Souris

Infectées par une bactérie injectée dans les deux cuisses, puis traitées jusqu'à 23 fois dans les études les plus longues, qui peuvent durer 84 jours, 6 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut provoquer inflammation, œdème, douleur locale et boiterie, et certaines souris reçoivent au préalable un immunosuppresseur. Le projet doit évaluer de nouveaux antibactériens, leur dose, leur fréquence et leur voie d'administration, en partie par un cathéter veineux "préalablement implanté" dont le résumé ne dit ni quand ni comment il est posé. Le porteur présente cette mise à mort systématique comme une garantie du "respect des exigences en matière de bien être animal".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les infections bactériennes localisées des tissus mous. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, une propagation de l’infection vers des formes plus graves. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier en raison de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Pour cela, des études sont réalisées chez la souris afin d’observer comment l’infection se développe au niveau musculaire et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antibactériens. Ces modèles permettent notamment de mesurer la capacité des médicaments à réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés, à limiter l’inflammation locale et à améliorer l’évolution de l’infection. Ils permettent également d’étudier le comportement des traitements dans l’organisme afin d’optimiser leur utilisation. Avant d’être testés chez l’animal, les composés font l’objet d’études préalables en laboratoire (en dehors de l’organisme) afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Les expérimentations animales ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par des méthodes alternatives. Ces travaux permettront de mieux identifier les traitements les plus efficaces et de mieux comprendre les relations entre l’exposition des médicaments et leur activité anti-infectieuse. À terme, ce projet vise à contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les infections bactériennes des tissus mous, notamment dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des infections bactériennes localisées des tissus intramusculaires de la cuisse. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, évoluer vers des formes plus graves difficiles à traiter. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier dans le contexte de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Les principaux bénéfices attendus concernent le développement de nouveaux traitements antibactériens plus efficaces. Les études permettront d’identifier des composés capables de réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés et de déterminer les conditions optimales de leur utilisation (dose, fréquence et voie d’administration). Ces travaux contribueront également à mieux comprendre l’évolution des infections musculaires localisées, la réponse inflammatoire associée et les mécanismes d’action des traitements au sein d’un organisme entier. Ils permettront ainsi d’améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des infections bactériennes des tissus mous. À terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients, en particulier dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces en raison de phénomènes de résistance aux antibiotiques. Enfin, en optimisant les modèles expérimentaux et les approches utilisées, ce projet participe à une utilisation raisonnée et limitée des animaux en recherche, en évitant la répétition d’études inutiles et en permettant d’obtenir des résultats fiables avec le nombre minimal d’animaux nécessaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types de gestes expérimentaux, incluant des administrations de substances, des infections expérimentales, des prélèvements sanguins et un suivi clinique régulier. Aucune procédure chirurgicale lourde n’est prévue. Les principales étapes sont les suivantes : • Acclimatation : minimum 5 jours avant toute procédure, sans intervention. • Utilisation d’un cathéter veineux préalablement implanté : Manipulation du cathéter (connexion, administration en perfusion, rinçage, vérification de la perméabilité) réalisée en conditions aseptiques par du personnel formé. • Pré-conditionnement (si nécessaire) : administration d’agent immunosuppresseur (voie sous cutanée, J 4 et J 1 avant infection) ou d’antihistaminiques. • Infection expérimentale : administration intramusculaire unique dans les 2 cuisses, réalisée sous anesthésie générale et en quelques minutes. • Traitement : administration prophylactique ou thérapeutique par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou orale jusqu’à 63 jours avant le début de l’infection en 2 ou 3 fois. Les volumes et fréquences respectent les recommandations. Le nombre maximal d’injections est généralement de 2 à 6 sur modèles courts (~25 h) et peut atteindre 20 à 23 sur modèles prolongés. • Prélèvements sanguins : o soit réalisés une fois en phase terminale o soit en cours d’étude (PK), jusqu’à 7 prélèvements sur 24 h, de faible volume, sur animal vigile ou anesthésié selon la technique o utilisation possible de cathéters pour limiter les ponctions répétées • Suivi clinique : réalisé 6 à 8 fois par jour selon le modèle (évaluation du score clinique, signes d’infection), avec une mesure du poids corporel réalisée 1 à 2 fois par jour. • Mise à mort : en fin d’étude ou dès atteinte des critères d’arrêt, avec réalisation de prélèvements terminaux. La durée des études est généralement d’environ 25 heures pour les modèles d’efficacité ou PK/PD, et peut atteindre jusqu’à 21 jours post infection. Soit un total maximal de 84 jours pour les études de survies si la thérapie est utilisée en prophylactique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce modèle d’infection intramusculaire sont principalement liés à l’établissement d’une infection localisée dans le tissu musculaire et aux manipulations expérimentales associées. Le développement de l’infection peut entraîner une altération légère à modérée de l’état général des animaux, se traduisant par une diminution de l’activité, une posture voûtée, un pelage ébouriffé, une perte de poids modérée et une baisse de la prise alimentaire. Des signes locaux spécifiques au modèle sont également attendus au niveau du site d’injection intramusculaire, incluant une inflammation, un œdème, une douleur locale et une possible boiterie ou diminution de l’appui sur le membre affecté. Ces manifestations reflètent la réponse inflammatoire et l’évolution locale de l’infection dans le muscle. Selon l’agent infectieux et la progression du modèle, une dissémination bactérienne peut survenir et conduire dans de rares cas à des signes systémiques (hypothermie, déshydratation), bien que le modèle soit principalement localisé. Ces effets sont considérés comme de sévérité légère à modérée, mais peuvent devenir modérés en raison de leur cumul au cours du protocole expérimental. Un suivi clinique régulier basé sur une grille de score est mis en place afin de détecter précocement toute dégradation de l’état des animaux. Des mesures de soutien sont instaurées dès l’apparition des premiers signes cliniques et des critères d’arrêt prédéfinis sont appliqués de manière stricte afin de limiter toute douleur ou souffrance excessive.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux sont systématiquement mis à mort. Aucune réutilisation, remise en liberté ou maintien en vie après la procédure n’est envisageable. En effet, les animaux ont été exposés à des agents infectieux potentiellement pathogènes et les procédures impliquent généralement des atteintes physiologiques incompatibles avec une récupération complète dans des conditions garantissant leur bien être. Le recours à la mise à mort permet également la réalisation de prélèvements terminales indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Cette approche garantit à la fois la qualité des données générées et le respect des exigences en matière de bien être animal, en évitant toute utilisation ultérieure inappropriée des animaux.

Remplacement

Avant de recourir à l’utilisation d’animaux, des méthodes alternatives sont systématiquement mises en œuvre afin de limiter leur utilisation. Les molécules testées sont d’abord étudiées en laboratoire, en dehors de l’organisme, grâce à des tests réalisés sur des micro organismes (bactéries) et des cellules. Ces approches permettent de vérifier si les candidats traitements sont susceptibles d’être efficaces et d’éliminer ceux qui ne présentent pas d’intérêt. Des modèles informatiques et des analyses de données existantes sont également utilisés pour mieux comprendre le comportement des médicaments et sélectionner les doses appropriées avant toute expérimentation animale. Ces méthodes permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés en ne testant que les molécules les plus prometteuses. Elles sont systématiquement privilégiées dès que cela est possible. Cependant, certaines questions scientifiques ne peuvent pas être étudiées sans recourir à un organisme entier. Les infections étudiées impliquent des interactions complexes entre l’agent infectieux et l’ensemble de l’organisme, notamment la circulation du pathogène dans différents organes et la réponse globale de l’organisme. À ce jour, ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal reste donc nécessaire dans certaines situations, mais il est limité au strict nécessaire, et uniquement lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire grâce à plusieurs mesures mises en place dès la conception des études. Avant toute expérimentation, les chercheurs s’appuient sur les données déjà disponibles (littérature scientifique, résultats internes) afin d’éviter de répéter des études déjà réalisées. Des tests préalables en laboratoire permettent également d’identifier les conditions les plus adaptées avant d’utiliser des animaux. Les modèles sont d’abord optimisés avec un nombre réduit d’animaux afin de définir précisément les paramètres expérimentaux (dose d’infection, durée de l’étude). Ces informations permettent ensuite de concevoir les études de manière plus efficace et d’éviter d’avoir à les répéter. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Par ailleurs, les études sont organisées de manière à limiter le nombre de manipulations réalisées sur chaque animal. Lorsque les besoins expérimentaux sont importants, des groupes distincts d’animaux (appelés cohortes) sont utilisés afin d’éviter d’imposer un trop grand nombre de prélèvements ou d’injections à un même animal. Enfin, plusieurs types de données (par exemple observations cliniques et mesures biologiques) sont recueillis chez un même animal lorsque cela est possible, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. L’ensemble de ces approches permet de concilier la qualité scientifique des résultats avec une utilisation raisonnée et limitée des animaux.

Raffinement

Le projet met en œuvre différentes mesures afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long des études. Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées et contrôlées, avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification, abris, tunnels) qui favorise leur bien être et leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils sont acclimatés avant toute expérimentation afin de réduire le stress lié au changement d’environnement. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour limiter l’inconfort et la durée de contention. Lorsque cela est nécessaire, une anesthésie est utilisée pour certaines procédures. Des traitements contre la douleur peuvent également être administrés si des signes de gêne apparaissent. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière (plusieurs fois par jour si nécessaire) afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Une grille de suivi permet d’évaluer leur état de manière objective. Des mesures de soutien sont mises en place en cas de besoin, comme l’apport d’eau ou de nourriture facile d’accès, ou un environnement chauffé si les animaux présentent des signes de fragilité. Des critères d’arrêt précoces sont définis : dès qu’un animal présente des signes importants de souffrance, il est pris en charge ou euthanasié afin d’éviter toute dégradation de son état. Enfin, l’organisation des études permet de limiter le nombre de manipulations par animal, notamment grâce à l’utilisation de groupes distincts lorsque nécessaire. L’ensemble de ces mesures permet de réduire autant que possible l’impact des procédures sur les animaux tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie pour ce projet car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche médicale. Elle permet d’étudier de manière fiable le développement des infections et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme entier. De nombreuses connaissances scientifiques existent déjà sur ce modèle, ce qui facilite l’interprétation des résultats et permet de limiter la répétition d’expériences. L’organisme de la souris présente des similitudes importantes avec celui de l’Homme pour l’étude des infections, notamment en ce qui concerne la manière dont les agents infectieux se propagent dans le corps et la façon dont l’organisme réagit. Cela en fait un outil pertinent pour améliorer les connaissances et développer de nouveaux traitements. Les animaux utilisés sont des adultes. Ce choix permet de travailler sur un organisme dont les fonctions sont totalement développées et stables, ce qui garantit des résultats plus fiables et reproductibles. Chez les adultes, le système immunitaire et les caractéristiques physiologiques sont mieux établis, ce qui est essentiel pour étudier correctement les infections. Selon les besoins de l’étude, des animaux avec un système immunitaire normal ou temporairement affaibli peuvent être utilisés. Cela permet d’explorer différentes situations, notamment celles où les défenses de l’organisme sont diminuées, comme cela peut être le cas chez certains patients. Ce choix d’espèce et de stade de développement permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en utilisant le modèle le plus adapté et le mieux caractérisé.

3 612 souris vont être utilisées, chacune recevant deux ou trois injections de vaccin, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale, et jusqu'à sept prises de sang. Selon les procédures, une injection d'acétate de médroxyprogestérone, une hormone, précède la vaccination de cinq jours. Ces souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, sont utilisées pour tester 18 vaccins, leurs adjuvants et leurs voies d'administration dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever moelle osseuse, rate et ganglions. Face à ces atteintes, le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouveaux vaccins", contre six agents infectieux allant du SARS-CoV-2 à la tuberculose.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les vaccins que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront : une injection sous-cutanée d'acétate de médroxyprogestérone 5 jours avant la vaccination selon les procédures, des injections de vaccins (durée: 30 secondes) par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang (durée 30 secondes) pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour, et le jour de la mise à mort) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 injections de vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. Les effets indésirables pourraient être une infection après l'utilisation d'aiguilles au moment de l'injection des vaccins ou des prélèvements de sang. Les aiguilles sont changées entre chaque animal pour limiter cet effet indésirable.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les vaccins utilisés dans ce projet ont déjà été évalués dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agit ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre est estimé à 3612 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).

Pour étudier comment l'absence d'une protéine de surface, l'intégrine alpha v, modifie la contraction des artères, 22 souris âgées de 13 à 15 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections dans le ventre sur trois jours consécutifs pour supprimer cette protéine dans les cellules musculaires de leurs vaisseaux, avec pour effets possibles une baisse d'activité et d'appétit, une perte de poids et un pelage hérissé. Quatre semaines plus tard, toutes sont tuées pour prélever leurs artères fémorales. À court terme, le porteur présente ce projet, mené avec un laboratoire européen, comme une "étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun".

Objectifs

Les vaisseaux sanguins doivent rester souples pour permettre au sang de circuler correctement et pour s'adapter aux variations de la pression artérielle. Avec l'âge, ils deviennent progressivement plus rigides, ce qui augmente le risque de maladies cardiovasculaires. Dans nos travaux précédents, nous avons montré qu'un élément présent à la surface des cellules musculaires qui composent la paroi des vaisseaux sanguins, joue un rôle important dans le maintien de leur souplesse. Lorsque cet élément est absente, ces cellules deviennent plus rigides en raison de modifications de leur structure interne ce qui pourrait également modifier la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher normalement. Si cette hypothèse est confirmée, elle permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte de souplesse des artères avec le vieillissement et trouver de nouvelles cible pour développer des médicaments. Pour le vérifier, nous étudierons en laboratoire des segments d'artère prélevés chez des souris âgées de 13 à 15 mois, soit normales, soit dépourvues de l'élement à la surface des cellules musculaires des vaisseaux (souris déficientes). Pour générer la déficiences, nous devrons injecter une molécule dans le ventre 3 jours consécutifs et attendre 4 semaines. Les souris seront euthanasiées pour prélever les artères et étudier leur capacité à se contracter et à se dilater

Bénéfices attendus

Il s’agit ici d’un profit humain : la rigidité artérielle augmente avec l'âge, touchant plus de 60 % des personnes de plus de 60 ans, et s'accompagne d'une altération du bon fonctionnement des vaisseaux sanguins. Ce projet permettra de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter ces altérations. Ce projet est mené en collaboration avec un laboratoire européen. A court terme, ce projet constitue également une étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun, qui contribuera à diffuser ces résultats au sein de la communauté scientifique et à faire progresser les connaissances sur les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Pour déclencher la modification génétique nécessaire à l'étude, les souris recevront trois injections d'un médicament une fois par jour pendant trois jours consécutifs. Elles seront ensuite laissées au repos pendant 4 semaines afin que cette modification soit pleinement effective. À la fin de cette période, les animaux seront euthanasiés de manière conforme à la réglementation en vigueur. Les principales artères seront ensuite prélevées afin d'étudier, en laboratoire, sa capacité à se contracter et à se relâcher. Ces analyses permettront de mieux comprendre le rôle de la protéine d’intérêt dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins et son implication dans le vieillissement des artères.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress léger et temporaire lors de leur manipulation et de leur maintien pendant les injections. Les injections elles-mêmes peuvent provoquer une douleur passagère au point d'administration. Le médicament utilisé dans cette étude, peut entraîner des effets secondaires transitoires, tels qu'une diminution de l'activité, une baisse de l'appétit, une légère perte de poids ou un pelage hérissé. Enfin, la répétition des injections sur trois jours consécutifs peut augmenter légèrement le niveau de stress des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux sont mis à mort afin de prélever les artères fémorales et réaliser leur étude morphologique.

Remplacement

Nos travaux réalisés en laboratoire sur des cellules musculaires issues de la paroi des artères ont montré que l'absence d'une molécule de surface cellulaire modifie leur organisation interne. Ces changements pourraient influencer la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher, un mécanisme essentiel pour réguler la circulation du sang et la pression artérielle. Cependant, ces expériences réalisées sur des cellules isolées ne permettent pas d'étudier les interactions entre les différents types de cellules qui composent la paroi des artères. Or, le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins dépend de la communication entre ces cellules. Il est donc nécessaire d'étudier des artères intactes prélevées chez des souris, afin d'évaluer leur capacité à se contracter et à se dilater dans des conditions proches de celles observées dans l'organisme. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement le fonctionnement complet d'une artère en laboratoire.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude, nous avons réalisé un calcul statistique permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul est basé sur des données préliminaires obtenues par nos collaborateurs et sur le principal paramètre étudié dans le projet. De plus, chaque animal permettra d’obtenir plusieurs fragments d’artères qui pourront être étudiés séparément en laboratoire. Cela permettra de réaliser plusieurs tests sur un même animal, notamment en évaluant la réponse des vaisseaux à différentes molécules capables de stimuler ou de bloquer la protéine ciblée. Cette organisation permet d’obtenir un maximum d’informations scientifiques tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées régulièrement après les injections du médicament, en particulier pendant la semaine qui suit le traitement, afin de vérifier leur état de santé et leur bien-être. Le personnel est expérimenté. Des critères précis de surveillance seront définis pour chaque étape de l’étude. Ces critères permettront d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou de souffrance et de prendre les mesures appropriées si nécessaire, conformément aux règles de protection et de bien-être des animaux utilisés en recherche. La mise en place de points limites adaptés à chaque procédure et d'une grille de score ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus adapté pour cette étude, car elle permet de reproduire de nombreux mécanismes impliqués dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins chez l'être humain. De plus, il est possible de modifier précisément certains gènes chez la souris afin d'étudier le rôle d'une protéine spécifique. Dans ce projet, cette approche permettra de supprimer la protéine ciblée uniquement dans les cellules musculaires des vaisseaux sanguins et uniquement chez des animaux adultes, afin d'étudier son rôle sans perturber le développement normal des artères. Avec l'âge, les vaisseaux sanguins perdent progressivement leur capacité à se dilater et deviennent plus rigides. Cette évolution est liée à des modifications des cellules qui composent la paroi des artères et constitue un facteur important de risque cardiovasculaire. Nous utiliserons donc des souris âgées de 13 à 15 mois, un âge auquel ces changements sont déjà présents et comparables à ceux observés chez les personnes âgées. Ce modèle nous permettra d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt dans un contexte proche du vieillissement naturel et de mieux comprendre son implication dans la perte de souplesse des artères.

1 440 souris nouveau-nées ou juvéniles, âgées de un à vingt-et-un jours, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Pour évaluer des molécules destinées à des épilepsies rares de l'enfant, on leur injecte sous anesthésie gazeuse des candidats médicaments directement dans le cerveau, à travers le crâne encore souple chez les souriceaux de un à trois jours et après incision de la peau chez les plus âgées, avec pour effets possibles un retard de croissance et le rejet par la mère. Les mères et les souriceaux non traités, hors de ce décompte, sont utilisés pour former le personnel à des gestes techniques ou dans un autre projet autorisé. Le porteur qualifie l'incision chez les juvéniles de "nécessaire et justifiée", et l'élargissement à cet âge de "scientifiquement indispensable".

Objectifs

Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgés de 1 à 3 jours par voie intracérébrale (phase développementale cérébrale similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois). [Afin de couvrir une fenêtre développementale plus large et représentative de l'évolution de ces pathologies durant la petite enfance, ce projet intègre également la réalisation d'injections chez des souris juvéniles âgées de 4 à 21 jours (stade de développement correspondant approximativement à la période allant de 6 mois à 3 ans chez l'enfant humain). Cette extension de la fourchette d'âge est scientifiquement indispensable car les cibles thérapeutiques étudiées peuvent s'exprimer de manière différentielle en fonction de l'âge et de la maturité neuronale.] En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale. Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). Les composés étudiés dans ce modèle chez la souris nouveau-née, seront issus de sélection par des tests in silico et in vitro, puis in vivo chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. L’efficacité des meilleurs candidats ainsi sélectionnés sera évaluée dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et dans le but d’être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. [En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques apparaissant dès la naissance ou durant l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), telle que les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (DEEs).] Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. - [De l’administration pré et post-opératoire d’un analgésique et administration pré-opératoire d’un anesthésique local selon l’âge au moment de l’injection. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent générer un léger stress.] Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : [4 mois]).

Devenir

Tous les [animaux] inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Gestion de la douleur, par anesthésies et analgésies adaptées en fonction de l’âge, afin de couvrir les phases d’administration intracérébrale et de prélèvement terminal : - [Souriceaux de 1 à 3 jours] : Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple. - [Juvéniles de 4 à 21 jours : approche chirurgicale avec incision cutanée nécessaire et justifiée par l'évolution physiologique et anatomique inhérente au stade de développement le crâne se renforce, la peau mûrit, la couleur naturelle apparaît et le pelage commence à pousser. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de la Structure de Bien Etre Animal en fonction de l'âge et du poids.] Après l'administration, les animaux font l'objet d'une surveillance attentive et régulière de leur état général et de leur bien-être tout au long de l'étude ([max 4 mois]). Leur rétablissement, leur comportement, leur croissance et leur développement sont évalués à l'aide d'observations adaptées et de critères standardisés. Ces suivis permettent de détecter rapidement tout signe d'inconfort, de détresse ou d'effet indésirable. Une attention particulière est portée à la bonne évolution des animaux, notamment par comparaison avec des animaux de référence. Si un animal présente des signes indiquant que son bien-être est compromis au-delà des limites prédéfinies, des mesures appropriées sont mises en œuvre conformément aux procédures établies afin d'éviter toute souffrance inutile. Afin de réduire le risque de rejet des souriceaux, plusieurs précautions sont prises : la mère est progressivement familiarisée avec les odeurs associées aux procédures, les perturbations de son environnement sont limitées au maximum après la naissance, les manipulations sont organisées de manière à maintenir un contact permanent avec une partie de la portée, et les souriceaux sont réimprégnés des odeurs du nid avant leur retour auprès de leur mère. L'environnement des animaux est enrichi à l'aide de matériaux de nidification et d'éléments favorisant l'exploration et l'expression de comportements naturels

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. [L'utilisation de souris juvéniles de 4 à 21 jours est, quant à elle, requise pour évaluer l’effet de nos composés à un stade plus avancé de la maturation cérébrale (expression des cibles thérapeutiques différentes en fonction de l’âge). Ce stade pré-sevrage est indispensable pour étudier l'impact des traitements pour évaluer une fenêtre thérapeutique plus tardive. L'utilisation de ces deux stades de développement est donc scientifiquement incontournable pour garantir la pertinence translationnelle des résultats vers la clinique pédiatrique humaine pour la pathologie ciblée.] Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours [et des souris âgées de 4 à 21 jours.]

Selon les groupes, les 1 260 souris de ce projet subissent une ou deux opérations du cerveau, quinze jours d'injections intrapéritonéales quotidiennes, une imagerie hebdomadaire sous anesthésie et jusqu'à huit prises de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Des cellules de glioblastome leur sont implantées dans le cerveau pour vérifier si la dopamine libérée pendant un apprentissage modifie la croissance de la tumeur, qui peut entraîner perte d'appétit et de poids, désorientation et déséquilibre. Le porteur prévoit un apprentissage moteur trois fois par jour et un apprentissage de mémoire une fois par jour pendant quinze jours, sans nommer les tâches imposées aux souris.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte, représentant 45 pour cent des tumeurs primaires. Malgré le traitement, la récidive est presque inévitable, avec une survie médiane de 15 mois. Les cellules de GB sont fortement influencées par l’activité des neurones qui, grâce à la libération de plusieurs molécules, modulent la progression de la tumeur. Dans ce cadre, la dopamine est capable de stimuler ou inhiber la croissance tumorale in vitro selon le type de récepteur activé. In vivo, la dopamine est libérée dans un contexte de récompense mais surtout d’apprentissage moteur et cognitif. Notre étude émet l’hypothèse qu’une libération importante de dopamine, à la suite d’un apprentissage de tâche, influence la croissance et le développement du GB in vivo. Afin d’étudier cet aspect, les cellules de glioblastome seront implantées dans le creveau des souris, et la progression tumorale sera évaluée après apprentissage d’une tache motrice. En parallèle, les effets de l’apprentissage d’une tâche de mémoire sur la progression tumorale seront également évalués en implantant les cellules de GB dans le cerveau des souris. Enfin, l’effet de la stimulation directe des neurones dopaminergiques sur la progression des cellules de GB, injectées dans le cerveau, sera investigué.

Bénéfices attendus

L'absence de résultats cliniques significatifs pour le traitement des glioblastomes peut s'expliquer par la complexité et la grande plasticité de ces tumeurs et par le manque de transposabilité aux modèles actuels. La dopamine constitue une thérapie prometteuse, mais des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre leur mécanisme d'action précis dans les tissus tumoraux. Cette étude, en mettant en évidence les principaux acteurs des effets anti-tumoraux de l’apprentissage et de la dopamine, permettra de concevoir des stratégies thérapeutiques non pharmacologiques potentiellement plus efficaces et possiblement en support des médicaments déjà existants sur le long term. Les résultats de ce projet seront accessibles sur le court terme pour les connaissances de base des mécanismes dopaminergique sur le développement de cancer du cerveau.

Procédures

Chirurgie du cerveau: 1 fois ou 2 fois selon la procedure, environ 14 minutes, animal anesthésié. -Traitements pharmacologiques : 1 injections par jour pendant 15 jours, souris vigile. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes, souris anesthésiée. - Prélèvements sanguins (8 fois au total, une fois par semaine) : 10 secondes sur animal anesthésié. Protocole d’apprentissage moteur pour évaluer l'état psychomoteur des animaux : 3 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile. Protocole d’apprentissage cognitif pour évaluer la mémoire chez les animaux :1 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs cérébrales peut générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit et de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre). Les animaux seront également soumis à des douleurs légères mais répétées liées aux injections intrapéritonéales lors de la stimulation pharmacogénétique. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des 1 ou 2 chirurgies. Injection intracrânienne de cellules tumorales et/ou virus : 1 fois, environ 14 minutes, sur animal anesthésié, modéré, nuissance pedant 5 jours (voir pointes limites). -Traitements intrapéritonéal 1 injections par jour pendant 15 jours sur animal vigile, légère, nuissance pedant 15 minutes. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes sur animal anesthésié, légère, nuissances liées a l'anesthésie (hypothermie, depression cardio-respiratoire pedant 10 minutes). - Prélèvements sanguins (8 fois au total) : 10 secondes sur animal anesthésié, légère. Entrainement moteur et cognitive, 1 fois/jour pédant 15 jours sur animal vigile, légère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures afin de prélever les cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance du comportement et de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations fiables afin d’étudier les changements qui se produisent. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur des animaux vivantes reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de processus d’apprentissage.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux sera de 15 animaux, c'est à dire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine, et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Ce nombre permet de atteindre la réalisation d’une conclusion statistique solide à partir de cette population et est justifié compte tenu de la grande variabilité des protocoles comportementaux. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation au maximum de souris sur une période de 5 ans. Toutefois, si l’expérience démontre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Nous attendrons au moins 1 semaine (7 jours) afin de permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le R de raffiner, tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux tout au long de cette étude. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général, comportemental et poids des animaux qui ont été définis et bien décrits dans les procédures. Une grille d’évaluation sera utilisée et la décision de soins conservatives ou de mise à mort des animaux sera pris par l’expérimentateur en accord avec le vétérinaire en suivant des critères bien décrit dans la grille. Pour les protocoles comportementaux, les souris seront habituées pendant 1 heure a la piece de comportement avant le début des tests.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés possédant un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale chez la souris. L'implantation de tumeurs chez la souris est donc essentielle pour rendre compte de la structure tridimensionnelle, de la composition chimique et de l'interaction tumorale avec les différents types des circuits neuronaux et aussi les effets de l’apprentissage moteur et cognitif. Le choix de la souche de souris est basé sur des étudies précédents que utilisent ce modelé en cancérologie et neurosciences. Les protocoles que nous avons établis débuteront à l'âge adulte des souris afin d’éviter les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études dans le domaine et d’avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation dans des animaux adultes permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les chirurgies seront réalisées à l’âge de 8 semaines, et après une période de convalescence décrite, les protocoles d’apprentissage décrits seront réalisés. Du fait de la nécessité de réaliser ces expériences sur des animaux adultes, les souris utilisées seront âgées de 10 à 16 semaines.

Rendues asthmatiques par exposition à des allergènes, 240 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous sédation des instillations dans le nez, dont le nombre et le rythme ne sont pas précisés, avec un risque de fausse route et d'étouffement, et certaines subissent des injections dans l'abdomen. Le projet teste une stratégie repérée sur des cellules bronchiques de patients, comparée à un anti-inflammatoire. En fin de protocole, une trachéotomie sous anesthésie sert à mesurer leur respiration pendant une dizaine de minutes, et elles sont tuées sans réveil pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique chez les patients asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules bronchiques de patients asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules et également de développer une stratégie thérapeutique potentielle. Toutefois, nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de la maladie. Afin d’étudier l’effet de notre stratégie thérapeutique dans le remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet le développement de l’asthme à partir de l’exposition aux allergènes et il nous permet de venir tester l’efficacité de notre stratégie thérapeutique en comparaison à un traitement anti-inflammatoire, molécule classiquement administrée dans l’asthme. L’objectif de ce nouveau projet est d’étudier l’effet synergique potentiel de cette stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme, afin à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes du blocage de la cible d’intérêt thérapeutique potentiel favorisant la mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) et une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires des effets thérapeutiques et leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB. Le bénéfice attendu de l'étude et de la validation de la stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme et à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques et le traitement de leur pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales sous sédation (durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (quelques secondes). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souris pourraient conduire à une fausse route/étouffement. Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale peut être un effet indésirable. L'injectionintrapéritonéale peut engendrer une faible inflammation au site d'injection

Devenir

Chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du muscle lisse bronchique. La procédure est sans réveil en fin de projet et les organes d’intérêt seront prélevés ex vivo pour des analyses.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB et l’efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques ciblant le remodelage du MLB.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de souris minimal par groupe pour obtenir des résultats interprétables. Les expérimentations seront planifiées afin d’obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur le plus faible nombre d’animaux. Chaque protocole nécessite la comparaison des paramètres de fonction respiratoire entre différents groupes de souris exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en pouvant interpréter les résultats. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Des contrôles quotidien permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées selon l'arbre décisionnel mis en place par l'équipe en charge du projet. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. L'anesthésie et l'analgésie sont adaptées à la procédure et prennent en compte l'ensemble des critères d'alerte et d'arrêt des souffrances éventuelles.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister les différents types cellulaires dans leur entièreté. Grâce à un modèle de souris asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. Le modèle souris apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme et pour tester l’efficacité des nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux utilisés sont des souris âgées de 6 semaines.