Souris
Modélisation de l’hidradénite suppurée par inactivation conditionnelle de la nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Épilées sous anesthésie, badigeonnées trois jours de suite d'un produit sur le dos, puis exposées quatre fois à des bactéries appliquées au coton-tige, 2 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi cinq prélèvements sanguins étalés sur soixante jours, une injection abdominale et cinq semaines de régime hyperlipidique. Le but est de construire un modèle d'hidradénite suppurée par inactivation d'un gène dans les cellules souches du follicule pileux, ce qui provoque hyperprolifération folliculaire et inflammation cutanée massive. Le porteur présente ce nouveau modèle comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains et une limitation de leur nombre, tout en annonçant 2 352 souris toutes tuées pour l'analyse de leurs tissus.
Objectifs
L'hidradénite suppurée (HS) est une maladie inflammatoire chronique de la peau affectant le follicule pileux. Notre équipe étudie le rôle de certaines cellules et a mis en évidence une altération de leur homéostasie chez les patients. Des mutations d’un gène de la protéine nicastrine ont été identifiées chez environ 10 % des patients HS. Un modèle de souris avec une délétion spécifique de la nicastrine dans certaines cellules développent des lésions cutanées associant hyperprolifération des follicules et une inflammation massive. Nous proposons un nouveau modèle murin qui permettra une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine de l'HS et pourrait aboutir à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le développement d'un modèle murin amélioré est essentiel pour comprendre la physiopathologie de l'HS et identifier de nouveaux traitements pour cette maladie actuellement sans solution curative. Ce modèle permettra aussi d'améliorer le bien-être animal en ciblant plus précisément les cellules d'intérêt, réduisant ainsi les effets secondaires indésirables et limitant le nombre d'animaux nécessaires. En effet, l’animal pourra servir de contrôle pour lui-même, minimisant la variabilité interindividuelle et optimisant la pertinence des résultats.
Procédures
Préparation des souris et traitement initial : Les souris seront épilées sous anesthésie afin de garantir une application homogène des traitements. Pendant trois jours consécutifs, une application cutanée de produit sera réalisée sur la région dorsale. Des prélèvements sanguins seront effectués à intervalles réguliers (J0, J14, J30, J45, J60) une méthode rapide (< quelques secondes). Une injection dans l’abdomen sera réalisée en quelques secondes. Application topique cutanée avec des bactéries à l’aide d’un coton-tige sur la surface cutanée sans nécessité de raser la fourrure. Cette application topique sera répétée de manière quotidienne un total de 4 fois (quelques minutes à chaque fois). Introduction d’un régime hyperlipidique sur une période de cinq semaines.
Impact sur les animaux
L'administration d’un des produits par voie cutanée pourrait induire des effets secondaires locaux tels qu'une irritation cutanée, une sécheresse excessive ou une inflammation transitoire au site d'application. Ces effets seront surveillés et atténués par une application contrôlée du traitement et l'utilisation éventuelle d'agents apaisants. De plus, l'inactivation de la nicastrine dans notre modèle pourrait provoquer une altération de la structure des follicules et une inflammation cutanée, ce qui sera évalué régulièrement afin d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer sur les tissus isolés l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.
Remplacement
Nous avons évalué les alternatives existantes, notamment les modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes, folliculoïdes) Toutefois, l’HS est une maladie complexe et multifactorielle, impliquant des interactions entre les cellules épithéliales du follicule pileux, le microbiote cutané et le système immunitaire inné et adaptatif. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire cette complexité de manière fidèle. Modèles in vitro et limites : Les folliculoïdes que nous développons offrent une plateforme intéressante pour étudier certains aspects précoces de la maladie, mais ils ne permettent pas d’analyser l’infiltration immunitaire ni les interactions systémiques entre les cellules de l’hôte et le microenvironnement inflammatoire. Les cultures isolées ne permettent pas de reconstituer l’architecture folliculaire ni les phénomènes de rupture folliculaire, caractéristiques clés de l’HS. Ainsi, l’utilisation de notre modèle murin est nécessaire pour explorer les mécanismes précoces de l’HS, notamment : le rôle de certaine scellules dans l’initiation de la maladie ; les interactions entre diffrérents types scellulaires ; et la formation des lésions caractéristiques. En complément, nous continuerons à développer et affiner des modèles alternatifs, notamment les folliculoïdes, afin de limiter le recours aux modèles animaux lorsque cela est possible
Réduction
Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes: Nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal: nous utilisons plusieurs approches/réalisons plusieurs analyses sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Nous avons développé un modèle fluorescent qui permet un traçage précis des cellules étudiées facilitant l’interprétation des résultats tout en réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. 3. Intégration de modèles in vitro pour réduire la dépendance au modèle murin: Nous avons mis en place des modèles de folliculoïdes, qui permettent d’explorer certains aspects de la physiopathologie de l’HS et de tester des candidats thérapeutiques en amont, avant de valider les résultats dans le modèle murin. Ces modèles in vitro nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis. 4. Standardisation et harmonisation des protocoles : L’homogénéisation de nos procédures (croisements génétiques optimisés, conditions expérimentales rigoureusement contrôlées) permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser le recours au modèle murin tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux sur l’HS.
Raffinement
Nous avons choisi un modèle murin permettant une perte spécifique de nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux sans affecter d’autres tissus. Cette approche ciblée réduit les effets secondaires systémiques et limite la sévérité des phénotypes, garantissant un impact minimal sur le bien-être général des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Les points limites précoces définis sont : diminution de l’activité spontanée, grooming excessif, posture légèrement courbée, ainsi que l’apparition de rougeur ou perte de poils débutante. En cas de détection, la surveillance sera intensifiée et un avis vétérinaire sera sollicité. Les procédures nécessitant une manipulation potentiellement inconfortable seront realisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, permettant de limiter la douleur, le stress et la durée d’immobilisation. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive pendant et après l’anesthésie, avec mise en place de mesures de soutien appropriées, notamment le maintien de la température corporelle. L’hébergement intègre plusieurs mesures de raffinement supplémentaire au cours de l’expérimentation: • enrichissement optimisé avec litière douce en cellulose ; • apport de gel nutritif en cas de baisse transitoire d’appétit ou pour limiter le stress post-manipulation ; • contrôle strict de la température. Nous collaborerons étroitement avec les vétérinaires et référents en expérimentation animale pour garantir l’application des meilleures pratiques en matière de raffinement.
Choix des espèces
1. Homologie génétique avec l'humain : La souris partage environ 85 % de son génome avec l’humain, permettant une extrapolation fiable des résultats. 2. Modèle précliniquement validé : Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies dermatologiques, y compris les pathologies inflammatoires du follicule pileux, garantissant une base de comparaison avec des études antérieures. 3. Manipulation génétique avancée : La disponibilité de lignées transgéniques permettent une étude fine des mécanismes moléculaires impliqués. 4. Facilité d’élevage et de suivi : Leur cycle de reproduction court et leur coût relativement bas permettent une étude efficace et reproductible sur plusieurs générations. 5. Ainsi, l'utilisation de la souris comme modèle animal est essentielle pour élucider les mécanismes sous-jacents à l’hidradénite suppurée et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avant d'envisager des études cliniques. L'étude portera sur des souris adultes entre 3 à 24 semaines. L'hidradénite suppurée atteint principalement les adultes.
Caractérisation Multimodale de Modèles Animaux par IRM
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 100
Immobilisés la tête maintenue dans un dispositif de contention, sous anesthésie gazeuse ou injectable pendant des séances allant jusqu'à deux heures et demie, 200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Environ la moitié reçoit en plus un cathéter sous-cutané, dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des douleurs. Le même document qualifie l'IRM de méthode "indolore et non invasive" et en fait un argument de réduction, alors que tous les animaux sont tués après la dernière séance pour que leur cerveau soit analysé ex vivo. L'effectif ne vient d'aucun calcul de puissance mais d'une prévision d'activité de plateforme, deux projets souris et un projet rat par an, deux groupes de dix animaux chacun.
Objectifs
En neurosciences, les études précliniques menées avec des modèles rongeurs sont souvent réalisées pour identifier des « signatures » - des biomarqueurs – des mécanismes cérébraux sains ou pathologiques pour envisager un transfert vers une recherche clinique. L’Imagerie par résonance magnétique (IRM) préclinique constitue un outil majeur pour l’étude des pathologies neurodéveloppementales, neurologiques et psychiatriques, car elle offre une exploration non invasive de multiples paramètres fonctionnels et anatomiques du cerveau des modèles étudiés. Il existe plusieurs modalités d’IRM, chacune ayant ses spécificités et permettant la caractérisation de paramètres précis mais restreints et une modalité utilisée seule ne permet souvent pas d’identifier un biomarqueur. Afin d’optimiser la découverte de biomarqueurs d’intérêt et de favoriser des translations vers la clinique à partir de modèles de pathologies cérébrales, nous proposons de combiner plusieurs modalités d’IRM – on parle d’IRM multimodale – pour offrir une vue d’ensemble détaillée et dynamique des processus biologiques au sein du cerveau d’un modèle rongeur : en multipliant les grilles de lecture, nous sommes capables, pour un modèle rongeur donné, d’évaluer la structure cérébrale, la connectivité fonctionnelle et les profils métaboliques. Nous pouvons ainsi identifier et comparer des biomarqueurs d’intérêt et suivre leur évolution longitudinale. Les modalités d’IRM utilisées dans ce protocole sont multiples et complémentaires : - IRM anatomique pour visualiser les structures cérébrales, offrant ainsi une vue détaillée de l’intégrité structurale du cerveau. - IRM fonctionnelle (IRMf) pour étudier l’activité neuronale et la connectivité fonctionnelle et ainsi obtenir des informations sur les réseaux neuronaux et leurs interactions en réponse à des stimuli. - Spectroscopie par résonance magnétique (MRS) pour étudier le métabolisme cérébral et donc comprendre les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques et psychiatriques. - Imagerie par transfert de saturation d’échange chimique (CEST) pour détecter des biomarqueurs moléculaires spécifiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont nombreux et couvrent plusieurs domaines de la recherche en neurosciences et en imagerie médicale. Nous pouvons identifier notamment : - L’amélioration de la compréhension des maladies neurologiques et psychiatriques. - L’identification de biomarqueurs. - Le suivi longitudinal des maladies. - L’optimisation des modèles animaux. - La translation vers l’imagerie clinique.
Procédures
Pendant les sessions d’IRM, un système de contention adapté sera employé pour assurer l’immobilisation des animaux indispensable à la qualité des acquisitions. les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse . Chaque animal pourra subir de 1 à 4 séances d’imagerie selon le projet et le type de modèle : les modèles neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs nécessitent généralement des suivis longitudinales, tandis que les autres projets prévoient une seule séance. Un intervalle d’au moins deux semaines sera respecté entre les séances pour limiter le stress. Pour les animaux destinés aux sessions d’IRM fonctionnelle un cathéter en sous-cutané sera placé pour l’administration d’un anesthésique ou d’un tranquillisant médicamenteux, l’anesthésie gazeuse n’étant pas adaptée à ce type d’examen. Cela concernera environ la moitié des animaux. Chaque session IRM n’excédera pas 2 heures et demi.
Impact sur les animaux
La pose d’un cathéter en sous-cutané pourra entraîner des douleurs. Le positionnement nécessaire pour l’imagerie peut être inconfortable. L’IRM peut induire un stress lié à la manipulation et à l'immobilisation prolongée sous anesthésie. L’examen lui-même n’est pas douloureux, mais la préparation et le maintien immobile de l’animal peuvent entraîner un léger stress. . Une anesthésie prolongée présente un risque d’hypothermie.
Devenir
A l’issue de la dernière session IRM, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour des études ex vivo indispensables pour confirmer la validité des biomarqueurs qui seront identifiés au cours de l’étude
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
L’application combinée d’imageries anatomiques, fonctionnelles et métaboliques permet une caractérisation plus complète que chaque technique isolée. Le recours à l’IRM multimodale contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés, en multipliant les mesures obtenues sur un même individu. Nous avons déterminé le nombre d’animaux en fonction des nécessités d’effectifs pour réaliser des statistiques significatives. Cela a été possible grâce aux expériences réalisées précédemment sur les modèles de souris et de rat. L’IRM qui est une méthode indolore et non invasive, permet d’examiner de nombreux paramètres sur un même animal, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux et d’expériences nécessaires pour obtenir ces informations. Dans le cadre du présent projet plateforme, chaque projet utilisateur accueilli comprend plusieurs groupes expérimentaux, par exemple des animaux modèles et des animaux contrôles, éventuellement différenciés par âge, sexe ou type de modification génétique. Sur une année, la plateforme prévoyoit d’accueillir environ deux projets impliquant la souris et un projet impliquant le rat, chacun comportant 2 groupes de 10 animaux. Sur cinq ans cela correspond à un maximum de 200 souris et 100 rats. En tenant compte des différents groupes expérimentaux ainsi que des acquisitions longitudinales prévues, ce nombre d’animaux est justifié. Il permet de couvrir l’ensemble des besoins liés aux conditions expérimentales, d’assurer la robustesse des résultats obtenus et de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés, tout en maximisant les informations recueillies pour chaque individu.
Raffinement
Raffinement Le raffinement repose sur des procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, l’observation des signes cliniques et des points limites, ainsi que des soins post-anesthésiques adaptés. Anesthésie Avant chaque examen, les animaux seront anesthésiés par un opérateur qualifié afin d’éviter toute douleur ou stress. Selon le type de session, l’anesthésie sera réalisée sous forme gazeuse ou injectable. Pendant l’examen, les animaux resteront sous anesthésie et leur fréquence respiratoire sera surveillée en continu pour garantir leur sécurité. Chaque session d’IRM durera au maximum 2,5 heures. Après l’examen, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet dans un environnement calme et chauffé. Immobilisation et réduction de l’inconfort Lors des séances d’IRM, la tête des animaux sera stabilisée à l’aide d’un dispositif de maintien adapté, afin d’éviter les mouvements pendant l’enregistrement des images. Pour limiter tout inconfort, une anesthésie locale sera appliquée avant la mise en place du dispositif. Maintien de la température corporelle Les animaux seront maintenus au chaud grâce à un tapis chauffant adapté, afin de prévenir toute hypothermie pendant la procédure.
Choix des espèces
Les fonctions cérébrales des rongeurs sont bien documentées, ce qui en fait des modèles de référence pour l’étude du cerveau. L’utilisation de rats et de souris adultes permet de reproduire plus fidèlement les mécanismes cérébraux observés chez l’adulte, notamment dans le cadre de modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques. Les expériences seront donc réalisées sur des souris adultes (18–35 g) et des rats adultes (150–250 g).
Rôle de la pollution atmosphérique dans les anomalies de résolution de l’inflammation dans la mucoviscidose
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 100 souris reproduisant l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, sous anesthésie, une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation des poumons, subissent des injections dans la veine de la queue sur animal éveillé, et une canule est placée dans leur trachée pour mesurer le flux d'air. Pendant 72 heures, l'air de leurs cages est modifié pour reproduire un pic de pollution parisien. Le porteur écrit que "seule l'expérimentation sur des animaux vivants" permet d'étudier ces interactions entre organes, tout en indiquant que les travaux préalables du laboratoire ont porté sur des cellules in vitro.
Objectifs
La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induisent une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de molécules aidant à résoudre l’inflammation et qui sont appelées SPMs. Une autre possibilité est que l’exposition à la pollution de l’air aggrave l’inflammation. Nous étudierons la production des SPMs dans un contexte de pollution de l’air sur un modèle murin mimant l’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - une meilleure compréhension de l’impact de la pollution de l’air sur des souris dont l’atteinte mime la mucoviscidose des êtres humains, - une preuve de concept que les SPM pourrait traiter l’inflammation des poumons dans la mucoviscidose. - mieux comprendre les différences de gravité de la maladie respiratoire selon le sexe A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouvelles recommandations et de nouveaux traitements de l’inflammation des poumons pour les patients vivant avec la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des traitements administrés en moins d’une minute soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes de solution par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, l’injection dans la veine de la queue sera réalisée sur souris éveillées, et l’administration intranasale sur les souris anesthésiées. Enfin pour mesurer la fonction pulmonaire des souris, celles-ci seront complètement anesthésiées et une canule sera placée (geste prenant moins d’une minute) dans leur trachée pour mesurer le flux d’air (la durée de la mesure est d’une dizaine de minutes). Pour induire un environnement pollué, l’air circulant dans les cages des souris sera modifié pour avoir une composition similaire à celle de Paris au cours d’un pic de pollution, cette exposition durera 72 heures.
Impact sur les animaux
Les souris exposées 3 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les animaux seront hébergés par 2 à 5 dans une cage identique à celle de leur environnement habituel afin de limiter leur stress. Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris qui en ont reçus. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés ici sera mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.
Remplacement
Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments. Cette étude vient compléter les études préalables de notre laboratoire qui ont été réalisées sur des modèles de cellules in vitro.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons étudié les publications préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence pertinente entre nos groupes de souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fournis dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Si besoin de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. Cette lignée de souris génétiquement modifiées est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose.
Caractérisation d’une lignée murine pour étudier le développement des neurones précérébelleux.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Un gavage unique ou une injection intrapéritonéale unique, moins d'une minute par animal sur souris vigile : 36 femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour que leurs embryons soient prélevés. Le projet vise à caractériser le rôle d'un gène dans la migration des neurones précérébelleux, en lien avec le syndrome de Joubert, dont le porteur rappelle la prévalence d'un cas pour 100 000 personnes. Rien n'est dit du nombre d'embryons prélevés ni du nombre de gestations conduites par femelle, alors que le risque de fausse route et de microlésions lié à la canule de gavage est décrit par ailleurs.
Objectifs
Les neurones précérébelleux sont des neurones localisés au niveau du tronc cérébral dans le cerveau. Ces neurones projettent leurs axones dans le cervelet. Les neurones précérébelleux naissent au cours du développement embryonnaire. Tous ces neurones migrent ensuite de différentes façons dans la partie basse de cette structure. Chez l’homme, plusieurs pathologies perturbent la migration des neurones précérébelleux, notamment le syndrome de Joubert et le syndrome HGPPS (associant une paralysie des mouvements oculaires à une scoliose). Les neurones précérébelleux participent au contrôle de la motricité et la planification des mouvements. Des analyses transcriptomiques (analyses sur l'expression des gènes dans différents organes) nous ont permis d'identifier un gène qui est exprimé dans cette population neuronale. L’objectif de notre projet est de caractériser l’implication de ce gène dans le développement et la migration des neurones précérébelleux.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Joubert a une prévalence d'un cas pour 100000 personnes. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement des neurones qui vont former les différentes régions du cerveau et permettra de mieux comprendre le développement de cette maladie.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). L’autre partie des animaux recevra une injection unique (sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un traitement unique par gavage ou par injection. La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule de gavage peut quelques fois provoquer des microlésions. Lors de l'introduction de la canule, il existe également un risque de fausse route. Pour les animaux qui recevront le traitement par injection intrapéritonéale, l'introduction de l'aiguille peut être source de stress et une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Un faible risque d'infection existe également lors de l'introduction de l'aiguille.
Devenir
L'ensemble des 36 femelles utilisés dans le projet seront euthanasiés afin de prélever les embryons.
Remplacement
Du fait de la complexité de tissus, de la cinétique de développement et de migration de cette population neuronale, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète et précise ces mécanismes développementaux.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 36 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre minimal d'animaux requis a été déterminé par un test de puissance et en fonction de nos expériences précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages (20-24degrés) et l’hygrométrie (45-55 pourcent) sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et des étiquettes de surveillance indiquant l’acte subi permettent une surveillance adaptée de l’animal par le personnel qualifié de l'animalerie et/ou l'expérimentateur. Nous les considérons en bonne santé si leur pelage est brillant, et que leur comportement est normal. S'il s'avérait qu'un animal présente des signes de souffrance, il sera immédiatement euthanasié. Les critères sont l'absence de locomotion, le pelage hérissé et/ou terne, présence de comportement d'évitement, prostration, dos vouté, identification d'une grosseur pouvant révéler la présence d'une tumeur.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est homologue à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Les lignées que nous utilisons ont déjà été publiées car utilisées dans d'autres système. Nous utiliserons des animaux matures sexuellement et en âge de reproduction (entre 8 semaines et 6 mois).
Évaluation d’un traitement pour le Syndrome de Rett chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris utilisées portent une mutation du gène Mecp2 qui installe chez les mâles, dès trente jours, apnées, hyperventilation, réduction de la mobilité, sensibilité accrue au stress et perte de poids. 454 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une biopsie d'identification, une injection de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, puis des tests comportementaux dont certains durent jusqu'à 48 heures. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour le prélèvement des organes, l'objet réel du projet étant de mesurer si un nouveau vecteur viral atteint le cerveau sans toucher le foie.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie génétique rare qui touche le développement du cerveau. Elle affecte presque exclusivement les filles et entraîne un handicap intellectuel sévère et progressif. Dans la grande majorité des cas, la maladie est causée par une anomalie d’un gène appelé MECP2. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir le syndrome de Rett. Les prises en charge actuelles visent surtout à réduire les symptômes afin d’améliorer la qualité de vie des patientes. Ces symptômes incluent notamment des difficultés à bouger volontairement, des troubles de la respiration, du sommeil et de l’alimentation. En 2007, des chercheurs ont montré qu’il était possible de corriger la maladie chez des souris atteintes, même à un stade avancé. Cette découverte a suscité beaucoup d’espoir et a ouvert la voie au développement de thérapies géniques, qui consistent à apporter une version saine du gène défectueux dans les cellules à l’aide d’un virus modifié. Cependant, traiter le cerveau reste difficile en raison d’une barrière naturelle qui le protège des substances étrangères. Les virus utilisés jusqu’à présent atteignent peu efficacement le cerveau et peuvent provoquer des effets indésirables, notamment au niveau du foie. Récemment, un nouveau type de virus a été développé pour cibler plus efficacement le cerveau tout en limitant les effets ailleurs dans l’organisme. Cette étude a pour objectif d’évaluer ce nouveau virus, appelé AAV.Cap-B10, comme traitement potentiel du syndrome de Rett chez des souris, en analysant à la fois son efficacité et sa sécurité.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester l’efficacité d’un nouveau virus conçu pour agir uniquement sur le cerveau, sans affecter les autres organes. Ce virus est utilisé comme outil pour apporter un gène thérapeutique dans le cadre d’un traitement par thérapie génique d’une maladie du système nerveux. Si le virus se révèle capable d’atteindre le cerveau de manière efficace et uniforme, ces résultats pourront être utiles à d’autres équipes travaillant sur le traitement de différentes maladies du cerveau. Par ailleurs, si le traitement montre des effets positifs, cette étude constituera une étape clé avant de poursuivre les recherches sur un modèle plus proche de la maladie humaine, puis d’envisager des essais cliniques chez les patientes.
Procédures
Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois)
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut induire du stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux de l’étude sont mis à mort en fin de procédure afin de prélever les différents organes nécessaires à la suite de l’étude.
Remplacement
La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap sévère. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle, c’est-à-dire que l’on souhaite que les résultats soient directement applicables à l’homme.
Réduction
Les différences entre les animaux sont limitées grâce à l’utilisation de souris génétiquement identiques. Le nombre de souris utilisées a été choisi à partir de nos études précédentes et de calculs statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. En première intention, les procédures seront réalisées sur la moitié des animaux prévue. Les résultats seront analysés de manière statistique. Si une différence claire et significative est observée entre les groupes, il ne sera pas nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux dans l’étude.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau à volonté, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (approches qui visent à réduire au maximum le stress) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. L’anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Une période d’habituation avec l’expérimentateur et aux tests comportementaux le cas échéants est prévue afin de réduire le stress de nos animaux.
Choix des espèces
La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiologique et pathologique avec l'espèce humaine. Utiliser ce modèle augmente les chances de réussite vers le passage à l’Homme. La souris génétiquement modifiée sur le gène Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans l’essai préclinique à 30 jours. Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en contact durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps nécessaire à l’acquisition de la maturité sexuelle.
Instillation de composés à visée antalgique dans le traitement de la douleur oculaire dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 000 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 32 instillations dans l'œil, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la cohorte, la cornée est râpée de son épithélium sous anesthésie, une toxine bactérienne est instillée, ou les glandes lacrymales sont retirées chirurgicalement pour installer une sécheresse oculaire durable. Le porteur annonce comme effets attendus une inflammation de la cornée, des irritations, des brûlures et une sécheresse oculaire d'intensité variable, y compris avec les agents censés soulager. Les tests comportementaux sont nommés, exploration et sensibilité mécanique et chimique de la cornée, et les retombées pour les patients restent au stade de l'identification de composés "prometteurs" quand l'atteinte oculaire des souris, elle, est le point de départ du protocole.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l’œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de la surface oculaire et des nerfs cornéens. Les symptômes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à évaluer les effets analgésique et anxiolytique de divers agents pharmacologiques à visée antalgique, administrés par instillation oculaire sur différents modèles de douleur oculaire développés chez la souris. La douleur oculaire, en particulier dans sa forme chronique, demeure aujourd’hui largement dépourvue de traitements efficaces. Ce projet permettra de comparer plusieurs agents pharmacologiques, à différentes concentrations, afin d’identifier les composés les plus prometteurs pour le développement de nouvelles thérapies ciblées contre la douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent des symptômes variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une altération de la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépression). On estime que plus d’un patient sur deux est gêné dans ses activités quotidiennes. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra d’identifier des agents pharmacologiques au travers de modèles précliniques et d’applications topiques, ciblant directement la surface de l’œil, afin de soulager ou de traiter la douleur oculaire. En effet, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant la douleur oculaire sont encore peu connus et sont considérés comme des pistes d’exploration thérapeutiques.
Procédures
Une première cohorte des animaux vigile recevra une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre et d’un agent pharmacologique (deux administrations par jour, espacées de 4 heures). Une seconde cohorte d’animaux sera soumise à une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation (quelques secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile. Parallèlement les animaux auront des instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique, (soit 2 fois par jour espacées de 4h, sur 5 jours). Une troisième cohorte sera dédiée au modèle d’exérèse des glandes lacrymales. Les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie (anti-douleur) 1 fois pendant 15 minutes. Ils recevront des instillations biquotidiennes répétées d’un agent pharmacologique (2 fois par jour, sur 14 jours) sur animal vigile. Tous les animaux seront soumis à des contentions manuelles brèves (quelques secondes) nécessaires pour l’instillation des composés et à la réalisation des tests comportementaux suivants : test d’exploration (2 fois, 10min par animal pour les 3 modèles), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 fois, 30 sec par animal : pour le 1er et le 3ème modèle et 2 fois, 30 sec par animal pour le 2ème modèle), test de sensibilité chimique cornéenne (1 instillation, 1 fois, 30 secondes par animal pour le 1er et le 2nd modèle et 4 instillations 4 fois, pendant 30 secondes par animal pour le 3ème modèle). Le nombre total d’instillations par animal s’élève à 29 pour le premier modèle (1ère cohorte), à 13 pour le second modèle (2nde cohorte) et à 32 pour le troisième modèle (3ème cohorte). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (5 minutes et 4 fois au total pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Certaines administrations d’anesthésiques ou d’analgésiques peuvent aussi induire un stress transitoire de courte durée (maximum 30 sec, lié à l’insertion de l’aiguille et à la contention de l’animal), ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. Les chirurgies peuvent entraîner une perte de sang durant l’opération, une perte de poids, des infections et des douleurs oculaires durant la période postopératoire. Les instillations des agents non thérapeutiques biquotidiennes induisent un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec). La chirurgie et les instillations biquotidiennes des agents non thérapeutiques pour la mise en place des modèles étudiés, entraîneront une inflammation de la cornée, des irritations ou brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d’intensité variable. Les instillations des agents thérapeutiques et des solvants peuvent induire un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec), mais également peuvent entraîner une inflammation de la cornée, des brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d'intensité variable.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés.
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer les effets antalgiques de composés, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Dans le respect du principe de réduction, le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, avec un effectif total n’excédant pas 4 000 sur 5 ans. Plusieurs structures seront prélevées sur chaque animal (cornée, ganglion trigéminal, cerveau) afin d’optimiser les données obtenues par animal. L’estimation du nombre d’animaux à inclure repose sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables, ainsi que sur des calculs de puissance statistique, indispensables pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées dans les études précliniques, notamment pour mieux comprendre la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris constitue le modèle animal de choix car les yeux et leur cerveau sont assez similaires à ceux de l’humain, et il existe des outils génétiques avancés spécialement adaptés à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques » tandis que d’autres ont été élevées pour permettre le suivi de certaines cellules inflammatoires. Ces modifications n’entraînent pas de troubles connus et n’affectent pas le bien-être des animaux. Les animaux seront accueillis à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’une période d’adaptation avant le début des procédures. Toutes les expérimentations dureront peu de temps, entre une et trois semaines maximums, ce qui signifie que les animaux n’auront pas plus de 11 semaines à la fin des procédures.
Enregistrement de neurones nociceptifs périphériques pour le criblage de candidats médicaments antalgiques chez la souris et le rat MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 630
Une douleur chronique installée exprès, puis un enregistrement électrophysiologique qui interdit toute survie : 630 souris et 630 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. 1 080 subissent une chirurgie nerveuse ou une injection de substance inflammatoire, 180 sont rendus diabétiques, et tous passent au moins deux tests mesurant leur hypersensibilité mécanique ou thermique. Le commanditaire est l'industrie pharmaceutique, qui fait cribler ses candidats médicaments antalgiques sur l'activité des nocicepteurs. Le porteur justifie le rat par "des raisons historiques" et la souris par la disponibilité d'animaux transgéniques, et présente l'anesthésie comme un raffinement permettant de tester des stimuli "très nociceptifs sans aucune souffrance".
Objectifs
Le projet consiste à tester des candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité des nocicepteurs chez le rat ou la souris anesthésié. Ces mesures se font chez l'animal sain, ou chez l'animal présentant un état douloureux de type inflammatoire ou neuropathique, induit expérimentalement. Il y a 2 aspects distincts dans ce projet : la procédure de mesure d'activité des nocicepteurs (réalisée chez l'animal anesthésié, dite terminale ou sans réveil) et la génération des modèles physiopathologiques qui seront utilisés dans cette procdure (modèles physiopathologiques réalisés chez l'animal anesthésié avec réveil). Ce projet implique un travail de recherche fondamental car il n'y a pas ou peu de données publiées sur l’activité des nocicepteurs chez la souris, espèces qui forment pourtant via l'utilisation des souris génétiquement modifiés le coeur des avancés dans le domaine de la recherche sur la douleur.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ce projet améliorera ou apportera une connaissance nouvelle sur l’effet de conditions physiopathologiques connus pour sensibiliser l’activité des nocicepteurs périphériques et supposé comme sous tendant un état de douleur chronique. Il permettra ensuite de déterminer l’efficacité analgésiques de candidats médicaments sur ces nocicepteurs de manière spécifique (par opposition à la mesure globale réalisée en comportement).
Procédures
1080 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale ou à une injection de substance inflammatoire sous anesthésie (durée inférieure à 15 min). 180 animaux seront rendus diabétiques et subiront 3 prélèvement sanguins vigiles (durée de 20 s). Tous les animaux seront soumis à au moins 2 tests comportementaux permettant de mesurer l’allodynie mécanique et/ou thermique (durée de 30 min).
Impact sur les animaux
Les modèles physiopathologiques mis en œuvre induisent un état de douleur chronique, modérée à sévère (c’est leur but, ce projet s’inscrit dans le développement de nouveaux traitements antalgiques). La mise au point de traitements analgésiques efficaces et dénués d’effet secondaire contre les douleurs neuropathiques nécessite l’utilisation de modèles de douleur neuropathique préclinique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les mesures électrophysiologiques sont invasives et n'autorisent pas la survie des animaux.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier (et non in vitro) que l’impact des caractéristiques physico-chimiques des candidats médicaments peut être évalué. D’autre part, l’électrophysiologie in vivo (et non in vitro) permet d’aboutir à une compréhension mécanistique du mode d’action des candidats médicaments analgésiques/antalgiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie, les nocicepteurs non-myélinisés, qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apporte des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments. Pour assurer leur bien-être, les animaux disposent dans leur cage de bois à macher, de petits abris et de matière pour faire des nids. Les animaux sont contrôlés quotidiennement et des points limites sont mise en place pour éviter toutes souffrance excessive que les animaux pourraient subir.
Choix des espèces
L’utilisation du rat est due à des raisons historiques. C’est l’espèce sur laquelle le plus grand nombre de données a été obtenus dans le domaine de l’algologie. L'utilisation de la souris permet de tirer parti d’animaux transgéniques, et certains aspects physiologiques font de la souris une espèce plus appropriée que le rat pour obtenir des prédictions d’efficacité clinique. Par exemple, il a été montré que chez la souris, seules les fibres exprimant le récepteur TRPV1 étaient insensibles aux stimuli mécaniques. Cette situation est similaire chez l’homme, mais différente chez le rat. Il existe aussi parfois une plus grande homologie dans la structure de certaines cibles thérapeutiques entre la souris et l’homme que l’homme et le rat, comme c’est le cas pour le canal au sodium voltage dépendant 1.7. Les animaux sont utilisés au stade adulte, 8-12 semaines pour les souris, 6-8 semaines pour les rats. On utilise des animaux au stade jeune adulte, car ils présentent un système neurophysiologique mature et sont en forme (ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé).
Prélèvement invasif en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour génotyper des lignées génétiquement modifiées, 2 880 souris subissent une coupe du bout de la queue et une entaille à l'oreille au sevrage, à quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte dure environ cinq minutes, sous anesthésie gazeuse et anesthésie locale, et peut laisser un saignement arrêté par compression s'il dépasse deux minutes. Le porteur indique avoir abandonné le génotypage par poils, infructueux, et par bout d'oreille, non concluant dans plus de 90 % des cas. Les souris du bon génotype partent en accouplement ou vers d'autres projets, celles dont le génotype ne convient à aucun groupe expérimental sont tuées après analyse.
Objectifs
La présente demande est réalisée afin de couvrir réglementairement la réalisation d’une biopsie de queue dans le cadre du génotypage des animaux transgéniques utilisés dans nos projets de recherche. Le génotypage sur biopsie de queue est à l’heure actuelle plus fiable et robuste que le génotypage à partir d’une biopsie d’oreille, ce dernier menant souvent (plus de 50 % des cas) à des résultats non concluants ou non robustes. L’entretien des lignées de souris transgéniques est déjà réglementairement encadré par d’autres demandes d’autorisation de projet.Le monde est aujourd’hui affecté par une explosion de maladies métaboliques caractérisées par un déséquilibre de l’homéostasie glucidique telles que l’obésité ou le diabète de type II. Ces maladies ont de lourdes conséquences socio-économiques sur nos sociétés et représentent un enjeu majeur de santé publique. La compréhension des mécanismes permettant la régulation centrale de la glycémie ainsi que de leurs dysfonctionnements physiopathologiques est cruciale pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de ces maladies. Nos projets de recherche s’inscrivent dans ce contexte puisque nous nous intéressons aux systèmes moléculaires de l’hypothalamus, identifiés comme des acteurs clés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Afin de mener à bien nos études, nous avons recours à l’utilisation de modèles murins transgéniques. L’invalidation de ces systèmes nous permet de mieux comprendre leurs rôles dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune technique efficace pour marquer ces neurones, nous utilisons également des souris transgéniques exprimant une molécule fluorescente nous permettant leur visualisation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ces projets que nous puissions génotyper ces animaux de manière fiable et robuste : à partir d’une biopsie caudale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de permettre un génotypage fiable et robuste des différents animaux transgéniques qui serviront d’une part à l’entretien et à la reproduction des lignées de souris et d’autre part aux expérimentations. Les expérimentations réalisées sur ces modèles transgéniques ont pour but de mieux comprendre les rôles respectifs et conjoint des systèmes moléculaires d’intérêt dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique ainsi que d’étudier leurs altérations dans un contexte pathologique d’obésité / de diabète. Ces études ont pour objectif de proposer des stratégies thérapeutiques innovantes dans la lutte contre l’explosion actuelle des maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type II.
Procédures
Les animaux subiront, de façon concomittante, une biopsie caudale et une entaille à l’oreille pour le marquage, sous anesthésie / analgésie lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge, une seule fois, l’acte dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale réalisée pour génotyper les animaux peut induire une douleur légère et de courte durée, prise en charge par anesthésie / analgésie des animaux. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La désinfection du bout de la queue préalablement à la biopsie permettra de limiter le risque d’infection et toute éventuelle complication de cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.
Devenir
Une partie des animaux (dont le génotype sera adéquat en fonction des besoins en expérimentation) sera placé en accouplement, dont l’entretien des lignées est encadré par d’autres demande d’autorisation de projet. L’autre partie des animaux de génotype adéquat (en fonction des besoins en expérimentations) sera utilisée dans des procédures d’expérimentations encadrées par d’autres demandes d’autorisation de projet. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation. Les animaux de génotypes inadéquats (ni mutants, ni pouvant convenir pour un groupe contrôle adapté au plan expérimental donné) donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage.
Remplacement
Le génotypage de nos lignées de souris à partir de poils ou bien du surplus de bout d’oreille généré lors du marquage des souris s’est avéré infructueux. Nous n’avons pas réussi à génotyper les souris à partir de poils. De même, malgré plusieurs tentatives de mise au point du protocole, à partir de l’excédent de bout d’oreille, les résultats étaient insatisfaisants dans plus de 90% des cas : soit nous n’avions pas de résultat, soit le résultat n’était pas fiable : deux tests sur le même échantillon donnaient deux résultats différents. Lorsque deux tests sur le même échantillon ne donnent pas de résultat ou un résultat douteux, nous avons besoin de prélever à nouveau la souris afin de lever le doute, multipliant donc les interventions sur cette dernière. Nous souhaitons par conséquent réaliser le génotypage de nos animaux à partir d’une biopsie de l’extrémité de la queue des souris. Cette technique est utilisée car elle est robuste, c’est-à-dire efficace, répétable et fiable : un prélèvement unique nous permet dans plus de 99% des cas de génotyper nos souris correctement. De plus, ce prélèvement n’entraine pas de signes visibles de douleur.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie (encadrée par nos autres demandes d’autorisation de projet) vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles dont les proportions sont calculées selon les règles de la génétique mendélienne. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos, afin d’évaluer les rôles des systèmes moléculaires étudiés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites et d’augmenter la fiabilité des résultats puisque les animaux contrôles seront les « littermates » des animaux mutants. L'utilisation de test de puissance statistique est ici sans objet dans la mesure où nous nous fondons sur les probabilités mendéliennes pour estimer le nombre d'animaux du génotype recherché dans les portées obtenues.
Raffinement
Les conditions de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour la biopsie caudale, l’extrémité de la queue de la souris sera d’abord désinfectée à la Bétadine® puis localement analgésiée grâce à l’application de Lidocaïne® liquide vétérinaire. La souris sera ensuite anesthésiée par inhalation d’isoflurane. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle in vivo chez l’animal est indispensable pour une compréhension globale du rôle physiologique des systèmes moléculaires étudiés, de leurs interactions fonctionnelles avec d’autres systèmes, de la physiopathologie de l’obésité et du diabète, ainsi que pour caractériser les altérations neuroanatomiques et le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques dans la régulation de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. L’acte de biopsie caudale ne peut se faire par définition que sur le modèle animal. La biopsie caudale permettant le génotypage des souris se fera lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et études de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle murin d’arthrite rhumatoïde
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrite leur est déclenchée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à 120 administrations de composés, subissent cinq prises de sang sur animal vigile et jusqu'à 45 mesures de leurs poignets et chevilles gonflés. La mise à mort sert à prélever articulations et organes pour l'analyse immunologique et histologique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ni aucune modélisation informatique ne peut remplacer "l'animal entier" pour tester des molécules candidates, et qualifie ce test de "nécessaire" avant une phase clinique.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche entre 0,5 et 1 % de la population adulte, avec une incidence constante à travers le monde. Si la maladie peut survenir à tout âge, elle apparaît généralement entre 30 et 50 ans. Elle est deux à trois fois plus fréquente chez les femmes que chez les hommes, une différence probablement en partie due à un effet des œstrogènes sur la fonction immunitaire. La polyarthrite rhumatoïde se manifeste au départ le plus souvent par un enraidissement douloureux et le gonflement de plusieurs articulations, généralement au niveau des poignets, des mains et des doigts. Par la suite, la maladie évolue sous la forme de poussées, entrecoupées de rémissions plus ou moins complètes. Au bout de plusieurs années d’évolution, la polyarthrite rhumatoïde finit par provoquer des déformations articulaires et des destructions des tendons. La chirurgie orthopédique est alors nécessaire pour réparer, et souvent remplacer les articulations par des prothèses. Ce projet a pour but d’étudier l'effet de nouvelles cibles thérapeutiques potentiellement inhibitrices de l’inflammation articulaire dans un modèle in vivo d'arthrite rhumatoïde. D'autre part ce projet a pour but d'étudier l'implication de différentes sous population de leucocytes dans un modèle d'arthrite chez des souris modifiées génétiquement pour avoir des gènes non fonctionnels. Ces modèles permettront d’évaluer l’implication de la sérotonine dans les érosions osseuses de la polyarthrite rhumatoïde et d’étudier les mécanismes de l’inflammation. Nous proposons 3 modèles d’induction de l’arthrite (CIA : collagen-Induced Arthritis, CAIA (Arthitomab : cocktail d’anticorps) et K/BxN). Le choix de l’un de ces 3 modèles se fera selon l’objectif de l’étude. Il y a 3 phases dans la maladie : la phase de tolérance (le système immunitaire fonctionne correctement), phase d’auto-immunité (le système immunitaire se trompe de cible) et phase effectrice (inflammation). Le modèle CIA étudie la perte de tolérance et l’auto immunité. Le modèle K/BxN étudie le passage de l’auto-immunité à l’inflammation et le modèle CAIA étudie la phase effectrice.
Bénéfices attendus
Ce projet a donc pour but d’étudier et de valider l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle in vivo d’arthrite rhumatoïde. Les thérapies ciblées sont le plus souvent très bien tolérées mais elles réduisent les défenses immunitaires des patients. Le risque de rechute est important, avec la possibilité que les mêmes médicaments ne soient pas aussi efficaces par la suite. Notre projet de recherche se porte sur la sérotonine et sa potentielle implication dans l’érosion osseuse ainsi que l’autophagie, modulateur majeur de l’inflammation dans les pathologies articulaires. Les premiers résultats obtenus sont encourageant et doivent être approfondis, ce projet est la continuité du précédent projet clôturé.
Procédures
induction de la maladie: 2 administrations maximum selon le protocole (30 secondes max/souris). Prélèvements de sang : maximum 5 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes max/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes max/souris). Administrations de composés : maximum 120 administrations (30 secondes max/souris ; dans le cas de 2 administrations/jour pendant 60 jours). Mesures des poignets/chevilles (45 mesures max au cours des études, 1x/jour, 30 secondes max pour les 4 membres).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun effet ou nuisance inattendue n’a été observé sur le précédent projet clôturé. Les animaux OGM seront préalablement génotypés chez le fournisseur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation, polyarthrite rhumatoïde, chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules « candidat médicament », test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables. Le nombre d’animaux a été déterminé par une estimation de puissance statistique (10 animaux par groupe) visant à détecter une réduction cliniquement pertinente des scores de la maladie avec un risque alpha = 5% et une puissance de 80%, tout en respectant la réduction des 3R. Dans ces conditions, on s’attend à une diminution d’un score de la maladie d’environ 25-35%. Ce nombre garantit des résultats exploitables sans l’utilisation excessive d’animaux. Ce calcul est basé sur les résultats des études réalisées sur le précédent projet.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur et agir rapidement pour les limiter. Dès le début de l’étude, des croquettes non humidifiées avec de l’hydrogel seront disposés dans les cages. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Les mesures mises en place sur le projet précédent ont été efficaces (croquettes humides, hydrogel, pour pallier à la perte de poids) et seront maintenues dans ce nouveau projet.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : _ Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris C57BL/6, BALB/c dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. _ La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. _ Manipulation, coût, animalerie disponible sur place, nombreuses publications avec des protocoles validés (Le modèle d’arthrite rhumatoïde est très bien décrit dans la littérature chez la souris). _ Le bien-être animal est suivi, contrôlé (suivi journalier avec des points limites établis) et justifié par un potentiel bénéfice sur la recherche pré-clinique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature.
Evaluation de nouvelles thérapeutiques dans un modèle d’inflammation du colon chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Ni réutilisées ni replacées parce que la colite qu'on leur inflige modifie durablement leur état biologique, 686 souris sont tuées à l'issue pour prélever intestin, sang et organes lymphoïdes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inflammation du côlon est provoquée par le DSS ou par instillation intrarectale de TNBS sous anesthésie, avec perte de poids allant jusqu'à 15 à 20 %, diarrhée parfois sanglante, pelage ébouriffé et posture voûtée pendant cinq à sept jours. Le porteur cite organoïdes, organes sur puce et modèles informatiques, puis les écarte au motif qu'aucun ne reproduit à la fois le système immunitaire, la paroi intestinale et le microbiote.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, provoquent une inflammation durable du côlon et altèrent fortement la qualité de vie des patients. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients, ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles solutions thérapeutiques. Ce projet vise à développer puis utiliser un modèle d’inflammation du côlon chez la souris afin de tester de nouvelles molécules ou formulations ayant un effet anti-inflammatoire. Dans un premier temps, deux méthodes d’induction de l’inflammation, le DSS et le TNBS, seront comparées chez des souris non transgéniques afin de sélectionner le modèle le plus adapté et reproductible. Une fois le modèle établi, il sera appliqué à des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans l’inflammation intestinale, afin de mieux se rapprocher de la maladie humaine et d’évaluer des traitements ciblés. Sur la durée du projet, un nombre limité de nouvelles molécules sera testé de manière progressive. L’évolution de l’inflammation sera suivie par des méthodes d’imagerie non invasives, permettant de limiter les manipulations et de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, sont des maladies de longue durée qui altèrent fortement la qualité de vie. Les traitements actuels ne fonctionnent pas chez tous les patients et peuvent perdre leur efficacité avec le temps, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation du côlon s’installe et évolue dans des modèles expérimentaux chez la souris. Il apportera des informations claires sur le rôle d’une protéine impliquée dans l’inflammation intestinale, l’IL-26, en comparant des souris classiques et des souris modifiées pour se rapprocher de la situation humaine. Le projet permettra également d’identifier les conditions les plus adaptées pour tester de nouveaux traitements (choix du modèle, doses, schémas d’administration). L’utilisation d’une méthode d’imagerie non invasive permettra de suivre l’évolution de l’inflammation chez un même animal, d’améliorer la qualité des données et de réduire le nombre d’animaux utilisés. À long terme, ce projet ne vise pas à aboutir directement à un traitement pour les patients, mais à générer des données solides permettant d’orienter le développement de nouvelles molécules ou formulations dans des projets ultérieurs. Les résultats positifs serviront de base à des études précliniques plus avancées et à des collaborations industrielles ou académiques. En cas de résultats négatifs ou non concluants, les données produites permettront d’écarter certaines approches, d’optimiser les modèles expérimentaux et d’éviter des essais inefficaces par la suite. Ainsi, quels que soient les résultats, le projet contribuera à faire progresser la recherche et à guider plus efficacement le développement de futurs traitements contre les MICI.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales, les animaux peuvent présenter des effets transitoires liés aux manipulations et aux modèles d’inflammation étudiés. Chaque animal pourra faire l’objet d’un prélèvement sanguin unique au niveau d’une veine du cou. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie générale légère à l’isoflurane, un gaz anesthésiant couramment utilisé chez la souris. La durée d’anesthésie sera courte, comprise entre 5 et 15 minutes. Les animaux pourront également subir jusqu’à trois séances d’imagerie non invasive sur une période maximale de 48 heures. Ces séances, d’une durée de 5 à 15 minutes chacune, seront réalisées après l’administration d’un marqueur fluorescent, soit par injection dans une veine, soit par voie orale. Cette technique permet de suivre l’évolution de l’inflammation sans chirurgie ni douleur durable. Pour les animaux recevant le produit TNBS, l’induction de l’inflammation du côlon sera réalisée par administration intra-rectale, sous anesthésie générale à l’isoflurane afin d’éviter toute douleur ou stress. La durée d’anesthésie sera également limitée à 5 à 15 minutes. Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure expérimentale concernée, après la dernière séance prévue pour chaque animal. La mise à mort sera réalisée par une méthode réglementaire et adaptée à l’espèce, sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute souffrance.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues reposent sur l’induction contrôlée d’une inflammation colique chez la souris par administration de DSS (dextran sulfate de sodium) ou de TNBS (trinitrobenzènesulfonique). Ces modèles bien établis reproduisent certains aspects physiopathologiques des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la réponse inflammatoire locale et systémique ainsi qu’aux manipulations expérimentales. Dans le modèle DSS, les signes cliniques typiques incluent une perte de poids progressive (jusqu’à 15–20 %), une diarrhée plus ou moins marquée, parfois teintée de sang, et une diminution transitoire de la prise alimentaire. Un aspect ébouriffé du pelage, une posture voûtée et une baisse modérée de l’activité peuvent également être observés. Ces symptômes apparaissent entre le 3ᵉ et le 6ᵉ jour après l’induction et régressent généralement 7 à 10 jours après l’arrêt du DSS. Dans le modèle TNBS, l’instillation intra-rectale sous anesthésie peut induire une inflammation plus aiguë, avec douleurs abdominales modérées, réduction temporaire de la mobilité et diarrhée hémorragique dans certains cas. Ces signes surviennent dans les 24 à 48 h suivant l’administration et persistent 3 à 5 jours avant amélioration. Une surveillance rapprochée permettra d’adapter les soins (hydratation, réchauffement, arrêt anticipé ou euthanasie) en cas de souffrance excessive. Les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales d’anticorps monoclonaux entraînent des nuisances mineures et transitoires (gêne au point d’injection). L’imagerie par fluorescence (NIR-dextran) est non invasive et sans effet délétère attendu. Les effets globaux sont donc qualifiés de modérés selon la classification réglementaire. L’inconfort est limité à la phase aiguë d’inflammation (environ 5 à 7 jours).
Devenir
À la fin des procédures, la majorité des animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses (intestin, sang, organes lymphoïdes, etc.). Ces prélèvements sont indispensables pour observer au microscope l’état de la paroi intestinale, mesurer précisément l’inflammation et étudier l’effet des traitements sur les cellules et les molécules impliquées dans la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne seront ni réutilisés dans d’autres expériences, ni replacés, car la maladie induite et les traitements reçus modifient durablement leur état biologique et ne permettent pas une réutilisation dans des conditions éthiques et fiables.
Remplacement
La stratégie de remplacement a été soigneusement examinée avant la conception de ce projet. Il existe des méthodes alternatives, comme des cellules cultivées en laboratoire, des mini-tissus (organoïdes), des systèmes de type « organes sur puce » et des modèles informatiques. Ces outils permettent de mieux comprendre certains mécanismes de l’inflammation de l’intestin, mais ils ne reproduisent pas le fonctionnement d’un organisme entier. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont en effet très complexes. Elles impliquent à la fois le système immunitaire, la paroi de l’intestin, les bactéries présentes dans le tube digestif et d’autres systèmes du corps. Aujourd’hui, aucune méthode uniquement en laboratoire ne permet de prendre en compte toutes ces interactions en même temps. L’objectif du projet est de tester de nouveaux traitements dans des modèles de colite chez la souris, qui reproduisent les mécanismes principaux de la maladie chez l’être humain. Pour évaluer ces traitements, il faut observer non seulement ce qui se passe au niveau des tissus et des molécules, mais aussi l’état général de l’animal, sa perte de poids et sa réaction inflammatoire globale. Cela n’est possible que chez un organisme vivant. Les souris choisies sont les modèles les plus pertinents pour ce type de recherche, car elles permettent de reproduire de façon contrôlée les caractéristiques essentielles de la maladie humaine. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour déterminer les bonnes doses, tester d’éventuelles associations de traitements et vérifier leur efficacité. Ce recours à l’animal s’inscrit dans une démarche stricte visant à limiter son utilisation autant que possible, à réduire le nombre d’animaux et à améliorer leurs conditions de prise en charge.
Réduction
Le nombre de souris prévu dans ce projet a été calculé avec des méthodes statistiques, afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. La variabilité des modèles de colite utilisés, la perte de poids, le niveau d’inflammation et l’effet attendu des traitements testés ont été pris en compte. Les expériences sont conçues pour tirer un maximum d’informations de chaque animal. Par exemple, une technique d’imagerie par fluorescence (NIR-dextran), non invasive, permet de suivre au cours du temps l’état de l’intestin et l’évolution de l’inflammation chez les mêmes souris. Cela évite de devoir en sacrifier davantage à différentes étapes et limite la création de groupes supplémentaires. Les résultats d’imagerie seront associés à d’autres mesures cliniques et d’analyse des tissus, afin de valoriser au mieux chaque animal inclus. Avant les grandes études, de petites études pilotes seront réalisées pour ajuster les doses de produits utilisés (DSS, TNBS et molécules testées). Cela permet de réduire le risque d’échec par la suite et d’éviter de devoir répéter les expériences. Les données recueillies serviront également à affiner les protocoles pour les étapes suivantes, toujours dans le but de limiter le nombre d’animaux. Les tissus prélevés à la fin des études seront utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés avec d’autres projets, afin de ne pas devoir recréer les mêmes modèles de maladie. Enfin, des critères d’arrêt précoces, une surveillance clinique attentive et des examens répétés par imagerie permettront de réduire au maximum la durée de la maladie chez les animaux et d’éviter le recours à des animaux supplémentaires. L’ensemble de ces mesures vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et le respect de principes éthiques stricts, en veillant à ce que chaque animal contribue de manière significative aux objectifs du projet.
Raffinement
Dans ce projet, les chercheurs mettent en place plusieurs mesures pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les produits utilisés pour provoquer l’inflammation de l’intestin sont administrés à la dose la plus faible possible permettant de mener l’étude. Les animaux sont observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Si un animal perd trop de poids, paraît très affaibli, ne mange presque plus, se déplace très peu ou montre des signes de détresse, il est retiré immédiatement de l’expérience et euthanasié de façon rapide et indolore. Les injections et manipulations sont réalisées par un personnel formé, pour que les gestes soient précis et les moins traumatisants possibles. Les animaux sont hébergés dans de bonnes conditions (température adaptée, environnement enrichi, vie en groupe lorsque c’est possible), avec un accès permanent à l’eau et à la nourriture, sauf exception clairement justifiée. Les chercheurs utilisent aussi des techniques d’imagerie non invasives pour suivre l’évolution de l’inflammation chez les mêmes animaux, ce qui évite des interventions plus lourdes et limite le nombre d’animaux sacrifiés. L’ensemble des procédures est régulièrement réévalué afin d’améliorer en continu les pratiques et de respecter au mieux le bien-être animal.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour sa physiologie immunitaire bien caractérisée et sa grande sensibilité aux modèles expérimentaux de colite, en particulier après exposition au DSS ou au TNBS, qui reproduisent fidèlement les mécanismes inflammatoires observés chez l’humain. La souche C57BL/6 est la plus couramment utilisée pour ces modèles, offrant une référence robuste et reproductible pour l’évaluation de nouvelles molécules. L’emploi de souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26 permet d’explorer le rôle spécifique de cette voie dans la physiopathologie colique et d’évaluer la pertinence de cibles thérapeutiques humaines. Ces modèles combinent pertinence biologique et transposabilité clinique, tout en minimisant le recours à d’autres espèces plus sensibles ou complexes à gérer. Leur taille, leur cycle de reproduction court et la disponibilité d’outils analytiques adaptés en font le choix le plus approprié pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en respectant le bien-être animal. Les expériences seront réalisées exclusivement sur des souris adultes de souche C57BL/6 et sur des souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26, âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade physiologique stable et à une pleine maturité du système immunitaire. Ce choix permet de limiter la variabilité biologique liée au développement et d’assurer une réponse homogène aux inducteurs de colite (DSS ou TNBS) ainsi qu’aux traitements testés. Les souris plus jeunes, non sevrées ou en croissance, présentent une immaturité immunitaire et métabolique pouvant modifier la réponse inflammatoire et la tolérance aux traitements, tandis que les animaux âgés développent des altérations spontanées du microbiote et des tissus intestinaux susceptibles de biaiser les résultats. Aucune procédure ne sera réalisée sur des embryons, des fœtus ou des individus en gestation. Le recours à des animaux adultes garantit donc la pertinence scientifique, la comparabilité inter-groupes et le respect du bien-être animal.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Onze prélèvements sanguins sur vingt semaines, deux séries d'injections dans les deux muscles et deux injections intrapéritonéales par semaine suivies de passages en imagerie sous isoflurane : 1 840 souris vont être utilisées. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour doser les vecteurs dans leurs organes. Le projet met au point des vecteurs synthétiques capables de faire entrer de l'ARN messager dans les cellules, les prélèvements au sinus rétro-orbitaire ou mandibulaire pouvant provoquer inflammation, gonflement et infection. Le porteur affirme que ces vecteurs polymériques ne délivrent leur ARN ni dans des cellules en culture ni dans des organoïdes, ce qui rend selon lui le recours aux souris "indispensable".
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme est une stratégue prometteuse. Ce projet a pour objectif de développer une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps pour concevoir rapidement des traitements antiviraux, et offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine thérapeutique par l’organisme receveur. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les études animales réalisées avec des vecteurs synthétiques de ce type ont ainsi débouché sur la commercialisation pour la protection de populations humaines de vaccins à base d’ARNm contre le SARS CoV2 (Cominarty, Spikevax). Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit.
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 2 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 14 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois toutes les 2 semaines pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 11 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine seront réalisées. Ces injections seront suivies d’une courte installation dans un appareil d’imagerie permettant de maintenir l’animal sous anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant une durée inférieure à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang au sinus retro orbitaire ou mandibulaire. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra- musculaire) du vecteur, qui pourra être détectée quand l’animal à tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. - Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (prélèvement de sang).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs qui seront évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses et conformément à l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique (calcul de puissance), et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus. Pour chacune des procédures, un test statistique de Kruskall-Wallis suivi d'un test de Dunn sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection d'un analgésique sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont déjà été validés in vivo sur cette espèce. De plus, la souris présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française (article R. 214-87 du Code rural et de la pêche maritime), le projet sera conduit des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Offre de prestation d’étude de pharmacocinétique et de tolérance chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7200
Cochons d'Inde : 7200
Une offre commerciale d'études de pharmacocinétique et de tolérance conduit à utiliser 7 200 souris, 7 200 rats et 7 200 cobayes, tous tués à l'issue. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 5 400 d'entre eux et modéré pour les 16 200 autres, et une lignée de souris génétiquement modifiées développe une maladie neurodégénérative avec désorientation et déclin de la mémoire. Les voies d'administration vont de l'orale à l'intraveineuse, l'intranasale et l'intradermique, jusqu'à l'injection intrathécale, dans la cisterna magna, dans les ventricules cérébraux ou directement dans le tissu cérébral, avec un à deux prélèvements sanguins par semaine pendant un mois. Le porteur annonce jusqu'à 180 études sur la durée du projet et jusqu'à 120 animaux par étude, chiffre qu'il présente comme "une évaluation de notre besoin maximum".
Objectifs
MODIFICATION : CE PROJET INTEGRE UNE LIGNEE GENETIQUEMENT ALTEREE (SOURIS) DEVELOPPANT DES SYMPTOMES DE MALADIE NEURODEGENERATIVE. L’OBJECTIF SCIENTIFIQUE EST D’ETUDIER LA PERMEABILITE DE LA BARRIERE HEMATO-ENCEPHALIQUE AU COURS DE LA PATHOLOGIE ET DE DETERMINER SI CES DEFAUTS FACILITENT LE PASSAGE DE MOLECULES THERAPEUTIQUES TROP VOLUMINEUSES EN CONDITIONS NORMALES. CETTE QUESTION EST ESSENTIELLE CAR, QUELLE QUE SOIT LA VOIE D’ADMINISTRATION, UN MEDICAMENT DOIT ATTEINDRE SON ORGANE CIBLE A UNE CONCENTRATION EFFICACE SANS TOXICITE. CE PARAMETRE DEPEND DU PROFIL PHARMACOCINETIQUE DU PRODUIT, INFLUENCE PAR LA VOIE ET LA FREQUENCE D’ADMINISTRATION AINSI QUE PAR LA FORMULATION. LE PROJET VISE TROIS OBJECTIFS PRINICPAUX : 1. REALISER DES ETUDES DE PHARMACOCINETIQUE POUR DEFINIR LE DEVENIR DU PRODUIT DANS L’ORGANISME. 2. DETERMINER LA BIO DISTRIBUTION ET L’EXPOSITION DANS CERTAINS FLUIDES (PLASMA, LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN) ET ORGANES (CERVEAU, FOIE…). 3. SELECTIONNER LES DOSES ET FORMULATIONS OPTIMALES POUR LES ETUDES D’EFFICACITE PRECLINIQUES ET LES PREMIERES ETUDES CLINIQUES. CES ETUDES SERONT MENEES CHEZ PLUSIEURS ESPECES (SOURIS, RAT, COBAYE) ET DIFFERENTES SOUCHES, DONT DES LIGNEES PATHOLOGIQUES. LE GENOTYPAGE DE CETTE LIGNEE EST REALISE PAR LE FOURNISSEUR ET COUVERT PAR L’APAFIS#38369. LES VOIES D’ADMINISTRATION INCLUENT : ORALE, INTRAVEINEUSE, SOUS-CUTANEE, INTRAMUSCULAIRE, INTRAPERITONEALE, INTRANASALE, INTRADERMALE. DANS CERTAINS CAS, DES INJECTIONS DANS LE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN (INTRATHECALE, CISTERNA MAGNA, VENTRICULES) OU DIRECTEMENT DANS LE TISSU CEREBRAL (INTRA-PARENCHYME) SERONT NECESSAIRES. CES APPROCHES PERMETTENT PARFOIS D’AMELIORER L’EFFICACITE ET DE REDUIRE LES EFFETS SYSTEMIQUES INDESIRABLES. L’UTILISATION DE FORMULATIONS INNOVANTES OU A LIBERATION PROLONGEE EST EGALEMENT PREVUE POUR OPTIMISER LA BIO DISTRIBUTION, PROLONGER LA DUREE D’ACTION, REDUIRE LE NOMBRE D’ADMINISTRATIONS INVASIVES ET MAINTENIR UNE CONCENTRATION ACTIVE STABLE. CES ETUDES PRECOCES DE PHARMACOCINETIQUE ET DE TOLERANCE SONT ESSENTIELLES POUR CARACTERISER LES COMPOSES D’INTERET ET ORIENTER LEUR DEVELOPPEMENT AVANT LES EVALUATIONS D’EFFICACITE.
Bénéfices attendus
Ces études de pharmacocinétique et de tolérance constituent un prérequis dans le développement de candidats médicaments, quelle que soit l’indication. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des composés et formulations ayant démontré une bonne tolérance et une bio distribution pertinente pour le traitement de différentes pathologies. Ces études pharmacocinétiques et de tolérance permettront de sélectionner les composés les plus pertinents en fonction de leurs propriétés de biodistribution et de leur innocuité, de déterminer la formulation permettant une délivrance optimale et la concentration à utiliser pour atteindre la concentration thérapeutique dans le tissu / fluide/ organe cible. MODIFICATION : Nous pensons réaliser jusqu’à 180 études au maximum sur la durée totale de ce projet.
Procédures
MODIFICATION : Administration de composés à tester ou de produit de référence : -L’administration de médicaments vétérinaires (anesthésiques/antalgiques) suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 7 jours au maximum. Durée de l’intervention entre 5 min et 1h 00. -Une administration intrathécale unique sous anesthésie générale, administration systémique ou intranasale sur l’animal éveillé en contention. Durée de l’intervention entre 5 min et 1h 00 suivant le type d’administration réalisée. -Des prélèvements sanguins pourront être réalisés : 1 à 2 par semaine (dans la limite des contraintes liées à la récupération des animaux et aux spécificités du site de ponction), jusqu’à la fin de l’étude (1 mois maximum après l'injection du principe actif). Durée de l’intervention maximum 5 minutes. En fonction de la fréquence et du volume minimum nécessaire aux analyses nous adapterons le site de ponction et éventuellement la réalisation des prélèvements sous anesthésie.
Impact sur les animaux
MODIFICATION : (4) Le développement d’une pathologie spécifique pour les lignées génétiquement altérées et particulièrement les maladies neurodégénératives. Les animaux peuvent être de plus faible corpulence en vieillissant. Ils auront aussi des altérations de la mémoire avec des performances en déclin sur les tests de mémorisation. Concrètement cela pourrait avoir comme impact des animaux qui peuvent être désorienté avec une sensibilité accrue aux sources de stress.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car le sang, certains tissus et organes sont prélevés afin de réaliser des analyses.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la biodisponibilité et la tolérance de molécules dans les organes cibles après administration systémique ou locale. La pharmacocinétique de nouveaux traitements ne peut pas être étudiée via la culture cellulaire ou les modèles informatiques. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé, en tenant compte de la variabilité des modèles et des techniques de dosage de pharmacocinétique. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. MODIFICATION : Pour les études de pharmacocinétique le calcul du nombre d’animaux nécessaire repose sur une étude statistique de la variabilité de la méthode de dosage ainsi que sur la variabilité qui existe entre les animaux suivant les différentes voies d’administration. En fonction des limites techniques rencontrées il est nécessaire, au maximum, d’avoir 5 points de dosage pour les tissus sur lesquels nous rencontrons la plus grande variabilité. L’évaluation du nombre d’animaux requis est faite sur la base de 3 études par trimestre et par espèce en considérant qu’au maximum nous serions susceptibles d’inclure 120 animaux par étude. Ce calcul ne représente pas un but à atteindre mais une évaluation de notre besoin maximum.
Raffinement
MODIFICATION : CE PROJET APPLIQUE UNE DEMARCHE DE RAFFINEMENT STRICTE, REALISEE PAR DU PERSONNEL FORME ET COMPETENT DANS LE RESPECT DES PRINCIPES ETHIQUES. LES ETUDES INTEGRENT DES MESURES VISANT A PREVENIR TOUTE DOULEUR, DETRESSE OU INCONFORT : HEBERGEMENT ADAPTE, ENRICHISSEMENT DU MILIEU, MODALITES D’ADMINISTRATION ET DE PRELEVEMENT OPTIMISES. SI NECESSAIRE, L’ALIMENT SERA PLACE AU SOL AVANT ET APRES ADMINISTRATION POUR FACILITER L’ACCES ET DES BIBERONS ADAPTES OU HYDROGEL SERONT MIS A DISPOSITION. LORS DES ANESTHESIES SUPERIEURES A 15 MINUTES, LES ANIMAUX SONT INSTALLES SUR TAPIS CHAUFFANTS AVEC APPLICATION DE GEL OCULAIRE ; UNE HYDRATATION PAR SERUM PHYSIOLOGIQUE EST PREVUE APRES ANESTHESIE > A 30 MINUTES. DES PROTOCOLES D’ANALGESIE ADAPTES SONT APPLIQUES POUR LES CHIRURGIES, INCLUANT ANESTHESIQUES ET ANTALGIQUES SELON LES BONNES PRATIQUES VETERINAIRES. UNE HABITUATION A LA MANIPULATION PEUT ETRE MISE EN PLACE POUR REDUIRE LE STRESS. DANS CERTAINS CAS, SI DES DIFFICULTES D'ACCES A LA NOURRITURE APPARAISSENT, L'ALIMENT EST DEPOSE AU SOL AVEC DU GEL D'HYDRATATION. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUERONT SELON DES METHODES DOUCES. LES CONTRAINTES MODEREES LIEES AUX ADMINISTRAITON ET PRELEVEMENTS SANGUINS (MAXIMUM 2 AU SINUS POUR LIMITER LES LESIONS) SONT REALISEE SOUS ANESTHESIE ET ANALGESIE, AVEC POMMADE OPHTALMIQUE ANESTHESIQUE LOCAL POUR LES PLUS INVASIFS, EN LIMITANT LA CONTENTION. L'ETAT CLINIQUE EST SURVEILLE QUOTIDIENNEMENT : PESEE, TEMPERATURE, EXAMEN SANGUIN...AFIN D'ANTICIPER TOUTE DOULEUR. DES MESURES SPECIFIQUES (ARRET ANTICIPE D'ETUDE, SOINS...) SONT MISES EN PLACE PAR LE RESPONSABLE EN CONCERTATION AVEC LE VETERINAIRE, SELON DES POINTS LIMITES STRICTS DEFINIS POUR LE PROJET. CES DISPOSITIONS GARANTISSENT LE RESPECT DES IMPERATIFS ETHIQUES ET LA REDUCTION MAXIMALES DES CONTRAINTES POUR LES ANIMAUX, TOUT EN ASSURANT LA QUALITE SCIENTIFIQUE DES DONNEES.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des adultes pour lesquels les différents organes sont complètements formés et fonctionnels. En amont une évaluation est faite sur le choix des modèles les plus pertinents selon le type de pathologie à traiter, et le mode d’administration préféré : l’utilisation de voies locales permet d’obtenir une meilleure efficacité en réduisant les effets systémiques non désirables. L’utilisation de formulations innovantes et/ou à libération prolongée, permet d’améliorer la biodistribution du produit et/ou d’augmenter la durée de l’efficacité des traitements, pour diminuer le nombre des administrations parfois invasives et/ou obtenir une concentration active stable dans le temps. Le mécanisme d’action de la thérapie à tester permettra également de sélectionner le meilleur modèle de rongeur pour réaliser les études d’efficacité et donc de pharmacocinétique.