Souris
Vaccination ARNm contre la tuberculose: étude préclinique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6 192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 5 040 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 152 un niveau modéré. Elles reçoivent deux injections de vaccin à ARNm à trois semaines d'intervalle sous anesthésie, une partie recevant en plus un anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines à l'état vigile, avant une exposition à la bactérie de la tuberculose par aérosol. Le porteur décrit des effets indésirables "légers" liés aux injections, et pour les souris infectées une perte de poids, une baisse d'activité et des troubles respiratoires chez les individus "insuffisamment protégés par la vaccination". L'effectif est présenté comme un maximum, réduit en cours de route par un schéma "en entonnoir", sans que le nombre de souris par groupe soit indiqué.
Objectifs
Le projet vise à développer des stratégies de vaccination à base d’ARNm pour lutter contre la tuberculose (TB), une maladie qui reste un défi majeur de santé publique mondiale. Actuellement, la TB est responsable de près de 1,5 millions de décès chaque année, en particulier dans les pays à faible et moyen revenu. Le vaccin BCG existant offre une protection partielle chez les jeunes enfants mais montre une efficacité limitée contre la TB pulmonaire chez les adolescents et les adultes. Ce projet repose sur l’exploitation de la plateforme vaccinale d’ARNm et de ses succès récents pour concevoir un vaccin plus efficace contre la TB. L’objectif principal du projet est d’explorer le potentiel de la vaccination ARNm pour stimuler des réponses robustes des cellules T, essentielles pour combattre l'infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Les vaccins à ARNm, bien qu'ayant prouvé leur efficacité contre des agents pathogènes viraux tels que le SARS-CoV-2, n'ont pas encore été pleinement exploités contre les bactéries et notamment Mtb. Le projet innove en adaptant cette technologie pour cibler spécifiquement la TB, en utilisant des antigènes de Mtb identifiés pour leur capacité à déclencher des réponses immunitaires protectrices chez les personnes ayant contrôlé l'infection.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourraient contribuer à des avancées majeures dans la lutte contre la TB, en offrant une alternative vaccinale capable d’induire une immunité. Les données obtenues permettront non seulement d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité protectrice des candidats vaccins ARNm, mais aussi d’identifier des corrélats de protection, essentiels pour guider les essais cliniques futurs. Ce projet se distingue par son approche collaborative entre équipes sud-africaines et françaises, avec des expertises complémentaires en conception et formulation de vaccins à ARNm et en études d’immunogénicité et de protection en modèles murins. En outre, le projet prévoit une large diffusion des résultats, notamment par des publications scientifiques et des présentations lors de conférences. La collaboration avec des institutions de renommée internationale assurera la transition des candidats vaccins les plus prometteurs vers des essais précliniques ou cliniques.
Procédures
Les animaux recevront une vaccination (deux injections à 3 semaines d'intervalle dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi). Une partie des souris recevra en addition l’administration répétée d'un anticorps thérapeutique, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (3 fois par semaine) pendant 4 semaines. Certaines souris seront exposées à la bactérie responsable de la tuberculose : ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes.
Impact sur les animaux
Chez les animaux recevant une vaccination, des effets indésirables légers sont attendus, principalement liés à l’injection et à l’anesthésie, pouvant inclure un stress transitoire et une irritation locale au point d’injection. L’administration d’anticorps peut également provoquer un stress léger lié à la contention nécessaire. Chez les animaux infectés par Mycobacterium tuberculosis, les nuisances attendues sont principalement liées au développement progressif de la pathologie pulmonaire expérimentale. Elles peuvent inclure une perte pondérale, une diminution d’activité ou des troubles respiratoires chez certains individus sensibles ou insuffisamment protégés par la vaccination. De manière générale, les animaux peuvent présenter un stress léger lors des manipulations nécessaires aux différentes étapes du protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou si leur état le nécessite, conformément à la réglementation en vigueur. Cette intervention sera réalisée par du personnel formé, dans des conditions garantissant une prise en charge rapide et sans souffrance. Cette étape est nécessaire pour permettre la collecte de tissus et d’organes dans des conditions optimales en vue des analyses prévues à l’étude. Aucune réutilisation n’est envisagée, car les procédures mises en œuvre ne permettent pas un nouvel usage des animaux.
Remplacement
Nous nous intéressons dans ces procédures à l’impact de la vaccination dans la tuberculose. La vaccination nécessite un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclu les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base des données préliminaires afin de garantir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. Le nombre utilisé est un nombre maximal dans la mesure où nous appliquons un schéma en entonnoir qui permet de ne sélectionner que les conditions expérimentales les plus pertinentes au fur et à mesure de l’avancement du projet. Des analyses multiples sur un même animal réduisent la variabilité et le nombre total de souris nécessaires. Nos expériences antérieures ont permis d’affiner les tailles de groupe et d’ajuster les procédures afin de garantir la puissance statistique tout en limitant strictement le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans ce projet, plusieurs mesures spécifiques sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les injections de vaccin et les procédures nécessitant une immobilisation sont réalisées sous anesthésie adaptée pour éviter la douleur et limiter l’angoisse. Après chaque vaccination, les animaux bénéficient d’une surveillance renforcée du point d’injection et de leur état général, afin de détecter rapidement toute réaction inhabituelle. Pour les phases d’infection expérimentale, une attention particulière est portée à la respiration, au comportement et au poids des souris, car ces paramètres peuvent refléter l’évolution de la maladie. Des points limites stricts, définis spécifiquement pour ce projet, permettent d’interrompre immédiatement la participation d’un animal si des signes de souffrance sont détectés. Cette approche garantit qu’aucun animal ne poursuit une procédure s’il présente un état incompatible avec son bien-être
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles de tuberculose chez l'animal : du primate non-humain au poisson zèbre en passantpar les rongeurs. Nous utilisons la souris car ce modèle est prédictif de ce qui se passe chez l'homme en termes d'immunité et de pathologie. En effet, depuis l'identification d'une mutation, on y trouve des lésions pulmonaires plus proches de celles trouvées chez l’Homme. C'est ainsi que notre projet utilisera des souris sensibles ou résistantes qui pourront être analysées avec les mêmes outils moléculaires établis, très performants et informatifs tout en présentant des lésions et une sensibilité différentielle à l'infection. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées entre 6 et 12 semaines au début des procédures. Ace stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Étude du rôle d’un régulateur épigénétique dans la différenciation d’une population de cellules immunitaires du poumon chez la souris lors de l’infection avec le virus de la grippe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Anesthésiées puis infectées par le virus de la grippe au moyen d'une instillation dans le nez, 204 souris subissent une maladie qui dure environ vingt jours. Les procédures sont classées en niveau de souffrance sévère et toutes les souris seront tuées pour prélever leurs poumons. Le porteur écrit que "les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l'animal" et ne détaille comme nuisances que les piqûres et le réveil d'anesthésie. Les souris reçoivent aussi une injection dans la veine située derrière l'œil, et les doses de virus ont été calibrées lors d'expériences antérieures pour, selon lui, éviter d'atteindre les points limites.
Objectifs
Parmi les cellules du système immunitaire, on trouve les lymphocytes T qui jouent un rôle majeur lors d’une infection ou dans la réponse anti-tumorale. Lors d’une infection ou d’un processus tumoral, les lymphocytes T se multiplient et migrent vers le site de l’infection ou la tumeur afin d’éliminer l’agent responsable. Aux premiers stades de la réponse immunitaire, après avoir exercé leur fonction, ces cellules vont être éliminées. Une partie minoritaire de cellules T, cependant, vont pouvoir survivre, se différencier en cellules mémoires et rester dans les tissus pendant des dizaines d’années pour protéger contre les réinfections. Les cellules mémoires, assureront une protection contre de nouvelles infections par ce même pathogène en permettant une deuxième réponse immunitaire plus rapide. Dans certaines circonstances, les cellules mémoires vont aussi pouvoir jouer un rôle contre le cancer. Les mécanismes de contrôle épigénétique régulent l'expression des gènes et sont très importants pendant la différenciation des cellules immunes, par exemple lors de la différenciation des cellules T en cellules mémoires. Lors des études précédentes de notre équipe, nous avons trouvé que l’absence d’un facteur épigénétique dans des souris génétiquement modifiées, augmentait la quantité des cellules mémoires dans le tissu du poumon après une infection par le virus de la grippe. Le projet va porter sur l’étude des mécanismes par lesquels ce facteur épigénétique contrôle la différenciation des lymphocytes T en cellules de type mémoire dans le tissu pulmonaire. Cette compréhension pourra aider à améliorer les vaccins pour protéger aussi bien des infections que du cancer.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à comprendre comment les lymphocytes T se transforment en cellules mémoire. Nos résultats pourraient aider à développer des vaccins plus efficaces et durables contre des maladies actuellement difficiles à prévenir comme la tuberculose, le HIV ou le cancer, ce qui pourrait, à long terme, amener à une réduction des épidémies et des traitements coûteux.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie générale de courte durée (environ 1 minute) et une anesthésie locale sera appliqué sur l’œil avant la réalisation d’une injection intraveineuse d’une durée de moins de 30 secondes. Un jour plus tard ou avant, les souris seront soumises à une anesthésie générale d’environ 1 heure par injection intrapéritonéale (durée de moins de 15 secondes) et elles seront infectées par le virus de la grippe par instillation intranasale (durée d’environ 30 secondes). L’infection grippale tendra une durée d’environs 20 jours jusqu’à récupération. Certaines souris seront mises à mort 9 jours après l’infection.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration des virus, de l’infusion de cellules T, ou de l’anesthésie seront celles liées aux injections elles-mêmes. Lors de l’injection des cellules T, une douleur légère immédiate et de courte durée (moins d’une minute) liée à la piqûre est attendue. À la suite de l'injection d’anesthésique dans l'abdomen, une douleur légère immédiate de courte durée (moins d’une minute) liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée (quelques minutes) pourrait être ressentie par les animaux après l’administration du virus. Il est important de souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux (204) seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour récupérer leurs poumons afin d'analyzer la quantité et qualité des cellules par cytométrie en flux.
Remplacement
Des expériences in vitro à partir de cellules isolées de souris ont été réalisées pour permettre d’affiner les hypothèses et de réduire le nombre de souris utilisées. Toutefois, le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, les cellules résidant dans le poumon sont adaptées à cette localisation et à leur microenvironnement. Enfin, l’infection virale entraîne la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles, ces cellules étant à la fois déjà dans le poumon ou recrutées à des temps variables à la suite de l’infection. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser par groupe expérimental se base sur des expériences déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle. Ces nombres sont ajustés pour limiter le nombre d’animaux à utiliser tout en surmontant les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à nos modèles. Notre modèle permet d'obtenir des groupes d'animaux très homogènes, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaire par expérience. De plus, ce modèle permet de transférer simultanément les cellules contrôles et les cellules modifiées dans le même animal, ce qui réduit encore par deux le nombre d'animaux nécessaires. Enfin, nous allons utiliser les mêmes souris pour évaluer l’expression de protéines et pour trier des populations T différentes pendant la première expérience, et si la coordination des expériences suivantes le permet, réduisant encore le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Avant l’infection, les souris seront manipulées sur plusieurs jours dans les mêmes conditions expérimentales afin de limiter leur stress. Suite à l’infection grippale, les animaux seront suivis périodiquement (tous les 2/3 jours) afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris infectées par le virus seront pesées tous les jours au pic de la maladie pour contrôler l’amplitude de l’infection (les pesées sont espacées de 2/3 jours en dehors du pic, afin de limiter le stress des animaux). Une grille de score a été établie afin d’évaluer périodiquement (tous les 2/3 jours) l’état des animaux de manière objective. Des points limites ont été définis, qui, s'ils sont atteints, marquent la fin de l'expérimentation pour l'animal concerné. Les doses de virus ont été déterminées lors d'expériences précédentes afin d'éviter que les animaux n'atteignent les points limites. De même, de la nourriture/eau en gel est placée dans la cage (en amont des symptômes grippaux, afin de permettre une habituation). Afin de limiter au maximum les douleurs et souffrances liées aux injections intra orbitales, les animaux seront anesthésiés et une anesthésie locale sera utilisé. Afin de limiter au maximum les douleurs et souffrances liées à l’instillation intranasale, les animaux seront anesthésiés et placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil. De la crème vaseline oculaire sera déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie.
Choix des espèces
La souris est ici le modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. Plus particulièrement, nos cellules d’intérêt sont présentes à la fois chez l’homme et la souris, espèces entre lesquelles leurs caractéristiques et propriétés sont très fortement conservées. Par ailleurs, la disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées parfaitement définies nous permet d’affiner les mécanismes de manière très précise. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 16 semaines après la naissance, afin que les populations immunitaires étudiées soient installées). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Nous utiliserons des souris adultes possédant un système immunitaire mature.
Maintien de modèles souris de cancer pancréatique pour l’étude et la mise en place de lignées cellulaires et d’un archivage tissulaire visant à réduire l’utilisation d’animaux (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Biopsiées à l'oreille entre sept et dix jours pour être génotypées, les souris sont ensuite accouplées, puis surveillées jusqu'à ce que le quart d'entre elles développe des lésions cancéreuses du pancréas, avec douleurs abdominales, prostration et cachexie. 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 492 et modéré pour 138. Le porteur présente ce maintien de deux lignées comme un moyen de constituer une banque de tissus et des lignées cellulaires qui réduiront l'usage d'animaux non-humains, tout en le jugeant "indispensable". Les souris sont tuées à deux, cinq, huit et douze mois pour prélèvement, celles qui servent seulement à l'élevage à huit mois faute d'avoir pu être replacées.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer au diagnostic tardif qui dispose de peu de traitements thérapeutiques. Bien que des modèles alternatifs existent, certains travaux comme l’étude de nouveaux composés thérapeutiques validés in vitro ou la caractérisation de nouvelles mutations nécessite de maintenir et d’étudier des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les étapes de la progression cancéreuse pancréatique. Notre projet s’appuie sur la nécessité de maintenir 2 modèles expérimentaux pour mettre en place une banque d’échantillons et plusieurs outils cellulaires qui permettront de mieux comprendre le rôle de nouveaux gènes dans les cancers pancréatiques tout en réduisant nos besoins d’utiliser inutilement des modèles animaux. Le projet sera réalisé au sein de 2 établissements où seront respectivement élevés et étudiés les animaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre la cancérogénèse pancréatique et d’établir des approches de remplacement (banques histologiques de tissus et lignées cellulaires) qui permettront de réduire l’utilisation d’animaux pour nos travaux biologiques et la caractérisation des lésions invalidées pour un nouveau gène dont l’implication est rapportée chez certains patients.
Procédures
Dans l’établissement 1, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué une fois par semaine et dure 1 minute. - A leur mise en accouplement, une fois au début de la procédure, et dure 1 minute. - A l’identification des nouveau-nés, 1 à 2 fois par mois pendant 01 à 20 minutes en fonction du nombre de nouveau-nés. La biopsie tissulaire à l’oreille, réalisée sur animaux à 7-10 jours pour identification génétique sera réalisée une seule fois et durera quelques secondes. Dans l’établissement 2, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué deux fois par mois et dure 1 minute. - Lors des pesées, effectuées deux fois par semaine et durent moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress sera induit chez les animaux lors des manipulations nécessaires à leur mise en accouplement ou à l’identification des nouveau-nés. Les animaux âgés de 7 à 10 jours pourront ressentir une légère douleur lors de la biopsie tissulaire d’un bout d’oreille nécessaire à leur identification génétique. Le risque de saignement est très faible. Selon nos schémas d’accouplements optimisés, 25% des animaux développeront des lésions cancéreuses pancréatiques avec l’âge, ces lésions pourraient se caractériser par une gêne abdominale, des douleurs qui pourront se retranscrire par une prostration, une perte de poids associée à un affaiblissement musculaire (cachexie) ainsi qu’une absence de toilettage ou l’identification de signe de douleur par l’observation d’yeux clos ou mi-clos des animaux. Des signes cliniques liés à des lésions cancéreuses pancréatiques pourraient se développer chez certaines souris âgées de plus de 8 mois. Cet inconfort pourrait se caractériser par une perte de poids, une gêne ou des douleurs abdominales qui pourraient se retranscrire par une prostration, une perte d’appétit ou de comportement social.
Devenir
Toutes les souris génétiquement modifiées qui présentent le risque de développer un cancer pancréatique seront mis à mort pour collecter des échantillons qui permettront d’établir une banque d’échantillons et des lignées cellulaires. Les autres animaux expérimentaux ne développant pas de tumeurs seront également mis à mort et leur pancréas utilisé comme contrôle dans nos analyses. Les animaux servant à maintenir les élevages seront eux mis à mort à l’âge de 8 mois si leur replacement n’avait pu être mis en place au sein de l’établissement d’élevage.
Remplacement
La caractérisation et l’étude des mécanismes de progression tumorale pancréatique ne peuvent pas être totalement modélisées par des outils cellulaires. Il en est de même pour l’étude des conséquences d’une nouvelle mutation que nous souhaitons étudier dans ces cancers. Le maintien de modèles génétiques de souris permettant leur étude dans le contexte des mécanismes d’initiation et de progression tumorale est donc indispensable. Les objectifs de notre projet visent en partie à réduire la nécessité du recours aux animaux en permettant l’établissement d’une banque histologique d’échantillons collectés à différents stades de progression tumorale mais également de lignées cellulaires dérivées des tumeurs développées par les modèles murins générés.
Réduction
Notre procédure vise à établir des lignées cellulaires ainsi qu’une banque d’échantillons histologiques permettant d’étudier in vitro et ex vivo la progression tumorale de 2 modèles de souris de cancers pancréatiques. Ces outils devraient nous permettre de mieux comprendre les conséquences liées à l’invalidation d’une nouvelle mutation rapportée chez l’homme. Ils permettront également de réduire la nécessite de maintenir inutilement des expérimentations animales pour nos travaux de recherche. Nous avons réduit au maximum les élevages nécessaires à l’obtention des nombres d’animaux pour atteindre cet objectif, nous limiterons à 4 le nombre d’accouplements annuels nécessaires au maintien de nos modèles. Cette stratégie devrait limiter le besoin en une banque tissulaire utile à la mise en place de nos accouplements et la maintenance de 2 modèles précliniques différents. Par cette approche nous pourrons constituer une banque tissulaire pour les 2 sexes à quatre stades de progression cancéreuse qui ne devrait pas impliquer plus de 256 animaux. A ce nombre nous estimons que 5 animaux supplémentaires permettront l’établissement de 3 lignées cellulaires pour chaque modèle. Dès que possible nous tenterons au maximum de limiter la génération des animaux non nécessaires à nos travaux et nous n’hésiterons pas à archiver par congélation de paillettes de sperme les souches d’animaux non nécessaires à nos recherches.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi (coton pour le nid, tunnels ou maison en plastique) afin de créer un environnement familier et réconfortant. Les animaux seront habitués à être manipulés pour réduire leur stress tout au long de leur vie Un suivi sera réalisé afin d’identifier d’éventuels signes qui laisseraient envisager une souffrance ou une douleur. En cas de blessure locale, nous appliquerons un traitement désinfectant. Pour le suivi des animaux, nous mettrons en place une surveillance rigoureuse et individuelle pour chaque individu afin d’assurer que les animaux développant des tumeurs pancréatiques ne subissent pas de souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance au travers d’une grille d’évaluation détaillée. Cette évaluation de multiples critères et de points limites adaptés nous conduira à ne pas maintenir des animaux ayant atteint un score de souffrance non acceptable. Nous optimiserons au maximum la quantité d’information biologique à collecter et étudier sur chaque souris.
Choix des espèces
Les souris que nous utilisons sont porteuses de mutations rapportées chez l’homme. Elles permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas et d’étudier sa progression. Des animaux des 2 sexes seront étudiés car les cancers pancréatiques se développent aussi bien chez l’homme que la femme. Les animaux en reproduction ont entre 2 et 8 mois et les animaux utilisés à des fins de prélèvements seront mis à mort à 2, 5, 8 et 12 mois.
Etude d’un nouveau traitement dans un modèle de cancer du sein métastatique
- Recherche appliquée
- Cancers
Le système immunitaire des souris utilisées est rendu déficient pour favoriser la prise de tumeurs mammaires humaines. 114 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les poumons et les ganglions. Après injection des cellules tumorales, elles subissent une chirurgie de résection et l'implantation d'une puce sous la peau, puis six semaines de mesures au pied à coulisse et de pesées trois fois par semaine, la peau au niveau de la tumeur pouvant s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur reconnaît n'avoir pas pu justifier statistiquement l'effectif de la première procédure, 24 souris, et s'appuie sur la littérature et son expérience.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif est un sous-type particulièrement agressif du cancer du sein. Représentant environ 10 à 15 % de l’ensemble des cancers du sein, le cancer du sein triple négatif touche plus fréquemment des patientes jeunes et présente une forte propension à métastaser précocement, en particulier vers les poumons, le cerveau et les os. Malgré les avancées réalisées en oncologie, ce cancer demeure l’un des sous-types les plus difficiles à traiter en raison de sa grande hétérogénéité, du nombre limité d’options thérapeutiques ciblées et de l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies conventionnelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer le pronostic des patientes. Parallèlement, les progrès réalisés dans les modèles précliniques, notamment grâce a de nouveaux modèles et à l’imagerie en temps réel, ont permis d’évaluer l’efficacité de traitements expérimentaux dans des contextes biologiquement pertinents. Dans ce contexte, le présent projet vise à explorer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ce type de cancer. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau dispositif médical implantable sous-cutané (puce microfluidique) dans un modèle xénogreffe de cancer du sein métastatique triple négatif. Le modèle sera suivi à l’aide d’un système d’imagerie afin d’évaluer la réponse globale au dispositif.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif, étant peu ou non réceptives aux traitements de référence.
Procédures
Implantation de cellules tumorales par injection (1min). Chirurgie de résection et implantation de la puce microfluidique (10min) Mesures tumorales au pied à coulisse 3x/sem et pesées 3x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 6 semaines après implantation. Imagerie par fluorescence (10min, 1x/semaine) Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois. Prélèvements sanguins une fois toutes les deux semaines (3min).
Impact sur les animaux
Une perte de poids, une détresse respiratoire et une altération de la mobilité peuvent être envisagés suite au développement des métastases, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin de réséquer la tumeur et d’implanter la puce microfluidique en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever en post-mortem les poumons et les ganglions lymphatiques pour les analyser.
Remplacement
Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas totalement le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur métastatique ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.
Réduction
Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Pour la première procédure, il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de 24 souris. Dans la 2e procédure, pour la comparaison des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique approprié et nous avons donc besoin de 90 animaux, ce qui fait un total de 114 animaux pour les deux procédures.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures.
Choix des espèces
Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire en induisant une déficience pour une meilleure prise de nos tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois une injection dans la veine située derrière le globe oculaire, et jusqu'à cinq prélèvements de sang à la veine de la mandibule. Le porteur indique que les injections derrière l'œil peuvent produire des effets indésirables sur cet organe, que les prélèvements exposent à la déshydratation et aux hématomes, et que le déclenchement de la réaction immunitaire altère l'état général des animaux. Elles sont tuées pour prélever la rate et en extraire les cellules productrices d'anticorps, une étape que le porteur juge "indispensable" faute de modèle informatique reproduisant une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.
Bénéfices attendus
Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (5 au maximum) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen (maximum 4 +1 avec une stimulation forte selon le protocole) ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.
Etude des processus sensorimoteurs chez la souris en condition physiologique et dans un modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une lésion cérébrale prive des souris de leur autonomie à se nourrir et à s'hydrater pendant dix jours, avec troubles moteurs et perte de poids, pour reproduire la maladie de Parkinson. 317 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le cerveau, 154 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 143 un niveau modéré et 20 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent une chirurgie d'implantation de deux à quatre heures, une trépanation, puis des séances d'enregistrement de quatre à six heures, la tête maintenue par un système de contention sur un tapis roulant, avec jusqu'à un mois d'entraînement quotidien. Le porteur écrit qu'aucune manipulation douloureuse n'est pratiquée sur un animal éveillé et que la prise en charge de la douleur est optimisée "pour que les animaux ne ressentent aucune douleur", tout en classant son modèle lésionnel en gravité sévère.
Objectifs
Les patients atteints de la maladie de Parkinson présentent des troubles sensorimoteurs ainsi qu’une détérioration de la qualité de leur sommeil. Ce projet propose d’étudier les mécanismes neuronaux responsables de ces troubles dans un modèle murin de la maladie de Parkinson par une approche anatomique, comparative, comportementale et électrophysiologique. Ce projet est focalisé sur la Zona Incerta, une aire cérébrale qui apparaît en clinique comme une nouvelle cible thérapeutique des symptômes moteurs dans la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Le traitement actuel des troubles moteurs engendrés par la maladie de Parkinson repose sur la stimulation cérébrale profonde qui requiert une chirurgie lourde et ne permet pas l’arrêt de la progression de la maladie. En clinique, la Zona Incerta apparaît comme une cible prometteuse de la stimulation cérébrale profonde pour soulager les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Toutefois, les types cellulaires et les circuits de la ZI responsables de ces effets restent mal définis. La cartographie fonctionnelle complète de la ZI reste encore à établir pour comprendre son rôle dans l’intégration sensorimotrice en conditions physiologiques et pathologiques. Notamment, une meilleure compréhension de l’anatomie et la fonction de la Zona Incerta permettra d’établir plus précisément le rôle de celle-ci dans la suppression d’informations motrices et sensorielles non pertinentes pour l’exécution fluide des mouvements dans un modèle murin de la maladie, et ainsi d’ouvrir la voie à des traitements plus ciblés pour les patients.
Procédures
Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisée sur un animal éveillé. A- Interventions sous anesthésie : 1- Une chirurgie d’implantation (2-4h). 2- Une trépanation (1-2h). 3- Enregistrements de l’activité cérébrale et injection intracérébrale de traceurs neuronaux ou d’agents inducteur de la maladie de Parkinson (4-6h). L'ensemble des trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié des souris. B- Interventions comportementales : 4- Manipulation et habituation (sessions quotidiennes de 10 minutes, sur plusieurs semaines). 5- Entraînement comportemental (1 session par jour, maximum 4h par session pendant un mois avec pauses régulières). 6- Enregistrements de l'activité cérébrale (1 session par jour pendant 1 à 5 jours consécutifs, durée maximale par session : 4h). C- Interventions terminales : 7- Prélèvement du cerveau pour analyses anatomiques et moléculaires ou pour des enregistrements d’activité in vitro. Durée moyenne d’une procédure complète : 10 minutes à 3 mois maximum par animal.
Impact sur les animaux
A- Ce projet nécessite des enregistrements électrophysiologiques sur la souris vigile. L’immobilisation est une source de stress pour la plupart des animaux. Dans ce projet, la souris est partiellement immobilisée : elle est placée sur un tapis roulant qu’elle peut mouvoir ou non, sa tête maintenue de manière indolore par un système de contention. Contrairement aux protocoles de contention utilisés pour induire un stress, le corps et les pattes de la souris ne sont ici pas contenus ou immobilisés : elle est libre de bouger, ajuster sa posture, se toiletter. B- Aucun prélèvement ni manipulation douloureuse n’est réalisé sur un animal éveillé ; toutes les interventions chirurgicales sont effectuées sous anesthésie générale profonde, avec analgésie appropriée. Après une intervention chirurgicale, une souris pourrait présenter une perte de poids, une hypothermie, des signes de douleur tels qu'une posture et/ou une mobilité anormale(s), des comportements anormaux, une absence de toilettage, la cicatrisation de la plaie pourrait ne pas être parfaite. Les animaux seront temporairement isolés pendant 24h suite à une chirurgie, ce qui peut entraîner un stress. C- Ce projet implique de travailler avec un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ce modèle lésionnel est sévère puisqu’il implique une perte de poids conséquente sur un maximum de 10 jours ainsi que le développement de problèmes moteurs et un possible trouble de la motivation..
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau en vue d’effectuer des analyses anatomiques et moléculaires ou pour des enregistrements d’activité in vitro.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour l’approche des mécanismes sensorimoteurs et l’étude des maladies neurodégénératives. La neuropsychologie humaine, la modélisation théorique des fonctions cognitives de haut niveau, ainsi que les cultures de neurones ne constituent pas actuellement une alternative pour l’étude des processus moteurs et de perception sensorielle à l’échelle cellulaire. L’étude des mécanismes neurophysiologiques des processus cognitifs se faisait jusqu’à maintenant essentiellement chez des modèles primates non-humains. Avec cette étude nous voulons profiter des avantages qu’apporte la souris (modèles génétiques et identification des neurones plus aisée) pour raffiner notre compréhension des processus sensorimoteurs à un niveau cellulaire.
Réduction
Notre modèle d’étude permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour une étude donnée : - un même animal participe à plusieurs sessions d’enregistrements, jusqu’à 5 jours consécutifs ; - les différents tests comportementaux que nous proposons pourront être réalisés sur chacune des souris, évitant la multiplication des groupes d’animaux ; - les données recueillies sur chaque animal sont multiples : activité de plusieurs régions cérébrales, au cours de différents états de vigilance et comportements, et partagées avec la communauté scientifique ; - chaque souris est son propre contrôle, divisant par deux le nombre d’animaux nécessaires et permettant d'appliquer des tests statistiques pour mesures répétées. Ensuite, les injections de traceurs sont réalisées sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation.
Raffinement
Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux et d'obtenir des données riches. La prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-opératoire est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe sévère affectant l’autonomie des souris à s’hydrater et se nourrir pendant 10 jours, donc une perte de poids. L’état de santé des souris (poids, poil, signes éventuels de douleur) sera surveillé tout au long de l’expérience. Une grille de score est utilisée pendant toute la durée post-opératoire afin d'avoir une mesure objective de la récupération de l'animal et de son bien-être. Des jouets sont placés dans la cage afin que les animaux disposent d’un environnement enrichi. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance. Plus spécifiquement, notre modèle d’étude a été développé avec une attention particulière au bien-être de nos souris : 1- pour réaliser des enregistrements au cours du cycle veille-sommeil naturel de l'animal ; 2- sans générer de douleur, toutes les interventions chirurgicales étant réalisées sous anesthésie ; 3- en prenant soin de juguler le stress de l’animal par une habituation adaptée, douce et très progressive à la contention ; 4- avec de nombreuses périodes de "handling" de l'animal ; 5- après chaque manipulation (habituation ou handling), l’animal retourne dans sa cage et est récompensé : la répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif, récompensé, et non douloureux de la contention.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d'étude car il existe présentement des outils moléculaires et génétiques développés chez la souris uniquement, donc non disponibles à ce jour pour d’autres espèces animales. Par exemple, la technique d’optogénétique permet d’activer ou d’inactiver de manière spécifique une région cérébrale. L’impact d’une telle manipulation sur l’activité des régions cérébrales étudiées peut être quantifié, et le rôle fonctionnel de ces régions peut être élucidé. Nous travaillons avec des animaux de 8 à 20 semaines c'est-à-dire de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale. Le stade de développement jeune adulte/adulte (autour de 2-4 mois d'âge) est essentiel pour étudier un système mature stable (croissance terminée) mais non vieillissant. De surcroît, ce projet se place au niveau de l’étude des circuits neuronaux (enregistrement d’activité neuronale). Les populations de neurones étudiées sont à 90% similaires à celle de l’Homme assurant une bonne transférabilité des résultats pour le niveau d’étude considéré.
Evaluation de l’effet de 3 composés en développement sur la production endogène d’Ocytocine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Gavées chaque jour pendant cinq semaines, soit 35 administrations, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles vivent seules en cage, sont pesées onze fois, puis subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour doser l'ocytocine dans leurs tissus. Le porteur affirme que la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier". Les trois composés testés appartiennent à un client du laboratoire, à un stade que le RNT qualifie de très précoce, et l'éventuelle mise sur le marché d'un médicament reste au conditionnel.
Objectifs
Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries, et notamment L. reuteri, réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (11 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par gavage orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Prélèvement sanguin sous anesthésie (prélèvement; durée : 3 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures régulières du poids corporel peuvent provoquer un stress léger, notamment en raison de la manipulation et de la restriction temporaire des mouvements. Les traitements par gavage oral, réalisés pendant 5 semaines, peuvent entraîner une gêne légère et un stress modéré. Bien que des études préliminaires aient été conduites préalablement à notre étude, des effets indésirables pourraient être induits par les composés testés. Enfin, au dernier jour de l’étude, les animaux seront anesthésiés ce qui pourra engendrer un stress de courte durée pour permettre la réalisation d'un prélèvement sanguin.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.
Remplacement
Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs expérimentés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude, avec accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels, et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin réalisé au jour 28 (D28) sera précédé d’une anesthésie afin de limiter le stress des animaux. Enfin, un suivi quotidien des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une intervention rapide en cas d’atteinte des seuils établis. Ces interventions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l’emploi d’analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Axe intestin-cerveau : rôle des cellules gliales dans le dimorphisme sexuel des comorbidités de l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.
Bénéfices attendus
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.
Procédures
1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.
Impact sur les animaux
1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.
Choix des espèces
LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.
Suivi de la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Huit à douze injections du substrat luminescent et une imagerie quotidienne sous anesthésie pendant trois à quinze jours : 130 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour trente d'entre elles et modéré pour cent. Cent souris reçoivent les cellules tumorales dans la veine de la queue sans anesthésie, le porteur indiquant que cette voie est inaccessible sous anesthésie. La tumeur se disperse alors dans plusieurs organes, ce qui peut provoquer une souffrance. L'objet déclaré du projet est de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, un seuil qu'il s'agit d'établir en laissant les tumeurs croître.
Objectifs
Nous étudions des cellules du système immunitaire appelées cellules NK, dont le rôle est de détruire les cellules cancéreuses. Pour comprendre comment elles agissent, nous injectons des cellules tumorales à des souris et nous observons si les cellules NK arrivent à éliminer la tumeur. Quand on injecte les cellules tumorales sous la peau, elles forment une tumeur solide, facile à mesurer. Mais quand on les injecte dans le sang, elles se dispersent dans plusieurs organes et forment une tumeur diffuse, beaucoup plus difficile à suivre car elle n’a pas de forme visible. Pour mieux voir ces tumeurs diffuses, nous avons créé des cellules tumorales qui produisent de la lumière lorsqu'on les met en présence d'une molécule appelée substrat. Cette émission de lumière est appelée bioluminescence et peut-être mesurée par un appareil appelé bioimageur. Ainsi, on peut réaliser un suivi régulier de l’évolution de la tumeur par administration du substrat aux souris et mesure de la lumière émise sur l'animal entier dans le bioimageur. L’objectif de ce projet est donc de mesurer la vitesse de croissance de la tumeur et de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, grâce au bioimageur.
Bénéfices attendus
Nous ne disposons pas à l'heure actuelle d'outils de suivi de l'évolution des tumeurs diffuses étudiées dans notre équipe, ce qui est défavorable pour l’animal. Grâce à l’imagerie par bioluminescence, ce projet permettra de définir précisément la vitesse progression de ces tumeurs et d'identifier la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser, afin d’améliorer le bien-être des animaux. Elle permettra également de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour les suivis sur plusieurs jours, car elle évite d’avoir recours à la mise à mort pour réaliser des autopsies.
Procédures
Les animaux recevront : - une injection de cellules NK dans le sang, sous anesthésie gazeuse (30 secondes, 10 animaux) - une injection de cellules tumorale dans le sang (veine de la queue) sans anesthésie (1 minute, inaccessible avec anesthésie, 100 animaux). Entre 3 et 15 jours après l'injection des cellules tumorales, la croissance tumorale sera suivie quotidiennement. Pour cela, les souris recevront : une injection du substrat dans l'abdomen (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection sous la peau (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection via la circulation sanguine (15 secondes, 8 à 12 injections). La mesure de la lumière sera réalisée dans le bioimageur, sous anesthésie gazeuse (10 minutes), sur un plateau chauffé à 37°C.
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau, dans le sang ou dans l'abdomen peuvent entrainer une douleur au niveau du point d'injection. La tumeur diffuse peut croitre dans divers organes, ce qui peut provoquer une souffrance pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L'étude de la réponse du système immunitaire à une tumeur disséminée dans l'organisme est une phénomène complexe, impliquant des intéractions entre différents types cellulaires dans divers organes. Cette complexité ne peut pas être reproduite avec des cellules et ne peut être étudiée qu’à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats (test ANOVA).
Raffinement
Les volumes d'injections ont été réduit au minimum pour faciliter le confort de l'animal. Les injections dans le sang (sauf via la veine de la queue) et sous la peau, sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Les injections dans le sang via la veine de la queue sont réalisées après application d'une crème anesthésiante. La mesure de la lumière emise dans le bioimageur est réalisée sous anesthésie gazeuse et sur un plateau chauffant. Les animaux sont suivis quotidiennement. Des points limites adaptés ont été définis (aspect général de l'animal, test d'aggripement, perte de poids).
Choix des espèces
Des souris mâles et femelles âgées de 7 à 12 semaines au démarrage de l'éxpérience seront utilisées. Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Par ailleurs, le système immunitaire de la souris est très similaire au système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes antitumoraux.
Travaux Pratiques – Unité de certification en Matière d’Expérimentation Animale : Application de Procédures sur Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 120
Piquer sous la peau et dans l'abdomen des rongeurs vigiles, pour que des étudiants valident une certification réglementaire : 240 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque étudiant dispose d'un animal de chaque espèce, manipulé lors de trois séances de quatre heures puis lors d'un examen où le geste d'administration est tiré au sort. Les souris passent ensuite à d'autres travaux pratiques avant d'être tuées, leurs corps servant à la dissection en licence, et les rats sont réutilisés en troisième année ou proposés à l'adoption aux étudiants. Le porteur affirme que la manipulation d'animaux factices ne permettrait pas de former à l'observation des signes de bien-être des animaux non-humains.
Objectifs
La réglementation en matière d'expérimentation animale publiée en 2013 oblige la formation spécifique des personnes voulant appliquer des procédures expérimentales utilisant des animaux. Ce projet concerne la réalisation de séances pratiques dans le cadre de cette Unité de Certification en matière d'Expérimentation Animale : Application de Procédures sur Rongeurs. Cette action de formation a été agréée pour une durée de 5 ans et comprend des séances qui mettent en oeuvre des animaux vivants et qui ont pour objectif de former les étudiants aux aspect pratiques de la manipulation et de l'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que l'observation du comportement pour évaluer le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Cet enseignement permettra aux étudiants volontaires et motivés qui souhaitent poursuivre leurs études dans le domaine de l'expérimentation animale, de mobiliser les concepts fondamentaux et les technologies de la physiologie animale et des sciences du comportement pour traiter une problématique du domaine, ainsi que d'analyser et synthétiser des données en vue de leur exploitation pour développer une argumentation critique et constructive vis-à-vis de cette problématique. Cette action de formation permettra également de sensibiliser les étudiants au respect des principes d’éthique, de déontologie et de responsabilité en matière d’expérimentation avec des animaux vivants.
Procédures
Les animaux qui seront utilisés dans le cadre de cette Unité de Formation Certifiante en matière d'applications de procédures expérimentales sur rongeurs permettront aux étudiants de se former à l'observation de leur comportement et des signes de leur bien-être, aux gestes de manipulation, de préhension et de contention de ces animaux ainsi que les gestes relatifs à l'administration de substances à des animaux vigiles par injection sous la peau ou dans l'abdomen.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation des animaux lors des séances pratiques et/ou de la séance d'évaluation des aptitudes pratiques des étudiants. Douleurs et/ou saignements liés aux piqûres lors de l'apprentissage des gestes d'administration sur animaux vigiles (seules les voies d'administration par injection ou dans l'abdomen seront enseignées).
Devenir
Les rats comme les souris seront utilisés dans des séances pratiques spécifiques (une séance rat et une séance souris) consistant chacune à enseigner aux étudiants les bases de l'observation du comportement des animaux et des signes apparents de bien-être, les gestes de manipulation, de préhension et de contention ainsi que les procédures d'administration de substances à des animaux vigiles par injection sous la peau ou dans l'abdomen. A l'issue de ces séances, les souris seront réaffectées à d'autres travaux pratiques de 1ère année de master consacrées à l'étude du comportement avant d'être mises à mort à l'issue de ces travaux pratiques et leurs cadavres utilisés pour des travaux pratiques de dissection en 2ème année de licence. Les rats seront quant à eux réutilisés dans le cadre de travaux pratiques de 3ème année de licence. Dans le cas où des rats ne seraient pas utilisés pour ces séances pratiques de 3ème année, ceux-ci seront proposés à l’adoption auprès des étudiants. Il ne sera procédé à la mise à mort de ces rats restants qu'en dernier recours dans le cas où leur réutilisation/adoption ne serait pas possible.
Remplacement
La formation en matière d'Expérimentation Animale - Application de Procédures sur Rongeurs vise à certifier les personnes inscrites pour la pratique de procédures non-chirurgicales sur des rongeurs. La formation oblige les étudiants à suivre 3 séances pratiques de 4h chacune dont 2 mettent en jeu des rongeurs vigiles (rat et souris) pour leur permettre d'apprendre à mettre en oeuvre des gestes de manipulation et d'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que se former à l'observation des rongeurs et de leurs signes apparents de bien-être. L'apprentissage de ces pratiques ne peuvent donc être réalisées qu'en mettant en oeuvre des animaux vivants. Le recours à des méthodes alternatives telles que la manipulation d'animaux factices ne peut pas être mis en oeuvre, ne permettant pas de rendre compte à eux seuls du comportement de l'animal et de permettre aux opérateurs de se former à l'observation des signes de bien-être animal.
Réduction
Les animaux (rat et souris) seront obtenus auprès d'un fournisseur agréé pour permettre la réalisation de ces travaux pratiques. Le nombre d'animaux est limité à un animal de chaque espèce par étudiant inscrit à la formation. Ces animaux seront ensuite réutilisés pour la séance d'examen pratique individuel à la suite des séances pratiques de formation, l'étudiant tirant au sort le geste d'administration qu'il aura à réaliser uniquement sur un animal d'une des 2 espèces. Ce nombre d'un animal de chaque espèce par étudiant a été estimé au plus juste sans avoir recours à une approche statistique pour l'estimer, le but de cet enseignement étant de former les étudiants à l'observation, la manipulation et l'administration de substances à des animaux vigiles. Par ailleurs, 4 animaux de chaque espèce ont été prévus en plus de ceux utilisés par les étudiants pour constituer des pools de nombre suffisant pour éviter une réutilisation excessive des animaux, notamment lors de la séance d'examen qui a lieu à la suite des séances de travaux pratiques dans un laps de temps très réduit.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Pendant toute la durée du projet, les animaux seront traités selon la réglementation par du personnel compétent. Les animaux seront hébergés selon les conditions imposées par la réglementation. Ils seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs (enseignants intervenant dans la formation) ou le zootechnicien de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les points limites habituels seront notés (l'isolement, les yeux fermés, un dos voûté, les poils hérissés, l'immobilité, une perte de poids de plus de 20% du poids corporel total ou de 15% entre deux pesées consécutives à une semaine d'intervalle, des signes de déshydratation, les yeux et l'abdomen creux, etc…).
Choix des espèces
Cette unité de certification Application de Procédures sur Rongeurs vise à certifier les personnes inscrites pour la pratique de procédures non-chirurgicales sur des rongeurs. La formation oblige les étudiants à suivre 3 séances pratiques de 4h chacune dont 2 mettant en jeu des rongeurs vigiles (rat et souris) pour leur permettre d'apprendre à mettre en oeuvre des gestes de manipulation et d'administration de substances à des animaux vigiles ainsi que se former à l'observation des rongeurs et de leurs signes apparents de bien-être. L'apprentissage de ces pratiques ne peuvent donc être réalisées qu'en mettant en oeuvre des espèces rongeurs (rat et souris) qui sont l'objectif de la formation. Les rats comme les souris seront utilisés à l'âge adulte (3 mois d'âge postnatal) quand tous les systèmes physiologiques sont matures.
Modèles nutritionnels pour l’induction de désordres métaboliques chez la souris, le rat et le hamster-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 500
Hamsters dorés : 1500
Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.
Objectifs
L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.
Etude du métabolisme des cellules souches musculaires au cours de la régénération après lésion physiologique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 200 souris subissent une électrostimulation sous anesthésie destinée à léser leur muscle, puis une mesure de force musculaire également sous anesthésie. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ce dispositif de "totalement non-invasif" alors qu'il sert à endommager le muscle, et affirme que l'interaction entre cellules ne peut être étudiée qu'in vivo. Les souris sont tuées pour prélever le tissu musculaire et analyser le métabolisme des cellules souches qu'il contient.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Cette régénération est notamment médiée par une population cellulaire spécifique, les cellules souches musculaires. De précédentes études ont démontré l’importance du métabolisme dans la fonction de ces cellules. Le projet vise à i) caractériser le comportement et le destin de cette population cellulaire au cours de la régénération, ii) identifier les régulations métaboliques sous-jacentes, iii) identifier des cibles biologiques qui permettraient d’influer sur la régénération musculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de caractériser les régulations métaboliques qui surviennent au cours de la régénération musculaire et d’identifier des cibles potentielles qui permettraient d’influer sur cette régénération. De plus, les analyses réalisées au cours de ce projet conduiront à la création d’une base de données importante sur le métabolisme des cellules souches lors de la régénération musculaire qui pourra alimenter des projets ultérieurs et être mise à disposition de la communauté scientifique. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques.
Procédures
Les souris sont soumises à un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum) et à une une mesure de force musculaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation, anesthésies). Le stress des animaux inclut : 1) l'anesthésie gazeuse lors de l'induction de la blessure musculaire (environ 15 minutes), 2) l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort (environ 1 minute).
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8-12 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes.