Souris

Jusqu'à quatorze injections dans l'abdomen par animal, pratiquées sur souris vigiles à raison d'une toutes les deux semaines, plus jusqu'à quatre prélèvements sanguins : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le résumé qualifie ces gestes de "stress transitoire" et de "douleurs légères à modérées", tout en indiquant que certains composés injectés peuvent altérer le comportement de l'animal. Les souris dont la réponse immunitaire est jugée la meilleure sont tuées les premières pour prélever les organes produisant les anticorps, les autres restant en hébergement quatre à huit semaines et pouvant recevoir un nouveau cycle de vaccination avant leurs propres "prélèvements terminaux". Ce maintien en vie assorti d'une seconde immunisation figure dans la rubrique consacrée à la réduction des effectifs.

Objectifs

Les anticorps sont des protéines sécrétées par des cellules spécialisées du système immunitaire qui s’attachent aux substances étrangères au corps (bactéries, virus), appelées antigènes, afin de les neutraliser dans le but d'être évacuées ou détruites par d’autres composants du système immunitaire. Ces antigènes sont gardés en mémoire par le système immunitaire, permettant de réagir plus rapidement en cas de nouvelle exposition. Depuis les années 1980, le développement d'anticorps a profondément amélioré les traitements thérapeutiques dans de nombreuses pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Les premiers anticorps utilisés en médecine étaient produits chez la souris et pouvaient provoquer des effets secondaires importants mais ils étaient précurseurs d'une révolution dans les soins. Grâce aux progrès des biotechnologies et du génie génétique, il est aujourd’hui possible de développer des anticorps modifiés de plus en plus proches des anticorps humains, ce qui réduit fortement les effets indésirables. Plus d’une centaine d’anticorps thérapeutiques sont désormais utilisés en médecine et de nombreux autres sont en cours de développement. Malgré ces avancées, le développement de nouveaux anticorps reste long et complexe. L’une des principales difficultés est le délai entre l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique potentielle par les laboratoires publics ou privés et la possibilité de tester cette cible en clinique. Ce projet s’inscrit dans la première étape de découverte des anticorps à visée thérapeutique et vise à accélérer la découverte et la sélection de nouveaux anticorps thérapeutiques avant leur évaluation dans des études précliniques.

Bénéfices attendus

Le projet faisant l’objet de cette demande permettra la découverte et l’obtention rapide d’un panel de nouveaux anticorps d’intérêt thérapeutique notamment dans le cancer et les maladies inflammatoires.

Procédures

- Des injections dans l’abdomen réalisées sur animaux vigiles en 2 min maximum/animal à une fréquence d’une injection toutes les 2 semaines durant 6 à 8 semaines. Toutes les souris du projet seront concernées. Nous envisageons que cela correspondrait à 1500 animaux. En fonction de la stimulation du système immunitaire, des injections supplémentaires peuvent être nécessaires suivant la même procédure. - Des injections en intraveineuse réalisées à l’ animal en 2 à 4 min sous anesthésie. Nous évaluons que cela correspondrait entre 150 et 300 animaux. - Des prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux vigiles à une fréquence de toutes les 2 semaines (6 jours après chaque injection dans l’abdomen à partir de la deuxième injection). Cette opération est réalisée en 2-3 min maximum/animal. Toutes les souris du projet seront concernées, soit 1500 animaux au maximum.

Impact sur les animaux

Suite aux procédures que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir : - du stress transitoire lié à la contention nécessaire à la réalisation des injections (de 4 jusqu’à 14 injections par animal) et des prélèvements sanguins (jusqu’à 4 prélèvements par animal maximum). - des douleurs légères à modérées dues au mode d’injection et à l’injection de certains composés pouvant altérer le comportement de l’animal.

Devenir

Les animaux présentant les meilleurs résultats seront choisis pour réaliser les étapes finales de la procédure. Seuls les animaux sélectionnés seront euthanasiés afin de prélever les organes produisant les anticorps et réaliser les étapes suivantes de recherches d'anticorps. Les animaux restants seront gardés et surveillés en hébergement durant 4 ou 8 semaines supplémentaires jusqu’à obtenir les résultats à partir des premiers animaux. Si les premiers résultats ne permettent pas d’identifier des anticorps d’intérêts, les animaux conservés pourront recevoir un nouveau cycle de vaccination, dans le but de renforcer la réponse immunitaire avant la réalisation des prélèvements terminaux. Si les résultats de séquençage sont concluants, les animaux seront euthanasiés dès que possible.

Remplacement

L’utilisation des animaux reste indispensable pour développer de nouveaux anticorps thérapeutiques. En effet, aucun autre modèle biologique ou chimique ne permet actuellement de produire des molécules de structure aussi complexe et variée. Les biotechnologies ne permettent pas de mimer ou reproduire totalement la réponse "anticorps" du système immunitaire rendant l’utilisation d’animaux encore indispensables pour la découverte de nouveaux anticorps comme de potentiels médicaments en immunothérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérience sera déterminé à partir des données scientifiques disponibles concernant la cible d’intérêt thérapeutique afin d’évaluer la complexité de la cible et la nécessité d’effectuer plusieurs stratégies de vaccination. Toutes les procédures expérimentales seront recensées numériquement permettant une traçabilité et un suivi des expériences menées. Ce suivi comprendra notamment les souris utilisées, les antigènes testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite. Une attention particulière sera portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les souris non sélectionnées pour les étapes finales du protocole (prélèvement d'organes) seront conservées. Si les premiers résultats ne permettent pas d’identifier des anticorps d’intérêts, les animaux conservés pourront recevoir un nouveau cycle de vaccination, dans le but de renforcer la réponse immunitaire avant la réalisation des prélèvements terminaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (mini-dôme en cellulose et lanières en papier kraft pour former des nids), maintien des animaux en groupes de 3 à 4 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours à l'anesthésie gazeuse lors de certains gestes techniques. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesée 2 fois par semaine en temps normal et quotidiennement en cas d’apparition de signes importants de douleur chez l’une des souris du protocole. Si un état persistant de douleur durant plus de 2 jours été observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux euthanasiés de manière anticipée après atteinte d'un point limite ne feront pas l'objet de prélèvements, leur état clinique pouvant compromettre la qualité des tissus et des cellules recherchés.

Choix des espèces

La souris reste l’animal le plus utilisé pour le développement d’anticorps à visée thérapeutique, car le génome de la souris est proche de l’homme à 95%. Le développement d’anticorps thérapeutiques par modification génétique est basé sur des anticorps d’origine murine. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation. Pour les modèles génétiquement modifiés difficiles à générer, une tolérance de 8-12 semaines sera admise. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation. Pour les modèles transgéniques ou KO difficiles à générer, une tolérance de 8-12 semaines sera admise.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection sous anesthésie générale puis dix injections sur animal vigile, et celles portant la tumeur TC-1 quatorze anesthésies générales de plus pour le suivi par imagerie, la croissance tumorale et l'immunothérapie pouvant entraîner une perte d'appétit et de poids. L'objet est de reproduire par une combinaison d'anticorps les signaux qu'émettent les cellules tumorales mourantes, afin de renforcer une immunothérapie déjà employée en clinique. Les retombées annoncées contre le cancer du poumon sont placées à long terme, quand le porteur affirme dans le même résumé qu'aucune technologie ne permet de reconstruire un système immunitaire fonctionnel hors de l'animal, et que le recours à "un organisme complet fonctionnel (la souris)" est "indispensable".

Objectifs

Certaines thérapies anticancéreuses induisent une mort cellulaire immunogène (immunogenic cell death, ICD), une forme de mort cellulaire régulée capable de déclencher une réponse immunitaire antitumorale durable grâce à l’émission coordonnée de signaux de danger (damage-associated molecular patterns, DAMPs. Nous avons démontré, dans un projet précédent, qu’une reconstitution de ces signaux de danger grâce à des lignées cellulaires génétiquement modifiées est suffisante pour induire une mémoire immunitaire durable et renforcer la sensibilité des tumeurs au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1. Fort de ces résultats mécanistiques, nous développerons une stratégie thérapeutique visant à reproduire pharmacologiquement les fonctions immunostimulatrices de ces signaux. Nous évaluerons une combinaison d’anticorps monoclonaux anti-CD47 et anti-CD39 associée à un agoniste de HMGB1 (RS-09) afin de reproduire in vivo les principales conséquences immunologiques induites par les DAMPs. Cette approche sera systématiquement combinée au blocage du point de contrôle immunitaire PD-1, dans un contexte thérapeutique directement compatible avec la pratique clinique et présentant ainsi un potentiel translationnel nettement supérieur à celui d’approches reposant sur des cellules tumorales génétiquement modifiées (projet précédent). Démontrer l’efficacité de cette combinaison sur la croissance tumorale constituera ainsi une validation préclinique robuste de notre stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace avec l’utilisation de combinaison d’anticorps et d’agoniste. Nous pourrons mettre aussi en évidence que cette stratégie sera possiblement applicable contre plusieurs types de cancer. À long terme, cela permettra le développement de nouvelles immunothérapies combinatoires contre le cancer du poumon, plus adaptées aux patients et beaucoup mieux tolérées.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations et injections) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est indispensable car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements par l'activation du système immunitaire. De nos jours, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles. Il n’y a, en effet, aucune technologie existante qui le permette. C’est pourquoi le recours à un projet sur un organisme complet fonctionnel (la souris) est indispensable.

Réduction

Une analyse statistique a été réalisée pour calculer le nombre d'animaux requis. Plusieurs paramètres seront suivis sur chaque animal (croissance tumorale, survie) et plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) afin d'extraire un maximum de données pour cette expérience. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Nous avons établi une grille de score regroupant les critères relatifs au bien-être de l’animal, elle sera utilisée tout au long du projet, les points limites précoces y ont été définis et seront strictement appliqués. Par ailleurs, des mesures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme et disposant de nids et de tunnels en carton. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou non selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Les points d’injections pour les traitements seront alternés d’une fois à l’autre.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - La souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 semaines pour s'assurer que l'organisme a terminé son processus de développement et que le système immunitaire est pleinement fonctionnel.

L'objet de ce projet est d'amplifier chez des souris une lignée de cellules tumorales humaines qui ne prolifère pas en culture, sans qu'aucun traitement y soit évalué. 50 souris immunodéprimées NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection de cellules de lymphome T angioimmunoblastique sous anesthésie, puis jusqu'à dix prélèvements sanguins rétro-orbitaires hebdomadaires, pendant un à trois mois, jusqu'à ce que la tumeur atteigne "le maximum tolérable". La rubrique consacrée à la réduction ne justifie que 6 souris, et le résumé n'explique nulle part d'où viennent les 44 autres.

Objectifs

Le système CRISPR/Cas9 est dérivé du système immunitaire bactérien. Il repose sur l’utilisation d’une nucléase Cas9 associée à un ARN guide (ARNsg) complémentaire d’une séquence cible de 20 nucléotides, permettant d’induire des cassures double brin dans l’ADN et ainsi d’inactiver spécifiquement le gène ciblé. Cette technologie peut être appliquée à l’échelle du génome entier dans le cadre de criblages CRISPR, permettant l’étude fonctionnelle systématique des gènes. Les criblages CRISPR constituent aujourd’hui un outil majeur pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, les modèles actuellement utilisés reposent principalement sur des lignées cellulaires établies, qui reproduisent imparfaitement la complexité biologique des tumeurs humaines et ne sont pas disponibles pour certaines entités tumorales. Notre projet porte sur le lymphome T angioimmunoblastique, qui représente l’une des formes les plus fréquentes de lymphome T périphérique. Cette pathologie correspond à une prolifération maligne de lymphocytes T et demeure associée à un pronostic défavorable, avec une survie globale à 5 ans d’environ 70 %. Les options thérapeutiques restent limitées, notamment en raison de l’absence de modèles expérimentaux adaptés et de lignées cellulaires disponibles pour cette pathologie. Afin de contourner ces limitations, nous utiliserons des modèles de xénogreffes dérivées de patients (Patient-Derived Xenografts, PDX), consistant en la transplantation sériée de cellules tumorales humaines chez des souris immunodéprimées. Les cellules tumorales seront modifiées génétiquement afin d’exprimer la nucléase Cas9 ainsi que des ARNsg. Ces cellules ne pouvant pas être amplifiées efficacement in vitro, leur passage chez la souris est indispensable pour assurer leur expansion. L’objectif du projet est donc d’amplifier une lignée de PDX de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la Cas9 afin de disposer, à terme, d’un modèle compatible avec la réalisation de criblages CRISPR in vivo. Ces travaux pourraient permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer au développement de stratégies visant à améliorer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’amplifier une lignée de xénogreffe dérivée de patient (PDX) de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la nucléase Cas9 et des ARN guides (ARNsg). Ce modèle présente un intérêt particulier en raison de l’absence actuelle de lignées cellulaires disponibles pour cette pathologie. À terme, ce modèle pourra être utilisé pour la réalisation de criblages CRISPR in vivo visant à identifier des gènes impliqués dans la progression tumorale, ainsi que des gènes suppresseurs de tumeur. Ces travaux pourraient ainsi conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans le lymphome T angioimmunoblastique.

Procédures

Après une période d’acclimatation, les souris recevront une injection unique de cellules tumorales par voie sous-cutanée (J0), réalisée sous anesthésie générale à l'isoflurane, ce qui provoquera le développement d’un lymphome. L'injection dure moins d'une minute et la durée totale de la manipulation, incluant l'induction anesthésique et le réveil, est d'environ 3 à 5 minutes. À partir de deux semaines après l'injection (J14), des prélèvements sanguins rétro-orbitaires seront réalisés une fois par semaine sous anesthésie générale de courte durée et ajout d’un collyre analgésique à base de tétracaïne, afin de suivre la progression de la maladie. Chaque prélèvement dure moins d'une minute et la durée totale de la manipulation, anesthésie comprise, est d'environ 3 à 5 minutes. Les animaux seront suivis pendant une durée comprise entre 1 et 3 mois, selon la cinétique de développement tumoral. Chaque animal fera l’objet d’un maximum de 10 prélèvements sanguins de 40µl avant sa mise à mort. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale lorsque les critères d'arrêt de l'étude ou les points limites seront atteints (Annexe). La mise à mort sera réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Nous allons injecter des cellules tumorales soit par voie sous cutanée soit par voie intrapéritonéale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour suivre l'évolution des cellules tumorales. Nous sacrifierons les souris sous anesthésie par dislocation cervicale, cela ne leur provoquera donc pas de douleur.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral atteindra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines (durée la plus couramment publiée) puis mises à mort pour analyse.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire adapté au lymphome T angioimmunoblastique. Cette pathologie présente des caractéristiques biologiques complexes et hétérogènes qui rendent difficile le développement de modèles in vitro représentatifs. L’absence de lignées cellulaires limite l’étude des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Par ailleurs, les cellules issues des modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) de lymphome T angioimmunoblastique ne prolifèrent pas en conditions in vitro. Il est donc nécessaire de recourir à un modèle animal afin d’assurer leur amplification et le maintien du modèle tumoral. Les souris immunodéprimées, notamment les modèles NOD/SCID ou NSG, présentent une déficience en cellules immunitaires (cellules T, B, et NK pour les NSG) permettant l’implantation et la croissance de cellules tumorales humaines. Ces modèles reproduisent de manière fidèle les caractéristiques biologiques et moléculaires du lymphome T angioimmunoblastique humain et constituent ainsi un outil pertinent pour l’étude de cette pathologie. Enfin, l’utilisation de ce modèle est indispensable pour le développement ultérieur de criblages CRISPR in vivo visant à identifier des gènes impliqués dans la progression tumorale ou des gènes suppresseurs de tumeur, dans l’objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En résumé, le recours à la souris est nécessaire pour permettre l’amplification stable d’une lignée PDX de lymphome T angioimmunoblastique exprimant la nucléase Cas9 et des ARN guides (ARNsg), en l’absence d’alternative in vitro adaptée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé sur la base d’un taux de prise de greffe d’environ 50 %, observé dans les modèles PDX de lymphomes T, de la variabilité du rendement de transduction lentivirale des cellules tumorales, des pertes cellulaires associées aux manipulations ex vivo, ainsi que de la nécessité d’obtenir une quantité suffisante de cellules tumorales exprimant de manière stable la nucléase Cas9 et les ARN guides (ARNsg) pour permettre l’amplification du modèle. L’objectif étant d’obtenir un à deux modèles PDX exploitables exprimant de manière stable la Cas9 et les ARNsg, 6 souris seront utilisées afin de tenir compte des échecs de prise de greffe et des pertes expérimentales potentielles, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés conformément au principe de réduction des 3R.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur (Annexe 2). Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si des signes cliniques apparaissaient, les animaux seront mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton et/ou du coton.

Choix des espèces

En l’absence de modèles in vitro adaptés au lymphome T angioimmunoblastique, le recours à un modèle animal est nécessaire pour l’étude de cette pathologie. Le modèle murin est actuellement le modèle de référence le plus largement utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des lymphomes humains, notamment dans le cadre des modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Les souris immunodéprimées de type NSG (NOD scid gamma) présentent une déficience sévère du système immunitaire, incluant l’absence de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK. Cette immunodéficience permet l’implantation et le maintien de cellules tumorales humaines tout en limitant les phénomènes de rejet de greffe. Ces modèles reproduisent de manière pertinente les caractéristiques biologiques et moléculaires du lymphome T angioimmunoblastique humain et constituent ainsi un outil expérimental adapté pour l’amplification des cellules tumorales modifiées génétiquement ainsi que pour le développement futur de criblages CRISPR in vivo. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome T angioimmunoblastique dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte.

La lignée employée porte la délétion d'un gène dont l'absence tue environ la moitié des souris femelles porteuses autour de la naissance, les survivantes pesant près de 10 % de moins que les autres. 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue du maintien de la lignée. Les femelles knock-out sont accouplées jusqu'à l'âge de six mois, le porteur ne déclarant d'autre intervention que la mise en reproduction et l'observation quotidienne des gestations et des naissances. Il ajoute que le prélèvement de tissus d'embryons se situe hors du champ réglementaire, ce qui place ces souris hors des 480 déclarées.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre le rôle d'une protéine dans l'inactivation du chromosome X (ICX), mécanisme indispensable au développement normal des mammifères femelles, qui possèdent deux chromosomes X et doivent en éteindre un pour éviter une double dose de gènes. Des travaux récents ont montré que cette protéine est cruciale pour l'organisation des régions chromatiniennes compactées et peu actives : son absence perturbe l'organisation de l'ADN, modifie l'expression génique et altère la plasticité cellulaire. De façon frappante, un modèle murin knock-out pour ce gène révèle une létalité spécifique aux femelles autour de la naissance et un poids de naissance réduit, suggérant un défaut d'ICX en l'absence de cette protéine, avec des conséquences sur le développement de l'embryon et du placenta, un tissu où le contrôle du chromosome X est plus fragile. Le projet comporte deux objectifs : analyser l'impact de la perte de cette protéine sur l'ICX au cours du développement embryonnaire (Objectif 1), puis étudier ses effets sur le développement des embryons mâles et femelles, en se focalisant sur le placenta (Objectif 2) afin de mieux comprendre comment l'organisation nucléaire du chromosome X inactif conditionne des étapes clés du développement et la spécialisation cellulaire.

Bénéfices attendus

Le bon déroulement de ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le développement embryonnaire et extra-embryonnaire, les différences entre les sexes et le contrôle épigénétique des gènes. Cela pourra avoir des implications futures en médecine régénérative et de la reproduction, mais aussi en oncologie où notre protéine candidate est utilisée comme biomarqueur. Ce projet nous permettra d’approfondir nos connaissances sur les dimorphismes sexuels, et ouvrira de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement des cancers en prenant en compte le sexe des patients.

Procédures

Les femelles dans lesquelles notre gène candidat a été enlevé seront utilisées pour maintenir la lignée dans notre animalerie. Elles seront utilisées jusqu'à leur 6 mois, exclusivement pour les accouplements. Les animaux seront donc soumis à des interventions limitées, principalement liées au maintien de la lignée et à l’étude du développement : - Mise en reproduction Les souris adultes seront placées en reproduction de manière contrôlée. Cette étape consiste à héberger un mâle et une femelle ensemble. - Suivi des gestations et des naissances Les femelles gestantes seront observées quotidiennement (quelques minutes par jour) afin de suivre le bon déroulement de la gestation et des naissances. - Phénotype lié au modèle génétique Le modèle étudié entraîne des effets sur le développement : environ 50 % des femelles porteuses de la modification génétique ne survivent pas autour de la naissance, et les individus survivants présentent un poids légèrement inférieur à la normale (~10%). Ces effets sont inhérents au modèle et ne résultent pas d’une intervention expérimentale directe.

Impact sur les animaux

La mort périnatale arrive régulièrement et ne touchera qu'un huitième de la portée en moyenne, ne devant pas générer de stress excessif chez les mères. Les femelles KO qui survivent montrent un décifit de poids de 10% dont on ne connaît pas la cause à ce jour, cependant ces souris présentent un comportement similaire aux souris sauvages (fertilité et durée de vie).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure de maintien de lignée. Par contre, les animaux utilisés pour prélèvement de tissus d'embryons est hors champ réglementaire.

Remplacement

Notre travail se base sur des données produites en amont sur des modèles de culture cellulaire (cellules souches embryonnaires femelles). L'extinction de l'expression des gènes sur le chromosome X ou inactivation du chromosome X, est un mécanisme crucial, qui n'a lieu que chez les mammifères. Il n'existe pas aujourd'hui de modèle cellulaire adéquat pour l'étude de l'embryon avant implantation. Le laboratoire de nos collaborateurs développe actuellement de nouveaux modèles de cellules souches pour réduire dans le futur l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le maintien de la lignée est réalisé avec le nombre minimal de cages reproductrices, afin de limiter la production d’animaux surnuméraires. Les croisements sont planifiés en fonction des besoins expérimentaux, et les animaux produits sont utilisés à la fois pour le maintien de la colonie et pour les analyses, afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque individu.

Raffinement

Nous prenons soin d'effectuer une manipulation minimale des animaux vivants. Nos expériences portent uniquement sur l’accouplement des animaux transgéniques dans le but de maintenir la lignée où notre gène d'intérêt a été délété. Des balles de coton pour permettre la réalisation de nids et « cabanes » de carton pour leur permettre de se regrouper à l’abri de la lumière quand elles le désirent leur seront fournis. Autant que possible, nous regrouperons les animaux afin qu’ils bénéficient de conditions de vie les plus proches de celles de leur espèce.

Choix des espèces

Ce projet vise à comprendre le rôle de notre protéine d'intérêt dans l'extinction de l'activité des gènes sur le chomosome X et son maintien pendant certaines étapes embryonnaires de la souris (jours 12,5-18,5 après conception). Les approches expérimentales ne sont pas envisageable chez l'humain (embryon) et le modèle animal suffisamment proche et connu est le modèle souris. En effet, l'extinction de l'activité des gènes sur le chomosome X est spécifique aux mammifères. Le modèle souris constitue le modèle de choix pour de nombreuses raisons. 1) Le modèle mammifère est obligatoire. 2) la connaissance de la génétique et du génome murin est essentielle. 3) Les souris sont un modèle d'étude aisé car le taux de reproduction est élevé, les générations rapides et la production d'embryons maîtrisée. 4) les modèles transgéniques murins utiles à notre étude sont déjà existants. 5) De nombreuses données transcriptomiques ont déjà été obtenues au laboratoire sur des modèles souris proches et constituent une base de connaissance nécessaire pour ce projet. 6) Enfin, des méthodes alternatives (études in cellulo et in vitro) complémentaires seront conduites mais ces approches ne peuvent pas se substituer à l'utilisation d'animaux.

Cinquante-deux semaines de régime enrichi en graisses, en sucres et en cholestérol, l'ablation des deux ovaires, quarante-quatre heures en cage individuelle : 4 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. S'y ajoutent six prises de sang à la joue après six heures de jeûne, quatre échographies cardiaques sous anesthésie, des gavages ou injections suivis d'une incision de la queue et d'un prélèvement toutes les quinze minutes pendant deux heures. L'objet déclaré est de comprendre pourquoi les œstrogènes protègent les femmes des maladies chroniques du foie, en supprimant ces hormones chez des souris femelles pour observer ce qui se passe ensuite. Le porteur écrit que la souris est le "meilleur modèle expérimental" parce que des lignées transgéniques dépourvues des deux protéines étudiées existent déjà dans le foie.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 38% de la population mondiale. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans cet organe. Ce stade précoce et bénin peut évoluer vers des stades plus graves, caractérisés par une inflammation et une fibrose conduisant à une dysfonction de l’organe. L’ensemble de ces atteintes hépatiques chroniques, nommées hépatopathies métaboliques (HM), représentent la première cause de transplantation de foie et sont associées à des complications cardiaques. Comprendre les mécanismes contrôlant la progression des HM est crucial pour identifier les patient(e)s à risque et développer des traitements préventifs et/ou curatifs actuellement inexistants. Les données cliniques et scientifiques montrent que les femmes sont protégées de la survenue et de la progression de ces HM et de leurs complications grâce aux hormones sexuelles féminines, les œstrogènes. Dans ce projet nous souhaitons déterminer le rôle de 2 protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie dans la progression des HM. Ce projet permettra de comprendre la fonction des hormones sexuelles à l’origine des différences liées au sexe dans la susceptibilité aux HM. Il nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire, car, à l'heure actuelle, les modèles et lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de reproduire la complexité du système hormonal et ne conservent pas leurs caractéristiques sexuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera donc des connaissances essentielles permettant de comprendre les mécanismes protégeant les femmes du développement de ces maladies. Il permettra l’élaboration de stratégies thérapeutiques préventives et /ou curatives adaptées au sexe contre ces atteintes hépatiques qui représentent aujourd'hui la première cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux anesthésiés subiront une opération chirurgicale de 15 minutes avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire – La moitié des animaux auront une alimentation riche en graisse et en sucre pendant 52 semaines et seront hébergés à thermoneutralité - les animaux vigiles seront placés en isolement pendant 90 à 120 secondes, à trois reprises - A 6 reprises nous serons amenés à effectuer des prises de sang à la joue des souris vigiles après 6 heures de jeûne (1 minute par animal) – A 4 reprises, les animaux anesthésiés auront une échographie cardiaque d’environ 10 minutes pour chaque animal - Les animaux vigiles recevront soit un gavage soit une injection d’une durée de 20 secondes par animal suivi par une incision au niveau de la queue et le prélèvement d’une goute de sang toutes les 15 minutes sur une durée totale de 2h - A 2 reprises les animaux seront transportés dans leurs cages d’origine dans un autre établissement (durée inférieure à 10 minutes) - Les animaux seront mis dans des cages individuelles pour une durée totale de 44 heures. « A la fin de l'expérimentation une prise de sang sur chaque animal vigile sera effectuée et, directement après, il sera mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour l’ovariectomie, c'est-à-dire l'ablation des 2 ovaires, comme pour tout autre acte de chirurgie, les risques attendus sont majoritairement des complications post-opératoires comme des infections, hémorragies, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont le poil hérissé, l’isolement des congénères et/ou une perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. De plus, les animaux pourraient subir plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourrait survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min) lors des 52 semaines de régime western diet (régime enrichi en graisse, sucres et cholestérol) ou encore lors de la détermination de leur composition corporelle et des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 10 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors des prises de sang ou lors des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline ou encore lors des injections intrapéritonéales. Également, un stress pourrait être subit par les animaux liés à l’isolation de leurs congénères lors des mesures de la composition corporelle ou des mises en cage à métabolisme.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation des cervicales.

Remplacement

Les effets sur tout l'organisme des hormones sexuelles dont les œstrogènes, synthétisés majoritairement par les ovaires, font intervenir des dialogues inter-organes, notamment centraux, et inter-cellulaires à l’échelle de l’organisme qui restent encore non modélisables par des approches cellulaires. Des modèles alternatifs ont été décrits pour l’étude des HM, notamment des modèles de lignées cellulaires d'hépatocytes incubés avec des cocktails de graisses et de sucres permettant de mimer le stockage de graisses dans les cellules qui est caractéristique des HM. Cependant ces modèles ne permettent pas encore d’étudier l’effet des hormones sexuelles et leur rôle dans le développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique, qui sont des éléments majeurs dans le développement des complications liées aux HM. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre l'impact physiologique des hormones sexuelles à l'échelle de l'organisme.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour, à la fois, répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs, c'est-à-dire 10 animaux par groupe expérimental. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive européenne. Du papier et du carton sont fournis pour permettre aux souris de fabriquer des nids et exprimer des comportements naturels. Des tunnels en carton favorisent leur activité physique et leurs interactions sociales. La préhension des animaux se fera grâce à un tube en plastique pour soulever les animaux. Une grille de scoring, en collaboration avec les zootechniciens, permet de surveiller en temps réel l'état de santé et de confort des animaux et d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Lors de l'ablation des ovaires, la diminution de la température corporelle sera limitée par un tapis chauffant. Un gel occuloprotecteur préviendra le dessèchement des yeux. La douleur et la sédation seront contrôlées par des injections d'analgésiques et l'inhalation d'anesthésiants. Les complications post-opératoires potentielles incluent le développement d’infections, d’hémorragies, d’adhérences internes et des problèmes de cicatrisation. Une injection supplémentaire d'analgésique sera réalisée 6h après l'opération pour éviter toute gêne au réveil. Une surveillance quotidienne sera assurée pendant 7 jours. En cas de signes de douleur (poils hérissés, isolement, perte de poids >10%), une intervention analgésique sera initiée en concertation avec le vétérinaire. Si les symptômes persistent, l’animal sera mis à mort par dislocation des cervicales. En cas de déchirure des fils de suture le lendemain, une réintervention sous anesthésiants et analgésiants sera effectuée sous surveillance stricte. Pour les prélèvements de sang sur animal vigile, les animaux seront laissés au maximum libres de leurs mouvements. Les animaux sont transportés suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont gardés dans leur cage d’origine pour le transport d’une durée de moins de 10 minutes avant l'euthanasie. Pour les mâles aussi bien que pour les femelles, la répartition des animaux dans les cages n’est pas modifiée par rapport à leur arrivée en zootechnie d’expérimentation.

Choix des espèces

Dans ce projet nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie et impliquées dans la progression des HM. Donc la souris est le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels ces protéines ont été supprimées dans le foie spécifiquement. Aussi, dans les études publiées par différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup bien décrits chez la souris, avec une transposabilité à l'Homme élevée. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour ce projet de recherche basé sur les effets des hormones sexuelles sur la progression des HM et leurs conséquences cardiaques. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d’âge, correspondant à la phase de fin de croissance et de maturité sexuelle et hépatique.