Souris
Elevage d’une lignée de souris mutantes, modèle du syndrôme de Hermansky-Pudlak
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris homozygotes de cette lignée saignent plus longtemps que les autres, faute de plaquettes en nombre suffisant, et vivent moins longtemps : c'est ce phénotype dommageable qui fait l'objet du projet. 315 souris vont être utilisées, 165 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau léger. Le seul acte décrit est une prise de sang d'une minute sur les animaux homozygotes, entre six semaines et neuf mois d'âge, le reste de l'effectif relevant de l'entretien de la lignée, soit 55 mutantes et 50 témoins par an. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever des organes et de la moelle osseuse, et le porteur précise que les homozygotes ne seront pas croisées entre elles afin d'éviter les mises bas.
Objectifs
Les maladies rares d’origine génétique peuvent nous en apprendre beaucoup sur le fonctionnement du corps humain. En les étudiant, les chercheurs découvrent des informations précieuses sur les gènes, les protéines et les mécanismes essentiels de la vie. Ces découvertes peuvent aussi aider à mieux comprendre des maladies plus courantes. Dans notre recherche, nous nous intéressons à une maladie appelée syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). C’est une maladie rare qui touche plusieurs organes et se manifeste notamment par une forme d’albinisme (peau et yeux très clairs) et une tendance aux saignements. Chez certains patients atteints de cette maladie, nous avons découvert des anomalies dans un gène. Ces anomalies pourraient expliquer certaines difficultés de défense contre les infections (déficit immunitaire) ainsi que des troubles du sang, en particulier un manque de plaquettes – des cellules qui aident à arrêter les saignements – et des problèmes dans leur fonctionnement. Le but de notre projet est d'étudier les effets de cette anomalie génétique, en utilisant un modèle de souris spécialement conçu pour porter cette mutation. Nous allons nous concentrer sur l’étude du sang, et plus particulièrement sur les plaquettes. Pour cela, nous maintiendrons la lignée de souris portant la mutation et nous réaliserons des prises de sang sur des souris saines et sur des souris porteuses de la mutation, afin d’analyser les différences et mieux comprendre les conséquences de cette modification génétique.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de système immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare syndrome de Hermansky-Pudlak, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène d’intérêt et son effet sur la thrombopénie (réduction de nombre de plaquettes) ainsi que les dysfonctionnements de ces plaquettes.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sur certains animaux (homozygotes) au plus tôt à 6 semaines d'âges et au plus tard à 9 mois d’âge. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux homozygotes présentent un phénotype qui se présente sous la forme d'une thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes). Ce phénotype implique un temps de saignement plus long et à une incidence sur la coagulation des animaux. La durée de vie de ces animaux est inférieure à la moyenne. L’animal va ressentir un stress lors de la contention pour la prise de sang et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour le prélèvement.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte d'organe, de la moelle ossuse, afin de l'analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude. Vu l'expérience que nous avons sur les études précédentes, la génération de 55 animaux mutants et 50 animaux contrôles par an sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, la posture, la présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat (présence de matériel pour la construction du nid et un tube). Des soins locaux (Dermidine ou autre produit selon les recommandations vétérinaires) seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique déterminé par le service vétérinaire pourra être administré. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local (Coalgan ou équivalent préconisé par notre service vétérinaire) afin d’atteindre l’hémostase. Le phénotype étant dommageable (thrombopénie), les animaux recevront des soins appropriés notamment en cas de blessures. En cas de bagarres récurrentes, les animaux seront séparés pour éviter les blessures. Les animaux homozygotes ne seront pas croisés afin d'éviter les mises bas pour les mêmes raisons.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons du modèle porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Le modèle de souris est notamment très utilisé pour étudier les fonctions immunitaires, où un large panel d’outils d’analyse est disponible. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Le prélèvement sera réalisé sur les animaux au plus tôt à 6 semaines et au plus tard à 9 mois car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses. Plus tardivement, le phénotype dommageable pourrait entrainer des effets importants. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU2/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
226 souris vont être utilisées, dont 202 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, les reproductrices et reproducteurs âgés étant réformés et tués eux aussi. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, puis une injection dans le cerveau sous anesthésie, dont le porteur écrit qu'elle provoque une douleur aiguë "modérée à sévère" liée à l'incision, au forage et à l'inflammation locale, alors qu'aucune procédure du projet n'est déclarée sévère. À sept et dix mois, les animaux passent un test de reconnaissance d'objet et un test de mémoire en labyrinthe, les mâles le matin pour que la présence des femelles ne biaise pas les résultats. L'objet est de tester si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de la protéine Tau, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait que la lignée soit déjà disponible sur place.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Etude préclinique des déficits fonctionnels et de l’inflammation cérébrale dans différents modèles de traumatismes crâniens et dans une pathologie neurovasculaire associée : l’accident vasculaire cérébral (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un traumatisme crânien de quarante-cinq minutes, pour une partie des animaux suivi d'une ischémie cérébrale d'une heure trente, puis des séances d'IRM à sept jours, vingt et un jours, deux mois et trois mois : 760 souris vont être utilisées, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées par une chirurgie sans réveil qui permet le prélèvement des organes. Le porteur affirme que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Il annonce quatre tests comportementaux, en donne les durées à la seconde près, et ne dit pas lesquels.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial qui peut provoquer ischémies et hémorragies, un dysfonctionnement immunitaire, une rupture de la barrière hémato-encéphalique ou encore une coagulopathie. Suite à un TC, une coagulation anormale est fréquemment observée chez les personnes touchées, menant à une aggravation des symptômes et du pronostic lors de la survenue de coagulopathies et pathologies neurovasculaires tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC). Ce projet permettra d’étudier les déficits fonctionnels et inflammatoires dans différents modèles de TC chez un modèle murin et d’explorer a posteriori les modulations physiologiques potentielles qu’ils entraînent. Dans un second temps, cette étude se focalisera sur la caractérisation de l’inflammation cérébrale et des déficits fonctionnels chroniques sur des souris touchées par un AVC ischémique après un TC afin d'en analyser les mécanismes sous-jacents. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et des accidents vasculaires cérébraux qui peuvent en découler, et présentent un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Traumatisme crânien (45 minutes), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes ; 5 fois 15 minutes (deux tests joints) ; 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique et moléculaire (7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois post-TC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. - Traumatisme crânien (45 minutes), modèle d’ischémie cérébrale (1h30), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes, 5 fois 90 minutes, 3 fois 15 minutes, 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’un traitement et/ou agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique (24h pré-AVC ; 8 minutes) et moléculaire (24h, 7 jours post-AVC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. L'ensemble des procédures chirurgicales, d'anesthésie et d'imagerie seront effectuées dans l'EU 1/2, et les tests comportementaux dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
Impact de l’inactivation d’un isoforme de PI3K sur les propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire de l’endothelium -MODIFICATION2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées la veille, anesthésiées profondément le lendemain, puis maintenues sous anesthésie quatre à sept heures pendant que leurs vaisseaux sanguins sont observés, une partie des 178 souris de ce projet porte une forme inactivée d'une protéine de la coagulation. D'autres subissent la ligature d'un vaisseau sanguin abdominal au cours d'une chirurgie de quarante minutes, d'autres encore une injection déclenchant une inflammation généralisée. 54 relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 124 d'un niveau modéré, le porteur signalant des risques de saignement important, de réveil difficile et de paralysie transitoire des pattes arrière. Toutes sont tuées, par excès d'anesthésique ou dans les quarante-huit heures suivant la chirurgie, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas survivre à ces interventions.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique (inhibant la formation de caillot ou amas plaquettaires) et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme agissant sur la conservation d’un état protecteur des vaisseaux sanguins. En effet au niveau cérébral le sang contenu dans les vaisseaux n’est pas capable de s’en échapper et les amas de plaquettes sont plus petit chez ses animaux. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire des vaisseaux et sur les amas de plaquettes en temps reel. L’impact de cette molécule d’intérêt sera évalué grâce à des souris génétiquement modifiées et en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également le développement et la solidité du thrombus (amas plaquettaire) ainsi que sa capacité à emboliser (à se détacher du vaisseau). Ces amas plaquettaires circulants sont critiques car ils sont à l’origine des obturations des vaisseaux cérébraux ou pulmonaire.Mieux comprendre l’impact de cette molécule est indispensable pour clarifier les mécanismes impliqués dans la thrombose et pour évaluer son potentiel en tant que cible thérapeutique. Cette étape est également cruciale pour envisager, à terme, le développement de molécules inhibitrices spécifiques.
Procédures
Trois types d’interventions sont réalisées sur des lots différents d’animaux : 1-Une injection intraveineuse la veille de l'expérimentation sera réalisée sur certains lots. L’intervention dure moins de 5 minutes dans EU1. Dans EU 2 Le lendemain Les animaux sont, sous anesthésie profonde, préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins, afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. 2- Dans EU2 Des lots différents sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés. 3- DAns EU2 Les derniers lots d'animaux sont soumis à une inflammation généralisée par une injection intrapéritonéale. 24h après cette induction les animaux sont anesthésiés et préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins et la réponse inflammatoire grâce à la mobilité des globules blancs. Ces animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et euthanasié après une heure d'expérimentation.
Impact sur les animaux
Les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intérêt sont viables et ne présentent aucun défaut morphologique apparent ni de reproduction. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum7 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique. Concernant les procédures sévères : Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. L’induction du sepsis va entrainer une inflammation généralisée chez les souris. L’inflammation sera étudiée à 24h post induction puis les souris seront euthanasiées par excès d’anesthésique.
Devenir
Les procédures utilisées étant invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures car ils ne pourraient pas survivre aux interventions.
Remplacement
Le recours à l’espèce souris est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes et la nature des différentes cellules misent en jeu ne sont pas modélisables par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas le lot en entier. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucune différence n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, nous ne réaliserons pas les expériences avec les molécules inhibitrices.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture à volonté. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçus par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant si un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié. Pour les procédures necessitant un suivi: les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle souris est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus (amas plaquettaire) et le développement d'une inflammation dans les souris est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nos collaborateurs ont établi une lignée de souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt qui nous permet d’étudier spécifiquement son impact sur la thrombose et l’inflammation. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures
Formation à la chirurgie de mise en place d’implants télémétriques factices et fonctionnels, à leur calibration et à la vérification de leur fonctionnement dans le cadre de l’installation d’une plateforme de télémétrie rongeurs
- Formation professionnelle
L'objet du projet est l'acquisition d'un geste chirurgical par un service qui veut ensuite le proposer en prestation aux équipes de recherche, et 40 souris y sont utilisées, toutes tuées. Quinze d'entre elles, prises parmi des productions surnuméraires et des reproducteurs réformés, sont opérées sous anesthésie pour la pose d'implants factices et tuées avant tout réveil. Les vingt-cinq autres reçoivent un implant fonctionnel lors d'une chirurgie de moins de quarante-cinq minutes, puis subissent trois tests métaboliques précédés chacun de cinq heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tuées pour que la pose soit vérifiée par autopsie. Le porteur présente la télémétrie implantée comme un gain pour le bien-être des animaux non-humains puisqu'elle évite les prélèvements sanguins répétés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle technologie au sein de notre établissement. La technique sera apprise via une formation dispensée par le fournisseur de la technologie installée pour la pose d’implants télémétriques chez les rongeurs. Cette formation de 2 jours devra impérativement être complétée par un renforcement de l’apprentissage sur site de manière à être pleinement opérationnel et maitriser les gestes techniques complexes que nécessite cette approche technologique. Le but, maîtriser le geste au sein du service et pouvoir le mettre à disposition des usagers en tant que service d’accompagnement. Une étude pilote pour la validation de la chirurgie d’implantation, la maîtrise du geste et la réalisation de tests métaboliques permettront de s’assurer que l’ensemble des tests réalisés par la suite pourront être assuré par le service. La télémétrie interne implantable donne la possibilité de réaliser des études longitudinales sur animal conscient et non contraint, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisé, leur stress tout en participant au raffienement de leur bien-être. Il s’agit pour notre service de proposer une approche collaborative et de préstations aux équipes de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de proposer un service d’accompagnement aux utilisateurs sur le long terme. La mise en place de cette nouvelle technologie au sein du service favorisera l’amélioration du bien-être animal en réduisant le stress des animaux lié aux manipulations. En effet, elle permettra de collecter des données physiologiques, d'activité et de glycémie sur animal non contraint, libre de ses mouvements, maintenu dans sa cage et sans avoir à réaliser les prélèvements sanguins itératifs habituellement utilisés. Dans le cas de l’implant au glucose, les données seront collectées en continu par l’intermédiaire du capteur sur une durée de 6 semaines. Seul 1 prélèvement de sang à la queue réalisé 2 fois (à 2 et 4 semaines après la chirurgie) sur la période d'enregistrement est nécessaire afin d'assurer la recalibration du système. Ainsi, ce dispositif pourra être utilisé sur des modèles animaux (diabète, obésité ect.) qui seront utiles à la santé humaine. De plus une grande diversité d'implants télémétriques étant disponible, nous pourrons transposer la techniques à l'enregistrement d'un ensemble d'autres paramètres physiologiques (ECG, EMG, pression artérielle,...).
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une chirurgie permettant la pose d'un implant permettant l'enregistrement de paramètres physiologiques en temps réel. Immédiatement après la chirurgie les animaux seront remis dans leur cage d'origine sans aucun changement et il nous sera alors possible d'acquérir en temps réel sans la moindre contrainte supplémentaire pour l'animal, des données physiologiques nécessitant habituellement des interventions directes et plus ou moins lourdes pour l'animal selon les paramètres mesurés. La chirurgie pour la mise en place de l'implant sera réalisée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique totale en pré, per et post-opération et durera moins de 45 minutes. Tous les animaux du projet seront soumis à cette procédure chirurgicale. Afin d'acquérir les gestes très précis et complexes que nécessite ce type d'expérimentation, un premier lot d'animaux sera implanté avec des implants factices (15 animaux au maximum) puis un fois le geste parfaitement maitrisé, un second lot dit "fonctionnel" comprenant 25 animaux maximum sera utilisé et implanté avec des implants fonctionnels. Ce lot sera séparé en sous-groupes de 5 animaux qui seront soumis à un test métabolique à 3 temps différents durant les 6 semaines d'activité de l'implant télémétrique. Pour ces tests métaboliques, une injection sera réalisée puis des prélèvements de sang (2 µL chacun) au bout de la queue seront pratiqués pour un volume total de moins de 30 µL par expérimentation. Ces prélèvements de sang permettront, par utilisation d'un lecteur de glycémie externe, de déterminer le taux de sucre sanguin et de le comparer à la valeur fournie par l'implant télémétrique. Les différents gestes réalisés en dehors de la pose de l'implant télémtrique auront des durées très courtes. Les injections par voie intrapéritonéales ou per os nécessiteront une contention d'environ 15 secondes durant laquelle l'injection sera réalisée sur une durée de moins de 5 secondes. Les prélèvements sanguins au bout de la queue se feront sur des animaux maintenus sur le fond de leur cage par la base de la queue pendant moins de 10 secondes juste pour limiter leur déplacement. Cette "préhension" permettra le prélèvement de la goutte de sang pour la mesure de la glycémie, ce prélèvement durera moins de 5 secondes. Enfin pour l'injection intraveineuse de glucose, celle-ci se fera sur animal sédaté à l'isoflurane afin de limiter le stress. La sédation durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour la pose d’un implant de télémétrie. Les animaux peuvent alors ressentir de potentielles douleurs qui seront prises en charge par une couverture analgésique complète pré, per et jusqu’à 48h en post-opératoire. Pour valider la technologie et la fiabilité des dispositifs une fois implantés, les animaux seront soumis à un test métabolique en condition vigile dans le but de comparer les mesures obtenues par le capteur implanté à la réalité physiologique. Le test métabolique sera répété 3 fois durant les 6 semaines d’enregistrement du capteur. Pour ces tests, les animaux seront mis a jeun pendant 5 heures avant chaque test physiologique qui durera 3h. Une potentielle perte de poids consécutive à la mise à jeun peut être observée et sera surveillée de près. Afin de limiter cette possible difficulté, deux semaines de repos seront laissées entre chaque expérimentation. Le suivi de la glycémie sera réalisé durant ces tests par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue. Une potentielle douleur peut être ressentie lors du premier prélèvement, celle-ci sera couverte par un traitement analgésique réalisé 15 minutes avant l’acte. De plus, une asepsie de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement et après le dernier afin de limiter le risque d’infection Enfin, pour limiter le stress que pourrait induire la contention nécessaire (moins de15 secondes) aux différentes injections, une habituation des animaux à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation sera réalisée plusieurs semaines avant le début des procédures. Les injections en elles-mêmes ne généreront pas une douleur supérieure à celle causée par la piqure d’une aiguille.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de valider la pose de l’implant par autopsie.
Remplacement
L’utilisation de cadavres issus d'autres projets en fin de procédure permettra d’étudier en détail l’anatomie, offrant ainsi un environnement sécurisé pour se familiariser avec les repères physiologiques et anatomiques sans risque pour les animaux et les manipulateurs. Toutefois, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour valider la maîtrise des gestes et la technologie, mais aussi pour assurer un personnel qualifié et compétent permettant ainsi de veiller au bien-être des animaux. De plus, un projet collaboratif visant à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2 et nécessitant cette technologie est déjà planifié, il est donc important de réaliser ces gestes en amont sur animaux vivants et ainsi se confronter aux conditions physiologiques associées à cette méthode. Aussi, la formation spécifique dispensée par la société ayant installé le dispositif réduira le nombre d’animaux nécessaire sur site, puisque ce projet constituera un renforcement de la qualification du personnel.
Réduction
Dans un premier temps l'emploi d'animaux morts issus d'autres projets et la formation spécifique dispensée en amont de la réalisation de ce projet nous permettront de rédurire le nombre d'animaux nécessaires à la mise en place de notre plateforme. Dans l’objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons divisé les animaux en deux lots dont le premier sera constitué d’animaux implantés avec un dispositif factice. Le nombre maximal sera de 15 animaux et seront issus de reproductions surnuméraires, d’ancien(-nes) reproducteurs(-trices) ou d’animaux présentants des critères non adaptés. Pour le second lot, des mesures métaboliques seront pratiquées sur les animaux implantés, avec maximum de 35 animaux. Dans les deux cas, si un nombre moins important d’animaux nous permettait de valider la technologie, le projet sera considéré comme terminé. Ce nombre n'a pas été déterminé par approche statistique dans la mesure où il s'agit de l'acquisition d'un geste.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront optimisées afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle. Les animaux seront maintenus, au minimum, 3 par cage et maximum 5 pour éviter tout isolement social ou surpopulation. Tous les animaux bénéficieront d’un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum hormis durant les 9h de mise a jeun avant et pendant les tests métaboliques au cours desquelles seul l'accès à l'eau sera maintenu. Cette mise a jeun sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines sur 6 semaines donc 3 fois au total. Un suivi quotidien sera assuré, avant, pendant et après les manipulations, par le personnel soigneur et les responsables du projet. Lors de la réalisation des procédures, une surveillance clinique sera assurée par les manipulateurs. Si des signes de souffrance ou de stress, définis selon des critères préalablement établis, étaient constatés, le suivi des animaux serait renforcé. Parmi ceci, plusieurs signes indicatifs seront observés : comportement de l’animal (absence de toilettage, vocalisations, stéréotypies, léchage, automutilation, prostration, létargie, isolement …), apparence générale (état du poil, position des oreilles, gonflement des yeux, position des moustaches), variation du poids, plaies ou cicatrisation difficile. En cas d'apparition d'un de ces signes une prise ne charge médicamenteuse sera faite par utilisation d'anti-inflammatoires et d'analgésiques adaptés. La procédure de chirurgie, susceptible d’entraîner une douleur, sera réalisée sous anesthésie, avec une prise en charge de la douleur avant pendant et après la procédure par utilisation d'analgésiques spécifiques à chacun des gestes. Pour favoriser la récupération des animaux 2 semaines de repos minimum leur seront laissées entre chaque expérimentation. La prise en charge d’une potentielle douleur et/ou infection lors du prélèvement de gouttes de sang au niveau caudal sera assurée par une injection d’analgésiques 15 minutes avant et l’application d'un antiseptique et antimycosique avant et après le prélèvement. Pour limiter le stress lié à la contention durant les expérimentations une habituation à la salle d’expérimentation et à l’expérimentateur sera systématiquement réalisée en amont.
Choix des espèces
Les équipes utilisatrices du service de ressources biologique utilisent principalement des souris pour leurs études. L’objectif de ce projet étant de développer une plateforme de télémétrie rongeurs, dans la continuité d’une formation pratique dispensée sur modèle rongeur par un prestataire externe, le modèle souris sera alors utilisé et préféré au modèle rat. Les souris seront utilisées à des stades adultes, à partir de 8 semaines, toutefois l’âge des animaux n’impactera que peu le projet et il pourra ainsi être étendu de quelques semaines en fonction des animaux disponibles. Le sexe des animaux n'ayant pas d’incidence sur les procédures prévues, les animaux utilisés proviendront de fins de procédure d'élevage, de productions surnuméraires ou à critères non-adaptés, garantissant ainsi une sélection sans critère de sexe des animaux pour ce projet.
Étude de la compétence vectorielles des tiques des genres Ixodes et Dermacentor pour les virus Dugbe et Hazara
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par un virus puis exposées quatre à sept jours durant aux piqûres de tiques posées sur elles, 3 708 souris subissent en plus un prélèvement sanguin quotidien pendant quinze jours. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à l'âge de quatre semaines, choisi parce que les jeunes souris développent une infection lente et progressive qui laisse le temps aux tiques de se gorger au pic de virémie. Le porteur qualifie les piqûres de tiques d'indolores et reconnaît dans le même dossier qu'il lui est difficile d'anticiper les symptômes, l'approche étant exploratoire. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, le porteur écartant toute réutilisation ou adoption au motif qu'elles auront été infectées.
Objectifs
Le virus Hazara est un virus originaire du Pakistan de la région de Hazara et a pour réservoir une espèce locale de campagnol. Le virus est alors transmis par piqure de tique Ixodes redikorzevi. Le virus Dugbe quant à lui est un virus que l’on retrouve chez les bovins d’Afrique centrale et qui peut parfois toucher l’Homme de manière peu symptomatique. L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus objet du projet par ces mêmes tiques. Nous utiliserons des souris de différentes origines : des lignées standard, présentant une sensibilité accrue aux infections virales, ou dont la sensibilité à cette famille de virus a été précédemment montrée. Le but est d’identifier une lignée plus apte à s’infecter pour obtenir un modèle d’infection stable. Les souris montrées comme étant sensibles permettront d’étudier la transmission du virus via les piqûres de tiques infectées. Si au cours de ces expériences de transmission naturelle, les souris sensibles à l’infection par injection intradermique de virus venaient à ne pas s’infecter, alors nous pourrions supposer que le risque que le virus étudié se transmette par des tiques présentes en Europe est minime sinon nul.
Bénéfices attendus
L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus étudié par ces mêmes tiques. Nous allons aussi étudier si ces virus sont capable de passer d’une génération à l’autre de la tique par transmission trans-ovarienne mais aussi sa résistance dans la tique lors des différents passages de stade.
Procédures
Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les jours pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement sanguin final sera réalisé juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.
Impact sur les animaux
Il est difficile d’anticiper des symptômes spécifiques. Le début de projet est exploratoire et nous permettra de mieux évaluer l’état des animaux en fonction des doses de virus. Nous nous intéresserons donc aux signes génériques. Parmi les signes génériques, une perte de poids, une dégradation de la posture, de l’aspect général (poil hérissé, yeux fermés, grimaces).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus. De plus, les organes seront prélevés pour analyse.
Remplacement
La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent. Les modèles d’infection in vitro sont imparfaits, les tiques ne se gorgent pas bien et peu parviennent aux stades suivants. D’autre part, l’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisante car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les études réalisées in vitro ne permettent pas actuellement de rendre compte de la complexité des interactions dans le cadre de la transmission d’une maladie par un vecteur à un hôte sensible. Il est donc nécessaire de se rapprocher des conditions naturelles de transmission en utilisant un modèle animal adapté. La souris est un modèle intéressant car il a déjà été montré qu’elle est sensible à l’infection par plusieurs virus de la famille du virus étudié.
Réduction
Dans un premier temps, nous chercherons à déterminer la cinétique de virémie de l’infection des souris par les virus. Le travail séquentiel que nous proposons et qui vise dans un premier temps à n’utiliser que les doses de virus les plus faibles notamment dans la procédure devrait permettre de réduire le nombre d’animaux si les résultats obtenus sont suffisants avec les premières doses. Dans certaines expériences des variations assez fortes du succès d'infection seront mis en évidence (par exemple, une variation de 20% à 50% du succès d'infection. Dans d’autres, le manque possible de puissance lié à l'utilisation de variables binaires sur des effectifs assez faibles sera étayé par des quantifications tout à fait complémentaires. Les analyses de puissance sont menées avec un logiciel adapté.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et bi-quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites généraux ont été définis basés sur la littérature (perte de poids, fièvre, atteinte hépatique, signes neurologiques). Lorsque l‘un de ces points limites sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Les résultats obtenus en début de projet où plusieurs lignées de souris seront testées permettront de mieux définir les symptômes et de sélectionner la lignée de souris la mieux adaptée à l’infection des tiques par la suite. Nous établirons également des points limites pertinents pour la suite du projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour l’apparition de signes cliniques jusqu’à 15 jours post-infection, notamment quand le modèle sera mis au point et les symptômes analysés. L'approche est exploratoire, en l'absence de connaissances précises dans le domaine, donc les animaux seront observés très précisément. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris avant et après l’infection (les animaux contrôles suivront le même traitement). Si des symptômes apparaissent, les souris seront observées de façon biquotidienne. En l’absence de récupération, les souris seront mises à mort et leurs organes seront récupérés pour des analyses virologiques, histologiques et moléculaires. L’état de santé des souris sera surveillé de façon quotidienne ce qui permettra de détecter précocement tout signe de souffrance et l'atteinte éventuelle des points limites. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris en cas de prostration ou dès lorsqu’une gêne même légère à la motricité sera observée.
Choix des espèces
Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission vectorielle. Les souris sont potentiellement des réservoirs du virus Hazara. Les souris immunodéficientes s’infectent et meurent de l’infection lorsque des doses élevées sont utilisées. Les jeunes souris s’infectent avec le virus Dugbe, mais la sensibilité décroit avec l’âge. Il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser d’autres souris présentant l’avantage d’avoir une grande variabilité génétique et certaines lignées ont déjà montré une plus grande sensibilité aux arbovirus. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 semaines car il a été montré que les jeunes souris développaient une infection lente et progressive, permettant ainsi de pouvoir poser les tiques pour qu’elles soient en phase de gorgement idéalement au cours du pic de virémie.
Pathologie hépatique et infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Dix semaines de régime gras, puis un infarctus provoqué par une chirurgie de trente minutes : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur. S'y ajoutent une échocardiographie et des injections répétées, toutes les quarante-huit heures pendant dix jours ou trois fois par semaine pendant deux semaines. L'objet est de comprendre comment une maladie du foie gras aggrave la réparation du cœur après un infarctus, sur des lignées modifiées pour porter l'atteinte hépatique. Parmi les nuisances attendues, le porteur ne mentionne que l'inconfort de la contention, le stress de l'anesthésie et des douleurs post-opératoires transitoires, sans un mot sur ce que représente l'infarctus lui-même pour l'animal.
Objectifs
La maladie du foie gras, qui touche plus de 127 millions d'Européens, est fortement liée à un risque accru de complications cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde. Les décès chez les patients atteints sont d'ailleurs plus souvent d'origine cardio-vasculaire qu'hépatique. Le remodelage cardiaque est un déterminant essentiel du résultat clinique après un infarctus du myocarde impliquant des réponses biologiques complexes, notamment un engagement du système immunitaire. Cependant, le rôle causal précis de l'atteinte hépatique sur la réparation cardiaque reste non établi. Le projet a donc pour but de caractériser les effets de différents types d'atteintes tissulaires qui caractérisent la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque aux niveaux cellulaires et moléculaires, avec un accent particulier sur la réponse inflammatoire. Une approche thérapeutique sera testée pour limiter les dommages cardiaques délétères observés. Les objectifs de ce projet sont : 1. Caractériser les effets de la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde chez la souris. 2. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire, par l’analyse dans le sang, la rate, la moelle osseuse et enfin dans le coeur. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’atteinte cardiaque exacerbée associée à l'atteinte hépatique. 4. Etudier la contribution directe d'un type de cellules inflammatoires délétères: les neutrophiles.
Bénéfices attendus
À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de communication cellulaire qui contrôlent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde, ainsi que le rôle de l’atteinte hépatique dans le contrôle de l’homéostasie du cœur défaillant. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du cœur infarci, prévenir ou freiner les atteintes cardiaques, et ainsi améliorer la survie des patients.
Procédures
Exposition diète riche en matières grasses - durée 10 semaines //chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection - durée 1 minute, soit chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie, soit 3 fois par semaine durant 2 semaines postérieures à la chirurgie.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires.
Devenir
À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable pour étudier le dialogue pathogénique complexe entre le cœur et le foie, un phénomène qui implique de multiples types cellulaires et ne pourrait pas être entièrement reproduit par de simples modèles cellulaires. Le choix de modèles animaux qui permettent de modifier spécifiquement le foie repose sur des données préalablement observées, garantissant que les modèles reproduisent fidèlement les atteintes hépatiques souhaitées. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un infarctus du myocarde dans un contexte de maladie du foie gras.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de la relation entre la stéatose hépatique et les maladies cardiovasculaires, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1. génétique et mécanismes : Il permet de générer les lignées génétiquement modifiées nécessaires pour induire spécifiquement l'atteinte hépatique. Ceci est crucial pour décortiquer les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires du dialogue cœur-foie. 2. reproductibilité et rurveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques et vasculaires associées à la maladie du foie dans un délai de temps pertinent. 3. complexité biologique : Contrairement aux modèles in vitro, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions inter-organes (cœur et foie) impliquées dans le remodelage cardiaque post-infarctus. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 10 semaines minimum. Ce choix est fait pour s'assurer que le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. Utiliser des souris plus jeunes risquerait d'introduire un biais, car elles n'auraient pas systématiquement atteint la puberté, et les hormones sexuelles sont connues pour jouer un rôle dans le remodelage cardiaque post-infarctus.
Appétit hédonique : dimorphisme sexuel et rôle du microbiote chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour comprendre pourquoi les souris mâles et femelles ne réagissent pas de la même façon à l'appauvrissement de leur microbiote intestinal, 1 032 souris vont être utilisées, dont 696 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Chacune peut recevoir cinquante-six injections sous-cutanées en quatre semaines, sept ponctions de la veine de la queue étalées sur deux heures et un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques destiné à vider son intestin de ses bactéries. Les mesures de prise alimentaire imposent un isolement qui peut durer quatre semaines. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine sont mises à mort, et le porteur annonce des tests comportementaux adaptés à un modèle de dépression sans préciser lesquels.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que chez la souris, l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmentent la consommation d'aliments appétents tels qu'une solution de saccharose, des granulés de saccharose ou des aliments riches en lipides avec un effet potentiel du sexe. Dans cette étude, nous évaluerons l’effet de la déplétion du microbiote intestinal dans notre modèle sur les états émotionnels afin de comprendre les facteurs qui sous-tendent le dimorphisme sexuel observé ainsi que le rôle d'une hormone gastro-intestinale dans l’effet de la déplétion du microbiote intestinal sur la prise alimentaire hédonique.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal selon le sexe sur l’appétit hédonique et des mécanismes associés. Cette étude chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire par exemple ou chez l’Homme.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois par animal. Une administration intragastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. Des administrations sous-cutanées bi-quotidiennes pendant 4 semaines seront réalisées sur des animaux vigiles, ce qui représente 56 injections par souris. L'injection prendra de 15 à 30 secondes par animal. Les mesures de prise alimentaire nécessitent un isolement des souris. Cet isolement pourra durer jusqu'à 4 semaines. Il n'excèdera pas 2 semaines pour la majorité des souris.
Impact sur les animaux
L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. Les tests de tolérance au glucose nécessitent une étape d'administration intragastrique et une ponction de sang au niveau de la veine caudale. Ces actions peuvent entraîner du stress ou de la douleur chez les souris. Les tests comportementaux adaptés au modèle de dépression peuvent être stressant pour les souris. Les autres interventions ne devraient pas entraîner d'autres souffrances ni d'angoisses.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Cette étude comprenant des mesures neuro-comportementales ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature et des travaux antérieurs au sein de l’équipe. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de détecter des différences neurocomportementales ou de réponses physiologiques entre les groupes expérimentaux. La réalisation d’une expérience pilote permettra de choisir des doses d’agents pharmacologiques efficaces sur nos paramètres d’intérêt sur un nombre limité d’animaux afin de garantir le succès des procédures concernées. L’utilisation d’un plan d’étude croisé (administration consécutive des différentes doses du traitement au même sujet) permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l'expérience pilote.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. Un surenrichissement de la cage sera prévu lors des phases d'hébergement individuel (ajout de matériel de nidification supplémentaire et stimulant le comportement exploratoire). De même, les souris seront habituées à l'administration intragastrique et à la contention avant le test de tolérance au glucose. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Dès que nécessaire, des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur des individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines à l’arrivage pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Développement de modèles de Colite sur un nouveau modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une colite est provoquée chez 480 souris, soit par une molécule ajoutée à l'eau de boisson pendant sept jours, soit par une administration rectale unique sous anesthésie générale. 360 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau léger, toutes tuées pour prélever plusieurs organes entiers. Ces souris sont génétiquement modifiées pour ne plus exprimer un récepteur de l'immunité innée, l'objet étant de caler les modèles avant d'étudier plus tard une bactérie anti-inflammatoire. Le porteur qualifie la colite de modérée "compte-tenu des points limites mis en œuvre", tout en décrivant une perte de poids, des selles molles, une déshydratation et des saignements possibles, et ne nomme aucune des deux molécules employées pour déclencher l'inflammation.
Objectifs
La maladie de Crohn (MC), l'un des sous-types les plus courants des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), se caractérise par une inflammation chronique et récidivante du tractus gastro-intestinal. L'étiologie précise de la MC reste incertaine, mais l'hypothèse la plus largement admise implique une activation inappropriée du système immunitaire muqueux due à la présence d'un microbiote intestinal altéré chez un patient génétiquement prédisposé. En effet, la MC est associée à une modification du microbiote intestinal, caractérisée par une diminution de certaines bactéries anti-inflammatoires. De plus, des études génétiques ont révélé que de nombreux patients atteints de MC sont porteurs d’une mutation perte de fonction d’un récepteur de l’immunité innée. L'objectif du projet est donc de mettre au point les modèles de colite chez des souris n’exprimant pas ce récepteur. Ces mises au point sont nécessaires pour permettre par la suite d’évaluer le rôle de ce récepteur dans les effets anti-inflammatoires de certaines bactéries d’intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partie d’un programme de recherche complet et ciblé sur le rôle de l’interaction entre une bactérie anti-inflammatoire du microbiote intestinal et l’implication d’un récepteur spécifique dans la maladie de Crohn. En France, les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin.
Procédures
Les souris seront soumises à l’un des deux modèles de colites induites expérimentalement : i) Par ajout d’une molécule dans l’eau de boisson durant 7 jours suivi de 5 jours sous eau standard (prise volontaire des animaux) ii) Par administration unique par voie rectale d’une molécule sous anesthésie générale (5 minutes). Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris transgéniques utilisés ne présentent pas de phénotype altéré. Néanmoins, ce modèle pourrait présenter une sensibilité accrue à la colite impliquant probablement des adaptations (dose/durée) par rapport aux protocoles validés. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables liée à l’inflammation intestinale : perte de poids, selles molles, déshydratation voir des saignements dans les cas les plus graves (rare). Dans un cas, la colite sera induite via une molécule dans l’eau de boisson. Ce changement dans l’eau peut induire une légère baisse transitoire de la consommation hydrique des animaux de courte durée. Dans l’autre cas, la colite sera induite par administration locale d’une molécule sous anesthésie. La principale contrainte sera alors les risques associés à une anesthésie générale : hypo-tension, hypo-thermie ou encore dans de rare cas un arrêt cardio-respiratoire. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons un prélèvement sanguin pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro, suggérant toutes que les effets anti-inflammatoires de la bactérie sont dépendants du récepteur d’intérêt. Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle, il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera un maximum de 480 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les expériences seront menées de manière séquentielle pour permettre de réduire le nombre de conditions expérimentales en sélectionnant systématiquement les conditions de traitement les plus intéressantes avec des résultats significatifs en utilisant le moins d’animaux. Si cela est possible, nous mutualiserons les conditions contrôles permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux impliqués. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à une évaluation de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. La colite dans ce projet est estimée à modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique permettant de réduire également les risques d’inflammation supplémentaires. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire aux maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont parfaitement maitrisés et sont effectuées par un personnel formé et autorisé.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en nutrition, infectiologie et immunologie qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin de mettre au point des modèles de colite qui nous permettront par la suite de mieux comprendre les mécanismes d’action d’une bactérie intestinale anti-inflammatoire. Justification des stades : Les animaux seront traités entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Cet âge de 6 et 12 semaines de vie est couramment utilisé dans la littérature, et nous souhaitons utiliser des conditions qui permettent une reproductibilité et une comparaison avec les études précédemment publiées.
Efficacité et synergie de thérapies ciblées et de chimiothérapies standards dans des modèles de sarcomes de tissus mous xénogreffés chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
2430 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin des traitements ou plus tôt si un point limite est atteint, puis leurs tumeurs prélevées. Elles reçoivent des fragments de tumeurs de patients sous la peau ou des cellules tumorales humaines, puis selon les cas des traitements par injection dans la veine ou l'abdomen ou par gavage, et certaines une irradiation des tumeurs cinq fois par semaine pendant quatre semaines. Les effets déclarés comprennent des risques de nécrose et d'ulcération au site de greffe avec anémie, une perte de poids, des œdèmes et nécroses de la queue après les injections dans la veine, des fausses routes au gavage, des rougeurs et une desquamation de la peau irradiée. Le porteur espère, grâce à ses collaborations avec l'industrie pharmaceutique, "l'ouverture rapide d'essais cliniques" pour les molécules efficaces chez ces souris. Il qualifie l'implantation des tumeurs d'"inconfort léger" et ne dit pas ce qui place toutes les souris en souffrance sévère.
Objectifs
Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents). Après la chirurgie, peu de traitement sont disponibles hormis des chimiothérapies classiques souvent peu efficaces. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies plus ciblées permettant une meilleure efficacité et moins d’effets secondaires pour les patients. Notre équipe a mis en place une plateforme préclinique qui nous permet d’étudier les effets biologiques et pharmacologiques de nouveaux médicaments en développement. L’efficacité de ces nouveaux composés est dans un 1er temps testée in vitro sur des cellules en culture. Dans la mesure où les résultats sont concluants, nous souhaitons les tester sur des souris immunodéficientes implantées avec des lignées cellulaires issues de patients ou directement des morceaux de tumeurs de patients quand cela est possible.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations s'inscrivent dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous. De part nos collaborations avec les industries pharmaceutiques développant ces nouvelles thérapies, notre localisation dans un centre expert de référence et notre forte interaction avec les oncologues médicaux impliqués dans la mise en place des essais de phases précoces, nous pouvons espérer l'ouverture rapide d'essais cliniques pour les molécules ayant montré leur efficacité dans nos modèles in vivo. Il y a donc un réel benéfice à court/moyen terme pour les patients qui pourraient prétendre à ces nouvelles thérapies.
Procédures
Greffe de tumeurs humaines ou injection des cellules humaines (1 fois par souris, 2 min par souris). Irradiations des tumeurs (radiothérapie) (durée 4 semaines à raison de 5 irradiations par semaine).
Impact sur les animaux
Les procédures d'implantation de fragments de tumeur en sous-cutané peuvent provoquer un inconfort léger avec notamment une risque de nécrose et/ou ulcération et donc d'anémie. Le developpement des tumeurs peut entrainer des changements métaboliques associés notamment à une perte de poids. En ce qui concerne l'administration des traitements, les gestes sont réalisés par du personnels expérimentés maitrisant ces injections. Ces gestes sont donc réalisés rapidement et n’entrainent que peu de stress chez l’animal. Cependant, pour les injections intraveineuses, des oedèmes éventuels et nécroses à la queue sont possible ; pour les gavages: cas de fausse route possible ; pour les injections intrapéritonéales: peu de stress. En cas d'irradiation des tumeurs, l'apparition d'erythème et de désquamation de la peau est possible.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des traitements ou lorsqu’un point limite est atteint. Les souris sont mises à mort puis leurs tumeurs sont prélevées pour analyses.
Remplacement
Dans le cadre d’études précliniques visant à démontrer l’efficacité d’un nouveau médicament en monothérapie ou en combinaison avec une chimiothérapie, la réalisation de tests chez la souris greffées avec des tumeurs de patient semble être indispensable. Ces modèles de greffes sont ceux qui pour l'instant préservent le plus les caractéristiques de la tumeur du patient, c’est une vrai "copie" génétique de la tumeur d’origine. En effet, les modèles de culture en 3D dans des boites en plastique ou autre système de remplacement ne sont pas suffisamment complexes/intégrés pour répondre à la problématique mais une veille scientifique est réalisée pour se tenir informé des nouveaux modèles dans le domaine des sarcomes.
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale des cellules greffées sera suivie de manière longitudinale tout au long des expériences ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés, le but étant d'obtenir des données significatives d'efficacité du médicament.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, utilisation de tapis chauffant et de gel ophtalmique, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).
Choix des espèces
Le but du projet étant de valider l’efficacité de nouvelles thérapies ciblées afin d'utiliser ces médicaments en clinique chez l'homme, il faut nécessairement un modèle de mammifères pour extrapoler les résultats. Nous avons donc choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes qui sont des modèles très immunodéprimés particulièrement adaptés à l'implantation de cellules tumorales d'origine humaine. Animaux âgés de 8-12 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur.
Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments après administration intrathécale
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 2200
2 650 rats et souris vont être utilisés, dont 2 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour examen des organes. Une chirurgie de trente minutes leur pose un cathéter dans l'espace qui entoure la moelle épinière, puis les composés y sont injectés jusqu'à trois fois par semaine pendant deux semaines, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et un jeûne de seize heures avant la mise à mort chez le rat. Le porteur estime qu'un quart des animaux, ceux qui reçoivent la dose forte, présenteront des signes modérés et exceptionnellement sévères, parmi lesquels stéréotypies, agressivité, tremblements et perte de plus de 20 % du poids. L'objet du projet est d'écarter tôt les molécules toxiques pour éviter des études réglementaires qu'il décrit comme coûteuses "d'un point de vue éthique, en animaux, et économique".
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les effets liés à l’administration par voie intrathécale d ‘une molécule d’intérêt. L'injection intrathécale est une injection dans l'espace sous-arachnoïdien. L'espace sous-arachnoïdien constitue le canal rachidien et contient le liquide cérébrospinal (LCS). Cela permet d'administrer le médicament dans le LCS. L'administration peut se faire à l'aide d'une aiguille à ponction lombaire ou avec un catheter implanté au cours d'une intervention chirurgicale Ces effets pourront être reliés à la concentration du candidat médicament administré grâce à des données d’exposition générées • de déterminer, dans le cas de toxicité, des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en analysant les échantillons biologiques obtenus dans le Projet, à l'aide de méthodes d’analyses ex vivo de biologie moléculaire, génomique, protéomique ou métabolomique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement d’un candidat-médicament les effets de toxicité du composé- test afin d’arrêter son développement avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour dans le domaine du système nerveux. Pour cibler une indication du système nerveux central, certaines molécules ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique lorsqu’elles sont administrées par voie systémique dû, entre autres, à leur taille moléculaire et leur charge ionique négative. Elles doivent alors être administrées localement par voie intrathécale dans le liquide cérébrospinal. Cette voie d’administration est aussi celle utilisées chez l’homme et permet une distribution ciblée de la molécule dans le système nerveux central, ce qui est crucial pour traiter des maladies neurologiques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Pose d’un cathéter intrathécal par chirurgie : durée 30 minutes. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : durée quelque secondes sur animaux anesthésiés si administration transcutanée et sur animaux vigiles si animaux porteurs d’un cathéter. Unique ou répétée max 4 fois à un intervalle d’une semaine si administration transcutanée ou 3 fois maximum par semaine pendant 2 semaines avec cathéter. • Anesthésie et analgésie pour des administrations intrathécale : durée de 5 minutes, maximum 4 fois à un intervalle d’une semaine. • Prélèvements de sang : o en microsampling : Durée 60 secondes sur animal vigile. Maximum 9 fois sur 24h. oprélèvement terminal en fin d'étude sous aneesthésie profonde : Durée 1 minute sous anesthésie générale. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, matériel de nidification et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Durée de l’hébergement individuel maximal de 24h. • Préhension douce lors des observations générales et neurologiques : durée 1 minute sur animal vigile, 6 fois maximum par jour. • Test de coordination motrice : 6 sessions d’une durée de 5 minute maximum sur animal vigile, avec une récupération de 15 minutes entre chaque session. •Mise à jeun d‘une durée maximale de 16h chez le rat préalablement à la procédure terminale de l’étude en vu des prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à des possibles doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effets indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes cliniques légers à modérés généralement et exceptionnellement sévères si la produit s’avère toxique :changements de comportements comme l’apparition de stéréotypie et/ou d’agressivité, barbering, hypomotilité, négligence du toilettage, posture analgésique, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général comme l’apparition d’une prostration, modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des contractions, selles diarrhéiques ou perte majeure du poids corporel (
Devenir
Pour l’ensemble des 3 procédure décrites ci-dessus, les animaux sont tous mis à mort en fin de procédure. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.
Remplacement
De nombreux tests in silico (simulations effectuées utilisant des modèles numériques) ou in vitro de toxicité ont déjà été mis en œuvre pour remplacer le recours aux animaux. Les tests actuellement disponibles ne permettent pas encore de répondre à tous les besoins pour écarter la toxicité des molécules en cours de développement. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques d'un animal qui puissent développer des effets secondaires ou toxiques après administration unique ou répétée d'un composé test.
Réduction
Les molécules d’intérêt auront préalablement fait l’objet de test sur des batteries de test in silico et in vitro permettant de ne sélectionner que les candidat médicament les plus prometteurs afin de réduire au maximum la phase vivo du développement. Pour les molécules qui sont développées en phase vivo, le nombre d'animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique tout en réduisant au maximum celui-ci. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit au minimum scientifique de 3 pour sélectionner de candidate en phase pré-clinique et cela pourra aller à 8 animaux maximum pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude si des analyses supplémentaires sont à prévoir ou une variabilité forte est attendu sur le modèle. Les recommandations de l’agence européenne des médicaments demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques et de l‘évolution de la recherche sur certaines modalités utilisées dans le système nerveau centrale. Au total ce projet pourrait utiliser 2650 animaux sur 5 ans. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de la cohorte sont traités afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur ces animaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses lors d’études type Dose Répétée ou Dose Maximale Tolérée après des administrations répétées ou une seule administration, seront administrées, autant que possible, lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures.
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention vigiles sont limitées et la durée est inférieur à 5 minutes. L'hébergement individuel est nécessaire après chirurgie pour suivi (maximum 24h). L'hébergement individuel peut survenir pour des raisons vétérinaires. Dans tous les cas, des contacts olfactifs, auditifs et visuels entre congénères seront maintenus ; de plus, un surenrichissement (plus de quantité de litière, tunnel, matériel de nidation) dans le micro-environnement est prévu. Les observations des animaux sont renforcées tout au long de cette période d'hébergement individuel. Lors d'une procédure, l'observation quotidienne des animaux par le personnel dûment formé permet de détecter toute anomalie. Des critères d’alarme et/ou d’interruption ainsi qu’un arbre décisionnel d’arrêt ayant été définis et diffusés à tous les intervenants, l’apparition de trois signes cliniques notables ou d’un signe clinique sévère font l’objet d’une évaluation par le responsable de la mise en œuvre du projet en collaboration avec le vétérinaire clinicien. Les animaux sont manipulés avec des méthodes douces de contention type soft handling pour toutes les manipulations du projet.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles (de 3 semaines d’âge minimale) pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué ou si la population finale humaine pour laquelle la molécule va être utilisée est une population juvénile.
Rôle du microenvironnement dans le cancer et thérapies antitumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 180 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à sept injections de cellules tumorales par semaine pendant deux semaines, 5 820 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 360 un niveau léger. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires, des échographies de suivi tumoral et une biopsie de la queue à trois semaines. Le porteur écrit n'attendre aucune atteinte à la faim, à la peur, à la détresse ou à la douleur, puis énumère les poils hérissés, la perte de poids, la prostration et les difficultés respiratoires possibles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure, le porteur indiquant qu'elles portent une pathologie chronique qui pèserait sur leur bien-être si elles restaient en vie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies tumorales. Malgré le succès de certains traitements, les tumeurs solides restent encore aujourd’hui très fréquentes et peu soignables, par exemple le cancer du pancréas. Ces pathologies ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de certaines pathologies et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes biologiques du développement tumoral et plus particulièrement des mécanismes de résistance aux thérapies anti-tumorales (chimiothérapies, thérapies ciblées ou immunothérapies). Notre étude permettra de mieux comprendre les processus impliqués, dans le but de proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des cancers à mauvais pronostics, comme le cancer du pancréas ou le cancer du sein agressif.
Procédures
Prélèvements sanguins : quelques secondes avec une semaine d’intervalles entre les prélèvements Injections de cellules tumorales: quelques secondes sur souris anesthésiée, 1x par souris, et 2-7x par semaine pendant la période analysée (max 14 jours) et 1x avant mise à mort sur souris anesthésiée. Biopsies de queue (
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu de nuisances ou effets indésirables des libertés individuelles de l’animal concernant la faim/soif, peur/détresse, stress physique/thermique, douleur/lésion/maladie, environnement (stabulation). Les actes et nuisances qui peuvent générer un inconfort léger et de courte durée sont les chirurgie (durée
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des répercussions sur leur bien-être si pas de mise à mort.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de certaines cellules avec leur microenvironnement qui infiltrent la tumeur. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui ont un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé après avis d’un biostatisticien avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, ou un modèle hiérarchique en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Afin de limiter l’inconfort, nous pratiquerons des méthodes de raffinement en mettant en place des points limites spécifiques et précoces selon la procédure, chauffer les cages si besoin lors d’analgésie, renforcer l’enrichissement des cages, et assurer un traitement adéquat d’analgésie selon les procédures appliquées et points limites établis.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies tumorales car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans les processus de cancérisation et sont semblables dans les pathologies humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux au moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 6 à 40 semaines car nous étudierons ces pathologies chez le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte