Souris

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de la grippe ou par Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie générale, puis reçoivent de une à trois administrations de la molécule testée, par la même voie et sous anesthésie à chaque fois. L'infection grippale entraîne perte de poids, perte d'appétit, inactivité et léthargie pendant six à sept jours, l'infection bactérienne agissant sur quarante-huit heures. Le porteur souligne que la molécule a déjà montré son efficacité in vitro à des doses non cytotoxiques, et écrit dans la même rubrique qu'"aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d'un organisme entier".

Objectifs

Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.

Procédures

Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.

Impact sur les animaux

Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.

Réduction

Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.

Raffinement

MODIFICATION : Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). DE PLUS, POUR FACILITE L’APPORT ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE LORS DES INFECTIONS, DES CROQUETTES HUMIDIFIEES D’EAU SERONT DISPONIBLES A L’INTERIEUR DE LA CAGE.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".

11 940 souris vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles développent un lupus, avec atteintes rénales, inflammation généralisée, douleurs articulaires, problèmes de peau et perte de poids, et reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines, des prises de sang mandibulaires sous anesthésie toutes les deux semaines, et des tests de sensibilité à un stimulus mécanique jusqu'à deux fois par semaine. Le bénéfice attendu reste de repérer des molécules candidates avant toute phase clinique. L'effectif, lui, couvre 109 études dont le porteur écrit que le nombre "ne peut pas être déterminé à l'avance", et il prévoit délibérément une marge pour "éviter des interruptions administratives ou des retards".

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune chronique et complexe caractérisée par la production d’auto-anticorps affectant plusieurs organes (reins, peau, articulations, sang…). Il s’agit d’une maladie du tissu conjonctif dont le symptôme caractéristique est une inflammation associée au système immunitaire. Il touche principalement les femmes (9 femmes pour 1 homme) en âge de procréer. C’est une maladie difficile à prendre en charge, car son évolution est imprévisible, les symptômes varient d’un patient à l’autre, et les traitements actuels, souvent lourds, ne permettent pas de guérir. Ils visent surtout à réduire les poussées inflammatoires et à prévenir les complications. Découvrir de nouvelles solutions thérapeutiques est crucial afin d’offrir des traitements plus efficaces, mieux tolérées et personnalisées améliorant la qualité de vie et réduisant la morbidité et la mortalité. Après une phase de sélection de molécules prometteuses, leur mode d’action sera étudié, et les plus pertinentes seront testées dans des modèles expérimentaux de lupus, qui reproduisent les grandes caractéristiques de la maladie humaine. Les molécules testées auront un potentiel anti-inflammatoire, immunomodulateur ou viseront des cibles biologiques impliquées dans le développement du lupus. Ces recherches, menées dans le cadre d’un programme de maturation préclinique, permettront d’évaluer la sécurité, la tolérance et l’efficacité de ces traitements potentiels avant toute phase clinique. L’objectif final est de proposer des solutions thérapeutiques innovantes qui amélioreront la qualité de vie des patients, tout en respectant les principes éthiques de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet au sein du lupus érythémateux systémique. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement de nouvelles thérapeutiques permettant de réduire la mortalité liée au lupus, de soulager les patients atteints de cette maladie, afin qu’ils aient une meilleure qualité de vie.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Tous les animaux recevront une injection en sous-cutanée pour l'implantation des puces d'identification RFID. Également, les animaux recevront des administrations de traitements. Plusieurs voies d'administrations sont envisagées en fonction du mode d'administration du composé testé. Le traitement sera administré une à sept fois par semaine, jusqu’à deux fois par jour, en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration, pendant plusieurs semaines. Toutes les deux semaines maximum, les animaux pourront subir un prélèvement de sang au niveau mandibulaire. Ces prélèvements se feront sur animal anesthésié. Des tests de comportement pourront être effectués, jusqu'à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude, en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation, soit un test durant 15 minutes en tout). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour évaluer leur état général.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les souris utilisées vont développer des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes de lupus, une maladie causée par un déséquilibre du système immunitaire. Ces signes peuvent avoir un impact sur leur état général et leur espérance de vie. Par exemple, les souris peuvent développer des dysfonctionnements aux reins, une inflammation généralisée, des douleurs articulaires, des problèmes de peau et de multiples atteintes notamment aux organes sièges de l'immunité tels que la rate et les ganglions lymphatiques. Ces dommages peuvent entraîner une perte de poids et une diminution de l'activité. Ces symptômes peuvent varier en intensité selon les modèles utilisés. Tout au long de l'étude, ces différents paramètres seront surveillés en observant l'état de chaque animal. Leur comportement, leur consommation de nourriture et de boisson, ainsi que leur poids seront régulièrement contrôlés, entre 2 et 5 fois par semaine. Les traitements administrés sont prévus à des doses non toxiques, basées sur des études préliminaires ou la littérature et ne devraient pas entraîner d'effets secondaires importants, hormis une légère gêne transitoire liée aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de ne pas provoquer de douleur et en respectant les recommandations éthiques des volumes prélevés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir évaluer l’effet de notre molécule sur la maladie.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, sur l’auto-immunité et sur la douleur implique de disposer de modèles animaux mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce souris à travers nos différents modèles reproduit plusieurs aspects du lupus humain. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation, la production d’auto- anticorps, la prolifération de lymphocytes, la douleur et sur l’aspect histologique des organes, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule candidate). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux. Pour ce projet nous prévoyons d’effectuer 109 études avec l’utilisation de 11940 animaux sur 5 ans. Toutefois, ce sont des estimations larges car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement, de l’efficacité des molécules, du choix du modèle translationnel pour aller en clinique ainsi que les souches d’animaux choisies en fonction du modèle. En effet, dans le cadre de demande d’autorisation, il est nécessaire d'inclure toutes les souches animales potentielles qui pourraient être utilisées. Chaque souche citée doit être associée à un nombre précis d’animaux, même si, dans la pratique, certaines souches pourraient ne pas être sélectionnées en fonction des besoins des projets en cours et des pilotes. Par conséquent, il est prévu en total un nombre d'études plus élevé que le besoin exact anticipé pour éviter des interruptions administratives ou des retards en cas de changements dans les souches animales requises si nous ne prévoyons pas cette marge dès le début du projet.

Raffinement

Pour minimiser les impacts sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie gazeuse (implantation des puces d’identification, prélèvements sanguins) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les procédures d’implantation des puces d’identification et de prélèvements sanguins sont réalisées sous anesthésie gazeuse (un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal). L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. De même, les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Une grille de score pour évaluer la douleur sera mise en place incluant un arbre décisionnel avec critères d’arrêt de souffrance. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré toutes les toutes les 6 à 12 heures jusqu’à 48 heures. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude pour détecter les signes de douleur insupportable et euthanasiés en fin d’expérimentation pour des analyses supplémentaires. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent se cacher et ronger. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux et/ou un marqueur sanguin ou urinaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

En accord avec les recommandations et la littérature, la souris représente un modèle très développé pour étudier le lupus. En effet, chez la souris le lupus ressemble beaucoup au lupus chez l’homme, notamment en ce qui concerne les problèmes rénaux et la production d’autoanticorps. Les modèles murins de lupus se répartissent en deux catégories principales : spontanés et induits. Afin de pouvoir étudier la progression de la maladie, les souris seront âgées de 6 semaines minimum et pourront être étudiées tout au long de leur vie. Ce stade nous permettra de réaliser des études présymptomatiques, symptomatiques et d’étudier l’effet de traitements jusqu’à la fin de la vie des souris.

Une chirurgie crânienne d'environ deux heures pour implanter de quoi enregistrer ou moduler des neurones, puis jusqu'à cinq semaines seules en cage pour protéger le matériel : 850 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que cet isolement représente "un appauvrissement pour ces animaux sociaux". L'objectif est de décrire les circuits de l'anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur, la perspective thérapeutique étant renvoyée au-delà de dix ans. Les trois tests comportementaux de vingt minutes que subit chaque souris sont annoncés comme évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle, sans être nommés.

Objectifs

Etat de l’art : L’objectif principal du présent protocole est de découvrir les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anxiété ainsi que l’apprentissage et la consolidation de la mémoire de peur chez la souris. Les troubles liés à la peur et à l'anxiété tels que le trouble de stress post-traumatique sont parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents et représentent un problème majeur de santé publique. Ces troubles sont généralement considérés comme une altération de la mémoire de la peur, en particulier sa consolidation. A ce jour, les circuits et mécanismes responsables de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire de peur restent mal connus. De nos données préliminaires et d'une large littérature, le présent projet propose d'étudier les circuits neuronaux de l’anxiété et de la consolidation de la mémoire. Hypothèses de travail : les informations des contextes anxiogènes sont transférées au cortex pour la mise en place d’une mémoire émotionnelle à long-terme, consolidée. De plus des population neuronales dédiées, vont jouer des rôles spécifiques dans la mise en place et le cadençage de ce transfert. Approches : Nous combinerons des techniques de pointe en comportement, neurophysiologie et neurostimulation pour comprendre et manipuler ce circuit et ses mécanismes. Interférer avec ces mécanismes en clinique représente une piste thérapeutique d'avenir.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes neurobiologiques de l’apprentissage et de la mémoire affective est une étape indispensable dans l’adaptation des individus au quotidien ou dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies neuropsychiatriques impliquant la peur et l’anxiété. À moyen terme (5–10 ans), ces résultats permettront d’améliorer la compréhension intégrée du fonctionnement des circuits dans différentes structures cérébrales et à long terme (au-delà de 10 ans), de contribuer à une compréhension mécanistique plus fine des désordres émotionnels associés aux pathologies neuropsychiatriques, ouvrant potentiellement la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces circuits.

Procédures

Ce projet faisant intervenir de l’imagerie et de la modulation de neurones spécifiques, tous les animaux utilisés seront soumis à une chirurgie ayant pour objet de pouvoir moduler ou enregistrer l’activité des neurones. Toutes nos chirurgies seront réalisées après analgésie préalable, couvrant la durée de la chirurgie et la période post-opératoire. Elles seront également toutes conduites sous anesthésie générale. Chaque souris sera soumise une chirurgie unique d'environ 2h et 3 tests comportementaux de 20 minutes évaluant la réponse anxieuse ou émotionnelle.

Impact sur les animaux

- Les chirurgies réalisées sur les animaux sont susceptibles d’occasionner stress et douleur. Cela se traduit habituellement par une perte de poids. - Une fois les chirurgies réalisées, les animaux sont maintenus en habitat isolé afin de garantir l’intégrité des équipements, et ce pendant une durée maximum de 5 semaines. Si cet isolement prévient nombre de blessures infligées entre congénères et évite d’endommager les équipements (impératif), elle représente aussi un appauvrissement pour ces animaux sociaux qu'il est important de limiter au maximum dans le temps. - Un stress pourra être observé sur les quelques jours du protocole qui contient des expositions à des environnements potentiellement anxiogènes.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Le présent projet explore le rôle des circuit neuronaux au niveau structurel mais également systémique et comportemental. De ce fait, les approches explorant l’activité de ces cellules in vitro et in silico bien qu’indispensables à la compréhension complète de leur fonctionnement, restent pour l’instant insuffisantes pour remplir nos objectifs scientifiques. De même, la dimension comportementale de l’étude des mécanismes émotionnels dicte l’utilisation d’un modèle animal vigile et non anesthésié.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum, en prenant en compte l’effectif nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, déterminé grâce à un calculateur de puissance statistique, ainsi que le taux d'échec des procédures, évalué lors de précédentes expérimentations. Afin de diminuer ce taux d’attrition, certains animaux seront logés en cages individuelles une fois les chirurgies réalisées pour éviter la détérioration des équipements fragiles. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de formules statistiques standards, en nous basant sur nos données préliminaires et les variables que nous souhaitons soumettre à des tests statistiques. Les données recueillies au cours de ce projet seront traitées à l’aide de logiciels et d’algorithmes adaptés puis la significativité statistique sera évaluée en fonction des données et de leur répartition (normale ou non).

Raffinement

Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Le temps de maintien des souris en hébergement individuel sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes). Les souris seront quotidiennement pesées et évaluées pendant un minimum de trois jours après la chirurgie. Une analgésie per- et post-opératoire sera délivrée, et une analgésie supplémentaire sera effectuée le lendemain de la chirurgie au besoin. Si des signes de mal-être sont observés en dehors de la période post-opératoire, les animaux seront placés en observation quotidienne afin d’alléger ce mal-être et de remédier à la cause sous-jacente. Une grille d’observation des signes cliniques et un arbre décisionnel correspondant sont mis en place afin de limiter le stress ou la douleur et d’optimiser le bien-être animal. Tout signe de douleur sera pris en charge médicalement, à titre conservatoire, par analgésie, jusqu’à amélioration de l’état de l’animal ou euthanasie si dépassement des points limites. Afin de diminuer le stress provoqué par les expérimentations, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention manuelle nécessaire à la connexion des différents équipements. De plus, ce stress sera maintenu au minimum nécessaire pour induire un apprentissage chez les souris et il est à noter que les souris peuvent à tout moment se réfugier dans un endroit abrité et diminuer leur niveau d’anxiété.

Choix des espèces

Chez l’homme, les traitements disponibles des troubles anxieux (au sens large) pâtissent d’un manque relatif d’efficacité et sont associés à de nombreux effets secondaires, causant notamment des troubles de la mémoire. De plus, chez l’homme, aucune méthode ne permet de comprendre les mécanismes cellulaires de la mémoire, nous devons donc utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Nos objectifs scientifiques nécessitent l’enregistrement et/ou la manipulation de neurones spécifiques d’une part et l’évaluation comportementale du comportement anxieux et de la mémoire de peur d’autre part. La caractérisation très solide de tests comportementaux évaluant les éléments sus-cités chez la souris fait de cette espèce, la plus indiquée pour réaliser notre étude. En effet, compte tenu de leur répertoire comportemental riche, de leur relative complexité cérébrale et de leur position position dans l’évolution des espèces, les rongeurs constituent le meilleur modèle animal pour comprendre les fonctions ou dysfonctions du cerveau humain, en particulier dans la dimension cognitive et notamment les fondements comportementaux et neuronaux de la mémoire. Notre étude ne se concentrant pas sur un stade de développement spécifique, nos procédures seront effectuées sur de jeunes souris adultes de 12 à 16 semaines. Elles seront donc à un âge ne présentant pas de vulnérabilité particulière, tout en réduisant au maximum le temps d’élevage.

Hébergement individuel de douze heures chaque mois pour recueillir les urines, administration orale quotidienne d'un médicament pendant sept jours à quatre puis à six mois d'âge : 170 souris vont être utilisées, toutes tuées pour récupérer leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris produisent un anticorps humain issu d'un patient, qui se dépose dans leurs reins et provoque des lésions menant à l'insuffisance rénale. Le porteur situe la gravité au niveau sévère. Sa liste d'effets indésirables tient en trois lignes, le stress de l'hébergement individuel et celui de la contention, avec la mention que le médicament "ne provoque pas d'effet secondaire" et que le prélèvement de sang n'en induit pas non plus.

Objectifs

Dans certaines maladies rénales appelées "light chain deposition disease" (LCDD ou maladie à dépôts de chaînes légères d'immunoglobulines monoclonales en français), un anticorps (molécule habituellement destinée à se défendre contre les microbes) fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré-cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. Aujourd’hui, les seuls traitements accessibles pour cette pathologie sont des chimiothérapies ciblant la cellule responsable de la fabrication de l’anticorps en cause. Néanmoins, ces traitements ne sont pas spécifiques et provoquent d’importants effets secondaires. Les mécanismes qui permettent le développement des lésions rénales à la suite du dépôt de l’anticorps ne sont pas connus. Les identifier permettrait donc de développer des médicaments plus ciblés, protégeant le rein des conséquences du dépôt de l’anticorps. Un modèle de souris reproduisant la pathologie humaine a déjà été créé, en permettant la fabrication d’un anticorps humain issu d’un patient atteint de LCDD chez la souris. Cela a permis de montrer que l’anticorps est directement toxique pour le rein. Néanmoins, il reste à comprendre les réponses du rein à la suite de ce dépôt. Nous allons donc utiliser ce modèle de souris afin de répondre à cette lacune des connaissances dans ce domaine. Cela permettra, nous l’espérons, d’identifier des cibles thérapeutiques que nous pourrons cibler pour protéger les reins après dépôts d’anticorps. En particulier, les cellules sénescentes paraissent impliquées dans ce processus. La sénescence, du latin senex ou « grand âge », est un état de la cellule dans lequel la cellule ne peut plus se diviser mais peut secréter un grand nombre de molécules. La sénescence a été impliquée dans plusieurs pathologies, comme le vieillissement ou le cancer par exemple.

Bénéfices attendus

Grace à ce projet nous espérons plusieurs bénéfices - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Caractériser le rôle de la senescence dans le développement des lésions rénale après dépôt d’anticorps. - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Estimer si la suppression des cellules sénescentes permet de protéger le rein de l’apparition de lésions après dépôt d’anticorps. - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec la LCDD) Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : - collecte d'urines pour mesurer la fuite de protéines dans les urines. Pour cela les animaux seront hébergés de manière individuelle dans des cages spécifiques pendant 12h afin de récupérer leur urine. Cette collecte se fera de manière mensuelle. - traitement par un médicament permettant d'éliminer les cellules senescentes. Ce traitement sera donné par voie orale, à l'aide d'une paille qui sera introduite dans la bouche de l'animal, de manière quotidienne pendant 7 jours, à 4 et 6 mois d'âge. - au moment du sacrifice, les animaux seront anesthésiés et du sang sera prélevé pour mesurer la fonction rénale

Impact sur les animaux

Plusieurs types d'effets indésirables peuvent etre observés. Stress lors de l'hebergement individuel pour collecte d'urine. Stress lors de la contention pour administration du médicament. Le médicament ne provoque pas d'effet secondaire. Le prélèvement de sang n'induit pas d'effet secondaire car les animaux seront anesthésiés et traités par un antalgique.

Devenir

Euthanasie pour collection et analyse d'organe (rein)

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie LCDD. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présentes dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Les procédures ici décrites utilisent des animaux qui risquent de developper des lésions rénales de manière spontanée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous utiliserons la totalité des animaux pour les procédures. Du fait de l’absence de différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes pour nos procédures. Nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de calculer le nombre minimum d’animaux afin de voir une différence de 15% de la sévérité de l’atteinte rénale après traitement.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Dans les données de la littérature, les souris commencent à développer des lésions rénales microscopiques à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans insuffisance rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Nous étudierons donc les souris tous les mois dès l’âge de 3 mois, jusqu’à 9 mois, âge médian de survie.