Souris
Etude de la pénétration intestinale de nanoparticules chez la souris dans le cadre de la vaccination muqueuse
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sur 1 232 souris, 714 subissent une ouverture de l'abdomen, une manipulation de leurs organes et une ligature de l'intestin sous une anesthésie pouvant durer une heure quarante-cinq, sans jamais se réveiller. Les 518 autres reçoivent un gavage unique après six heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes sont tuées pour prélever les organes et mesurer si des nanoparticules franchissent la muqueuse intestinale. Le vaccin à ARN messager pris par la bouche, qui justifie ces expériences, reste annoncé comme un bénéfice à long terme, aucun n'existant aujourd'hui.
Objectifs
Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent atteindre et traverser la muqueuse intestinale, que ce soit après une administration directe dans l’intestin ou après une administration orale.
Bénéfices attendus
Ce modèle expérimental permet d’étudier comment les nanoparticules peuvent traverser la paroi de l’intestin. De plus, la résistance des nanoparticules à l’environnement digestif et leur répartition dans l’intestin seront évaluées après administration orale. Cette étude vise également à mieux comprendre la relation entre la composition des nanoparticules et leur comportement au contact de la muqueuse intestinale, afin de sélectionner les vaccins candidats les plus prometteurs. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.
Procédures
Un groupe de 714 souris sera soumis à une chirurgie abdominale sans réveil et recevra donc une anesthésie générale d’une durée maximale de 1h45. Un autre groupe, composé de 518 souris, recevra une administration orale par gavage (1 fois/animal, durée de moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Six heures avant l’anesthésie, les souris seront mises à jeun, mais avec un accès libre à l’eau, ce qui entraîne un stress. Les effets liés à l’intervention chirurgicale comprennent : • l’injection d’un traitement contre la douleur ; • l’anesthésie générale ; • les effets d’une anesthésie générale : les troubles cardio-respiratoires, la baisse de température corporelle, une déshydration ou une sécheresse des yeux ; • l’ouverture de l’abdomen, la manipulation des organes, la ligature de l’intestin ; • la fermeture de l’abdomen et de la peau ; • la durée de l’intervention. Les effets attendus liés à l’administration par voir orale : • le stress lié à la contention de l’animal, • l’administration orale par gavage chez des animaux conscients, provoquant un stress et une possible gêne après administration.
Devenir
A l’issu des trois procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.
Remplacement
Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 1232 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. L’optimisation des conditions expérimentales permettra, si les résultats sont prometteurs, de diminuer encore ce nombre. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, des temps d’étude optimisés seront sélectionnées afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Pendant l’intervention, les souris seront placées sous anesthésie générale. Un médicament analgésique sera également administré avant la chirurgie. Une surveillance étroite des animaux sera assurée notamment pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Un tapis chauffant sera utilisé pour maintenir la température corporelle et un film protecteur recouvrira la zone afin de limiter la déshydratation. Un gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé dans la recherche afin d’étudier comment des nanoparticules traversent la muqueuse intestinale. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la pénétration et l’interaction des nanoparticules avec la muqueuse intestinale. Des souris de plus de 7 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.
Identification d’une nouvelle endopeptidase performante pour le clivage des immunoglobulines G chez les individus séropositifs dans le cadre de la thérapie génique par virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Une à trois injections, puis deux à sept prélèvements de sang le premier mois et un par mois ensuite pendant trois mois : 654 souris subissent ces procédures, classées en souffrance légère, toutes tuées pour prélever leurs organes. L'objet est d'identifier des enzymes capables de découper les anticorps qui bloquent les thérapies géniques par vecteur viral chez les personnes déjà immunisées. Le porteur annonce des groupes de cinq souris et trois enzymes retenues sur cinquante candidates, et ajoute qu'aucun effet indésirable majeur n'est attendu. Il n'explique pas comment ces chiffres conduisent à 654 souris, ni ce qui fixe la durée de suivi à trois mois.
Objectifs
Les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV) sont largement utilisés pour transférer un gène dans l’organisme dans le cadre de traitements de certaines maladies génétiques rares. Ces traitements sont bien tolérés chez l’homme et plusieurs d’entre eux ont déjà été autorisés par les agences de santé européennes et américaines. Toutefois, des obstacles importants freinent encore leur efficacité et leur accessibilité. L’un des principaux défis est lié au fait que de nombreuses personnes ont déjà des anticorps dirigés contre les AAV, ce qui peut empêcher le traitement de fonctionner. De plus, après une première administration, l’organisme produit de nouveaux anticorps, ce qui rend toute seconde injection inefficace. Notre laboratoire a montré qu’un traitement par une enzyme appelée IdeS, capable de dégrader ces anticorps, pouvait permettre le succès du traitement chez des animaux porteurs d’anticorps anti-AAV. Cette approche prometteuse fonctionne toutefois moins bien quand les niveaux d’anticorps sont élevés. Dans ce contexte, notre projet vise à tester d’autres enzymes similaires chez la souris, pour identifier celles qui seraient plus efficaces et sûres. L’objectif final est de développer un traitement capable de neutraliser les anticorps, afin de rendre ces thérapies accessibles à un plus grand nombre de patients, y compris ceux qui présentent déjà une immunité contre les AAV.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de permettre aux patients avec des anticorps contre l’AAV d'accéder aux thérapies géniques, dont ils sont exclus. Le développement d’enzymes plus performantes que celles disponibles aujourd’hui pourrait permettre de neutraliser ces anticorps, d’augmenter l’efficacité des traitements et d’offrir des solutions aux patients présentant des taux d’anticorps élevés. Ce projet pourrait ainsi élargir l’accès aux thérapies géniques, améliorer leur équité et, à plus long terme, ouvrir la voie à des ré-administrations chez les patients qui nécessitent plusieurs traitements pour atteindre un bénéfice thérapeutique durable.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, plusieurs expériences seront menées sur des souris afin d’évaluer l’efficacité et la tolérance de différentes enzymes. Les animaux recevront entre 1 et 3 injections, selon des schémas expérimentaux définis. Dans certains cas, 2 injections successives (anticorps/sérum et enzymes à tester) seront réalisées au cours de la même journée, avec un intervalle d’au moins 30 minutes entre chaque injection. Chaque injection sera effectuée rapidement, en environ 30 secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés régulièrement sur une période de suivi allant jusqu’à trois mois, afin de mesurer la réponse immunitaire, la sécurité des traitements, ainsi que l’efficacité du transfert de gène. Chaque prélèvement dure quelques dizaines de secondes, y compris la compression pour arrêter le saignement, puis l’animal est replacé en cage. Entre 2 et 7 prélèvements seront réalisés au cours du premier mois de l’étude, puis un prélèvement sera effectué chaque mois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus dans ce projet concernent principalement les procédures techniques, considérées comme de gravité légère. Les souris seront soumises à plusieurs injections, ce qui peut engendrer une douleur ponctuelle liée aux piqûres ainsi qu’un stress dû à la manipulation. [CP3.1]Aucun autre effet indésirable majeur n’est attendu du fait des produits injectés ou du modèle animal utilisé.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales. Cela permettra de prélever des organes afin d’analyser la distribution des vecteurs et de conclure sur l’efficacité des endopeptidases.
Remplacement
1. Replacement : La thérapie génique consiste à utiliser un vecteur conçu pour transporter une copie d’un gène médicament permettant la production d’une protéine d’intérêt dans certains organes. Ce vecteur doit franchir plusieurs obstacles dans l’organisme, comme les barrières naturelles des tissus ou la réponse immunitaire. Lorsque des anticorps sont présents dans le corps, ils peuvent neutraliser ces vecteurs, ce qui empêche le bon fonctionnement du traitement. Dans ce contexte, notre objectif est d’identifier un modèle pertinent pour étudier ce phénomène. Avant d’envisager des tests sur les animaux, des expériences ont été menées en laboratoire à l’aide d’anticorps synthétiques similaires à ceux que l’on retrouve chez l’humain. Ces essais ont permis d’évaluer l’action de plusieurs enzymes capables de couper ces anticorps. Leur activité, leur rapidité d’action et leur efficacité ont ainsi été mesurées. Toutefois, ces approches en laboratoire ne permettent pas de reproduire toute la complexité des mécanismes biologiques d’un organisme vivant, notamment les interactions entre le vecteur, le système immunitaire et les barrières biologiques. C’est pourquoi l’utilisation de souris reste nécessaire à ce stade du projet. Ce modèle est reconnu comme adapté pour ce type d’étude. Seules les enzymes ayant montré les meilleurs résultats lors des tests en laboratoire seront ensuite étudiées chez l’animal, afin de limiter l’expérimentation aux cas strictement nécessaires tout en assurant la fiabilité des résultats.
Réduction
Nous avons défini la taille des groupes expérimentaux sur la base d’un test statistique, ce qui permet d’assurer la robustesse scientifique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Chaque groupe sera constitué de 5 souris, nombre suffisant pour détecter les effets des traitements. Chez les mêmes souris, des prélèvements de sang et d’organes (foie, rate, système nerveux, muscles et autres tissus) seront réalisés afin de maximiser les données obtenues par individu. Nous éviterons la multiplication de groupes de contrôle non nécessaires et concentrerons les analyses sur les candidats les plus prometteurs : à partir de 50 endopeptidases initiales, seules les 3 plus efficaces seront retenues pour la phase finale de l’étude.
Raffinement
Dans cette étude, nous utiliserons des souris en bonne santé et exemptes de maladies. Elles seront suivies régulièrement afin de détecter tout signe de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. En cas de perte de poids supérieure à 20 % ou de signes persistants de malaise après une semaine, les animaux seront euthanasiés conformément aux protocoles éthiques. Les conditions expérimentales seront conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur, en adaptant les méthodes de manipulation et de prélèvement afin de préserver le bien-être des animaux. Nous resterons attentifs à toute amélioration ou nouvelle méthode permettant de raffiner davantage ces conditions tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très similaire à celui de l'humain, ce qui en fait un modèle de référence pour étudier les réponses immunitaires complexes, impliquant différents types de cellules et se déroulant dans divers organes. Chez la souris, le système immunitaire atteint sa pleine maturité à partir de l'âge de 6 semaines. Il est bien documenté et partage de nombreuses similitudes avec celui d'autres mammifères, permettant ainsi d'extrapoler les résultats à d'autres espèces, y compris les humains. Pour cette étude, nous utiliserons uniquement des souris jeunes adultes âgées de 6 à 10 semaines, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires chez des organismes adultes. Les souris seront examinées et/ou euthanasiées entre 7 semaines et 4 mois, ce qui nous permettra d’évaluer les réponses immunitaires ainsi que l’expression du transgène.
Etude de dose maximale tolérée d’un composé pharmaceutique chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 400
800 rongeurs, 400 souris et 400 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs organes. Ils reçoivent jusqu'à huit injections d'un composé pharmaceutique, jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie et quatre prélèvements de sang. Le but étant de trouver la dose au-delà de laquelle apparaissent des effets indésirables graves, ils peuvent développer œdèmes, convulsions, tremblements, arythmies cardiaques, difficultés respiratoires et diarrhées. Le porteur conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" pour caractériser la tolérance d'un candidat médicament, le bénéfice final annoncé étant "la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques".
Objectifs
Les études de doses maximales tolérées (résumé sous l’acronyme anglais de MTD, Maximum Tolerated Dose) d’un composé pharmaceutique (médicament, vaccin, agent de contraste..) permettent de définir la dose maximale à laquelle l’administration d’un composé n’induit pas d’effet indésirable grave. Ces études sont conduites en amont des études de toxicologie réglementaires exigées avant une première administration chez l’Homme lors des tests cliniques et, au final, pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM). L’objectif de ce projet est donc de déterminer les doses maximales de différents composés pharmaceutiques / candidats médicaments ou vaccins administrés chez le rongeur (souris ou rat) sans que celles-ci ne provoquent d’effets indésirables sévères ou pouvant remettre en question la survie de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir des doses limites administrables de plusieurs produits. Cela permettra de sélectionner des doses pertinentes pour les études de toxicologie réglementaire. Les études de MTD constituent une étape clé dans le développement et la caractérisation d’un produit permettant d’anticiper les risques cliniques et soutenir l’établissement d’un schéma posologique sûr lors de la transition vers l’homme. Le bénéfice final attendu est la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques.
Procédures
Les animaux recevront le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, 8 injections maximum par animal pourront être réalisées. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute) et la durée sera d’environ 5 minutes sur des animaux anesthésiés. Des examens d'imagerie pourront également être réalisés, avec parfois injection d’un produit de contraste, sous anesthésie générale pendant une durée de 5 à 20 minutes. La fréquence des examens sera au maximum de 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude (soit 4 examens au total). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 4 prélèvements de sang). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes techniques avec ou sans anesthésie (pesées, suivis cliniques, administration de composés, prélèvement de sang…) ce qui pourra leur engendrer un stress. De plus, lié à l’objectif du projet (recherche de la limite supérieure de sécurité de prise d’un traitement), les animaux pourront développer divers effets indésirables et réactions liés à l’administration du composé d’essai à des doses élevées : inflammation locale ou systémique, œdème, perte de poids, variation de température, léthargie ou au contraire hyperactivité, déshydratation, dyspnée, arythmies cardiaques, tremblements, convulsions, diarrhées, vomissements, modifications de la formulation globale sanguine, etc.). La détermination de points limites précoces et adaptés permettra la bonne prise en charge des animaux présentant des signes cliniques. La sévérité et la durée des signes pourront varier entre les groupes en fonction des produits testés et de leurs concentrations.
Devenir
Le projet ayant pour but l’évaluation de la dose maximale tolérée d’un composé pharmaceutique, il nécessite des prélèvements d’organes en fin d’étude donc tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière fiable la complexité physiologique (métabolisme, système immunitaire, fonction respiratoire, cardiaque, neurologique…) d’un organisme vivant. L’étude de la tolérance d’un candidat médicament nécessitant une évaluation de l’impact de ce traitement sur l’ensemble de ces différentes fonctions physiologiques, le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour pouvoir caractériser la tolérance du traitement de manière exhaustive.
Réduction
Pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle tolérance du traitement testé, des groupes de 6 animaux minimum seront utilisés. Dans le cas d’utilisation de composés marqué (compatible avec les objectifs du projet), l’évaluation de la tolérance d’un produit et de son impact sur la physiologie d’un animal pourra être complété par de l’imagerie. L’avantage de l’imagerie médicale est de plus facilement corréler un effet observé à l’injection d’un composé mais aussi de suivre un même animal au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux intégrés au projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée, portée à 7 jours en cas de transport aérien. Les animaux seront hébergés collectivement en cage tout au long du projet (de l’acclimatation à la fin de l’étude), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne afin de détecter tout signe clinique anormal et d’appliquer, dès que nécessaire, les mesures appropriées pour garantir leur bien-être : mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc.) ou mise à mort humanitaire si l’état clinique est jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré quotidiennement après administration des produits testés. Un scoring clinique sera réalisé parallèlement à l’aide d’une grille d’évaluation. Les critères examineront à la fois l’état général (comportement, pelage, écoulements nasaux ou oculaires…) et des atteintes plus spécifiques d’un système physiologique (détresse respiratoire, troubles gastro intestinaux…), directement ou indirectement liés à la voie d’administration du composé. L’ensemble de ces éléments permettra d’attribuer un score global reflétant l’état de santé général des animaux et d’orienter la prise de décision. Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Lors des anesthésies, une attention particulière sera portée pour éviter l’hypothermie : animal sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante pendant toute la durée de l’anesthésie.
Choix des espèces
Les rongeurs (souris et rats) ont été choisis car ce sont des modèles standards, polyvalents (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poil) et couramment utilisés dans les études de tolérance en raison de leur facilité à obtenir des lots homogènes (âge et sexe fixés). Le choix entre la souris et le rat sera directement lié aux contraintes de volumes d’administration ou de prélèvements (plus faible chez la souris). De plus, leur taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier pouvant être un atout non négligeable pour le suivi d’un composé à l’échelle systémique. Des souches de souris sans poil seront privilégiées dans le cas d’utilisation de composés bioluminescents ou fluorescents pour obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). Des souris et des rats de minimum 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte - adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g pour les souris et 250g pour les rats.
Blocage d’un gène favorisant le cancer du poumon chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, respirent vite ou portent une plaie non guérie après deux jours sont mises à mort. 468 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Elles inhalent sous anesthésie des molécules qui déclenchent un cancer du poumon, puis reçoivent jusqu'à vingt injections réparties sur six semaines, avec perte de poids et gêne respiratoire liées aux tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune médication n'est prévue pour ne pas interférer avec les expériences, alors que les molécules testées seront selon lui "bientôt proposées en routine aux patients".
Objectifs
Les cancers du poumon sont la première cause de mortalité par cancer en France et dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques récentes, principalement basées sur les thérapies ciblées et les immunothérapies, de nombreuses tumeurs restent résistantes aux traitements et le taux de survie global à cinq ans ne dépasse pas 26 %. Il y a maintenant des nouvelles molécules qui bloquent un gène très important dans la survenue des tumeurs du poumon. Dans ce projet nous souhaitons caractériser l’apport de ces nouvelles molécules sur les thérapies classiques (chimiothérapie combinée à l’immunothérapie), identifier les potentiels mécanismes qui bloqueraient l'efficacité de ces traitements combinés et définir des stratégies pour contourner ces blocages.
Bénéfices attendus
Ces expériences pré-cliniques nous permettront de mieux appréhender l’efficacité des nouveaux traitements pour bloquer la progression des cancers du poumon. Ces traitements, qui incluent de nouvelles molécules qui suppriment l'activité d’un gène impliqué dans la progression des cancers, seront bientôt proposés en routine aux patients .
Procédures
- Les souris seront soumises à l'inhalation de molécules stimulant l’initiation du cancer. Cet acte dure moins de 30 secondes. Il est réalisé sous anesthésie pour diminuer le stress de l'animal. - Injections: 20 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 6 semaines. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.
Impact sur les animaux
- Stress à la préhension. – Stress lié à l’injection.- Perte de poids liée à la présence de tumeurs. – gene respiratoire liée la présence de tumeurs.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus pulmonaires et l’analyse post mortem des échantillons. Les poumons seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des lésions cancéreuses pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des nouveaux inhibiteurs pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.
Remplacement
Nous avons utilisé des approches de culture cellulaire et analyses informatiques dans les étapes préliminaires qui ont permis le financement de ce projet. Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées sur des cultures cellulaires et/ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. A ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules associée à une modélisation informatique ou modèles invertébrés) qui permettent de caractériser chez les mammifères la dynamique des interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle le cancer du tissu pulmonaire résistants aux traitements. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.
Réduction
Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les expériences seront arrêtées dès que nous aurons obtenu les résultats permettant de valider nos hypothèses de travail.
Raffinement
Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous avons choisi une technique basée sur l’instillation. L’instillation est réalisée sous anesthésie gazeuse sous une lampe chauffante pour limiter la perte de température. Le temps d’anesthésie a été adaptée pour limiter le risque de fausse route. Les animaux seront mis à mort avant l'apparition de signes cliniques extérieur. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites (non guérison de plaie après traitement, manque de soin associé à un isolement pendant plus de 2j, suintement au site d’injection, respiration rapide, blessure étendue ou surinfectée, perte de poids >20%) à partir desquels l’expérience sera arrêtée. Aucune médication n’est prévue pour ne pas interférer avec nos expériences. Dans le cas de blessures légères, nous appliquerons un antiseptique pour nettoyer la plaie et réaliserons un suivi spécifique des animaux et si la blessure n’est pas en cours de guérison pas après 2j, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement modifié que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature comme dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de cancer du poumon après l’expression de la forme active d'un gène promoteur de tumeur. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 4 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.
Modèle nutritionnel de calculs biliaires chez la souris- MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Quarante heures d'isolement en cage individuelle sans enrichissement, vingt heures sur grille pour récolter urines et selles, un jeûne avant chacun des huit prélèvements de sang : 3 450 souris subissent ces procédures, classées en souffrance modérée, toutes tuées pour prélever tissus et sang. Un régime enrichi en cholestérol et en acides biliaires leur fait développer des calculs biliaires, avec inflammation du foie, sensibilité accrue à la douleur abdominale et jaunisse possibles, chez des souris génétiquement modifiées qui développent déjà spontanément la maladie. Le porteur qualifie ces complications hépatiques et intestinales de modérées tout en choisissant ce modèle pour étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Il revendique le nombre minimal d'animaux, et cette version du projet en ajoute 1 650 à l'autorisation initiale.
Objectifs
La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments. L'AJOUT D'UNE PROC2DURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 1650 SOURIS.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.
Procédures
Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. A maximum 4 étapes, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme). A maximum 2 étapes, nous mesurerons la composition corporelle (2 min sur animal vigile), la consommation énergétique (40h en cage individuelle sans enrichissement sur animal vigile), la force musculaire (5 minutes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
1) La mise sous régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 5)Les mesures de consommation énergétiques impliquent un isolement pendant 40h, ce qui induit un stress à l'animal. 6)Les souris génétiquement modifiées développent spontanément une pathologie chronique. Ces évolutions de la maladie peuvent entrainer des modifications du comportement général, telles que : baisse d’activité, poil terne, diminution de la prise alimentaire ou perte de poids, augmentation possible de la sensibilité à la douleur abdominale ou à l’inconfort lié à l’inflammation chronique, une jaunice dans le sang.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.
Choix des espèces
La souris développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris génétiquement modifiée est dépourvue de certains transporteurs, ce qui engendre une accumulation de lipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.
Régulation des molécules antimicrobiennes par le microbiote intestinal chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Deux à trois secondes de biopsie au bout de la queue, une fois par animal : les gestes déclarés s'arrêtent là pour 1 080 souris, dont 160 relèvent d'une souffrance modérée, toutes tuées ensuite pour analyses. Les atteintes annoncées sont d'un autre ordre, avec une inflammation intestinale accompagnée de diarrhée et d'une possible perte de poids, et des lignées porteuses d'un phénotype dommageable qui apparaît après quatorze semaines. L'objet du projet est de modifier le microbiote intestinal de ces souris pour mesurer l'effet sur l'expression de molécules antimicrobiennes. Rien n'indique comment l'inflammation intestinale est provoquée, et le bénéfice tient en une phrase sur des approches thérapeutiques innovantes.
Objectifs
La flore intestinal (microbiote) joue un role crucial contre le développement de nombreuses maladies inflammatoires intestinales et extra-intestinales. Des études récentes montrent que le microbiote intestinal module l'expression de molécules antimicrobiennes dans différents organes qui peuvent jouer un role dans la protection contre ces maladies inflammatoires. Notre objectif est d'induire différents contextes intestinaux dans lesquels le microbiote est modifié et d'évaluer l'impact sur l'expression des molécules antimicrobiennes.
Bénéfices attendus
Notre étude révélera les mécanismes protecteurs du microbiote intestinal contre les maladies inflammatoires et ouvrira la voie à des approches thérapeutiques innovantes.
Procédures
- Biopsie de l'extrêmité de la queue sur souris vigile : 1 fois par animal, 2-3 secondes.
Impact sur les animaux
-Développement d'une inflammation intestinale associée à une diarrhée et une possible perte de poids. -les lignées à phénotype dommageable seront utilisées dans les procédures avant l'apparition de ce phénotype. -La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress léger chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Pour étudier les interactions complexes entre le microbiote intestinal et les tissus, seuls les modèles in vivo sont relevants. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentations déjà menées.
Réduction
les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée. Une analyse de puissance statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum d'animaux nécessaires.
Raffinement
-nombre d’individus par cage adapté pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car leur microbiote intestinal est proche de celui de l'homme et peut être modifié. Les biopsies pour génénotypage de l’extrême pointe de la queue sont effectuées à l’âge de 10 jours âge assez avancé pour être sexés correctement et suffisamment précoce pour le système nerveux qui n’est pas encore parfaitement achevé pour permettre de procéder à l’identification et à la biopsie avec une douleur minimale. Les souris adultes de 8 à 14 semaines seront utilisées avant l'apparition de symptômes pour les lignées à phénotype dommageable qui se fait après 14 semaines d'age.
Evaluation de l’impact immunologique de produits de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Pompe
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Toutes tuées pour prélever rate, ganglions, foie et muscles, 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une forme de la maladie de Pompe qui provoque une faiblesse musculaire progressive, une toxicité cardiaque et une espérance de vie raccourcie. Elles reçoivent un produit de thérapie génique, jusqu'à quatorze prélèvements de sang, des injections d'immunosuppresseurs et des tests mensuels de force musculaire, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Le porteur affirme que "seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune" et qu'aucune méthode substitutive n'existe.
Objectifs
L’émergence des produits de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteur viraux apporte aux patients un espoir de traitement pour les maladies génétique. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre le vecteur ou la protéine qu’il exprime représentent un obstacle majeur qui limite l’efficacité thérapeutique, nécessitant ainsi la mise en place de stratégies d’immunosuppression adaptées. La maladie de Pompe est une affection génétique héréditaire causée par un déficit en alpha-glucosidase acide (GAA) entrainant une accumulation pathologique du glycogène (forme de stockage du sucre) dans les cellules et provoque une faiblesse musculaire et des problèmes respiratoires. L’unique traitement actuel, l’injection de GAA produite en laboratoire, est limité par l’apparition d’anticorps et ne permet pas d’éviter la mortalité chez les patients les plus atteints. La thérapie génique utilisant des vecteurs a montré son efficacité pour traiter cette pathologie. Toutefois, la réponse immunitaire induite par ce traitement pourrait compromettre son efficacité. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de notre organisme en neutralisant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration d’un vecteur viral puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer les éléments nouveaux qui sont produits, telle la GAA. Notre objectif est d’analyser dans un modèle de souris malade comment certaines caractéristiques des vecteurs influent sur la réponse immune, quelles sont les conséquences de cette réponse en termes d’efficacité thérapeutique et d’effets indésirables et enfin de déterminer comment la co-administration d’immunosuppresseurs pourrait permettre de mieux contrôler cette réponse immune délétère.
Bénéfices attendus
Des médicaments à base de vecteurs viraux arrivent sur le marché et/ou sont en test clinique pour traiter la maladie de pompe. Cependant, quelques rares effets indésirables et graves sont apparus, dont la cause serait une réponse immune. L’objectif de ce projet est d’analyser l’influence de divers éléments du vecteur modifiés en laboratoire sur la réponse immune et l’efficacité thérapeutique. Cela permettra de déterminer les règles qui déterminent pourquoi le système immunitaire se met à répondre au vecteur dans telle ou telle condition. Outre l’aspect scientifique novateur, deux bénéfices principaux sont attendus : 1) la conception de médicaments de thérapie génique plus sûrs pour les patients, moins susceptibles de générer des effets indésirables, 2) des approches d’immunosuppression plus adaptées et moins lourdes pour les patients.
Procédures
Les souris recevront une injection du médicament de thérapie génique. Les animaux vigiles seront ensuite suivis sur une période allant de 3 à 12 mois avec : 1) Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois, puis mensuels entrainant une douleur légère passagère de 20 secondes (14 fois maximum pour les procédures les plus longues). 2) Tests comportementaux qui permettent d’évaluer la force musculaire, mensuellement à partir de 3 mois. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Une seconde injection d’agents déclencheurs de la réponse immune sera également administrée. Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats des premiers points de temps et déterminera le nombre total de prélèvements et tests de force. Les souris recevront X injections additionnelles de molécules immunosuppressives : durée (quelques jours à quelques semaines selon les molécules administrées.). Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats de la partie 1.
Impact sur les animaux
Injections répétées durant 5 secondes maximum entrainant une légère douleur passagère. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Le modèle murin de la maladie de pompe entraine une faiblesse musculaire progressive entrainant une toxicité cardiaque et une espérance de vie plus courte (représentatif de la pathologie chez les patients) qui devrait être corrigée grâce aux traitements testés
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des cellules du système immunitaire dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement de thérapie génique (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement euthanasiés. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous euthanasiés.
Remplacement
Des expériences en laboratoire ont permis de ne sélectionner que les candidats médicaments fonctionnels les plus prometteurs. De plus, les molécules cibles de la réponse immune seront sélectionnées grâce à des outils informatiques de prédiction adaptés. Néanmoins, les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus, ainsi que de la force musculaire sur animal vigile. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, nous analysons le maximum de tissus post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal.
Raffinement
Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques), suivi vigilant de l’état des animaux. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
Le model murin de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique de notre candidat puisque les souris n’ayant pas de GAA présente une forme pathologique proche de celui observé chez l’homme : absence de GAA dans l’organisme, accumulation du glycogène, diminution de la force musculaire et une réponse immunitaire contre la GAA est observée en cas d’injection de constructions immunogéniques. Lors de nos précédentes études, nous avons démontré qu’il était possible de traiter ces symptômes via l’injection d’un de nos vecteurs. En fonction des disponibilités, les animaux seront utilisés entre 3 et 8 semaines d’âge, âge auquel le système immunitaire est mature.
Intérêt thérapeutique de la prise en charge de l’hépatocarcinome cellulaire via un traitement par anticorps dans un modèle murin immunocompétent
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester un anticorps censé renforcer les immunothérapies du cancer du foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Chaque souris reçoit dans la veine de la queue une injection rapide d'un large volume de liquide qui déclenche un choc et fait pousser des tumeurs dans son foie, puis des injections d'anticorps deux fois par semaine et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que les tumeurs volumineuses peuvent entraîner une gêne et des douleurs, et décrit le choc provoqué par l'injection comme un épisode dont l'animal récupère en moins d'une heure sans séquelle. Cette description s'accorde mal avec le niveau de souffrance sévère déclaré pour les 360 souris.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules immunitaires par notre anticorps permet de moduler leur activité. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire. Egalement, ce projet nous permettra d’évaluer la pertinence de l’utilisation de cette stratégie thérapeutique innovante dans d’autres cancers exprimant fortement la protéine.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Egalement, ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une injection rapide d’un large volume de liquide. Cette injection entraine un choc chez l’animal, qui récupère en moins d’une heure et ne subit pas de séquelle à long terme. Cette procédure dure moins d’une minute. En fonction des groupes, les animaux seront anesthésiés ou vigiles. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant la durée totale du traitement, par injection réalisée sur animal vigile, cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. L’injection d’un large volume peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère en général rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs en cas de tumeurs volumineuse. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur légère transitoire.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront soumis à une période d’acclimatation d’une semaine, puis habituées à la contention pendant une semaine avant le début des procédures afin de diminuer le stress lié aux injections.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle développé d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue est spécifique à la souris et permet le développement in situ de tumeurs hépatiques, sur la base d’un foie sain, très semblables aux tumeurs retrouvées chez les patients. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de minimum 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire et hépatique mature.
Étude de la synérgie entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux sur la croissance tumorale et son microenvironnement dans des modèles murins de cancer colorectal
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris sert d'abord à faire répéter au personnel les gestes de contention, d'injection dans la veine de la queue et de gavage, deux fois par semaine pendant deux semaines. 266 souris femelles vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dont 242 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des gavages quotidiens ou des injections hebdomadaires, et court chaque jour sur un tapis équipé d'une grille qui délivre une stimulation électrique dès qu'elle s'arrête. Le porteur reconnaît des ulcères et des nécroses possibles sur la peau au niveau de la tumeur, et présente l'exercice physique comme un adjuvant "sans effet indésirable" pour les patients.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de l’exercice physique réalisé avant l’administration de l’immunothérapie et de la chimiothérapie sur l'évolution de la taille de la tumeur dans un modèle de souris de cancer colorectal dans le but d’améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent directement la santé humaine. Il vise à mieux comprendre comment l’exercice physique peut améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. Les résultats obtenus pourraient permettre d’intégrer l’activité physique comme adjuvant thérapeutique dans la prise en charge de certains cancers, offrant une approche complémentaire, non médicamenteuse et sans effet indésirable pour la santé des patients.
Procédures
Les procédures expérimentales prévues comprennent l’injection sous la peau de cellules tumorales (réalisée sous anesthésie), la contention, l’administration de traitements par gavage oral tous les jours (administration orale à l’aide d’une petite sonde) ou par injections une fois par semaine (sous cutanée et intra-caudales soit une injection réalisée dans une veine superficielle de la queue) chez des animaux éveillés, ainsi que la mise en place d’un programme d’exercice physique sur tapis de course tous les jours précédent les traitements, comprenant une phase d’habituation au tapis et des séances répétées. Ces interventions d’exercice et de traitement par injection ou gavage dureront au total 3 semaines. Certaines souris seront également utilisées dans le cadre d’une courte formation destinée à l’apprentissage des gestes techniques (contention, injections, gavage) par le personnel expérimentateur, avant le début des procédures expérimentales. Les gestes seront réalisés deux fois par semaine pour une durée de deux semaines pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection sous la peau de cellules tumorales, réalisée en quelques secondes au niveau du flanc droit, ce qui peut provoquer un stress lié à la contention et une douleur légère à l’injection. La tumeur peut parfois provoquer des lésions locales, telles que des plaies ou zones endommagées de la peau (ulcères et nécroses). Dans ce modèle de souris, aucune métastase (migration de cellules tumorales à distance) n’a été observée avant l’atteinte du volume tumoral maximal autorisé. Pendant les séances d’exercice, les souris courront sur un tapis de course équipé d’une grille de stimulation, qui délivre un léger stimulus uniquement lorsqu’un animal cesse de courir, afin de l’encourager à reprendre sa course. Pour limiter au maximum l’exposition à cette stimulation, un dispositif de protection constitué de petits bâtons sera installé juste en amont de la grille. Ce dispositif mobile limite le contact direct avec la grille tout en permettant aux animaux de poursuivre leur activité en toute sécurité. Certains animaux seront soumis à une période de formation où ils subiront des injections en sous-cutané et en intra-caudale (injection réalisée au niveau d’une veine superficielle sur la queue), des gavages oraux (administration orale à l’aide d’une petite sonde). La contention durant ces sessions peut induire le stress de l’animal et les injections et les gavages qui pourront être répétés deux fois par jour sur le même animal peuvent induire une légère irritation.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ces procédures seront mise à mort à la fin des expérimentations afin de pouvoir récolter les tumeurs pour des analyses biologiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier comment la croissance de la tumeur, les traitements combinés et l’exercice physique interagissent, en particulier sur le système immunitaire, la circulation du sang dans la tumeur et le manque d’oxygène (hypoxie) dans la tumeur. Ces phénomènes doivent être étudiés dans tout l’organisme et ne peuvent pas être remplacés par des expériences en laboratoire sur des cellules ou par des simulations informatiques.
Réduction
Nous utiliserons le plus petit nombre de souris possible tout en garantissant des résultats fiables. L’objectif est de comparer la croissance des tumeurs entre les groupes ayant fait de l’exercice et ceux qui n’en ont pas fait. Le nombre d’animaux a été calculé pour être suffisant afin de détecter de vraies différences si elles existent, tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en place pour minimiser le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine et une familiarisation au tapis de course avant le début des protocoles d’exercice et de traitement seront envisagés afin de réduire le stress au moment des séances expérimentales. Après l’inoculation de la tumeur, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de souffrance. En cas de douleur un traitement analgésique est prévu. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens ne seront pas utilisés afin de ne pas modifier la réaction du système immunitaire et de ne pas biaiser les résultats. Durant l’exercice physique, un dispositif de bâtons sera installé sur la grille électrique du tapis de course pour limiter l’exposition des animaux aux stimulations électriques tout en les incitant à continuer l’exercice. Des points limites ont été définis concernant l'état de l'animal et de la tumeur, et seront appliqués afin d'éviter la souffrance. Les souris seront hébergées dans des cages à enrichissement classique durant la période d’acclimatation et de familiarisation. Après l’inoculation de la tumeur, l’enrichissement sera adapté avec de la cellulose qui remplacera les copeaux de litière pour éviter les irritations qui peuvent survenir sur la peau au niveau de la tumeur.
Choix des espèces
Ce projet utilisera des souris femelles, un modèle que nous connaissons bien dans notre laboratoire. Tous les outils nécessaires sont déjà optimisés pour cette espèce : le tapis de course pour l’exercice, le modèle de cancer, les traitements et leur administration, ainsi que les analyses immunologiques à la fin de l’étude. Cela permet de réduire le nombre d’animaux, de limiter les tests préliminaires et de garantir des résultats fiables. Les souris auront 5 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Les 2 premières semaines seront consacrées à une période d’acclimatation et d’habituation avec le tapis de course. La greffe de tumeur et les expériences débuteront à l’âge de 7 semaines, âge auquel la prise de greffe est facilitée et le muscle est complètement développé.
Etudes des mécanismes réduisant l’efficacité de traitement antibiotique et promouvant l’émergence d’antibiorésistance chez la souris infectée par Mycobacterium tuberculosis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Anesthésiées puis infectées en une minute par des bacilles de la tuberculose, 2 136 souris subissent ensuite jusqu'à six périodes de traitement antibiotique, gavage quotidien sept jours de suite puis trois semaines sans rien, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour mesurer la charge bactérienne dans leurs organes. Les souches inoculées portent des mutations construites au laboratoire pour survivre aux antibiotiques ou reprendre leur croissance après traitement, l'enjeu étant d'observer l'apparition de résistances chez un hôte vivant. Le porteur retient la souris parce que sa sensibilité au bacille et la cinétique de réplication y sont bien caractérisées et qu'elle reproduit selon lui une bonne part des observations faites chez l'humain.
Objectifs
La progression de la résistance bactérienne aux traitements antibiotiques est une menace mondiale. L’identification des mécanismes bactériens qui facilitent le développement de résistance et mènent à des échecs thérapeutiques sont des priorités urgentes. Plusieurs résultats suggèrent un rôle moteur de deux processus complémentaires, mis en évidence chez Mycobacterium tuberculosis, l'agent infectieux bactérien le plus fatal au niveau mondial : la tolérance, qui désigne la capacité de la bactérie à survivre lors de l’exposition antibiotique, et la résilience, qui désigne sa capacité à réinitier rapidement sa réplication après une telle exposition. Cependant, la dynamique d’interaction entre ces mécanismes de tolérance et de résilience et le développement de résistance reste méconnue. L’objectif du projet est de déterminer ces interactions en utilisant une approche d’évolution expérimentale dans le modèle souris sous traitement antibiotique reproduisant des conditions favorables de souches modifiées de tolérance, de résilience et de résistance. A cette fin, des souches de M. tuberculosis porteuses de différentes mutations connues de tolérance et/ou de résilience ont été construites. Le but initial est d’évaluer la dynamique de croissance et d’évolution de résistance de ces souches exposées à un traitement antibiotique chez la souris, en comparaison de souches parentales dépourvues de ces mutations de tolérance ou de résilience. L’objectif final est de déterminer si, et dans quelle mesure, la présence mutations de tolérance et/ou de résilience réduisent l’efficacité antibiotique chez l’hôte et accélèrent l’émergence de résistance au traitement. La compréhension avancée des interactions entre tolérance, résilience et résistance qui en est attendue devrait permettre de mettre en lumière les mécanismes fondamentaux expliquant les échecs de traitements et le développement global d’antibiorésistances. Les informations visées devraient fournir des données essentielles pour le développement d’outils diagnostiques et thérapeutiques inédits de détection et/ou de prévention de risque d’émergence de chimiorésistance.
Bénéfices attendus
La tuberculose est une cause majeure de mortalité globale due à l’antibiorésistance. La recherche de nouveaux antibiotiques, en particulier contre cette maladie, est une tâche très ardue. Cependant, la majorité des cas de tuberculose dans le monde restent encore sensibles aux traitements. Il est donc essentiel de préserver l’efficacité des traitements actuels et futurs, et d’éviter que la bactérie ne développe davantage de résistances. Ce projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur les rôles et les dynamiques d’interaction de mécanismes génétiques de tolérance et de résilience aux antibiotiques dans la réduction de l’efficacité chimiothérapeutique et la facilitation de l’évolution de l’antibiorésistance chez le bacille de la tuberculose. Les résultats attendus devraient fournir des informations permettant l’identification de marqueurs génétiques bactériens prédictifs de traitement déficient et de risques d’émergence de résistance, offrant la perspective du développement d’un nouvel outil de diagnostic moléculaire capable de détecter à la fois les populations bactériennes tolérantes/résilientes et l’émergence de résistances. Ces schémas d’évolution expérimentale in vivo pourront également fournir de nouveaux modèles expérimentaux pour l’évaluation pré-clinique de composés candidats inhibant la tolérance et/ou la résilience aux médicaments, augmentant l’efficacité des traitements et prévenant l’émergence de résistances.
Procédures
Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose après avoir été anesthésiés. Cette opération dure 1 minute. Certains groupes d'animaux recevront jusqu’à 6 périodes de traitement par antibiotique pendant 7 jours consécutifs par semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ou nuisances attendus chez les animaux dans le cadre de nos expériences se situent à deux niveaux, soit lors de l’infection expérimentale, et lors de l’administration des traitements antibiotiques. Pour l’infection, il s’agit de nuisances modérées d’une durée de 1 minute. Lors de chaque période de traitement antibiotique, les animaux seront soumis à une contention quotidienne (d’une durée maximum 1 minute) suivie d’un gavage (si choisi), 7 jours par semaine pendant une semaine, suivie de trois semaines sans traitement.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes
Remplacement
Les modèles in vitro ou cellulaires ne permettent pas de rendre compte des conditions pharmacocinétiques, ni des conditions métaboliques bactériennes et d’interactions avec la réponse immunitaire prévalant lors du traitement antibiotique au sein de tissus de l’hôte infecté par Mycobacterium tuberculosis. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour une telle étude. Le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris, car il reproduit en termes de réponses au traitement anti-tuberculeux bon nombre des observations faites chez l’humain.
Réduction
Chaque phase du projet sera suivie d’une décision de poursuite ou d’interruption de l’étude, en fonction des résultats obtenus. Pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes,4 ou 5 souris par groupe et par point de temps seront nécessaires afin de tenir compte de la variabilité inter-individus, attendue sur base de données disponibles dans la cadre d’autres projets précédemment menés dans des modèles murins d’infection par M. tuberculosis sous traitement antibiotique. Les différences de charge bactérienne entre groupes expérimentaux seront analysées à l’aide de tests statistiques. Afin de limiter la variabilité expérimentale, nous constituerons des lots d’animaux homogènes.
Raffinement
Des mesures seront mises en place afin de minimiser les nuisances pour les animaux : réduction maximale du temps de contention lors des phases d’infection et d’administration des antibiotiques, surveillance renforcée après chaque intervention. Les animaux seront suivis avec une table de suivi de soins comportant des points limites et spécifiques du projet. Pour l’infection, les animaux seront anesthésiés.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet visant à explorer le lien entre tolérance, résilience et émergence de résistance aux antibiotiques chez l’hôte infecté, à travers l’étude de souches modifiées et contrôles de Mycobacterium tuberculosis, le modèle murin s’impose comme le choix le plus pertinent. La souris est très bien caractérisée quant à son niveau de sensibilité à ce pathogène et à la cinétique de réplication bactérienne au cours de l’infection. Elle est aussi un modèle couramment utilisé pour l’évaluation préclinique d’efficacité d’antibiotiques in vivo. En particulier, après établissement initial de l’infection pendant une période de trois semaines, la relation entre le traitement quotidien par doses thérapeutiques d'antibiotiques et la réduction de charge bacillaire dans lesorganes est bien établie Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge
Etude de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles d’infection pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
12 096 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection respiratoire leur est provoquée par une administration unique de virus ou de bactéries dans les voies aériennes sous anesthésie, puis des traitements sont administrés jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines. Le porteur annonce une perte de poids, une baisse d'activité, une respiration rapide ou difficile et, dans les cas les plus graves, des complications pulmonaires ou générales, effets qu'il déclare "nécessaires" à l'évaluation des traitements. Les effectifs qu'il détaille, sept groupes de six à douze animaux par étude, ne sont jamais rapportés aux 12 096 souris annoncées, et ni les pathogènes ni les molécules testées ne sont nommés.
Objectifs
Les infections respiratoires constituent un problème majeur de santé publique, à l’origine d’un grand nombre d’hospitalisations et de décès chaque année. Elles regroupent différentes entités cliniques, d’origine bactérienne ou virale, pouvant évoluer vers des formes sévères telles que les pneumonies ou les syndromes de détresse respiratoire aiguë. Parmi elles, les pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) représentent une complication fréquente et grave chez les patients en réanimation, caractérisée par une inflammation pulmonaire aiguë et la colonisation des voies respiratoires profondes par des agents pathogènes opportunistes, souvent hyper- virulents et/ou multi-résistants. Les options thérapeutiques actuelles demeurent limitées et parfois inefficaces face à l’antibiorésistance croissante. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou de repositionner des molécules existantes afin d’améliorer la prise en charge des infections respiratoires sévères. Le présent projet s’inscrit dans ce cadre et a pour objectif de développer et caractériser des modèles précliniques d’infection respiratoire bactérienne et virale permettant l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ces modèles ont pour finalité de reproduire différentes situations cliniques : mimer une infection physiologique par voie respiratoire haute ou reproduire des infections pulmonaires profondes de type PAVM. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules dans des contextes infectieux variés, de documenter leurs effets sur la charge bactérienne, la réponse inflammatoire et la fonction respiratoire, et de sélectionner les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement préclinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier et valider, dans un contexte physiopathologique pertinent, l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ou de molécules repositionnées dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales, incluant les pneumonies acquises sous ventilation mécanique. Les bénéfices attendus concernent la mise au point de modèles précliniques d’infection respiratoire permettant d’évaluer chez l'animal l’efficacité de ces molécules sur des infections pulmonaires induites par des souches d’intérêt clinique, et de comparer leur efficacité à celles des traitements de référence. Ces études permettront également de mieux comprendre leurs mécanismes d’action à travers l’analyse de la charge bactérienne, des biomarqueurs inflammatoires et de la réponse pulmonaire. À terme, ce projet contribuera à identifier des candidats thérapeutiques prometteurs susceptibles de réduire la sévérité et la durée des infections respiratoires, d’améliorer la fonction pulmonaire et de diminuer la mortalité associée à ces pathologies.
Procédures
Les animaux participeront à une étude visant à reproduire une maladie respiratoire, puis à tester l’efficacité de différents traitements. Pour induire la maladie, les animaux recevront une administration unique de virus ou bactérie pathogènes au niveau des voies respiratoires. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie afin de limiter toute douleur ou inconfort et durera quelques minutes. Certains animaux recevront uniquement une solution sans principe actif afin de servir de groupe de comparaison. Les traitements étudiés pourront être administrés avant ou après l’apparition de la maladie, sur une durée pouvant aller de quelques jours à plusieurs semaines. La fréquence d’administration pourra varier de quelques fois par semaine à une ou deux fois par jour selon les besoins de l’étude. Les modes d’administration pourront varier en fonction du composé et de la posologie envisagée. Ces manipulations peuvent entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’un inconfort léger et transitoire. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude, sous anesthésie, à intervalles espacés et dans des volumes respectant les recommandations en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant leur réveil après chaque intervention. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires, après anesthésie, afin de permettre des analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de l’étude, les animaux développeront une infection respiratoire. Cela pourra entraîner des signes de maladie tels qu’une perte de poids, une diminution de l’activité, une respiration plus rapide ou difficile, ainsi qu’un état de fatigue. Dans les cas les plus sévères, l’infection pourra provoquer des complications au niveau des poumons ou affecter plus largement l’organisme. Ces effets sont attendus dans ce type de modèle et sont nécessaires pour permettre l’évaluation des traitements étudiés. Les traitements testés ne devraient pas entraîner d’effets indésirables particuliers, car les doses utilisées sont connues pour être bien tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les poumons et le sang seront prélevés à des fins d’analyses.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales nécessite de disposer de modèles animaux capables de reproduire la complexité de la pathologie humaine, incluant la réponse immunitaire, l’inflammation pulmonaire, l’élimination de l’agent pathogène et les lésions tissulaires associées. Bien que des essais sur cellules soient réalisés en amont pour évaluer la toxicité, la réponse inflammatoire cellulaire et l’activité antimicrobienne ou antivirale des composés, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions entre les pathogènes, le système immunitaire et les organes cibles. L’utilisation du modèle souris reste indispensable pour évaluer de manière intégrée les effets du traitement sur l’infection, l’inflammation et la fonction pulmonaire. Les procédures proposées présentent donc un caractère de stricte nécessité scientifique et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives ne faisant pas appel à l’animal vivant.
Réduction
Pour chaque étude pilote, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les concentrations d’inoculum testées (3 concentrations) selon les souches, seront choisies en s’appuyant sur les modèles infectieux déjà décrits dans la littérature. Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour obtenir une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 7 groupes (4 groupes pour les pilotes) de 6 à 12 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.
Raffinement
Pour chaque souche bactérienne ou virale testée, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Les conditions d’hébergement respecteront les exigences réglementaires pour le respect de l’animal ; 5 à 6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’hébergement. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour limiter la contention des souris par la queue. Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Toutes les procédures d’infection seront réalisées sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et prévenir toute douleur ou inconfort. L’anesthésie sera induite par inhalation (induction et maintien au masque) ou par une injection d'un couple anesthésiant/analgésique. Dans ce dernier cas, l’anesthésie sera interrompue au bout d’environ 30 minutes, afin de favoriser un réveil rapide et limiter la durée d’exposition anesthésique. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habilité, maîtrisant les techniques d’administration et de surveillance anesthésique. Les animaux anesthésiés seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’administration dans les poumons, nécessitant la mise en place d’une sonde, sera réalisée avec précaution afin de limiter les lésions locales et les risques d’irritation, à l’aide d’un endoscope à fibre optique. Cette stratégie de raffinement vise à assurer une maîtrise rigoureuse de la douleur et du stress, à limiter les nuisances tout en maintenant la validité scientifique et la reproductibilité des modèles d’infection respiratoire mis en œuvre.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des infections respiratoires bactériennes et virales. Sa réponse immunitaire bien caractérisée, sa reproductibilité expérimentale et sa taille adaptée permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la quantité de composé administrée et les nuisances associées. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Développement d’une nouvelle thérapie contre le cancer ciblant les cellules immunitaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester si un composé injectable modifie le comportement des cellules immunitaires attirées par une tumeur, 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections sur animal vigile, dont celles qui provoquent le cancer et celles de l'immunothérapie associée, le porteur n'attendant "aucune nuisance particulière" dans ce modèle de cancer au-delà du stress de la préhension. Les groupes comptent vingt souris, et le projet s'arrête si aucune différence significative n'apparaît entre traitement et témoin. Sur le remplacement, le porteur affirme avoir besoin d'un "organisme entier et autonome", ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne reproduisant selon lui la circulation des cellules immunitaires entre organes.
Objectifs
L'apparition d'une inflammation attire les cellules du système immunitaire. Dans le cancer, ces cellules peuvent empêcher la réponse immunitaire contre les cellules tumorales. Nous avons découvert l’un des mécanismes contrôlant le comportement des cellules immunitaires et réussi à augmenter l’efficacité d’un traitement anti-tumoral par blocage de points de contrôles immunitaires, dans un modèle de cancer chez la souris. Nous avons mis au point in vitro un composé injectable qui pourrait modifier le comportement de ces cellules immunitaires. Le but de ce projet est de tester ce composé dans une situation physiologique in vivo, et en particulier pour le traitement du cancer. Ce travail constitue la première étape pour le développement de cette nouvelle piste thérapeutique qui pourrait déboucher sur de nouveaux traitements dans le cancer.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente le développement d'une nouvelle approche thérapeutique afin d'améliorer l'efficacité des thérapies anti-cancer.
Procédures
Tous les animaux vigiles subiront une injection pour tester notre composé (quelques secondes) et des injections supplémentaires pour induire le modèle de cancer et pour le traitement par immunothérapie (4 injections supplémentaires, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : stress lié à la préhension (légère et rapide) et douleur légère liée à la piqure. Aucune nuisance particulière n'est attendue dans le modèle de cancer.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort (fin de l'expérience ou pour analyses post-mortem).
Remplacement
Nous avons identifié in vitro et dans des souris génétiquement modifiées une cible thérapeutique intéressante. Afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie, nous devons à présent utiliser un modèle animal représentant un organisme entier et autonome. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La dynamique de l'inflammation, des cellules immunitaires recrutées ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de tester notre stratégie thérapeutique dans un système physiologique complexe. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 20 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Si nous mettons en évidence une différence significative entre le traitement et le contrôle, nous poursuivrons les analyses. Dans le cas contraire, le projet s'arrêtera.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans chaque procédure, les animaux seront surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins spécifiques seront mis en place si nécessaire, tels que l'injection de solution réhydratante en cas de déshydratation. Les animaux seront pesés et évalués au minimum deux fois par semaine grâce à une grille de score pour éviter la souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux