éviter toute surconsommation d’animaux.

Raffinement

Les procédures appliquées sont non invasives ou faiblement invasives et réalisées selon des protocoles standardisés. Les acquisitions d’imagerie seront effectuées sous anesthésie gazeuse de courte durée afin de réduire le stress et la douleur. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier, incluant la surveillance de l’état général et de la croissance tumorale. Des critères d’arrêt anticipé stricts seront appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive. L’euthanasie sera réalisée avant l’atteinte des points limites réglementaires.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme espèce animale pour ce projet en raison de sa large utilisation et de sa pertinence reconnue dans les études d’imagerie optique in vivo. Sa taille, sa physiologie et sa compatibilité avec les systèmes d’imagerie par bioluminescence et fluorescence permettent une acquisition fiable et reproductible des signaux dans des conditions standardisées. Le modèle tumoral murin utilisé, implanté chez des souris C57BL/6 immunocompétentes, permet de préserver un environnement physiologique et immunologique intact, condition essentielle pour une validation réaliste des performances de l’imageur. Ce modèle est particulièrement adapté à une approche méthodologique, car il est bien caractérisé, reproductible et maîtrisé par l’équipe expérimentale. Aucune autre espèce animale ne permettrait de répondre aux objectifs du projet avec un niveau équivalent de pertinence scientifique et technique, notamment pour l’évaluation de la pénétration tissulaire, du bruit de fond et des limites de détection des signaux optiques in vivo. Le recours à la souris est ainsi pleinement justifié au regard des objectifs strictement techniques et de validation de ce projet. Le choix de l’âge de 6 à 8 semaines en début d’étude, soit le stade de jeunes adultes, est pertinent pour cette étude. Il permet d’avoir des individus pleinement développés à un stade fréquent pour ce type d’étude.

Greffées d'une tumeur puis irradiées jusqu'à cinq fois sous anesthésie, 4 560 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Elles reçoivent aussi des injections de complexes de platine testés comme radiosensibilisants contre des cancers de l'œsophage et du col de l'utérus. Le porteur signale une toxicité cutanée, dépilation et plaies, pouvant apparaître des semaines à des mois après l'irradiation. Les bénéfices annoncés pour les patients, un traitement plus efficace et moins toxique, restent renvoyés au long terme.

Objectifs

La combinaison de la chimiothérapie avec la radiothérapie est une stratégie habituelle dans le traitement de certains cancers. Si cette stratégie a fait ses preuves, pour certains cancers le taux de survie globale des patients reste faible, des résistances aux traitements de chimiothérapie apparaissent fréquemment de même que des effets indésirables avec de fortes toxicités secondaires. Nous avons donc développé une nouvelle série de complexes de platine présentant des capacités radiosensibilisantes supérieures au traitement de chimiothérapie de référence. De plus, certains de ces complexes exercent leur effet radiosensibilisant à des doses n’engendrant pas de toxicités ce qui peut constituer un réel bénéfice pour le traitement des patients. Une première étude nous a permis de tester nos complexes sur des lignées de cancer du col de l’utérus, cancer pour lequel les traitements actuels restent insuffisants, en particulier avec le développement des phénomènes de résistance à plusieurs chimiothérapies. Les résultats obtenus in vivo sont très encourageants, nous avons donc étendu notre étude à des lignées de cancer de l’œsophage, dont les traitements actuels sont dans une impasse thérapeutique. Nous avons identifié deux nouveaux complexes qui présentent des activités supérieures à la chimiothérapie de référence in vitro et dont les solubilités sont compatibles avec une étude in vivo. C’est pourquoi nous souhaitons à présent, tester ces complexes in vivo, Cette étude permettra de valider les nouveaux complexes sur des modèles in vivo de tumeurs issues de différentes lignées cellulaires cancéreuses de l’œsophage dans un premier temps. Si les résultats sont positifs, nous envisageons de valider les composés hit sur d’autres modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires résistantes à certaines chimiothérapies, telles que les cancers d’ovaires, de poumons, de sein.., après validation in vitro. Cette étude a pour but de déterminer si les complexes choisis pourraient être envisagés comme de potentiels nouveaux médicaments qui, administrés en combinaison avec la radiothérapie, auraient des effets supérieurs aux traitements radiothérapie-chimiothérapie actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Les expériences programmées in vivo ont pour but de valider la stratégie de combinaison radiothérapie-chimiothérapie avec de nouveaux complexes métalliques sur les xénogreffes issues de lignées cellulaires commerciales issues de différents cancers dont les traitements actuels chimio/radiothérapie restent insuffisants Ainsi, si cette étude préclinique combinant des deux traitements apporte un effet synergique comparé aux traitements isolés, alors ces complexes pourraient être envisagés dans le cas des cancers de l’œsophage. Ces complexes pourraient également être pertinents sur des modèles tumoraux ayant acquis une résistance au traitement de chimiothérapie de référence et dans le cas d’autres cancers incurables pour lesquels la combinaison chimiothérapie/ radiothérapie est déjà préconisée mais pas assez efficace. A plus long terme, nous pourrons donc envisager de proposer un traitement plus efficace et présentant moins d’effets secondaires aux patients.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutané (une fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 1 min par souris) sur animal vigile. La croissance des tumeurs est observée par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine (durée de la mesure inférieure à 1 min). Lorsque les tumeurs atteignent un volume tumoral seuil, les souris sont placées sous anesthésie générale gazeuse afin de procéder aux différents schémas d’irradiations (durée maximale de 20 min par souris, répétée au maximum 5 fois au cours de l’expérience). Le poids des animaux et la croissance tumorale sont ensuite observés jusqu’à la fin de l’expérience. Dans un second lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutané (une fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 1 min par souris) sur animal vigile. La croissance des tumeurs est observée par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine (durée de la mesure inférieur à 1 min). Lorsque les tumeurs atteignent un volume tumoral seuil, les composés d’intérêt sont injectés aux souris vigiles, puis elles sont placées sous anesthésie générale gazeuse afin de procéder aux irradiations (dose et fractionnement défini avec le premier lot d’animaux, durée de l’injection des composés inférieur à 1 min, durée de l’irradiation inférieur à 20min). Le poids des animaux et la croissance tumorale sont ensuite observés jusqu’à la fin de l’expérience.

Impact sur les animaux

L’inoculation de cellules cancéreuses conduira au développement de tumeurs sous la peau. Pour cette inoculation la gêne occasionnée sera équivalente à celle d’une piqure d’aiguille (gêne de courte durée) Le développement de la tumeur si elle devient trop grosse peut engendrer une gêne lors des déplacements de l’animal. L’administration des traitements peut induire une douleur équivalente à celle d’une piqure d’aiguille (gêne de courte durée). Du stress peut être induit chez l’animal lors de la contention (durée du geste

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des études in vitro ont été menées au préalable afin de valider nos hypothèses. Pour l'évaluation pré-clinique des traitements, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris avant une application clinique chez l’homme.

Réduction

Avant toute procédure sur animal, des tests in vitro sont pratiqués afin de procéder à plusieurs vérifications (radiosensibilité des lignées cellulaires, réponses des lignées aux complexes de platine…) et permettre la sélection des lignées d’intérêts, des complexes les plus efficaces et donc une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux que nous prévoyons d’utiliser dans la procédure 2 pourrait être réduit de moitié si aucune différence significative n’est trouvé entre les sexes lors de l’analyse des résultats de la procédure 1. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test statistique adapté.

Raffinement

Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les souris seront suivies deux fois par semaine pour s’assurer de leur bien-être et les expériences seront arrêtées en cas d’atteinte de points limites définis dans la grille de score. Dans le cas d’une perte de poids liée aux traitements, des aliments gélifiés, des croquettes humides et une réhydratation parentérale seront mis en œuvre. Les souris seront placées sous anesthésie générale gazeuse pendant toute la durée de l’irradiation. Un tapis et/ou une lampe chauffante sont utilisés lors des phases d’endormissement et de réveil afin de maintenir la température corporelle de l’animal. En cas d’apparition d’une toxicité cutanée suite à l’irradiation, une crème cicatrisante sera appliquée jusqu’à disparition des lésions.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en cancérologie et radiothérapie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés au stade adulte, car les cancers ciblés se développent chez l’adulte. Les souris Nude arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats.

8 800 souris vont être utilisées sur quatre ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées et 200 réutilisées dans d'autres projets. On remplace leurs cellules hépatiques par des cellules humaines pour tester des candidats médicaments, après des injections détruisant leurs propres hépatocytes. Le porteur présente ce modèle comme plus acceptable que le recours aux primates non-humains. Il reconnaît n'avoir mené aucun calcul statistique, l'effectif reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur un plan commercial de croissance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

472 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'effet préventif d'une molécule sur la douleur. Toutes reçoivent une injection de la molécule ou d'un placebo, 252 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel et 220 une injection d'un composé inflammatoire. La sensibilité est mesurée avant et après par des filaments pressés sur la patte. Les animaux sont tués moins de dix-huit heures après l'intervention pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4, dont la perte de fonction chez la souris transforme une douleur aigue (inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire) en douleur chronique. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeutique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Récemment, nous avons montré que l'injection de Tafa4 avant une lésion post-opératoire empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de Tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeutique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.

Bénéfices attendus

Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre quels types cellulaires permets la mise en place de l'hypersensibilité ouvrira un nouveau panel de solutions pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.

Procédures

Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons amenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutanée sur toutes les souris (472). 252 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie générale. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 220 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à recevoir l’administration de composés par injection intra-péritonéale et sous-cutanée. L’injection de ces produits n’entraine pas d’effet indésirable sur les animaux mais la contention et l’injection peut générer un stress chez les souris. De plus, nous utiliserons des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire ou post-opératoire qui pourraient entrainer une douleur légère qui n'a pas d'incidence sur le comportement de l'animal. Le test d'hypersensibilité appelé test de Von Frey engendrera un léger stress et au cours duquel on évoquera une contrainte sur une patte. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et notamment l’effet préventif de TAFA4.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Nos études se concentreront essentiellement sur la peau de la patte, mais nous utiliserons également d'autres tissus de chaque animaux pour pouvoir avancer sur d'autres projets parallèles.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie lors du procédé chirurgical et des soins préopératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Après une lésion, de la nourriture humide sera placée au sol pour éviter que les animaux ne se dressent sur leur patte lésée. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Moins de 18 heures après l'intervention sur les animaux, ceux-ci seront mis à mort.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moelle épinière) sont parfaitement décrit chez la souris. Il est clairement admis et recommandé par la communauté scientifique que les expériences de comportement soient réalisées sur des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie.

Réutilisées ensuite dans d'autres procédures légères ou sans réveil, 40 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul quatre semaines, reçoit un gavage de bactéries porteuses de gènes de résistance aux antibiotiques et, pour la moitié, deux injections sous la peau. Le projet compare des souches bactériennes fluorescentes pour choisir la plus détectable, étape préalable à une future étude sur le stress. Le porteur qualifie la procédure de sans dommages, alors qu'il la classe lui-même en gravité modérée.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Elle est à la fois liée à une mauvaise utilisation des antibiotiques mais également à la capacité d’autres facteurs à stimuler les transferts de gènes de résistance entre bactéries, notamment au sein du microbiote intestinal. Notre thématique de recherche vise à évaluer comment un stress chronique pourrait augmenter la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du microbiote intestinal. Pour cela, nous utilisons un modèle de stress chez des souris à qui nous avons administré des bactéries non pathogènes portant des gènes de résistance aux antibiotiques. Afin d’étudier l’effet du stress sur les transferts génétiques, nous devons utiliser une souche de bactérie qui soit d’une part capable de s’implanter de façon durable dans le microbiote de la souris et d’autre part qui soit facilement détectable et quantifiable par des techniques basées sur des marqueurs fluorescents. L’objectif de ce projet est de comparer deux espèces bactériennes différentes et possédant des marquages fluorescents différents pour le suivi de leur capacité à persister dans le microbiote intestinal de la souris. Nous comparerons ainsi les performances de leur détection selon les molécules fluorescentes utilisées. Ce projet est une étape préliminaire indispensable pour choisir la meilleure souche de bactérie qui permettra de caractériser l’impact du stress chronique sur la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la colonisation des différentes souches donneuses. Parmi les quatre souches testées, celle qui présentera la meilleure persistance ainsi que la meilleure détection en termes de signal fluorescent sur l’ensemble des 21 jours de protocole sera sélectionnée.

Procédures

L'ensemble des animaux subira un gavage (durée du geste = 30 secondes) de bactéries, et certains d'entre eux (n=20) auront en plus deux injections sous la peau (durée du geste = 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris seront hébergées individuellement pendant une durée de 4 semaines. Elles subiront un gavage de bactéries, et certaines d'entre elles auront en plus deux injections sous la peau.

Devenir

Les animaux dans ce projet sont utilisés dans une procédure modérée n'entrainant pas de dommages. Ils seront ré-utilisés en fin de procédure uniquement sur des procédures légères (telles que des travaux pratiques) ou des procédures sans réveil.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier les processus de colonisation dans un milieu complexe tel que l’intestin. En effet la colonisation est liée aux caractéristiques de l’hôte et de la bactérie donneuse de gènes de résistance aux antibiotiques. Les caractéristiques intestinales de l’hôte sont complexes et ne peuvent être à ce jour reproduites sur des modèles alternatifs in vitro ou informatiques. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte.

Réduction

L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets tout en garantissant une fiabilité forte des résultats.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au sein du microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles de 8 semaines. De plus ces souris sont majoritairement utilisées et caractérisées dans les études liées au microbiote. En particulier, la dose de bactéries donneuse à administrer a été précédemment déterminée dans des souris.

Immunodéprimées pour accepter des fragments de tumeurs mammaires humaines, 271 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chaque animal subit une greffe tumorale, des traitements par gavage ou injection sur quatre à cinq semaines, puis un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Le projet cherche à comprendre la rechute des cancers du sein après traitement. Le RNT détaille longuement les mesures de bien-être des animaux non-humains, qui sont pourtant tous mis à mort une fois les prélèvements réalisés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier, dans des modèles de xénogreffes dérivées de patients, les mécanismes biologiques associés à la réponse, à la récidive et à l’acquisition de résistances aux traitements anticancéreux dans des tumeurs mammaires humaines présentant des altérations de la réparation de l’ADN. Plus précisément, le projet vise à : • suivre l’évolution des populations cellulaires tumorales au cours du temps, avant, pendant et après traitement ; • identifier des sous-populations cellulaires associées à la persistance tumorale et à la récidive ; • comparer les dynamiques tumorales et clonales observées selon différents contextes biologiques de réparation de l’ADN ; • évaluer l’intérêt de biomarqueurs circulants, tels que les cellules tumorales circulantes et l’ADN tumoral circulant, comme outils de suivi non invasif de l’évolution tumorale et de la réponse aux traitements. Ces objectifs sont poursuivis à l’aide de procédures expérimentales in vivo permettant le suivi longitudinal de la croissance tumorale, la réalisation de prélèvements tissulaires et sanguins à des temps définis, ainsi que l’analyse corrélée des données tumorales et circulantes. Les résultats attendus visent à améliorer la compréhension des mécanismes de résistance et à contribuer à l’identification de stratégies thérapeutiques adaptées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes biologiques associés à la rechute tumorale après traitement anticancéreux dans des modèles de cancer du sein. Il permettra d’identifier et de caractériser des sous populations de cellules tumorales capables de persister après le traitement et de contribuer à la reprise de la croissance tumorale. Ces sous-populations pourront être étudiées directement au niveau des tumeurs, mais également dans le sang des animaux. Les cellules tumorales circulantes, définies comme des cellules cancéreuses issues de la tumeur primaire et libérées dans la circulation sanguine, ainsi que l’ADN tumoral circulant, correspondant à des fragments d’ADN libérés par les cellules tumorales, seront analysés comme indicateurs de l’évolution tumorale. L’étude de ces paramètres sanguins pourrait permettre d’obtenir des informations sur l’état de la tumeur sans recourir à des prélèvements tumoraux répétés. Les résultats attendus contribueront au développement de stratégies précliniques visant à mieux comprendre la résistance aux traitements anticancéreux et à identifier des marqueurs biologiques pertinents pour le suivi de la maladie.

Procédures

Au cours du projet, les souris seront soumises à plusieurs types d’interventions, réalisées sous anesthésie et avec prise en charge de la douleur lorsque nécessaire. Tout d’abord, certaines souris subiront une intervention chirurgicale afin d’implanter un petit fragment de tumeur, soit sous la peau, soit au niveau de la glande mammaire. Cette intervention dure en moyenne quelques minutes par animal. Une analgésie et une anesthésie générale sont systématiquement utilisées, et les animaux sont surveillés après l’intervention jusqu’à leur réveil complet. Lorsque les tumeurs auront atteint une taille définie, les souris recevront des traitements médicamenteux, soit par administration orale (gavage), soit par injection dans la cavité abdominale. À différents moments de l’étude administration orale (gavage), soit par injection dans la cavité abdominale. Ces traitements sont réalisés plusieurs fois par semaine, sur une durée de 4 à 5 semaines, selon le groupe expérimental. À différents moments de l’étude, certaines souris feront l’objet d’un prélèvement sanguin terminal, réalisé sous anesthésie profonde afin d’éviter toute douleur. Ce prélèvement permet d’analyser la présence de cellules tumorales et d’ADN tumoral dans le sang. Immédiatement après ce prélèvement, les animaux sont mis à mort selon une méthode réglementaire, sans reprise de conscience. Dans certains cas, les tumeurs seront également prélevées chirurgicalement afin d’être analysées ou réimplantées dans d’autres animaux. Ces gestes sont réalisés sous anesthésie et dans des conditions identiques à celles des autres interventions chirurgicales. Tout au long de l’étude, les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne, incluant l’observation de leur comportement, la mesure du poids et de la taille des tumeurs, afin de s’assurer de leur bien-être et d’interrompre l’expérience si des signes de souffrance apparaissent.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont principalement liées aux interventions chirurgicales, à la croissance tumorale, aux traitements administrés et aux prélèvements biologiques. Les greffes tumorales, réalisées par voie sous-cutanée ou orthotopique, constituent des interventions chirurgicales légères pouvant entraîner une douleur transitoire et un léger inconfort post-opératoire. La croissance des tumeurs peut générer un inconfort progressif, notamment lorsque le volume tumoral augmente, pouvant s’accompagner de modifications de la mobilité des animaux. Les traitements administrés peuvent induire des effets indésirables transitoires tels qu’une diminution de l’activité, de l’appétit ou une perte de poids modérée. Les prélèvements sanguins réalisés par ponction intracardiaque sont effectués sous anesthésie générale et après mise en place d’une analgésie adaptée ; ils constituent une nuisance ponctuelle et terminale. L’ensemble de ces nuisances est suivi attentivement tout au long du projet afin de limiter l’impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

À l’issue de chaque procédure expérimentale, le devenir des animaux est strictement encadré et dépend des objectifs scientifiques de l’étude ainsi que de leur état de santé. Lorsque les prélèvements biologiques nécessaires à l’étude sont réalisés, ou lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints, les animaux sont mis à mort selon une méthode réglementaire, réalisée sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute douleur ou détresse. Cette mise à mort permet la collecte d’échantillons indispensables à l’analyse scientifique. Par ailleurs, si au cours de l’étude un animal présente une dégradation de son état général, une perte de poids importante, une gêne liée à la tumeur ou tout autre signe indiquant une altération de son bien-être, l’expérimentation est immédiatement interrompue pour cet animal. Dans ce cas, une mise à mort anticipée est réalisée afin de prévenir toute souffrance inutile. Aucun animal n’est maintenu en expérimentation au-delà de ce qui est strictement nécessaire. L’ensemble des décisions concernant le sort des animaux est pris par du personnel formé et expérimenté, dans le respect de la réglementation en vigueur et avec pour priorité la protection du bien-être animal.

Remplacement

Pas de possibilité de remplacement. Au sein de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques histologiques et moléculaires des tumeurs de patients, mais aussi celles de l'environnement tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction. Les effectifs ont été définis afin de permettre des comparaisons fiables entre les groupes d’animaux recevant différents traitements, tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. Cette estimation repose sur des données issues d’études préliminaires et de la littérature scientifique, qui ont permis d’anticiper la variabilité des réponses tumorales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, les prélèvements biologiques sont réalisés à différents moments clés du suivi sur des sous-groupes distincts d’animaux, ce qui évite la répétition inutile des expériences. De plus, les pertes potentielles liées à l’absence de prise de greffe ou à une croissance tumorale inadaptée sont anticipées dès la conception de l’étude, permettant d’obtenir les effectifs nécessaires sans recourir ultérieurement à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tout au long du projet, des mesures de raffinement sont mises en place afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les interventions chirurgicales, les traitements et les prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, associés à une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après les actes. Les animaux bénéficient d’une surveillance clinique quotidienne incluant l’observation du comportement, de l’état général, de la prise alimentaire et de l’hydratation. Le poids corporel est mesuré régulièrement afin de détecter précocement toute altération de l’état de santé, indépendamment de la croissance tumorale. La progression tumorale est suivie de manière régulière afin d’anticiper toute gêne ou inconfort pour l’animal. Des critères précoces et prédictifs permettent d’interrompre l’expérimentation pour un animal donné dès qu’une altération de son bien-être est observée, sans attendre l’apparition de signes sévères. Des mesures de soutien, telles que l’administration d’antalgiques, une hydratation adaptée ou une alimentation plus appétente, sont mises en place dès que nécessaire. Les conditions d’hébergement sont enrichies afin de limiter le stress et de favoriser le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Lorsque les objectifs scientifiques sont atteints, ou si l’état général d’un animal se dégrade, celui-ci est mis à mort selon une méthode réglementaire réalisée sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute douleur ou détresse inutile.

Choix des espèces

Le projet utilise des souris de laboratoire, car il s’agit de l’espèce la plus adaptée pour étudier l’évolution de tumeurs humaines dans un organisme vivant. La souris est un modèle largement utilisé en recherche biomédicale, en particulier dans le domaine du cancer, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Elle permet d’étudier la croissance des tumeurs, leur réponse aux traitements et l’apparition de rechutes dans des conditions proches de la réalité clinique. Le recours à la souris est indispensable dans ce projet, car les phénomènes étudiés, tels que l’évolution des tumeurs au cours du temps, leur interaction avec l’organisme et la présence de marqueurs tumoraux dans le sang, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des modèles alternatifs comme les cultures cellulaires ou les simulations informatiques. Les souris utilisées sont des animaux immunodéficients, ce qui permet l’implantation et le développement de fragments tumoraux humains sans rejet par le système immunitaire. Ce choix est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet et obtenir des résultats interprétables. Seuls des animaux adultes sont utilisés dans cette étude. L’utilisation de souris à un stade de développement mature permet de limiter la variabilité biologique liée à la croissance et d’éviter toute interférence avec les phases de développement de l’animal. Aucun animal en gestation, nouveau-né ou juvénile n’est utilisé. Le choix de l’espèce et du stade de développement a été réalisé afin de garantir la pertinence scientifique du projet tout en respectant les principes éthiques de l’expérimentation animale. Le nombre d’animaux est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, et toutes les mesures appropriées sont mises en place pour assurer leur bien-être tout au long de l’étude.

Pour évaluer si un médicament de l'hypercalcémie prévient la fragilité de l'émail dentaire, 48 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Elles reçoivent le produit par gavage quotidien, avec des prélèvements sanguins mensuels et des passages au microscanner sous anesthésie. Les gavages répétés exposent à un risque de fausse route et d'inflammation. Le porteur vise un intérêt clinique pour des patients pédiatriques atteints de la maladie, et tue les animaux pour analyses ex vivo.

Objectifs

La maladie génétique étudiée a pour conséquences une augmentation du taux de calcium dans le sang et une fragilité congénitale de l’émail. Un médicament, utilisé habituellement pour corriger l’augmentation du taux de calcium dans le sang, va être testé sur des souris qui présentent la même maladie. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’efficacité du médicament sur la fragilité dentaire. Les souris vont recevoir ce médicament tous les jours par voie orale. La fragilité dentaire sera évaluée par scanner sur l'incisive à croissance continue. A terme, ce travail aurait un impact clinique direct car il permettrait de discuter l’intérêt de ce traitement chez des patients pédiatriques atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Évaluer l’impact du médicament sur la prévention de la fragilité de l'émail dentaire et discuter l’intérêt du médicament chez des patients pédiatriques porteurs de la maladie génétique étudiée.

Procédures

L’administration orale quotidienne du médicament par gavage peut induire un stress léger. Le prélèvement sanguin sur animal vigil peut induire un léger stress lié à la contention. L’imagerie des animaux réalisée sous anesthésie peut induire un stress léger.

Impact sur les animaux

Les animaux seront traités par gavage tous les jours par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress. Les nuisances attendues sont donc principalement liées à la contention. Il existe également un risque de fausses routes ou d’inflammation causée par les gavages répétitifs. En l’absence de complication, le geste de gavage n’induit pas de douleur ou une douleur légère. L’administration orale du médicament ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la dose administrée. Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire pour mesure de la calcémie sera réalisé une fois par mois par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress (3 prélèvements au total). Les nuisances attendues sont donc principalement liées à la contention. Le microscanner sera réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront anesthésiés pendant au plus 10 minutes pour la réalisation du microscanner. Les nuisances attendues sont donc principalement liées au stress lié à l’anesthésie.

Devenir

Mise à mort pour analyses ex vivo

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de tester cette hypothèse.

Réduction

A l’aide d’un test statistique approprié, il a été calculé que, pour obtenir un résultat exploitable, 16 souris seraient nécessaires par type de mutation génétique : 8 souris seraient traitées par le médicament et 8 souris recevraient un placebo. Parmi les souris, 4 seraient des mâles et 4 seraient des femelles, car la maladie génétique étudiée concerne autant les femmes que les hommes.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse. Le suivi régulier des animaux et la mise en place de points limites stricts et spécifiques permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress.

Choix des espèces

L’étude va porter sur des souris car il s’agit d’un bon modèle de la maladie génétique étudiée. Les souris seront traitées à l’âge adulte, soit à partir de l’âge de 2 mois, jusqu’à l’âge de 4 mois. L'incisive à croissance continue constitue un bon modèle de formation de l'émail.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, soumises six semaines durant à un stress chronique léger imprévisible destiné à induire un état dépressif. Chaque animal subit quatorze prélèvements de glycémie par incision de la veine caudale, des isolements et des injections quotidiennes. Le protocole cible les femelles, seules à développer une insulinorésistance dans ce modèle. Le porteur écrit que le raffinement restera limité, l'objectif même du projet étant l'induction d'une symptomatologie dépressive.

Objectifs

La dépression est un problème majeur de santé publique, associé à un risque accru de maladies cardiovasculaires, métaboliques et à une mortalité élevée. La résistance à l’insuline semble jouer un rôle clé dans ces comorbidités, et elle pourrait aussi moduler la réponse aux traitements antidépresseurs. Les mécanismes liant dépression, insulinorésistance et neuroinflammation restent mal compris. Nous avons développé un modèle murin combinant symptômes dépressifs et insulinorésistance sans obésité, basé sur le stress chronique léger imprévisible ppliqué pendant six semaines. Ce modèle induit un état dépressif chez les deux sexes, mais seules les femelles présentent une insulinorésistance et une hyperinsulinémie. Le projet proposé vise donc à (1) évaluer l’effet de traitements antidiabétiques et insulino-sensibilisateurs sur les paramètres métaboliques et le comportement dépressif, et (2) étudier les mécanismes reliant insulinorésistance, neuroinflammation et dépression chez les souris femelles.

Bénéfices attendus

La dépression majeure est associée à une morbidité élevée, un handicap psychique et une mortalité accrue, incluant les événements cardiovasculaires liés à des altérations cardiométaboliques, notamment la résistance à l’insuline. Les mécanismes physiopathologiques liant dépression et insulinorésistance restent mal connus, limitant le développement de biomarqueurs et de stratégies thérapeutiques ciblées. L’étude des interactions entre dépression, insulinorésistance et régulation métabolique dans un modèle murin permettra de mieux comprendre ces mécanismes. L’approche pharmacologique combinera plusieurs stratégies actuellement utilisées en clinique ou en phase de développement. Ces interventions visent à améliorer la sensibilité à l’insuline, à moduler le risque cardiométabolique et à influencer des processus biologiques liés à la dépression, comme l’inflammation et la signalisation neuro-métabolique. Leur évaluation intégrée dans un même modèle permettra de caractériser les liens mécanistiques entre dysfonction métabolique et comportements dépressifs, et d’identifier des pistes thérapeutiques agissant sur les dimensions psychiatriques et cardiométaboliques de la maladie.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour ces tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un isolement de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Le test en lui-même dure 2h, l’isolement total sera de 8h. Pour les tests comportementaux, ceux-ci sont indispensablesindispensable afin de pouvoir évaluer l’induction du syndrome dépressif. Aucun prélèvement ne sera effectué, la nuisance principale de ces tests étant l’isolement (30 minutes à 2h en fonction du test). Lors des traitements pharmacologiques quotidiens, une injection de 200 µl pour une durée maximum de 5 secondes sera effectuée.

Impact sur les animaux

Le présent travail a pour base l’induction d’une symptomatologie dépressive, à travers des stress répétés, d’intensité légère, de survenue aléatoire pour les animaux. Maintenant que nous maîtrisons le modèle nous sommes susceptibles d’observer : une perte d’envie une diminution de l’appétit une baisse d’énergie une apathie Dans le même sens, il subsiste un risque rare de déshydratation et de perte pondérale (moins de 10% de la masse initiale).

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

La dépression et les maladies cardiométaboliques potentiellement associées, peuvent être vues dans une approche systémique, avec des conséquences négatives sur de nombreux tissus et organes. Afin d’explorer au mieux cette dimension multi-systémique, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Pour réaliser ce travail, nous nous nous sommes basés sur des études antérieurement publiées et notre expérience acquise lors de la mise au point du modèle. Sur les 17 articles pertinents retrouvés, 11 ont portés sur des souris C57BL/6. Les tailles d’échantillon (pour les souris soumises au UCMS) variaient de 07 à 64, avec une médiane de 22,5 par condition/sexe. Au vu de ces éléments et de notre expérience préalable, en considérant l’éventualité de souris ne répondant pas au protocole UCMS, c’est-à-dire ne présentant pas de signes de dépression lors des tests comportementaux, nous avons défini à 24, le nombre de souris UCMS par groupe nécessaire à notre projet. La significativité statistique entre plusieurs groupes sera déterminée par une analyse de variance suivie d’un test de Tukey-Kramer. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney.

Raffinement

Avant la mise en application des épreuves constitutives UCMS, et ce pendant deux semaines (entre la 10ème et la 12ème semaine d’âge de la souris), les animaux seront placés par groupes de quatre dans des cages avec contrôle de la température et de l’humidité (22 ± 2°C, et 65 ± 5%), avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, et des alternances lumières/obscurité de 12h (lumière à 7h du matin, obscurité à 7h du soir).Cependant, le raffinement sera limité du fait de l’objectif du projet, en l’occurrence l’induction d’une symptomatologie dépressive. Pendant la période d’administration UCMS, les souris seront hébergées en cages individuelles en journée afin de subir les différents stresseurs puis retourneront dans leurs cages d’origine pour la période obscurité.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées dans la littérature scientifique, notamment en ce qui concerne les maladies mentales (dont la dépression et la schizophrénie), ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de la symptomatologie dépressive par stress chronique léger imprédictible sera réalisée chez des souris de douze semaines. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes et est idéal pour induire tout type de conditionnement chez la souris puisque d’après la littérature, ce type d’expérimentation montre son efficacité maximale chez des animaux âgés de 12 à 24 semaines. Considérant une durée de stress de six semaines, suivie de trois semaines de traitement pharmacologique, les souris seront âgées de 20 semaines à la fin de la procédure. Les tests comportementaux inhérents à la vérification de la validité du modèle seront réalisés dans les trois semaines après chez toutes les souris, et les prélèvements finaux à 23 semaines de vie.