Souris

Toutes tuées en fin d'étude pour l'analyse de leurs organes, 2 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des traitements radioactifs ciblés contre le cancer de la prostate. Elles subissent une greffe tumorale, une castration chirurgicale, parfois une irradiation du corps entier qui supprime un temps leurs défenses immunitaires, un transport de cinq à six heures entre deux établissements et jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie. Certaines sont immunodéficientes, et la tumeur peut provoquer nécroses et amaigrissement. Le porteur affirme qu'on ne peut se passer d'un "organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes", pour des souris castrées et parfois irradiées.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies ciblées couplées à des radioéléments. Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement une protéine surexprimée par les cellules tumorales prostatiques. Pour la thérapie, on utilise des molécules radioactives puissantes sur une distance très courtes (de l’ordre du millimètre ou micromètre), détruisant ainsi les cellules tumorales à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée, tout en limitant la toxicité sur les tissus sains environnant la tumeur. Dans ce projet, l’objectif principal est d’évaluer l’activité antitumorale de nouveaux traitements ciblés. Dans le cas où aucune donnée de toxicité ne serait disponible, une étude de la toxicité de ces thérapies ciblées pourra être réalisée au préalable dans le cadre de ce projet. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le développement de la radiothérapie interne vectorisée est actuellement en plein essor. En effet, cette thérapie cible de façon spécifique la tumeur de chaque patient, et permet un traitement personnalisé. Notre projet permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés de radiothérapie interne vectorisée.

Procédures

Une induction tumorale : sous anesthésie (

Impact sur les animaux

- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires sur une courte période et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu dans des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait, si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, selon le modèle tumoral, que la progression tumorale entraîne une cachexie (amaigrissement et fatigue) constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - lors de la répartition en groupes homogènes selon les critères de volume tumoral et de poids corporel, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés intraveineux qui pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Différentes analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes ; les modèles animaux sont ainsi indispensables. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. Les effectifs d’animaux dans les groupes expérimentaux ont été adaptés pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant au maximum les effectifs des groupes. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle permet d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

La chirurgie pour la greffe de fragments tumoraux et la castration sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse sur lit chauffant afin de réduire l’inconfort potentiel et permettre ainsi le raffinement de l’étude. La chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une couverture analgésique. Une surveillance post opératoire et des soins post opératoires adaptés sont appliqués si nécessaires.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car son génome est connu et ses principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. D’autre part, les souris sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation des molécules utilisées pour cibler et visualiser les tumeurs chez l’homme. Du point de vue scientifique, la souris porteuse de tumeur reste le modèle de choix dans les études d’évaluation de l’efficacité des nouvelles thérapies contre le cancer. Les animaux pourront être utilisés pour l’induction tumorale à un âge minimum de 5 semaines (jeune adulte), et pourront ensuite être traités à partir de l’âge de 7 semaines (adulte), les modèles de tumeur de prostate humaine nécessitant au moins 2 semaines post implantation pour commencer à pousser. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.

380 souris vont être utilisées, chacune opérée du cerveau pendant une à quatre heures pour recevoir des implants, puis soumise à des séances comportementales allant jusqu'à trois heures par jour. Toutes sont tuées à l'issue pour vérifier la position des implants et analyser le tissu cérébral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant onze jours au plus, elles subissent jusqu'à onze injections et une restriction alimentaire qui maintient leur poids à au moins 85 % de la normale, restriction que le porteur dit destinée à entretenir leur "motivation". Les tâches, décrites comme l'apprentissage d'une règle puis son changement, ne sont pas nommées. Les retombées pour la schizophrénie ou l'autisme sont renvoyées au "plus long terme".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains réseaux neuronaux participent à la flexibilité cognitive, c’est-à-dire à la capacité d’abandonner une stratégie devenue inadaptée afin d’en adopter une nouvelle. Nous chercherons à identifier comment certaines populations neuronales contribuent au maintien de comportements stables mais également à leur mise à jour lorsque les conditions changent. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des approches complémentaires chez la souris. Les animaux réaliseront des tâches comportementales permettant d’étudier l’apprentissage initial d’une règle comportementale puis l’adaptation nécessaire lorsque cette règle change. Pendant ces tâches, l’activité neuronale pourra être enregistrée chez des animaux éveillés et libres de leurs mouvements afin de caractériser les dynamiques d’activité associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales et aux changements de stratégie. Nous étudierons également comment certaines populations cellulaires influencent ces mécanismes et peuvent favoriser des comportements persévérants lorsque l’adaptation comportementale échoue. Les données obtenues permettront une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques pour des troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits d’adaptation comportementale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes neuronaux permettent l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les travaux fourniront des données détaillées sur les dynamiques d’activité neuronale associées à l’apprentissage, aux erreurs comportementales, aux changements de stratégie et aux comportements persévérants. Grâce à la combinaison d’approches complémentaires ce projet permettra d’étudier de manière précise le rôle de différentes populations neuronales dans le contrôle des comportements flexibles. Les données obtenues permettront également de mieux comprendre comment certaines perturbations de l’activité inhibitrice peuvent altérer les capacités d’adaptation comportementale. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans plusieurs troubles neurologiques et psychiatriques associés à des déficits cognitifs et à une rigidité comportementale, notamment la schizophrénie, l’autisme et certains troubles neurodéveloppementaux. Ces résultats pourront contribuer au développement futur de nouvelles hypothèses et approches thérapeutiques ciblant les circuits neuronaux impliqués dans ces déficits. Les données produites dans le cadre du projet pourront également contribuer au développement de nouvelles approches visant à mieux comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans la prise de décision et l’adaptation comportementale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau unique sous anesthésie générale. Cette chirurgie durera entre 1 et 4 heures selon les implants réalisés. Dans certains groupes d'imagerie, une seconde courte sous anesthésie générale pourra être réalisée une seule fois; cette intervention durera 30 à 60 minutes. Les animaux pourront recevoir au maximum 5 injections sur 5 jours consécutifs, selon les lignées utilisées. Pour certaines expériences, les animaux pourront recevoir une autre injection avant certaines séances expérimentales, avec un maximum d'une injection par séance et de 11 injections par animal sur l'ensemble de la période comportementale. Après récupération post-opératoire, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations expérimentales et aux dispositifs d’enregistrement. Les séances comportementales dureront entre 30 minutes et 3 heures maximum par jour. La période comportementale, incluant l'habituation finale la restriction alimentaire contrôlée, les enregistrements et/ou les manipulations, durera au maximum 11 jours par animal. Une restriction alimentaire modérée pourra être mise en place uniquement pendant cette périodes comportementale, pour une durée maximale de 11 jours par animal. Le poids sera surveillé quotidiennement et maintenu à au moins 85 % du poids ad libitum. Les animaux seront ensuite replacés en hébergement collectif avec leurs congénères lorsque cela sera compatible avec leur état clinique et l'intégrité des implants.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des chirurgies du cerveau réalisées sous anesthésie générale pouvant durer entre 1 et 4 heures selon la complexité des implants. Ces interventions sont susceptibles d’entraîner une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la chirurgie, ainsi qu’une gêne transitoire liée à la cicatrisation et à la présence des implants chroniques. Les animaux subiront également des manipulations répétées, des périodes d’habituation aux dispositifs expérimentaux, des connexions aux systèmes d’enregistrement et, pour certains protocoles, un hébergement individuel temporaire. Ces procédures pourront induire un stress modéré transitoire. Les tâches comportementales nécessiteront une restriction alimentaire contrôlée destinée à maintenir la motivation des animaux. Cette restriction pourra entraîner une diminution modérée et réversible du poids corporel. Les nuisances attendues au cours du projet sont donc principalement : une douleur post-opératoire légère à modérée et transitoire, une gêne liée aux implants chroniques, un stress modéré associé aux manipulations et aux procédures comportementales, ainsi qu’une perte de poids légère et réversible liée à la restriction alimentaire.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet ne pourront pas être replacés ou adoptés à l’issue des procédures expérimentales. Une partie des animaux sera maintenue en vie de manière séquentielle entre certaines procédures compatibles du projet afin de permettre la réalisation des enregistrements comportementaux et des analyses prévues. La poursuite des expérimentations sera conditionnée à l’état de bien-être des animaux et à l’absence de signes de douleur ou de détresse incompatibles avec la poursuite des procédures. À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires prévues afin de permettre la réalisation des analyses finales nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. Ces analyses incluront notamment l’étude des tissus cérébraux, la vérification de la localisation des implants et des injections ainsi que l’évaluation de l’expression des marqueurs expérimentaux. Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets en raison des chirurgies intracérébrales, des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées et des prélèvements tissulaires finaux nécessaires aux analyses scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative non animale permettant d’étudier de manière complète les mécanismes cérébraux impliqués dans la flexibilité cognitive et l’adaptation du comportement lorsque les règles de l’environnement changent. Les objectifs du projet nécessitent l’étude de l’activité de réseaux neuronaux intacts pendant des comportements complexes impliquant perception, apprentissage, prise de décision et modification de stratégie comportementale. Les cultures cellulaires, modèles informatiques ou autres approches in vitro ne permettent pas de reproduire l’organisation complète des circuits cérébraux, les interactions entre différents types cellulaires, ni les comportements cognitifs étudiés dans ce projet. De plus, les expériences nécessitent l’étude de l’activité neuronale chez des animaux éveillés réalisant des tâches comportementales, ce qui ne peut pas être reproduit par des méthodes alternatives. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le nombre d’animaux sera limité autant que possible et plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les données obtenues.

Réduction

Le nombre total d’animaux inclus dans ce projet a été estimé en tenant compte des objectifs scientifiques et des mesures de réduction mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Plusieurs analyses complémentaires pourront être réalisées à partir d’un même animal, notamment les expériences comportementales, les enregistrements d’activité cérébrale, l’imagerie et les analyses histologiques finales, afin de maximiser les données obtenues pour chaque animal utilisé. Le nombre d’animaux sera également réduit grâce à l’utilisation de protocoles expérimentaux standardisés, à l’expérience des expérimentateurs et à l’optimisation des procédures chirurgicales et comportementales, permettant de limiter les pertes expérimentales et la variabilité des résultats. Lorsque cela sera possible, les tissus prélevés pourront également être utilisés pour plusieurs analyses complémentaires. Les animaux ne pourront généralement pas être réutilisés après certaines procédures en raison des implants chroniques, des manipulations expérimentales réalisées ou des analyses terminales nécessaires à la collecte des tissus cérébraux. La taille des groupes expérimentaux sera déterminée à partir des données de la littérature, d’expériences antérieures et d’analyses statistiques adaptées afin d’obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques appropriés seront utilisés selon les données obtenues.

Raffinement

Toutes les mesures visant à réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et les dommages durables subis par les animaux seront appliquées tout au long du projet. Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin de limiter le stress lié aux manipulations, aux chirurgies et aux tâches comportementales. Les animaux bénéficieront d’une période d’habituation aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux afin de réduire le stress associé aux procédures. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie adaptée et accompagnées d’une prise en charge analgésique appropriée. Une surveillance régulière des animaux sera effectuée après les procédures expérimentales afin d’évaluer leur état général, leur poids, leur activité locomotrice et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de détresse. Des points limites spécifiques et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement et d’enrichissement du milieu seront adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés aux procédures expérimentales et au suivi du bien-être animal. Les protocoles expérimentaux pourront être ajustés au cours du projet afin d’intégrer toute nouvelle méthode de raffinement permettant d’améliorer le bien-être des animaux ou de réduire les nuisances expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des fonctions cognitives et des mécanismes cérébraux impliqués dans l’apprentissage, la mémoire et la flexibilité comportementale. Les propriétés fondamentales des circuits neuronaux chez la souris sont comparables à celles observées chez d’autres mammifères, ce qui permet d’obtenir des connaissances pertinentes pour la compréhension du fonctionnement cérébral normal et pathologique. Cette espèce permet également la réalisation d’approches expérimentales complémentaires chez un même animal. Les souris présentent en outre l’avantage de pouvoir être génétiquement modifiées afin d’étudier le rôle de populations neuronales spécifiques impliquées dans les comportements étudiés. Les lignées transgéniques utilisées dans ce projet présentent des phénotypes compatibles avec les objectifs expérimentaux et ne présentent pas d’altérations majeures du comportement ou de l’état général en dehors des manipulations expérimentales réalisées dans le cadre du projet. Les souris seront incluses dans la procédure à partir d’environ 5 semaines d’âge selon les cohortes expérimentales. Les chirurgies du cerveau pourront être réalisées à partir de cet âge afin de permettre une période suffisante de récupération post-opératoire et d’expression virale avant le début des tâches comportementales ou des analyses terminales. Les tâches comportementales et les enregistrements in vivo seront réalisés après la période de récupération et d’expression virale, chez des animaux adultes ou jeunes adultes, à un stade de développement compatible avec les objectifs du projet. Ce choix permet de réaliser les implants chroniques suffisamment tôt tout en effectuant les mesures comportementales et physiologiques après maturation adaptée des circuits cérébraux étudiés.

752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, une partie d'entre elles subit des changements d'environnement, des bruits et des perturbations lumineuses, reçoit une pompe sous la peau qui élève la pression artérielle, ou se voit implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'environ une heure. L'équipe cherche à savoir si le stress chronique rend les petits vaisseaux cérébraux plus vulnérables à l'hypertension, et soumet les souris à des tests de mémoire et de comportement qu'elle ne nomme pas. Elle qualifie ce protocole de stress de "sans douleur", tout en indiquant qu'il peut réduire la prise alimentaire, altérer le pelage et diminuer l'activité.

Objectifs

L'hypertension artérielle est la première cause modifiable d'une maladie qui touche les petits vaisseaux du cerveau et qui peut entraîner, avec le temps, des troubles de la mémoire et de la concentration. Certaines personnes développent des atteintes cérébrales sévères malgré un bon contrôle de leur tension artérielle, ce qui suggère l'existence d'autres facteurs aggravants. Le stress chronique (lié par exemple au travail, à l'isolement social ou aux difficultés financières), auquel les femmes sont particulièrement exposées, pourrait être l'un de ces facteurs : il fragiliserait les petits vaisseaux du cerveau et les rendrait plus sensibles aux effets néfastes de l'hypertension. Ce projet a quatre objectifs : identifier les zones du cerveau les plus sensibles à cette combinaison stress-hypertension ; mesurer, grâce à des techniques d'imagerie, comment la circulation sanguine et l'étanchéité des petits vaisseaux cérébraux sont modifiées dans deux régions du cerveau impliquées dans la mémoire et les émotions (le cortex préfrontal et l'hippocampe) ; repérer des signes précoces, dans le comportement des animaux, annonçant des troubles de la mémoire ; identifier les mécanismes biologiques qui rendent certains individus plus vulnérables et d'autres plus résistants.

Bénéfices attendus

L'hypertension artérielle touche plus de 1,4 milliard de personnes dans le monde et constitue le premier facteur de risque de la maladie cérébrale des petits vaisseaux et du déclin cognitif. Malgré un contrôle tensionnel adéquat, certains patients développent des lésions cérébrales sévères tandis que d'autres sont épargnés, indiquant l'existence de facteurs de vulnérabilité encore non identifiés. Ce projet apportera : à court terme, une caractérisation de l'interaction entre stress psychosocial et hypertension sur le système neurovasculaire cérébral, avec identification de régions cérébrales particulièrement sensibles et de marqueurs biologiques permettant de distinguer les cerveaux qui résistent au stress de ceux qui y sont plus vulnérables ; à moyen terme, des indicateurs précoces (imagerie, marqueurs biologiques) permettant d'estimer le risque individuel de déclin cognitif lié à l'hypertension ; à long terme, de nouvelles pistes thérapeutiques personnalisées pour la prévention du déclin cognitif, intégrant la dimension du stress psychosocial dans la prise en charge de l'hypertension artérielle. Les résultats négatifs seront valorisés par publication dans des revues à comité de lecture.

Procédures

Ce projet utilise des souris réparties en quatre expériences sur 5 ans. Dans toutes les expériences, certaines souris sont soumises pendant 4 semaines à un protocole de stress modéré (changements d'environnement, bruits, perturbations lumineuses, sans douleur) et/ou subissent une chirurgie d'environ 5 minutes sous anesthésie gazeuse pour l'installation d'une petite pompe sous la peau délivrant une substance augmentant modérément la pression artérielle. Première expérience : mesure du flux sanguin cérébral par imagerie non invasive sous anesthésie, à trois reprises sur 4 semaines (environ 25 minutes par session). Deuxième expérience : chirurgie sous anesthésie pour implanter un dispositif d'imagerie miniaturisé dans le cerveau (environ 1 heure), puis enregistrements chez l'animal éveillé à trois reprises sur 4 semaines (environ 1h10 par session pour la moitié des animaux ; environ 45 minutes par session, incluant un test de mémoire de courte durée, pour l'autre moitié). Troisième expérience : tests de mémoire et de comportement ne causant aucune douleur, réalisés à deux reprises (environ 20 à 40 minutes par session selon le test), suivis de l'analyse des vaisseaux cérébraux après euthanasie. Quatrième expérience : après euthanasie sous anesthésie profonde, les cerveaux sont prélevés pour des analyses au microscope et des analyses des gènes actifs dans les vaisseaux.

Impact sur les animaux

Le stress chronique peut entraîner une légère diminution de la prise alimentaire, une altération de l'état du pelage et une réduction de l'activité. Ces effets sont transitoires et de faible intensité. La chirurgie d'implantation de la pompe et celle du dispositif d'imagerie peuvent occasionner une douleur modérée, prévenue et traitée par des médicaments antidouleur. L'hypertension modérée est généralement sans symptôme. De rares complications graves peuvent survenir, entraînant la mise à mort immédiate de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, seul organe étudié dans ce projet.

Remplacement

Le stress psychosocial chronique induit des modifications hormonales, comportementales et vasculaires systémiques non reproductibles en dehors d'un organisme vivant. L'étude de l'interaction entre stress et hypertension sur le cerveau nécessite un réseau vasculaire fonctionnel dans son environnement naturel. L'imagerie cérébrale avancée et les tests cognitifs nécessitent un animal vivant intact. Aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire cette complexité. Des études complémentaires sur cellules en culture seront néanmoins réalisées pour valider certains mécanismes

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour garantir une analyse fiable avec le minimum nécessaire. Les expérimentations les plus lourdes (imagerie fonctionnelle et imagerie cellulaire) sont réalisées uniquement chez les femelles, population la plus à risque d'après les données épidémiologiques ; les résultats clés sont ensuite vérifiés chez les mâles (tests comportementaux et analyses tissulaires), ce qui évite de répéter l'ensemble du protocole d'imagerie dans les deux sexes. L'imagerie et les tests comportementaux sont longitudinaux (mêmes animaux suivis dans le temps).

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse avec médicaments antidouleur avant et après l’intervention. Les animaux sont acclimatés à la salle d’expérimentation et habitués à la manipulation avant le début des protocoles. Pour l’imagerie par miniscope, les animaux sont progressivement habitués au port du dispositif. Le stress utilise exclusivement des facteurs de faible intensité, sans douleur. Un suivi quotidien de l’état de santé est assuré, avec une surveillance accrue en période post-chirurgicale. Une grille de score et un arbre décisionnel définissent les soins conservatoires (antidouleur, nourriture enrichie, surveillance renforcée) et les critères de mise à mort en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris a été choisie car cette espèce permet de combiner stress chronique et hypertension dans un modèle intégré, avec des outils d’imagerie cérébrale avancés. La souche utilisée présente une sensibilité particulière aux lésions des petits vaisseaux cérébraux sous hypertension modérée, reproduisant les atteintes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées au stade adulte (12 semaines) car le projet étudie des mécanismes pathologiques adultes et que la maturation vasculaire cérébrale est complète à ce stade.

787 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection unique leur fait pousser une tumeur, puis des séances d'impulsions électriques d'environ huit secondes lui sont appliquées jusqu'à deux fois par semaine pendant quatre semaines, sous anesthésie générale, les substances à évaluer étant administrées jusqu'à sept fois par semaine. L'objectif est d'améliorer un traitement déjà employé en clinique contre les cancers de la tête et du cou, l'électrochimiothérapie, qui reste peu efficace sur les tumeurs volumineuses. Le porteur écrit que les méthodes in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d'appréhender la complexité du comportement cellulaire dans les tumeurs, et conclut que ses perspectives thérapeutiques justifient la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer un traitement existant du cancer de la tête et du cou, appelé électrochimiothérapie. Ce traitement combine l'application d'impulsions électriques sur la tumeur, qui ouvrent temporairement les cellules cancéreuses, avec l'administration de médicaments. Cette ouverture facilite l'entrée des médicaments dans les cellules tumorales et rend ainsi le traitement plus efficace. Ce traitement donne de bons résultats pour les petites tumeurs, mais reste insuffisant pour les tumeurs plus volumineuses, et les médicaments actuellement utilisés peuvent provoquer des effets secondaires importants. Ce projet vise donc à tester des nouvelles substances, notamment des molécules naturellement présentes dans l'organisme, en association avec les impulsions électriques, afin de rendre le traitement plus efficace tout en réduisant ses effets indésirables.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices concrets pour les patients. On attend une meilleure réduction de la taille des tumeurs, notamment pour les tumeurs volumineuses qui répondent actuellement peu au traitement. L'utilisation de substances d'origine naturelle, mieux tolérées que les médicaments chimiothérapeutiques classiques, devrait également permettre de réduire les effets secondaires. Enfin, cette nouvelle approche pourrait être combinée avec d'autres traitements déjà utilisés en clinique afin d'en renforcer l'efficacité globale, ouvrant ainsi la voie à des options thérapeutiques mieux tolérées et plus efficaces pour les patients atteints de ce type de cancer.

Procédures

Les souris recevront d'abord une injection unique (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum) pour faire croître une petite tumeur expérimentale. Une fois la tumeur développée, des séances d’environ 8 secondes d'impulsions électriques seront appliquées sur celle-ci au maximum 2 fois par semaine, pendant quatre semaines, sous anesthésie générale, entre 1 à 180 minutes après l’administration du traitement ou du véhicule (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum). En absence de l’électroporation, les traitements à évaluer seront administrés au maximum 7 fois par semaine (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum), pendant quatre semaines. Enfin, un prélèvement sanguin unique sera effectué (durée: 2 minutes maximal), sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress passager et un léger inconfort lors des manipulations nécessaires aux traitements, ces effets étant de très courte durée (30 secondes à 1 minute). Une légère fatigue temporaire après l'anesthésie est également attendue. Si la tumeur atteint une taille importante, des douleurs locales, une réduction de la mobilité et une perte de poids modérées pourront apparaître. Selon les traitements reçus, une perte de poids transitoire légère, de la fatigue, une réduction de l'activité modérées pourront également être observés, pendant une durée de quelques jours à deux semaines.

Devenir

À l'issue de l'expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans les tumeurs dans toute sa complexité, en particulier le système immunitaire impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour étudier le développement tumoral, réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire aux traitements proposés. Notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, grâce à plusieurs mesures : l'utilisation d'une lignée cellulaire avec un taux de prise tumorale très élevé, limitant les échecs d'implantation; une sélection précise des doses, basée sur la littérature existante et nos résultats préliminaires; un suivi non invasif de la tumeur par imagerie, évitant des euthanasies intermédiaires; ainsi qu'une collecte de nombreux prélèvements sur chaque animal en fin d'expérience, limitant le besoin de groupes supplémentaires. Le nombre d'animaux a par ailleurs été calculé spécifiquement pour chaque expérience selon des méthodes statistiques reconnues, et, pour deux expériences clés jugées particulièrement importantes pour la validité des résultats, l'expérience sera répétée trois fois afin d'en assurer la reproductibilité. Le nombre total d'animaux requis pour l'ensemble du projet est de 787.

Raffinement

Les souris disposeront d'un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement avant le début des expériences, incluant un temps de familiarisation avec les chercheurs. Des méthodes limitant le stress lié à la manipulation seront appliquées, par exemple en évitant de saisir les animaux par la queue. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout changement de comportement, ainsi que tout signe de développement tumoral ou d'inconfort. Dès l'apparition de tels signes, la fréquence de surveillance sera renforcée, et une analgésie sera mise en place si nécessaire pour soulager l'animal. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués, afin de limiter autant que possible la durée et l'intensité de toute souffrance éventuelle.

Choix des espèces

L'espèce choisie est la souris, car elle est facile à manipuler et à héberger, avec un cycle de vie court, et la tumeur expérimentale s'y développe de façon simple, rapide et fiable. Les souris utilisées partagent toutes le même fond génétique, ce qui garantit que la tumeur ne sera pas rejetée par leur système immunitaire et permet d'obtenir des résultats reproductibles. Ce modèle est par ailleurs largement utilisé et reconnu depuis de nombreuses années dans les études précliniques sur ce type de cancer, les résultats obtenus chez la souris s'étant montrés transposables à l'humain ; notre partenaire utilise d'ailleurs ce modèle depuis plusieurs années et dispose déjà de premiers résultats avec celui-ci. Les souris seront âgées de 7 à 10 semaines, un âge correspondant au stade de jeune adulte, nécessaire pour que la tumeur puisse être greffée et que le système immunitaire soit pleinement mature.

7 806 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties en sept lots, elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant deux à trois semaines, un lot étant d'abord irradié sept minutes trente avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur affirme que les traitements ne sont pas toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables, et écrit que le raffinement de ces protocoles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché, alors qu'il signale une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience, et une diarrhée avec perte de poids pendant quelques semaines après l'irradiation. Sur les 7 806 souris demandées, la rubrique consacrée à la réduction n'avance aucun calcul d'effectif, seulement le principe de couper chaque tumeur en deux échantillons et d'arrêter une étape si la précédente ne donne rien.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

Jusqu'à un animal sur dix meurt d'un œdème malin ou d'une hémorragie sous-arachnoïdienne dans les 72 heures qui suivent la pose d'un filament dans la carotide. 210 rongeurs vont être utilisés, 126 souris et 84 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point une imagerie par IRM et scanner X qui suivrait l'inflammation cérébrale après un accident vasculaire cérébral. Selon les groupes, la lésion est provoquée par ce filament, par l'injection stéréotaxique d'un peptide vasoconstricteur ou par celle de lipopolysaccharide, chaque animal subissant une chirurgie d'une heure au plus, parfois deux à deux semaines d'intervalle. Un sous-groupe est génétiquement altéré et présente, écrit le porteur, une anxiété augmentée et des crises épileptiques spontanées chez certains individus, alors qu'il affirme par ailleurs que la douleur concerne uniquement la cicatrice, les dommages au parenchyme cérébral n'en engendrant pas.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.

Impact sur les animaux

Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).

Remplacement

Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.

Réduction

L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites. [MODIFICATION juin 2026. La manipulation et la surveillance des animaux génétiquement altérés sera renforçée.]

Choix des espèces

Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.

Pour former environ 140 personnes aux gestes de base de l'expérimentation animale, 690 rongeurs vont être utilisés, 660 souris et 30 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des gavages et des injections sous-cutanées, intrapéritonéales, intradermiques, intramusculaires, intraveineuses caudales ou rétro-orbitaires, ainsi que des prises de sang par la veine temporale ou caudale sur animal vigile, jusqu'à dix injections et dix prélèvements au cours de sa participation. Le porteur reconnaît que les gestes encore mal maîtrisés génèrent de l'anxiété chez les souris et les rats manipulés, et que le risque de blessure ne peut être totalement exclu. La formation commence sur simulateurs et sur cadavres, supports dont il affirme qu'ils ne peuvent remplacer complètement l'apprentissage sur animal vivant, faute de reproduire la perception tactile fine et l'ajustement des gestes en temps réel.

Objectifs

Ce projet vise à former les utilisateurs aux gestes techniques fondamentaux indispensables à la conduite de projets expérimentaux, tout en intégrant pleinement les exigences liées au bien-être animal. L’objectif est de transmettre des compétences pratiques rigoureuses, fondées sur les bonnes pratiques en expérimentation animal, afin d’assurer des manipulations fiables, sécurisées et éthiquement responsables. Une attention particulière est portée à la maîtrise des techniques permettant de minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux.

Bénéfices attendus

Sur une période de 5 ans, ce projet visera à former l’ensemble des nouveaux utilisateurs de la plateforme ainsi que les utilisateurs déjà actifs souhaitant acquérir ou se remettre à niveau sur des gestes techniques nécessaires à la réalisation de leurs projets expérimentaux. Chaque année, environ 20 nouveaux entrants rejoignent la plateforme. Par ailleurs, parmi les 120 utilisateurs réguliers, certains peuvent exprimer le besoin de développer de nouvelles compétences techniques en fonction de l’évolution de leurs projets. Il est donc estimé qu’environ 140 personnes seront La mise en place de ce projet a pour objectif d’accompagner la montée en compétences des utilisateurs de la plateforme expérimentale, qu’il s’agisse de nouveaux entrants ou d’utilisateurs réguliers souhaitant approfondir ou diversifier leurs pratiques techniques. Les formations proposées permettront à chacun de maîtriser les gestes essentiels à la réalisation de leurs projets expérimentaux, tout en encourageant une autonomie progressive. Un des bénéfices majeurs est l’amélioration de la qualité des manipulations. En standardisant les pratiques et en diffusant les bonnes techniques, le projet contribuera à réduire les erreurs de manipulation et à améliorer la reproductibilité des résultats expérimentaux. Cela permettra de garantir des expérimentations plus fiables, tout en favorisant un environnement de travail rigoureux. Un volet essentiel du projet concerne le respect du bien-être animal, notamment dans le cadre des expérimentations impliquant des modèles vivants. La formation permettra d’enseigner les gestes techniques dans le strict respect des réglementations éthiques et des bonnes pratiques en matière d’expérimentation animale. Cette approche garantira la réduction du stress animal, la limitation de la douleur et des manipulations invasives superflues, tout en contribuant à la fiabilité des données scientifiques produites. Elle s’inscrit pleinement dans la démarche des 3R.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures de formation comprenant des administrations de substances par différentes voies : gavage oral, injections SC, IP, ID, IM, IV caudale ou rétro-orbitale. Les injections ID, IM et rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins sur animal vigile par ponction de la veine temporale ou de la veine/artère caudale. Chaque manipulation dure généralement moins de 5 minutes (hors anesthésie et surveillance). Les animaux subiront 1 à 2 manipulations par séance, espacées d'au moins 24 heures (24 à 48 heures pour certains gavages chez le rat). Les injections rétro-orbitales seront limitées à deux par animal au cours de sa vie. Un même animal ne recevra pas plus de trois types d'injections différents au cours d'une même séance, ni plus de 10 injections et 10 prélèvements sanguins sur l'ensemble de sa participation.

Impact sur les animaux

La mise en place de ce projet de formation peut entraîner certains effets indésirables sur les animaux, qui doivent être anticipés, surveillés et limités autant que possible. Les principales nuisances concernent le stress lié à la manipulation, de légers inconforts transitoires, ainsi que de rares risques de blessures mineures. Le stress constitue la première source de nuisance attendue, en particulier lors des manipulations réalisées par des personnes en apprentissage. Les gestes techniques, lorsqu’ils ne sont pas encore parfaitement maîtrisés, peuvent générer de l’anxiété chez les animaux manipulés. Ce stress reste cependant temporaire, réversible et diminue progressivement au fur et à mesure de l’acquisition des compétences. Les nuisances directes liées aux gestes pratiques sont les suivantes : • Les animaux peuvent ressentir un stress et une anxiété transitoires dus à la manipulation et à la contention. • L’introduction d’une sonde dans l’œsophage peut provoquer un inconfort modéré et un stress passager. • Lors des injections et prélèvements sanguins, les animaux peuvent présenter une légère douleur transitoire liée à la pénétration de l’aiguille, ainsi que de rares saignements maîtrisés par une simple compression. Le risque de blessure demeure faible mais ne peut être totalement exclu, notamment en cas de geste mal contrôlé. Pour cette raison, toutes les manipulations seront strictement encadrées par des personnels expérimentés, permettant une correction immédiate des erreurs et la prévention des incidents.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de leur parcours de formation, après avoir contribué aux objectifs pédagogiques prévus par le projet et lorsque leur réutilisation ne sera plus nécessaire.

Remplacement

La formation débutera systématiquement par une phase de tutorat utilisant des modèles de simulation et des cadavres d’animaux. Ces supports permettent aux apprenants d’acquérir progressivement les gestes fondamentaux, notamment le positionnement de l’animal, l’identification des zones d’injection ou de prélèvement, ainsi que la maîtrise des manipulations de base. Les modèles de simulation offrent un environnement d’apprentissage sécurisé pour s’exercer aux postures et aux techniques, tandis que les cadavres permettent de travailler dans des conditions anatomiques réalistes avant toute intervention sur un animal vivant. Toutefois, malgré l’intérêt majeur de ces dispositifs alternatifs, ils ne peuvent remplacer complètement l’apprentissage sur animal vivant. En effet, certains paramètres essentiels, tels que le comportement, les réactions physiologiques, la variabilité anatomique ou encore la gestion du stress, ne peuvent être reproduits fidèlement par des modèles inertes. De même, la perception tactile fine et l’ajustement en temps réel des gestes nécessitent une pratique encadrée sur l’animal.

Réduction

Dans une démarche stricte de réduction, le projet prévoit d’optimiser l’usage des animaux en utilisant ceux issus de génotypes non recherchés, de la réforme des reproducteurs ou encore les animaux surnuméraires. Ces individus, qui ne sont pas utilisés dans des projets expérimentaux, seront réaffectés aux sessions de tutorat afin d’éviter l’élevage ou l’utilisation d’animaux dédiés spécifiquement à la formation. Chaque animal pourra être réutilisé pour plusieurs séances de tutorat, espacées d’au moins 24 heures, et ce sur plusieurs semaines. Cette organisation permet de mutualiser l’usage d’un même individu entre différents utilisateurs et différentes sessions, tout en respectant les temps de récupération nécessaires. Par ailleurs, afin de réduire encore davantage le nombre total d’animaux requis, sur un même animal plusieurs types de gestes techniques compatibles entre eux pourront être réalisés (injections, prélèvements). Cette diversification des gestes par animal, strictement encadrée et assortie d’un suivi physiologique et comportemental rigoureux, constitue une mesure compensatoire supplémentaire visant à limiter les effectifs. La mise à mort ne sera réalisée qu’en toute fin de parcours, après que l’animal aura contribué à plusieurs séances et à l’acquisition de plusieurs gestes techniques. Afin de réduire encore davantage le recours aux animaux vivants, la première phase du tutorat sera systématiquement réalisée sur des modèles de simulation et des cadavres. Ces supports permettent aux apprenants d’acquérir les gestes techniques fondamentaux, positionnement de l’animal, repérage des zones d’injection ou de prélèvement, manipulation de base, avant toute intervention sur un animal vivant. Le recours aux animaux n’interviendra qu’une fois ces compétences préalables maîtrisées. D’autres mesures de réduction seront également appliquées, notamment l’adaptation du nombre d’animaux en fonction du besoin réel des apprenants à l’acquisition d’un ou plusieurs gestes techniques. L’ensemble de ces dispositions contribue à une utilisation raisonnée et minimisée des animaux, tout en maintenant les conditions nécessaires à une formation de qualité et respectueuse du bien-être animal.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la PE afin que la prise en charge soit la plus efficace et rapide possible. Une période d'acclimatation d’au moins 7 jours avant toute manipulation sera respectée. De plus, une habituation progressive d'une semaine est réalisée au cours de l’apprentissage via l’acquisition des méthodes de préhension et de contention. Le projet met l’accent sur le raffinement des procédures de formation pour minimiser douleur, stress et inconfort des animaux. Cela inclut l’adoption de techniques de préhension et contention douces (tunnel, scruffguard), et l’usage d’analgésiques ou d’anesthésiques gazeux si nécessaire. La déshydratation sera prévenue par un test du pli de peau et du gel diet ou une injection de liquide pourra être administrée en SC. Le recours à l’injection IP ne sera tutorée que lorsqu’il est indispensable et dûment justifié sur des bases scientifiques par rapport à l’administration par voie SC. Des points limites stricts, gradués et spécifiques aux procédures tutorées sont prédéfinis et seront appliqués à chaque animal. Une surveillance clinique quotidienne permettra de détecter toute altération de l’état général, du comportement, de l’alimentation ou de l’hydratation. Des critères spécifiques sont également définis pour chaque geste technique (gavage, injection et prélèvement), notamment en cas de difficulté lors du geste, de saignement, de réaction locale, de détresse respiratoire, de douleur ou de toute autre complication. L’atteinte d’un point limite entraînera immédiatement l’action prédéfinie correspondante : arrêt du geste ou retrait de l’animal de la procédure, traitement analgésique et réévaluation lorsque cela est indiqué, ou mise à mort immédiate en cas de signe de gravité ou de score clinique ≥ 2. En cas de score clinique ≥ 1, une analgésie sera administrée et l’animal sera réévalué dans les 24 heures ; en l’absence d’amélioration, l’animal sera retiré de la procédure et mis à mort. Ces critères permettent une intervention précoce et garantissent que l’animal ne sera pas maintenu dans une situation de douleur, de détresse ou d’inconfort important.

Choix des espèces

Les espèces choisies correspondent à celles déjà utilisées au sein de notre EU pour la réalisation des projets scientifiques autorisés. Les animaux âgés de plus de six semaines seront utilisés. Cet âge correspond à celui des individus pouvant provenir de génotypes non recherchés, de la réforme de reproducteurs ou d’animaux surnuméraires disponibles au sein de la plateforme et non utilisés dans les projets expérimentaux.