Souris
Utilisation de nouvelles nanoparticules dans deux modèles de cancer du pancréas chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies pour leur immunité fortement réduite, qui facilite la prise de la tumeur greffée, 140 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une injection intraveineuse de nanoparticules puis une séance d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Il s'agit d'une étude pilote, destinée à lever des verrous techniques avant un second dossier où le protocole thérapeutique sera détaillé. Le porteur qualifie la prise tumorale d'"indispensable" au projet et annonce, à la rubrique des bénéfices, une nanoparticule pour le traitement des glioblastomes, quand tout le reste du dossier porte sur le cancer du pancréas.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est : Hommes =environ 9% et Femmes = environ 10%. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lévera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement in fine de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des macrophages humains ou dans des cellules souches mésenchymateuses humaines qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisement, les NP particules utilisées seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour le projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement des glioblastomes. Cette partie courte nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique. Une deuxième étape sera ensuite réalisée, sur la base des résultats de l'étude pharmacocinétique/biodistribution pour planifier l'étude de l'efficacité thérapeutique, limitant les groupes expérimentaux.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions avec les durées moyenne - max : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales = 5-10 min /souris - injection IV molécule d'intérêt (véhicule, particule avec dose 1 ou dose 2 couplée aux macrophages ou cellules mesenchimateuse) = 10-15 min /souris - imagerie corps entier sous anesthésie gazeuse = 15-20 min / souris - mis à mort = 5-10 min / souris. Les souris suivront donc 1 intervention pour linoculation des tumeurs, 1 injection de la molécule et 1 imagerie suivie de la mise à mort.
Impact sur les animaux
D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des nanoparticules véhiculées dans les macrophages, cellules mesenchimateuses ou contrôle est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront inclus dans cette procédure qui prévoit une mise à mort pour prélèvement d'organes à la suite de l'imagerie.
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une première étude pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers. Ayant eu cette validation, une suite est prévue une fois ces informations traitées pour l'étude des effets thérapeutiques avec la réduction des groupes expérimentaux.
Réduction
Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation des nanoparticules dans les macrophages et les cellules mesecnhimateuses. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la litérature. Ces simulations ont été faites à l’aide d'un outil informatique.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite deux fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.
Choix des espèces
Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche utilisée est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.
1.2. Titre du Projet : Effets de nouveaux inihbiteurs de la voie SPAK sur la cognition, le sommeil et les crises d’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Environ 400 souris reçoivent une injection de PTZ pour déclencher des crises d'épilepsie, une partie devant atteindre un état de crise prolongée. 2 040 souris vont être utilisées en tout, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 240 un niveau modéré, avec des implantations d'électrodes de cinq heures et des injections quotidiennes pendant sept jours. Le porteur écrit que l'injection de PTZ "ne provoque pas de douleur particulière" et qualifie les crises qui suivent de stressantes et fatigantes, sans autre précision sur ce que subit l'animal pendant le status epilepticus. Après chaque procédure, le cerveau est prélevé, ce qui suppose la mise à mort de tous les animaux.
Objectifs
Dans le cerveau, l’inhibition agit comme un frein qui empêche les signaux nerveux de s’emballer. Quand ce frein fonctionne mal, cela peut contribuer à des maladies comme l’épilepsie ou certains troubles psychiatriques. Pour mieux comprendre ces problèmes et imaginer de nouveaux traitements, nous avons étudié une voie de communication entre neurones, appelée SPAK, qui est anormalement activée dans certaines de ces maladies. Nous avons découvert un nouveau mécanisme qui contrôle cette voie et, grâce à des modèles informatiques, nous avons conçu des molécules capables de la réguler. En les testant sur des neurones cultivés en laboratoire et observés avec des techniques de microscopie avancée, nous avons vu que certaines molécules parviennent à bien contrôler cette voie, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Cependant, leurs effets ne sont pas identiques selon qu’elles agissent sur des neurones « freins » (inhibiteurs) ou des neurones « accélérateurs » (excitateur), ce qui rend difficile de prédire précisément leur impact dans un vrai cerveau. La prochaine étape sera de tester ces molécules dans l’organisme pour comprendre comment le blocage de la voie SPAK influence l’activité des connexions entre neurones, le fonctionnement global du cerveau et différents comportements comme la mémoire, l’anxiété, le sommeil, les interactions sociales ou encore la sensibilité aux crises d’épilepsie chez la souris. Enfin, nous chercherons à comprendre plus en détail le rôle de cette voie dans les deux grands types de neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne une voie de communication encore peu étudiée dans le cerveau, appelée voie SPAK, et à tester l’efficacité de nouvelles molécules que nous avons développées (une invention déjà déposée et en cours de brevet). Nous espérons montrer que bloquer cette voie grâce à nos molécules pourrait protéger contre les crises d’épilepsie et améliorer des fonctions comme la mémoire, l’attention et les interactions sociales, tout en préservant un sommeil de bonne qualité. En étudiant des versions modifiées de cette voie dans différents types de cellules nerveuses, nous pourrons identifier plus précisément celles qui sont impliquées. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements contre certaines formes d’épilepsie, y compris celles associées à des troubles cognitifs ou du sommeil.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, plusieurs types de procédures seront réalisées sur les animaux expérimentaux. 1. Chirurgies sous anesthésie générale (1 à 2 fois par animal) o Injections cérébrales : administration de vecteurs viraux, d’une durée d’environ 1 heure par animal. Nombre total prévu : ~624 animaux. o Implantations d’électrodes : chaque intervention dure environ 5 heures. Nombre total prévu : ~800 animaux. 2. Évaluations comportementales (animaux vigiles) Des séances d’observation et d’évaluation comportementale sont planifiées, pour un total d’environ 260 souris. 3. Induction de crises d’épilepsie aiguës (animaux vigiles, 1 fois par animal) o Les crises seront induites par administration de PTZ. o Durée de chaque session : environ 1 heure. o Nombre total prévu : 400 souris. 4. Injections répétées (animaux vigiles) o Injections intrapéritonéales (IP) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour ~312 souris. o Injections intraveineuses (IV) : même protocole et durée que les injections IP, pour ~312 souris. o Injections IV ou IP (expériences principales) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour un total d’environ 792 souris, après détermination du mode d’injection le plus adapté sur la base des expériences de contrôle.
Impact sur les animaux
Les injections (sous la peau, dans l’abdomen ou dans une veine) ainsi que les différents tests comportementaux réalisés sur les souris adultes peuvent provoquer un léger stress. Celui-ci est lié à la manipulation nécessaire pour l’injection ou au fait de se retrouver dans un environnement nouveau. Pour l’induction de crises d’épilepsie, les souris reçoivent une seule injection sous la peau d’une molécule appelée PTZ. Cette injection ne provoque pas de douleur particulière, mais les crises qui suivent sont stressantes et fatigantes pour l’animal. Dans le cadre de certaines expériences, il est nécessaire que l’animal atteigne un état de crise prolongée (status epilepticus). L’implantation d’électrodes pour mesurer l’activité musculaire, cardiaque ou cérébrale, ainsi que les injections cérébrales de virus pour cibler certains types de cellules, nécessitent des chirurgies sous anesthésie générale. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’électromyogramme (EMG) et de l’électrocardiogramme (ECG) et du potentiel de champ (LFP), ainsi que l’injection stéréotaxique de vecteurs viraux dans des types cellulaires spécifiques, impliquent une intervention chirurgicale susceptible d’induire une douleur résiduelle, considérée comme modérée après application des mesures de raffinement.
Devenir
Après chaque procédure, le cerveau des animaux est prélevé pour permettre des analyses scientifiques.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules de l’hippocampe, une région du cerveau, et ces tests montrent que nos molécules pourraient agir sur la voie de signalisation SPAK. Pour vérifier leur potentiel thérapeutique, nous devons maintenant les tester chez l’animal éveillé. Cela nous permettra de mieux comprendre comment ces molécules agissent sur les cellules du cerveau, sur les circuits impliqués dans l’épilepsie et sur les comportements qui sont affectés par cette maladie. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle, car elle permet de conserver les interactions naturelles entre les différents organes, ce qui n’est pas possible dans des études uniquement sur des cellules en laboratoire.
Réduction
Nous avons conçu ce projet pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en gardant un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été déterminé à partir des données de nos études précédentes et de calculs statistiques précis. En pratique, nous utiliserons 10 animaux par groupe. Les deux sexes, mâles et femelles, seront inclus dans nos expériences. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour tous les tests comportementaux, en commençant toujours par les tests les moins stressants afin de limiter leur inconfort. Enfin, les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées pour garantir la fiabilité des conclusions.
Raffinement
Toutes les procédures chirurgicales de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale ou locale, sur un tapis chauffant, et avec l’utilisation d’antalgiques pour limiter la douleur. Les injections et prélèvements seront faits en suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Les souris seront hébergées par petits groupes, avec un maximum de 5 animaux par cage, et observées régulièrement pour vérifier leur état de santé. Avant chaque intervention, le poids et l’état général de chaque animal seront contrôlés. Si un signe de douleur ou de malaise est détecté, l’animal sera retiré immédiatement du protocole. Nous faisons tout pour réduire au maximum le stress et la douleur, en mettant en place des périodes d’habituation et en utilisant des anesthésiants et antalgiques adaptés. Le suivi quotidien de l’état des animaux (attitude, aspect du pelage, poids) permettra d’administrer un traitement supplémentaire si nécessaire ou, si un seuil critique est atteint, de retirer l’animal de l’étude. Enfin, lorsque l’euthanasie est nécessaire, elle sera réalisée dans une pièce séparée, pour éviter tout stress aux autres animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé en recherche en neurosciences. Elle permet d’étudier le comportement, de modifier certaines cellules du cerveau grâce à des techniques génétiques, et de reproduire des modèles d’épilepsie qui sont bien établis pour comprendre cette maladie chez l’humain. Nos expériences seront réalisées sur des souris adultes, car les changements dans le fonctionnement des molécules que nous étudions apparaissent après la naissance, dans des maladies comme l’épilepsie, certains troubles psychiatriques ou encore des troubles du sommeil.
Identification de cibles vaccinales pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les infections materno-fœtales sévères à Escherichia coli, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Des souriceaux de deux à trois jours sont exposés à Escherichia coli, certains mourant dans les vingt-quatre heures qui suivent, les autres étant tués au même terme. 3 158 souris vont être utilisées au total, 1 980 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 178 un niveau léger, toutes tuées pour prélever cerveau, foie et rate. L'objet est d'identifier gène par gène des composants de la bactérie qui pourraient servir de cibles vaccinales chez le nouveau-né. Le porteur range les injections et le gavage parmi les gestes causant "un léger inconfort ou un stress passager", tout en décrivant chez les souriceaux non protégés une léthargie, des troubles respiratoires et une mort rapide.
Objectifs
Escherichia coli est l’un des principaux agents bactériens responsables d'infections graves, en particulier chez les bébés prématurés. Ces infections peuvent toucher le sang (bactériémie), le cerveau (méningite), les poumons ou d’autres organes vitaux, et entraîner des complications graves, voire le décès. Même lorsqu’ils survivent, certains enfants gardent des séquelles durables. Ces infections surviennent souvent peu après la naissance, lorsque le bébé est colonisé par la bactérie au contact de sa mère. La bactérie peut ensuite franchir les barrières naturelles du corps et atteindre la circulation sanguine, ce qui déclenche une infection généralisée. Dans ce projet, notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes qui permettent à E. coli de provoquer ces infections sévères chez la souris et d’identifier des cibles qui pourraient être utilisées pour prévenir ces maladies. Pour cela, nous utilisons une méthode de recherche innovante, qui permet d’analyser le rôle de chaque gène de la bactérie. Cette approche permet d’identifier automatiquement les éléments de la bactérie qui déclenchent une réaction de défense chez l’hôte. Ces éléments pourront ensuite servir de base au développement d’un vaccin destiné à protéger les nouveau-nés contre les infections à E. coli. À terme, ce travail vise à contribuer à la mise au point d’une stratégie de prévention efficace contre ces infections néonatales graves.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, aucun vaccin ne peut protéger les nouveau-nés contre les infections graves causées par Escherichia coli. Cette bactérie, responsable notamment d’infections du sang et du cerveau chez les nourrissons, est difficile à cibler par le système immunitaire. En effet, sa capsule protectrice ressemble à des molécules naturellement présentes dans le corps humain, ce qui rend la réponse immunitaire moins efficace et soulève des risques de confusion avec nos propres cellules. Notre projet vise à contourner cet obstacle en utilisant une approche innovante, qui permettra d’identifier d’autres composants de la bactérie, capables de déclencher une réponse immunitaire sans danger. Ces éléments seront ensuite testés en laboratoire et sur modèle animal afin de vérifier leur efficacité, ce qui constituera la première étape vers un futur vaccin. Cette méthode pourrait à terme servir à identifier d'autres cibles vaccinales pour protéger contre d'autres pathogènes responsables d’infections graves, voire dans le cadre du cancer. Les résultats de ce projet seront publiés dans des revues scientifiques et présentés lors de conférences. Nous veillerons aussi à les partager avec le grand public à travers des actions de vulgarisation et d’enseignement. Ce travail pourrait aboutir à un vaccin efficace contre E. coli, réduisant la dépendance aux antibiotiques et le risque de résistance. En protégeant les mères et leurs bébés, il représenterait une avancée importante en santé publique.
Procédures
Chez les souris adultes, la vaccination peut provoquer des effets légers et temporaires, comme un poil légèrement hérissé, une baisse d’activité pendant quelques heures ou une petite sensibilité au point d’injection. Aucun décès n’est attendu à cette étape. Chez les souriceaux âgés de 2 à 3 jours, l’exposition à la bactérie peut entraîner une infection grave. Les signes qui apparaissent le plus souvent sont une baisse importante de l’activité, une réaction moindre aux stimulations et parfois une coloration de la peau qui devient plus terne ou grisâtre. Ces symptômes surviennent généralement entre 6 à 12 heures après l’infection. Sans protection immunitaire, les souriceaux atteints peuvent rapidement s’aggraver et certains peuvent mourir dans les 24 heures, ce qui est caractéristique de ce type d’infection chez le nouveau-né. Pour éviter toute souffrance prolongée, tous les souriceaux sont mis à morts 24 heures après l’infection, ou plus tôt si leur état le nécessite, conformément aux critères d’arrêt prévus.
Impact sur les animaux
Cette étude est classée comme une procédure de classe sévère en matière de bien-être animal. Certaines manipulations, comme les injections dans l’abdomen ou l’administration de liquide directement dans l’estomac, peuvent provoquer un léger inconfort ou un stress passager. Des prélèvements de sang seront également réalisés sous anesthésie, à l’aide d’un gaz. Ce gaz peut parfois provoquer une toux ou des signes d’inconfort à très court terme, ainsi qu’une légère perturbation de la régulation de la température corporelle. Là encore, toutes les précautions seront prises pour limiter ces effets. Le classement global de la sévérité est lié au challenge infectieux réalisé chez les souriceaux, qui peut entraîner des signes cliniques modérés à sévères (léthargie, troubles respiratoires, perte de poids), voire un décès rapide dans certains cas.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort de manière éthique, conformément à la réglementation en vigueur et aux objectifs scientifiques de l’étude. Cette mise à mort est nécessaire pour : – Réaliser des prélèvements d’organes (cerveau, foie, rate…) indispensables à l’analyse de la dissémination bactérienne et à l’évaluation de l’efficacité du vaccin testé ; – Éviter toute souffrance prolongée dans les groupes non protégés, notamment en cas d’infection sévère (sepsis) ; – Garantir la qualité et la fiabilité des résultats, en assurant un recueil homogène des données au même moment post-infection.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont permis d’établir les doses optimales de vaccin et de bactéries à administrer. Cependant l’emploi du modèle animal nous est indispensable afin d’étudier la réponse immunitaire de l’hôte. De plus, s’agissant du développement d’une nouvelle stratégie curative, l’expérience sur l’animal est justifiée avant l’application sur l’Homme. Néanmoins, plusieurs parties du projet seront faites in vitro ; dès que cela nous est possible et scientifiquement justifié.
Réduction
Nous utiliserons une lignée consanguine de souris dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. De plus, nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative. Par nos expériences passées, il est estimé qu’un groupe de 16 animaux est suffisant pour obtenir une étude statistique.
Raffinement
Pour réduire le stress et l’angoisse des souris de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d'offrir un environnement enrichi et approprié. Les souris auront un accès à volonté à l'eau et à la nourriture pour assurer leur hydratation et leur besoin nutritionnel. Après réception des souris à l’animalerie, aucune expérience ne sera faite avant au moins une semaine, pour leur laisser le temps de s’habituer à leur nouvel environnement (bruits, odeurs, sensations…). Elles seront simplement manipulées, sans geste invasif, pendant cette semaine pour les habituer à l’expérimentateur (marquage, contention). Pendant toute la durée de l'étude, des aiguilles et sondes adaptées aux voies d'administration et à l'âge des souris seront utilisées afin de minimiser les traumatismes induits. Les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie afin de minimiser le stress et la douleur lors des prélèvements. De plus, un collyre anesthésiant sera appliqué sur l'oeil prélevé des souris pour minimiser leur souffrance au réveil. Les souris seront surveillées régulièrement par les membres de ce projet ou, le cas échéant, par le personnel qualifié de l’animalerie afin de relever toute souffrance isolée ou non induite par les manipulations expérimentales.
Choix des espèces
Tout d'abord, la souris est un modèle animal bien établi et largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa génétique bien caractérisée et de sa similitude avec l'organisme humain en termes de physiologie et de pathologie. Ces caractéristiques permettent de réaliser des études reproductibles et de haute qualité, fournissant des résultats pertinents et transposables aux humains. De plus, la souris est reconnue comme modèle d'infection systémique à E. coli. En effet, les bactéries notamment E. coli se répliquent très bien chez la souris, ce qui est nécessaire pour une sélection efficace des mutants. •Animaux adultes : Afin de réduire au maximum la variabilité de nos résultats nous n’utiliserons que des animaux adultes du même âge (8 à 10 semaines). •Animaux nouveau nés âgés de 2 à 3 jours. Notre projet porte sur les infections néo natales à E. coli. Il est parfaitement démontré dans la littérature que la traversée de l’épithélium digestif, l’envahissement sanguin, ainsi que la traversée de la barrière hémato encéphalique et l’envahissement méningé sont des phénomènes qui ne s’observent qu’à un stade très précoce du développement (< 5 jours de vie) sans doute en raison de l’immaturité des différentes barrières anatomiques (digestive et hémato encéphalique).
Effet des hormones sexuelles sur la cornée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est privée d'ovaires ou de testicules avant de recevoir de la testostérone ou de l'œstrogène sous la peau de la nuque. Elles sont 186, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La cornée est abrasée pour reproduire une blessure, atteinte dont le porteur écrit qu'elle peut causer pendant 72 heures une douleur comparable à celle d'un grain de sable dans l'œil. Les yeux sont prélevés après la mise à mort pour examiner la cornée et ses annexes, seule façon selon lui d'évaluer l'effet des hormones sur la cicatrisation.
Objectifs
L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neuro-dégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de connaissances sur le fonctionnement de la cornée et son environnement constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. Une étude préliminaire menée par notre équipe a mis en évidence une différence significative de sensibilité cornéenne entre souris mâles et femelles. Notre projet vise donc à explorer cette différence de la cornée due au sexe et à en évaluer les conséquences sur la fonctionnalité cornéenne, en particulier sur les mécanismes de cicatrisation. L’objectif à long terme est de mieux comprendre les interactions neurones/hormones dans la cornée afin de contribuer au développement de nouveaux traitements plausibles.
Bénéfices attendus
La kératite neurotrophique étant en impasse thérapeutique, comme d’autres pathologies de la cornée, notre projet a pour but de déterminer et mettre en place de nouvelles thérapies innovantes. La première étape de cet objectif est de mieux comprendre et détailler le fonctionnement de la cornée, notamment dans les différents sexes. En étudiant l’impact des hormones sur la cicatrisation de la cornée, le projet permet alors de développer des nouvelles thérapies en médecine personnalisée. On s’adapterait ainsi au patient et à ses conditions (sexe, grossesse, variations hormonales).
Procédures
Manipulées par nos soins, les souris, même si aucune douleur n’est causée lorsqu’elles sont simplement tenues, risquent d’éprouver du stress. Seront limitées au maximum les anesthésies, les durées et le nombre des manipulations. La testostérone (hormone masculine) et l’oestrogène (hormone féminine) seront injectées juste sous la peau de la nuque chez des souris endormies à l’aide d’un gaz. C'est une intervention très rapide qui prend moins d'une minute par souris. Celle-ci peut légèrement influencer le comportement des animaux : agressivité mineure, hyperactivité faible.
Impact sur les animaux
La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée et ses annexes.
Remplacement
Les systèmes de cellules isolées ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier qui dépend des hormones, ce qui rend indispensable l’utilisation d’un modèle animal, en particulier la souris, notamment grâce à l’utilisation de souris sans organes génitaux primaires : ovaires et testicules +/- traitées à la testostérone et l’oestrogène.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.
Raffinement
Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Pendant le traitement à la testostérone, les souris ne sont pas maintenues entre nos mains. Elles sont simplement anesthésiées à l’aide d’un gaz, ce qui permet de réaliser l’injection sans induire de stress important. L’administration sous-cutanée permet une libération prolongée, limitant les pics hormonaux et les manipulations répétées. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute anomalie. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance ou d’effet secondaire sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’abrasion cornéenne, avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. L’animal est suivi les heures et jours suivant la procédure ainsi en cas de signes de douleur, il sera pris en charge immédiatement. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des lignées sauvages. Elle permet ainsi d’étudier l’impact des hormones sur le microenvironnement cornéen en étant un modèle très satisfaisant pour la reproductibilité chez l’Homme. Nous débutons nos traitements hormonaux sur des souris âgées 6 et 9 semaines, car c’est à cet âge que la cornée est mature ce qui permet d’éviter des fluctuations hormonales susceptibles de fausser les résultats.
Etude d’un candidat médicament sur un modèle souris de sarcopénie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Livrées à l'animalerie à l'âge de 23 mois, 75 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 91 administrations du composé testé, subit 27 pesées, deux prélèvements sanguins en boîte de contention et trois tests d'endurance de trente à quarante-cinq minutes sur tapis roulant. Le RNT ne précise pas comment les souris sont amenées à courir jusqu'au bout de ces tests. Le porteur écrit que l'étude in vivo est une "étape règlementaire incontournable" pour le dossier de son client avant les premiers essais chez l'humain, et espère une mise sur le marché contre la perte musculaire liée à l'âge.
Objectifs
Le composé testé a été initialement développé comme un médicament visant les fibres musculaires dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire liée à l'âge. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment ses effets sur la masse et la force musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris âgées.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter la faiblesse musculaire liée à l'âge chez l'humain. Bien que de nombreux traitements aient été testés au cours des vingt dernières années, il n’existe toujours pas de médicament capable de guérir la sarcopénie. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la perte musculaire. .
Procédures
Au cours de l'étude, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (27 mesures ; durée de la mesure : 1 minute) ; 2) Administration du candidat médicament (91 administrations ; durée : 1 minute) ; 3) Analyse non invasive de la composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure : 2 minutes) ; 4) Prélèvements sanguins (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes) ; 5) Analyse des échanges respiratoires sur un tapis roulant (1 mesure ; durée : max. 48 minutes); 6) Test d'endurance sur un tapis roulant (3 mesures ; durée moyenne : 30-45 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel, ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Les tests réalisés sur tapis roulant constitueront une nuisance d'isolement sur les animaux qui garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. L’anesthésie peut également générer un stress de courte durée chez l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus près euthanasie pour analyses ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles musculaires. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la prise alimentaire) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages collectives et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront réalisés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans l'appareil de mesure permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. Avant chaque test sur tapis roulant, les animaux seront également habitués à être sur un tapis roulant à une faible vitesse. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. A la réception, les 75 animaux seront âgés de 23 mois. Le stade de développement de ces animaux correspond ainsi à la population cible du composé développé.
Évaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des modèles murins de maladies articulaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Une perte de poids trop importante ou une immobilité totale suffit à arrêter l'expérience, un score clinique supérieur à 8 pouvant y mettre fin. 4 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée par injection, puis des composés sont administrés jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire ou intradermique, avec des prélèvements sanguins allant jusqu'à 12 % du volume sanguin total. Le porteur décrit œdèmes, difficultés locomotrices, posture prostrée et douleur, et précise que la fréquence des prélèvements relève de "l'appréciation du client".
Objectifs
Plus de 200 maladies rhumatismales sont recensées et se manifestent sous différentes formes avec des atteintes au niveau des os et des articulations, des ligaments, des cartilages, des muscles et des tendons des membres inférieurs et supérieurs. On distingue quatre principaux types de rhumatismes : les rhumatismes inflammatoires (arthrite rhumatoïde, spondylarthropathies...), les rhumatismes dégénératifs (arthrose...), les affections des parties molles (fibromyalgie...) et les affections osseuses (ostéoporose...). Parmi les rhumatismes inflammatoires, l’arthrite rhumatoïde (AR) fait partie des maladies articulaires inflammatoires chroniques de l'adulte les plus fréquentes. En effet, elle concerne plus de 300 000 personnes en France et peut réduire l’espérance de vie des personnes atteintes. Bien que l’AR puisse se manifester à tout âge, elle apparaît généralement à l’âge adulte entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans et une incidence deux à trois fois plus élevée chez les femmes. Les répercutions psychologiques, fonctionnelles, professionnelles et sociales, de la pathologie sont importantes et en font un enjeu économique de santé majeur. En effet, la douleur est souvent le symptôme le plus contraignant pour les patients car elle peut persister malgré la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. Ainsi, bien que certains traitements soient proposés aux patients, ils n’en restent pas moins uniquement symptomatiques et parfois peu efficaces sur l’évolution de la pathologie et la gestion de la douleur. A ce jour, il est donc impératif de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Depuis ces dernières années, le développement de traitements pour les maladies articulaires a permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Même si certaines de ces stratégies s’avèrent efficaces dans l’amélioration des symptômes et permettent parfois une rémission complète et prolongée, le pronostic d’évolution de la pathologie reste mauvais pour de nombreux patients. En effet, les déformations articulaires ainsi que la destruction des tendons contraignent parfois les médecins à avoir recours à la chirurgie orthopédique. Par ailleurs, de part leurs comorbidités, certains traitements ne peuvent être proposés à certains patients. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un suivi plus personnalisé et d’aboutir à une rémission complète de tous les patients. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement…) de différents candidats médicaments dans les maladies articulaires.
Procédures
1) Induction de la pathologie : les animaux pourront être soumis à une ou plusieurs injections afin de mettre en place le modèle (1 minute maximum). Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale (5min) ou non selon le mode d’injection décrit dans la procédure. 2) Administrations répétées de composés client (2 fois par jour au maximum): les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client (maximum 2 fois par semaine pour des petits prélèvements inférieurs à 8% du volume sanguin total, 1 fois pour ceux supérieurs à 8%), un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées à la pathologie pourront être observées sur les animaux telles que : - Perte de poids - Posture prostrée - Absence d’hygiène corporelle : poil hérissé - Difficultés locomotrices - Douleur - Œdèmes et atteintes des articulations - Stress lié à l’isolation des animaux en cages individuelles pendant 24 à 60h (activmètre) - Stress et douleur liés à l'utilisatuon d'un test de douleur. De plus, l’injection de certains inducteur de la maladie peut provoquer une inflammation au niveau de la queue. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.
Remplacement
Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être évitée. En effet, comme vu précédemment, les maladies articulaires telles que l’arthrite rhumatoïde présentent des origines diverses (facteurs immunologiques, environnementaux, hormonaux, génétiques). Les modifications physiopathologiques liées à ces pathologies sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Il s’agit de maladies évolutives qui, une fois déclenchées, s’aggravent progressivement et s’étendent à d’autres articulations. La douleur est un problème majeur chez les patients car elle persiste bien après la prise en charge thérapeutique par des anti-inflammatoires par exemple. Il est donc inévitable d’utiliser les modèles animaux dans l’étude de l’efficacité de nouvelles thérapies qui doivent impérativement prendre en compte le paramètre de la douleur. Par ailleurs, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux minimum seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63 en unités individuelles ventilées avec enrichissement de l’environnement (igloo et carrés de ouate). L'état de santé des animaux sera évalué selon des critères en accord avec le comité́ de suivi du bien - être animal de notre établissement. L’expérimentateur sera alors prévenu et une dégradation trop importante de l'état de santé (au-delà d'un score de 8 selon les critères détaillés dans les procédures, score 1) pourra entrainer l'arrêt immédiat de l'expérimentation. Par ailleurs, dès lors que la pathologie sera induite, les expérimentateurs procéderont à un suivi quotidien des animaux (le suivi du week-end sera effectué par le personnel de la zone d'expérimentation) afin d’identifier les atteintes spécifiques à la pathologie (grilles de score spécifiques permettant de définir les points limites). Certains critères suffiront à eux seuls pour acter l'arrêt de l'expérience, tels qu'une perte de poids trop importante ou une immobilité totale. Par ailleurs, dès lors qu’une inflammation d’une articulation et/ou une difficulté de mobilité seront observées, de la nourriture humidifiée et de l’eau gélifiée seront ajoutés dans la cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement d’arthrite rhumatoïde compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la réponse inflammatoire. L’ensemble des modèles décrits dans ce projet nécessite l’utilisation de souris adultes car l’arthrite rhumatoïde apparaît généralement entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans. Le modèle de développement de l’arthrite rhumatoïde nécessite l’utilisation d’animaux âgés de 6 semaines, c’est-à-dire un âge auquel la sensibilité au développement de la pathologie est optimale. Le modèle d’induction de l’arthrite rhumatoïde par transfert de sérum nécessite d’une part, des souris présentant les premiers signes de développement de la pathologie à partir de 8 semaines et permettant de fournir le sérum nécessaire à l’injection et, d’autre part, des souris âgées de 6 à 10 semaines qui recevront le sérum. Les autres modes d’induction nécessiteront l’utilisation d’animaux âgés de 6 à 10 semaines.
Rôle des récepteurs métabotropiques au glutamate dans le phénotype autistique des souris Fmr1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris porteuses de la mutation Fmr1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies du cerveau sous anesthésie générale, l'une d'environ une heure pour une injection intracérébrale, l'autre pour implanter une canule et une fibre optique, puis reçoit des injections répétées et passe trois tests d'interaction sociale de dix minutes dans une arène. Le porteur cherche à savoir laquelle de deux voies nerveuses porte l'amélioration du comportement social observée quand une région du cerveau est stimulée. Il écrit que la mise à mort "constitue la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques", après avoir précisé que les canules et les modifications cérébrales interdisent toute réutilisation des animaux.
Objectifs
Une petite région du cerveau joue un rôle important dans la régulation des interactions sociales chez la souris. Chez certaines souris qui présentent des difficultés sociales similaires à celles observées dans l’autisme, stimuler cette zone du cerveau améliore nettement leurs interactions. Cette zone reçoit des informations venant de deux endroits différents du cerveau. Nous voulons comprendre lequel de ces deux endroits est responsable de cette amélioration. Pour le savoir, nous allons d’abord empêcher l’un de ces deux chemins de fonctionner. Ensuite, nous activerons très précisément l’autre chemin grâce à une petite molécule qui peut être contrôlée par la lumière. Si l’amélioration disparaît lorsque le premier chemin est bloqué, cela voudra dire que c’est le plus important. Si l’amélioration est toujours là, alors c’est l’autre chemin qui joue le rôle principal. Nous réalisons cette expérience uniquement sur les souris présentant des difficultés sociales, car ce sont les seules qui permettent de répondre clairement à cette question.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à comprendre comment le cerveau contrôle les comportements sociaux chez des souris qui présentent des difficultés proches de celles observées dans certains troubles du développement. Deux zones du cerveau pourraient être responsables de ces difficultés, et notre objectif est d’identifier laquelle joue le rôle principal. Pour cela, nous comparerons l’influence de deux chemins différents du cerveau et déterminerons lequel est indispensable pour améliorer le comportement social lorsque nous stimulons une région précise. Les résultats de ce travail permettront de mieux comprendre ce qui, dans le cerveau, contribue aux difficultés sociales observées dans ce modèle de trouble du développement. À long terme, ces connaissances pourraient aider à orienter des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour les personnes présentant des troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première consiste en une chirurgie (environs 1h) d’injection dans le cerveau. La seconde consiste en une chirurgie d’implantation d’un dispositif permettant des injections et des stimulations ultérieures. Au cours du protocole, les animaux recevront plusieurs injections de médicaments. Certaines injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, d’autres seront effectuées localement dans le cerveau à l’aide du dispositif implanté. Les animaux seront également manipulés pour être connectés à un dispositif optique et participer à des tests de comportement social réalisés dans une arène dédiée. Les animaux réaliseront trois tests de comportement de 10 minutes chacun.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont globalement modérés et transitoires. Après les chirurgies, les animaux peuvent présenter une douleur légère, une diminution d’activité ou de l’appétit pendant 3 à 4 jours, ainsi qu’un faible risque d’inflammation locale ou d’infection au niveau de la plaie. La présence de la canule peut entraîner une gêne mécanique durant quelques jours. Les injections intracérébrales peuvent théoriquement provoquer une réaction inflammatoire limitée, bien que jamais observée dans nos travaux précédents. Les manipulations (contention, connexion à la fibre optique, injections) peuvent générer un stress ponctuel, de très courte durée. Les injections intrapéritonéales peuvent causer une petite gêne immédiate au point d’injection. Les anesthésies comportent un risque faible d’hypothermie ou de ralentissement respiratoire, maîtrisé par une surveillance adaptée. L’ensemble de ces effets est généralement réversible en moins d’une semaine.
Devenir
À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés conformément aux méthodes réglementaires en vigueur. Cette étape est indispensable car les analyses finales nécessitent l’examen du cerveau pour vérifier la bonne localisation des injections, l’efficacité du knock-down et l’implantation correcte du matériel. Ces vérifications histologiques sont essentielles pour interpréter correctement les résultats et garantir la validité scientifique du projet. Par ailleurs, la présence des canules et les modifications cérébrales induites ne permettent pas de réutiliser les animaux dans un autre protocole. L’euthanasie constitue donc la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques.
Remplacement
Pour mieux comprendre l’autisme et trouver de nouvelles pistes de traitement, les chercheurs ont besoin de modèles qui permettent de reproduire certains aspects de cette condition. Les souris utilisées dans ce type d’étude présentent des difficultés sociales qui ressemblent à celles observées chez certaines personnes autistes. Observer leur comportement est la seule façon de savoir si ces modèles sont fiables et s’ils peuvent réellement aider la recherche. C’est aussi la seule manière de tester si un traitement potentiel fonctionne : pour l’autisme, il n’existe pas de prise de sang, d’analyse ou de mesure biologique permettant d’évaluer l’amélioration. Tout repose sur le comportement. C’est pour cette raison que l’étude doit être faite sur l’animal entier, qui peut montrer toute la palette de ses comportements sociaux, d’exploration et d’interaction. Ces observations sont indispensables pour faire avancer la compréhension de l’autisme et le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi pour être le plus faible possible, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables, conformément aux recommandations éthiques. De plus, toutes les manipulations seront réalisées exclusivement sur des souris mutantes, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés en évitant l’inclusion de groupes supplémentaires non nécessaires.
Raffinement
«Nous mettrons en œuvre des mesures de raffinement visant à limiter au maximum la douleur, l’inconfort et le stress des animaux tout au long du protocole. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie adaptée, et une analgésie sera mise en place afin de réduire la douleur péri- et post-procédurale. Une surveillance clinique renforcée sera assurée après les interventions et au cours des manipulations, avec l’application de points limites adaptés permettant d’interrompre la procédure ou de mettre en œuvre les mesures appropriées si l’état de l’animal le nécessite. Après la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (quatre souris par cage) et bénéficieront d’un enrichissement du milieu (matériel de nidification, cabane en carton). Les animaux seront habitués et manipulés quotidiennement par le même expérimentateur afin de réduire le stress lié aux manipulations. Comme l’autisme touche aussi bien les hommes que les femmes, nous utiliserons des animaux des deux sexes. Enfin, l’optopharmacologie constitue un raffinement supplémentaire, car elle permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle grâce à l’activation et l’inactivation réversibles du composé par la lumière, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, ce qui permet d’étudier facilement les difficultés d’interaction, un symptôme important observé dans l’autisme. Elles disposent aussi d’un répertoire de comportements variés, ce qui permet d’évaluer d’autres aspects liés à cette pathologie. Les troubles observés chez les souris utilisées comme modèle d’autisme sont suffisamment marqués pour vérifier que le modèle est pertinent et pour tester si certains traitements peuvent améliorer leur comportement. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), moment où leurs comportements sont pleinement développés et où les difficultés sociales sont bien établies.
Evaluation de l’efficacité de composés antiépileptiques sur un modèle rongeur d’épilepsie EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
165 souris vont être utilisées, chacune manipulée tous les jours pendant dix semaines, injectée environ dix-huit fois, opérée deux fois et transportée huit heures en camion entre deux établissements. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever des tranches de cerveau. Une épilepsie est provoquée chirurgicalement, des électrodes sont implantées au cours d'une intervention d'environ deux heures, et l'activité cérébrale est enregistrée en continu jour et nuit, le porteur indiquant trois à quatre crises par jour. Il situe l'apport du projet dans la sélection et l'orientation de composés candidats, en amont des premières étapes précliniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mesurer l’efficacité de molécules antiépileptiques dans un modèle d’épilepsie chez la souris. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs différents pour la création du modèle et la collection de datas. Des données récentes de la littérature scientifique indiquent que certains récepteurs neuronaux de l’hippocampe sont impliqués dans les mécanismes d’épilepsie temporale. L’hypothèse est que ces molécules anti-épileptiques que nous testerons vont alors cibler ces récepteurs afin de diminuer la fréquence et la sévérité des crises.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments antiépileptiques dans ce modèle. Nos techniques mise en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation des effets pharmacologiques sur le système nerveux central et sur ces explants de tissus vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie une analyse des crises focales partielles ; - D’obtenir des enregistrements sur animal vigile lors des crises et du repos, des crises épileptiques ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.
Procédures
Les animaux sont manipulés tous les jours pendant 10 semaines pour les pesées. (EU1/2) Ils sont injectés tous les quatre jours en SC soit environs 18 injections sur 10 semaines (EU1/2) et (EU2/2) Ils subissent deux chirurgies : *Induction d’épilepsies de 15 à 20 min et une heure post opératoire (EU1/2) *Implantation des électrodes d’enregistrement environ deux heures (EU1/2) Une période d’enregistrement de l’activité électrique cérébrale (sans fil) synchronisée à un enregistrement vidéo 24h/24, 7j/7. (EU1/2) Un transport entre les deux sites (camion spécialisé, 8h de trajet en une seule journée) Et enfin une anesthésie gazeuse durant 5 min maximum. (EU2/2)
Impact sur les animaux
Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables : La procédure peut par : *-l’hébergement individuel des animaux génère du stress ; *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables de types inflammation induration au site d’injection, *- des conséquences des chirurgies avec des déshydrations, des infections possibles ; *- L’implantation des électrodes peut provoquer de l’inconfort*- l’état épileptique provoques des crises épileptiques à une fréquence de 3 à 4 par jour, de courte durée inférieure à 2 minutes en temps cumulé et par jour.
Devenir
Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des antiépileptiques sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle..
Remplacement
Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car les modèles informatiques actuels ne nous permettent pas d’appréhender la complexité de ces connexions anormales observées lors des crises épileptiques.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole. Pour la partie ex vivo, nous réalisons des enregistrements multiples sur tranches de cerveau après mise à mort des animaux. Le même tissu étant utilisé pour plusieurs expériences d'électrophysiologie sur tranche, cela réduit le nombre d'animaux total nécessaire.
Raffinement
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Détection et compréhension de la signalisation des rétinoïdes à l’aide de sondes issues de la chimie click
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Un gavage de quelques secondes, une seule fois dans la vie de l'animal, suffit à justifier l'utilisation de 360 souris. Elles sont 900 en tout, toutes tuées pour prélever leurs organes, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 180 un niveau modéré, ces dernières subissant une chirurgie d'une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. L'objet est de cartographier dans les tissus les formes actives de la vitamine A grâce à des sondes chimiques, méthode que l'équipe a déjà validée en culture cellulaire. Le porteur affirme qu'un remplacement est impossible et retient des souris de quatre semaines, âge qui selon lui limite aussi la durée d'élevage en captivité.
Objectifs
La vitamine A est indispensable au développement et à la physiologie des organismes vertébrés. Les données de nombreuses études scientifiques ont révélé des fonctions extrêmement complexes des formes actives de cette vitamine, dans quasiment tous les types de tissus composant notre organisme. Un déséquilibre de sa signalisation est associé à diverses pathologies, y compris des déficits immunitaires, visuels, et des maladies neurodégénératives. On connait encore peu de choses sur les mécanismes sous-tendant le transport, la biodisponibilité et/ou le stockage des formes (molécules) actives de la vitamine A ou rétinoïdes dans les cellules de l’organisme. Il s’agit de petites molécules qui, à la différence des protéines, sont impossibles à détecter par les méthodes classiques d’analyses de cellules et tissus en histologie et microscopie. Notre équipe a consacré plusieurs années à développer une méthode novatrice pouvant permettre une telle détection. Brièvement, elle repose sur une méthode développée dans le domaine de la chimie du vivant, récompensée par un récent Prix Nobel de chimie. Dans notre cas, et en collaboration avec une équipe de pointe en chimie du vivant, nous avons produit par synthèse chimique des formes modifiées de la vitamine A, et avons prouvé que ces formes réagissent avec des molécules sondes détectables, par exemple, par fluorescence. Cette méthode a été validée en particulier dans des systèmes de culture cellulaire. Le projet va maintenant permettre, pour la première fois, de détecter et de cartographier ces molécules rétinoïdes dans l’organisme au niveau cellulaire grâce à l’histologie et à la microscopie à très haute résolution. De plus, il sera possible de déterminer les formes moléculaires précises de rétinoïdes produites in vivo dans les tissus, en analysant ces molécules capturées dans des extraits tissulaires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier de nouvelles molécules bioactives à fort potentiel pour le traitement ou le diagnostic de diverses maladies neurologiques. Les nouveaux outils validés dans le cadre de ce projet seront essentiels pour déterminer leur localisation avec une résolution au niveau de la cellule. De telles connaissances permettront d'étudier et de faire progresser de manière significative notre compréhension de la physiolopathologie de plusieurs troubles neurologiques dont la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington. En effet, des travaux scientifiques ont indiqué un lien possible entre la voie des rétinoïdes et les causes possibles de ces maladies. L’amélioration des connaissances sur le métabolisme et la distribution des rétinoïdes au sein des tissus de l’organisme pourraient donc aboutir (en agissant sur cette voie biologique) à des stratégies pour la prévention ou le traitement de ces maladies. Au-delà des connaissances spécifiques sur ces maladies, les données obtenues devraient faire progresser les connaissances sur l'absorption et la signalisation des vitamines. Les techniques et outils spécifiques validés dans le cadre de ce projet devraient être applicables à toutes petites molécules biologiques et à leur analyse dans un organisme vivant.
Procédures
Des souris non-génétiquement modifiées âgées de 4 semaines recevront l’administration d’un soluté par gavage oral. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois pour chaque animal, et ne durera que quelques secondes. Etant donné le nombre de molécules (solutés) et les temps post-administration à analyser, cet acte concernera 360 souris. D’autres souris seront soumises à des injections intra-péritonéales : 180 souris recevront une seule injection, 360 recevront une injection supplémentaire pour anesthésie générale, entraînant un endormissement rapide pour effectuer chirurgie terminale sans réveil et des prélèvements d'organes sans réveil. Chaque injection (seringue fine de type insulinique) ne durant que quelques secondes. Un acte chirurgical sera réalisé sur 180 animaux sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les administrations de solutés par voie orale ou intra-péritonéale peuvent générer un stress de courte durée et un inconfort pour les animaux. Les procédures n’ayant qu’une durée totale de 1 heure (minimum) à 24 heures (maximum), les animaux pourront être surveillés pour tout signe d’inconfort. Les solutés injectés ne comportent pas de principe (molécule) directement actif, ils ne sont pas de nature à avoir un effet indésirable dans le laps de temps précédant la mise à mort de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort, en vue du prélèvement et de l’analyse d’organes par des techniques de pointe.
Remplacement
Il n’est ici pas possible de remplacer le modèle animal, l’essence même du projet étant de pouvoir cartographier par une méthode novatrice, dans l’organisme et en condition de vie réelle - potentiellement jusqu’à l’échelle sub-cellulaire - les molécules et métabolites d’une voie de signalisation impliquée dans divers processus physiologiques ou pathologiques. Les données obtenues seront transposables et amélioreront les connaissances de ces processus dans l’espèce humaine.
Réduction
Dans notre projet nous utilisons un faible effectif d’animaux permettant toutefois d’effectuer des analyses statistiques (n=5). Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie. De plus, si l’une des deux voies d’administration des molécules rétinoïdes s’avérait plus efficace, elle sera immédiatement privilégiée, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En vue de raffiner les procédures, les injections seront exercées par un manipulateur expérimenté. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur aux animaux lors des administrations orales ou injections de solutés. Il s’agira de plus d’actes isolés ou répétés seulement 1 ou 2 fois pour les injections en vue d’anesthésie générale. Les procédures chirurgicales sont ainsi réalisées sous anesthésie générale par injection d’un mélange d’anesthésie et d’analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie des précautions sont prises pour protéger les yeux des animaux d’un éventuel dessèchement. Les animaux sont préservés du refroidissement généré par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Finallement, des points limites ont été définis et seront appliqués. A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort par un personnel expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce mammifère dont les processus physiologiques sont dans l’ensemble proches voire comparables à ceux de l’homme. Il s’agit aussi, et ceci est particulièrement important, d’un modèle pour lequel de nombreuses lignées génénétiquement modifiées ont été créées, modèles de mutations et/ou de processus pathologiques affectant les humains. Les résultats de notre étude pourront immédiatement servir de base pour une exploration des voies biologiques impliquant la vitamine A dans n’importe lequel de ces modèles, si les données de la recherche le justifiaient. Les procédures concerneront des animaux âgés de 4 semaines, âge auquel le développement post-natal des organes (particulièrement le cerveau) peut être considéré comme complet. Ceci minimisera la durée d’élevage des animaux en captivité.
Recherche de cibles thérapeutiques et évaluation de molécules dans des modèles murins de lymphomes B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Comprendre pourquoi les patients atteints de lymphome B répondent inégalement à un inhibiteur d'EZH2 conduit à greffer des cellules tumorales humaines sous la capsule du rein ou dans le fémur de 653 souris immunodéprimées. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de vingt minutes pour la greffe rénale ou de cinq minutes pour la greffe fémorale, des prises de sang hebdomadaires et un traitement par voie orale ou intrapéritonéale trois à cinq jours par semaine. L'atteinte des points limites est ici l'un des résultats mesurés : le porteur indique que des groupes de dix souris sont comparés par courbes de survie, ce qui suppose de laisser la maladie progresser jusqu'à ces seuils.
Objectifs
Parmi les cancers à cellules B, le lymphome folliculaire (LF) est le plus fréquent de ceux à évolution lente et le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGCB) de ceux à caractère agressif. Ils représentent un enjeu clinique majeur puisque le LF reste incurable et se transforme au fil du temps vers un profil plus aggressif de LDGCB chez plus de 20 % des patients. Les cellules tumorales du LF se caractérisent par une grande dépendance vis-à-vis des cellules les environnant, les cellules stromales qui soutiennent leur croissance. Les cellules tumorales du LF se caractérisent également par la présence de plusieurs mutations génétiques, notamment, environ 30 % présentent des mutations activatrices dans un gène appelé EZH2, qui joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes. Ces mutations provoquent des changements dans le comportement des cellules B, entraînant leur prolifération excessive et modifiant leurs interactions avec les cellules stromales de leur environnement. Actuellement, des inhibiteurs d'EZH2 sont en cours d'essais pour traiter ces lymphomes. Cependant, les résultats des traitements varient d'un patient à l'autre, sans que ces différences soient comprises. Mais nos résultats préliminaires in vitro suggèrent que ces différences de réponses au traitement pourraient être liées à la présence d'autres mutations touchant d'autres gènes de la régulation génique fréquemment associées aux mutations d’EZH2. Nos objectifs sont donc d’améliorer la compréhension de ces différences de réponses aux traitements observées chez les patients ainsi que de trouver et valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces lymphomes B. Ainsi nous aurons deux approches : une approche de criblage pour rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques pour impacter la croissance des cellules B tumorales, et une approche de caractérisation des réponses aux traitements du type inhibiteur d’EZH2 en des mutations présentes chez les patients.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir, grâce à ce projet, une meilleure compréhension des réponses hétérogènes des patients atteints de lymphome B suite aux traitements par les inhibiteurs d'EZH2 et ainsi pouvoir proposer une thérapie plus personnalisée en fonction du profil mutationnel des patients. Egalement, ces travaux pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (injection unique sous-cutanée en pré-opératoire de quelques secondes) : greffe de cellules tumorales sous la caspule du rein (la durée de la réalisation de l'ensemble de la greffe est estimée à 20 minutes) ou dans le fémur (la durée de la réalisation de l'ensemble de la greffe est estimée à 5 minutes). Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Les animaux pourront recevoir 3 à 5 jours par semaine un traitement par voie orale ou intrapéritonéale (1 minue).
Impact sur les animaux
Possible stress et douleur à la piqûre liés à l’anesthésie par agent chimique lors des chirurgies. Possible stress et douleur liés à la contention pour les traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille). Le développement tumoral peut entraîner un affaiblissement de l’animal, c’est pourquoi les souris expérimentées seront suivies régulièrement avec une attention particulière à la perte de poids, au comportement et à la mobilité des animaux.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes pour analyse.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de réponses aux traitements des lymphomes ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) qui est particulièrement crucial dans la cadre du lymphome folliculaire dont les cellules tumorales se caractérisent par une grande dépendance vis-à-vis des cellules les environnant : les cellules stromales qui soutiennent leur croissance. Cette compréhension passe donc par la mise en place et la caractérisation de modèles murins robustes et pertinents pour reproduire la pathologie humaine (utilisation de cellules tumorales humaines, implantation au site d'origine du cancer...).
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats exploitables, ainsi le nombre de souris par lot est adapté à chaque type d'analyse. Le nombre d'animaux peut être limité à 5 pour un groupe contrôle, être augmenté à 8 pour les mises au point et jusqu'à 10 pour permettre d'étudier la cinétique du développement tumoral (dissémination, atteinte des points limites) ainsi que la niche médullaire (cellules tumorales et stromales de la moelle osseuse). En effet, pour l'étude d'atteinte des points limites, un calcul d'effectif a été réalisé et a permis de déterminer que des groupes de 10 souris recevant les cellules modifiées comparés à des groupes de 10 souris recevant les cellules de référence étaient nécessaires pour visualiser la différence espérée. L'analyse des résultats d'atteinte des points limites sera ensuite réalisée par l'établissement de courbes de survies suivi d'une analyse statistique de rang. Egalement certains lots d'animaux sont optionnels, en fonction de résultats préalables ils seront réalisés ou pas. Enfin pour l'étude des combinaisons de mutations, 3 combinaisons par lignées tumorales seront étudiées dans un premier temps, puis seule la plus pertinente pour chaque lignée au vu des résultats sera conservée pour la suite des expérimentations.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • des conditions d'hébergement garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients • la formation du personnel, • un suivi adapté des animaux et des points limites pertinents permettant de détecter rapidement les signes de souffrance , • le recours à des anti-douleurs adaptés et aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (prévention de la sécheresse occulaire, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. Le stress sera également limité au maximum grâce à un enrichissement (coton, "maisons" en carton, boîtes à oeufs) et grâce à une habituation progressive à la manipulation.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, les lignées de souris immunodéprimées permettent la greffe de cellules tumorales humaines permettant ainsi de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront âgés de 7 à 12 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale.
Culture d’hépatocytes primaires murins : Formation des agents et application expérimentale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
200 souris vont être utilisées, anesthésiées puis ouvertes au niveau de l'abdomen et tuées avant tout réveil. Une injection intrapéritonéale précède l'endormissement, la paroi abdominale est ouverte et la veine cave perfusée pour récupérer les hépatocytes. Vingt souris sont utilisées pour former le personnel de l'animalerie au geste, les autres sont tuées pour prélever des cellules, à raison de trois par mois pendant cinq ans. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme l'expérimentation animale grâce aux organes sur puce, tout en affirmant que la souris est le "seul modèle utilisable" puisque les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir et varient d'un donneur à l'autre.
Objectifs
Dans l’idée de reconstituer in vitro des organes-sur-puce, nous aurons besoin de cellules provenant de foie de souris (hépatocytes primaires) car les lignées cellulaires de cellules du foie existantes reproduisent mal les caractéristiques de ces cellules primaires. Nous avons donc besoin de pouvoir obtenir des hépatocytes de la souris. Le but du projet est de former le personnel de l’animalerie pour installer la technique de récupération de ces hépatocytes primaires de souris pour ensuite les utiliser pour nos besoins expérimentaux pour le développement de multiorganes-sur-puces in vitro reproduisant les interactions inter organes dans le corps entier et permettra par la suite de réduire l’expérimentation animale pour l’étude des communications inter-organes car les cellules d’une souris permettent de construire plusieurs organes-sur-puces.
Bénéfices attendus
Deux bénéfices sont attendus : Installation de la technique d’isolement des hépatocytes de souris . Développement d’un multiorgane-sur-puce pour la diabétologie
Procédures
Aucune expérimentation ne se fera sur animal vigile, les nuisances pour les animaux dans ce projet seront les injections intrapéritonéales qui seront suivie d’une chirurgie sans réveil, le temps d’endormissement sera de 5 à 10 min (vérifié par pincement de la patte, et réadministration d’anesthésique si réaction), l’ouverture de la paroi abdominale jusqu’à la perfusion de la veine cave durera 1 à 2 min maximum, au moment de la section de la veine porte, la souris ne sera plus vivante : arrêt de la circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Aucune nuisances ou effets indésirables ne sont attendus du vivant de l’animal qui sera hébergé dans des conditions habituelles à 5 animaux par cage, la procédure effectuée sur ces animaux sera sans réveil (après analgésie et anesthésie profonde).
Devenir
Procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Les lignées cellulaires de foie reproduisent mal les caractéristiques fonctionnelles des cellules natives. Les cellules de foie humaines sont difficiles à obtenir, ont une très grande variabilité inter-donneurs, et ne permettent pas d’investiguer des modèles transgéniques. Les souris sont donc le seul modèle utilisable dans ce projet. Nous aurons un besoin régulier en cellules de foie natives de souris (3 par mois maximum), les cultures ayant une durée de vie autour de 4 jours.
Réduction
S’agissant ici d’une procédure pour formation de personnel dans le but d’obtenir ensuite des cellules de foie primaires sur 5 ans, le nombre minimum de souris pour permettre aux agents de se former a été estimé à 20 (comprenant le nombre de souris utilisées par le formateur ainsi que les nouveaux-formés). Le reste des animaux servira à nous fournir ensuite en cellules (3 fois par mois maximum) pour nos besoins expérimentaux sur la durée du projet. Ce projet permettra in fine d'utiliser moins d'animaux en expérimentation car une souris peut fournir assez de cellules de foie pour environ 5 organes-sur-puces. Les organes-sur-puce comme ceux développés dans ce projet permettront, à terme, de répondre à un plus grand nombre de questions scientifique du fait de l'environnement contrôlé de la culture primaire en évitant les facteurs confondants et les compensations qui existent in vivo. Bien évidemment, nous utiliserons strictement le nombre d’animaux nécessaire dans un souci de « réduction » et le développement du modèle 4-organes-sur-puce pourrait prendre moins de 5 ans et utiliser moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront regroupés à 5 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi par des dômes, tunnel, morceau de bois, maison rouge, coton de nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Lors de l’utilisation des animaux pour récupérer les cellules du foie, une solution d’analgésique leur sera administrée 30min avant l’anesthésie. La profondeur de l’anesthésie sera mesurée par vérification des paramètres et constantes de suivi de la narcose chez le rongeur.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle animal car c’est un mammifère relativement proche phylogénétiquement et physiologiquement de l’Homme qui permet l’accès à un maximum de modèles transgénique par la suite lorsque le multiorgane-sur-puce sera mis au point. Les cellules primaires de foie seront récupérées sur souris C57BL/6J mâles et femelles de 6 à 15 semaines.
Amélioration de l’efficacité des traitements par thérapie cellulaire dans le lymphome B MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées puis soumises à une lymphodéplétion chimique pour accepter la greffe, les souris de ce projet portent un lymphome B implanté. Elles sont 1 152, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, une irradiation, une injection de cellules CAR-T, des injections d'inducteur et d'anticorps, puis une prise de sang. Le porteur indique que les souris traitées contrôlent d'abord la tumeur avant de rechuter, ce qu'il présente comme une bonne reproduction de l'échec observé chez la moitié des patients, et conclut à la mise à mort de tous les animaux pour analyser leurs tumeurs.
Objectifs
Les lymphomes B représentent le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde occidental et le 9ème cancer le plus mortel. Il touche environ 15 000 personnes par an en France. Malgré les progrès des traitements conventionnels (chimiothérapie, immunothérapie), une part significative des patients ne répond pas aux traitements ou rechute quelques mois après. La première ligne de traitement repose sur de la chimiothérapie. En cas de non-réponse à ce traitement, la deuxième ligne de traitement repose sur une immunothérapie dite de thérapie cellulaire génique : les cellules CAR-T : des lymphocytes T du patient reprogrammés au laboratoire puis réinjectés. Ce protocole a pour but d’aider le système immunitaire du patient à reconnaître et tuer les cellules tumorales . Ce traitement à été révolutionnaire, mais encore 50% de ces patients ne répondent pas ou rechutent rapidement. Il a été démontré un épuisement rapide de ces cellules CAR-T après l’injection chez le patient, qui peut être expliqué par un microenvironnement tumorale très immunosuppressif notamment causée par un certain compartiment du système immunitaire, les cellules myloides. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser l’efficacité des cellules CAR-T afin d’augmenter le taux de succès qui est actuellement de 50%.
Bénéfices attendus
Modification : Pour le lymphome (1) , nous avons réalisé différents protocoles incluant différentes concentrations de CAR-T cells. Nous avons démontré que 6x10^5 CAR-T était la concentration la plus adéquate afin d’avoir un contrôle tumoral maximal. Cependant, certaines souris répondent de manière partielle avec une rechute systématique de la tumeur. Ainsi notre modèle murin actuel reproduit bien ce qui se passe chez l’homme, le traitement par cellules CAR-T est efficace initialement, mais les souris vont présenter une rechute. Pour le lymphome (2) la quantité de CAR-T cells injectée se base la littérature. Ces modèles permettent donc d’évaluer des stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la réponse au traitement des Lymphome Diffus à Grandes Cellules B indépendemment de leur origine génétique. L’idée d’une partie de ce projet est ainsi de modifier ces CAR-T et d’étudier cette nouvelle dynamique de contrôle tumorale. Le bénéfice sera de trouver la nouvelle version du CAR-T permettant un contrôle tumoral maximal et ainsi obtenir une meilleure survie chez l’animal, sans rechute. Fin de modification
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux incluront : Injection unique de cellules tumorales (durée : 1 minute, anesthésie locale). Irradiation (durée : 5 minutes, vigile sans anesthésie car non douloureuse). Injection de cellules CAR-T (durée : 2 minutes).sous anesthésie générale . Injection de l'inducteur (Durée 1 min sous anesthésie anesthésie locale). Injection des Anticorps ( Durée 1 min, anesthésie locale). Prise de sang unique (durée : 2 minutes, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Modification Les animaux auront un type de cancer appelé lymphome, ce qui peut entraîner fatigue, perte de poids modérées. L'irradiation à faible dose et la lymphodépletion avec injection de cyclophosphamide sont bien tolérée et ne provoque pas d’augmentation des infections. Le syndrome de libération de cytokines a été jugé modéré dans les études précédentes et sera surveillé attentivement. Fin de modification
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en raison de la présence de tumeurs et afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour : •Étudier l’interaction entre la totalité du microenvironnement tumoral et les cellules CAR T. •Il est également intéressant d’étudier les différentes populations immunitaires (notamment compartiment myéloide) dans la moelle osseuse et leur dynamisme après l’injection des CAR-T •Observer l’impact de la modulation du compartiment myéloïde sur la réponse tumorale. Ces différentes études cruciales ne peuvent pas être réalisées par des modèles in vitro ou ex vivo. Il faut pour cela un organisme entier. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro ou d’organoïdes associant cellules tumorales, cellules myéloïdes et cellules CAR-T. L’ensemble des publications dans ce domaine repose sur de l’expérimentation animale. Des modèles organoïdes sont effectivement importants à développer, mais ne sont actuellement pas du tout disponibles.
Réduction
Le nombre de souris est limité au minimum possible. Un calcul de puissance a permis de déterminer ce nombre. L’utilisation de logiciels d'aide à la conception et de statistiques nous ont permis d’optimiser ces données. Des méthodes statistiques seront également utilisées pour exploiter les résultats.
Raffinement
Toutes les interventions (greffes) des procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections simples seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des points limites stricts ont été définis et seront appliqués. La surveillance des animaux en procédure sera faite par un examen clinique quotidien.
Choix des espèces
- Génétique proche de celle de l’Homme. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines.