Souris

Jusqu'à trois prises de sang, un gavage quotidien d'un "composé X" pendant un mois et, pour 360 d'entre elles, seize heures de jeûne suivies d'un gavage de calcium et de huit heures d'isolement pour recueillir l'urine attendent des souris dont certaines lignées portent un gène inactivé dans l'intestin. Au total, 4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce des diarrhées et des effets sur la croissance chez les lignées modifiées. Étudiées de deux semaines à six mois, elles servent à comprendre le rôle de certains gènes dans le métabolisme du calcium et à tester ce composé, qui n'est jamais nommé. La modification ajoute une lignée et 600 souris, sur la base de "la lecture de publication", sans autre justification de l'effectif.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium. Augmentation de l’effectif de 3600 à 4200, soit ajout de 600 souris.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Pour 1 112 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le protocole prévoit selon les groupes jusqu'à deux injections par jour pendant neuf jours, l'implantation sous anesthésie d'une puce à capteur de température, ou une série de cinq à sept tests de comportement. Ces tests portent sur l'interaction sociale, la mémoire, l'anxiété, la locomotion et le seuil de douleur, ce dernier sur une plaque chauffante dont le porteur reconnaît qu'elle "peut entraîner une douleur persistante au-delà de l'arrêt du test". Le THC injecté provoque une hypothermie qui peut durer au-delà de six à huit heures, dans une étude sur le rôle d'une molécule du cerveau, la pregnénolone, face à ses effets. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever sang et cerveau, et les bénéfices se résument à de "nouvelles pistes de recherche" qui "pourront être explorées ultérieurement".

Objectifs

Dans le cerveau, il existe une machinerie, appelée « système endocannabinoïde », qui joue un rôle majeur dans le bon fonctionnement du cerveau, liés notamment aux émotions, à la mémoire et à certains comportements. Le cannabis contient une substance active, appelée THC, qui agit sur ce système. En cas de consommation répétée, le THC peut dérégler ce système et ces modifications peuvent provoquer une dépendance, malgré les conséquences négatives. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’une molécule produite par le cerveau, appelée pregnénolone (PREG). Il a été montré que lorsque le THC arrive dans le cerveau, il augmente la production de cette molécule. Celle-ci agit alors comme un mécanisme naturel de défense en limitant certains effets nocifs du THC. Plus précisément, cette étude cherche à comprendre comment fonctionne ce mécanisme chez la souris, dans des conditions mimant la dépendance au cannabis, et à vérifier si la PREG intervient également dans le fonctionnement normal du système endocannabinoïde, en dehors de la consommation de cannabis. Cette étude permettra de mieux comprendre le fonctionnement du cerveau et les mécanismes impliqués dans les effets de la dépendance au cannabis. À plus long terme, elle pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre l’addiction au cannabis.

Bénéfices attendus

Le THC, en agissant sur le système endocannabinoïde, peut dérégler le fonctionnement de certains comportements liés notamment aux émotions et à la mémoire. Notre organisme a mis en place un système de défense naturel avec la production d’une molécule protectrice, la pregnénolone. Cette production locale lui permet d'exercer une action rapide afin de maintenir des conditions optimales pour le fonctionnement cérébral. Ce projet vise à comprendre les mécanismes d’action du THC et de la pregnénolone dans le cerveau. L’identification de ces mécanismes vise à proposer de nouvelles pistes de recherche. Celles-ci pourront être explorées ultérieurement dans des contextes pathologiques ou thérapeutiques.

Procédures

Les types d’intervention seront les suivants : •584 souris seront anesthésiées sous isoflurane (4% pendant 3 min) avec la mise en place d’une puce RFID (1.25 x 7mm) (en sous-cutanée). •188 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; deux injections par jour espacées de 8h) pendant 9 jours. •396 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; une injection par jour) pendant 6 jours. 144 souris vigiles seront soumises à une injection (30 s par injection). •384 souris vigiles seront soumises à deux injections espacées de 10 min (30 s par injection). •116 souris vigiles seront soumises à des tests comportementaux pendant 4 jours consécutifs. Ces tests ont pour objectif d’étudier les performances d’interaction sociale, les capacités de mémoire, ou des comportements liés à l’anxiété. Sept tests seront effectués chez le même animal avec trois expositions maximum par jour, espacées d’une à deux heures (exposition entre 15 min et 1h pour chaque test). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. •252 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min par jour). Chaque test sera réalisé deux fois avec un intervalle de 6 jours. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception. •384 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min au total). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux et l’administration de substances, ainsi que la contention nécessaire à leur réalisation peuvent entrainer de légères douleur et un incomfort modéré de courte durée. La mise en cage individuelle (avec la présence d’enrichissement dans la cage et sans isolement visuel, sonore et olfactif), de courte durée, peut entraîner un stress modéré. L’exposition sur une plaque chauffante peut entraîner une douleur persistante au-delà de l’arrêt du test (qui a lieu dès l’apparition de signes de douleur ou avec un délai de 30 sec maximum). L’hypothermie, induite par le THC, peut être durable (au-delà du délai de 6 à 8 h, correspondant au retour vers des valeurs normales). L’implantation sous-cutanée d’une puce munie d’un capteur de température, réalisée sous anethésie générale, peut engendrer un petit saignement et une légère réaction inflammatoire au niveau du site de l’implantation, et une hypothermie de courte durée.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer des échantillons (sang, structures cérébrales et/ou biopsie de queue) nécessaires pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Ces approches ont permis d’identifier comment notre molécule d’intérêt se liait à sa cible, et ces connaissances ont permi de créér le modèle d’étude. Ce modèle a été validé par des approches in vitro (modèles cellulaires) avant d’être étudier chez l’animal. Bien que nous menons ces études in vitro, qui permettent certes d’appréhender certains processus moléculaires; ce projet a pour objectif l’étude de systèmes intégrés (mettant en jeu des comportements), qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal vivant.

Réduction

Nous avons utilisé une formule de calcul qui permet d’ajuster le nombre d’animaux par groupe en fonction de la variabilité des paramètres mesurés. Nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées. Les effets analysés seront les effets du traitement, du génotype et du sexe. Le nombre d’animaux sera optimisé en combinant les stratégies suivantes. Tout d’abord, nous effectuerons plusieurs tests chez les mêmes animaux, lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience. De plus, des études pilotes seront réalisées (chez un nombre réduit d’animaux) afin de déterminer les conditions expérimentales optimums. Selon les résultats, les groupes seront complétés avec la condition la plus appropriée. Aussi, des efforts de réduction seront réalisés pour la production des animaux transgéniques, en adéquation avec les besoins expérimentaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance pouvant être imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour améliorer le bien-être des animaux : (1) Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et des critères d’arrêt seront mis en place si nécessaire. (2) La mise en cage individuelle temporaire sera réalisée dans des conditions pour maintenir des contacts olfactifs, sonores et visuels entre les animaux. (3) La manipulation des animaux se fera à l’aide des tunnels en carton présents dans les cages, afin de réduire le stress pouvant être lié à cette manipulation. (4) L’administration (locale ou générale) d’analgésiques est prévue pour minimiser les douleurs éventuelles liées à certaines procédures. (5) De nouvelles règles pourront être mises en place au cours du projet sur la base de données scientifiques ou réglementaires, et/ou de préconisations faites par le responsable du bien-être animal et du vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des modifications génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’être humain. La souris permet d'étudier des mécanismes conservés du système endocannabinoïde et dispose de modèles génétiques et comportementaux adaptés. De plus, les effets comportementaux étudiés dans ce projet ont été clairement décrits et validés chez la souris. Enfin, le modèle murin utilisé dans le projet a été validé. Tous les animaux utilisés seront de jeunes-adultes car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications majeures, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité des mécanismes étudiés dans ce projet et renforce la pertinence des résultats obtenus.

Pour produire des marqueurs d'imagerie destinés à de futures évaluations précliniques de traitements, 146 souris, dont des porteuses d'une mutation liée à un syndrome de déficience intellectuelle, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. La lignée mutante présente une susceptibilité accrue à l'épilepsie, avec un suivi des crises spontanées. Les souris passent trois tests de comportement sur la mémoire à court terme, la mémoire des événements vécus et l'orientation dans l'espace, sans que leurs noms soient donnés, puis sont transportées vers un second établissement pour environ deux heures trente d'IRM sous anesthésie gazeuse, et une partie subit une chirurgie terminale sans réveil. Le porteur annonce aussi vouloir "développer et standardiser" chez la souris la méthode d'imagerie GluCEST, c'est-à-dire fournir un outil pour d'autres expériences sur des souris.

Objectifs

Le syndrome deéficience intellectuelle étudié est une maladie génétique rare qui affecte le développement du cerveau. Les personnes atteintes présentent souvent une déficience intellectuelle, une tête plus petite, un retard de croissance, des troubles du spectre de l’autisme et une susceptibilité accrue à l'épilepsie. Cette maladie est causée par des anomalies d'un gène, qui joue un rôle essentiel dans la formation et le fonctionnement du cerveau. Des recherches récentes ont montré que lorsque ce gène ne fonctionne pas correctement, certaines cellules nerveuses importantes migrent mal au cours du développement. Cela perturbe l'équilibre entre les signaux qui stimulent et ceux qui freinent l'activité cérébrale. L’objectif de ce projet est donc de caractériser les altérations cérébrales associées à la déficience intellectuelleétudiée, chez un modèle de souris, (portant la même anomalie génétique et présentant des caractéristiques proches de celles observées chez les patient) par plusieurs techniques d'imagerie par résonance magnétique (IRM) ainsi que des tests comportementaux. Cette approche fournira des biomarqueurs d'imagerie utilisables comme critères de jugement intermédiaires pour les futures évaluations thérapeutiques précliniques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Sur le plan fondamental, ce projet qui se déroulera au sein de 2 Etablissements Utilisateurs permettra de mieux comprendre comment la perte partielle du gène d'intérêt affecte le fonctionnement du cerveau, ainsi que d'autres troubles du développement neurologique liés à un déséquilibre entre les signaux excitateurs et inhibiteurs des neurones. Grâce à une technique d'imagerie appelée GluCEST, il sera possible de mesurer le glutamate qui est la principale molécule excitatrice dans l'ensemble du cerveau de souris porteuses de cette anomalie génétique et de vérifier si ce déséquilibre, déjà observé au niveau des cellules, est également présent à l'échelle de l'organisme entier. Ce projet pourrait aussi avoir des retombées pour les patients. En effet, l'identification de marqueurs visibles à l'IRM pourrait faciliter le diagnostic et le suivi de la maladie chez l'Homme, mais aussi servir à évaluer l'efficacité de futurs traitements lors d'essais précliniques. Enfin, ce travail contribuera à développer et standardiser l'utilisation de la méthode GluCEST chez la souris pour l'étude des maladies neurodéveloppementales, le système glutamatergique étant impacté dans un grand nombre de ces pathologies..

Procédures

Les souris ne reçoivent aucun traitement pharmacologique dans le cadre de ce projet (en dehors des anesthésiques et de l'analgésie locale liés aux procédures elles-mêmes). Les interventions sont les suivantes : Dans le premier établissement utilisateur : 3 tests comportementaux passifs permettant d’évaluer la mémoire à court terme, les souvenirs d'événements vécus et l'orientation dans l'espace: 1 fois par animal et par test, durée maximale 20 min/test. Transfert entre les établissements utilisateurs (1 fois). Dans le deuxième établissement utilisateur : Anesthésie gazeuse pour l'IRM : Durée totale environ 2h30. • pour une partie des animaux : une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil d’une durée de 20 minutes et résulte en la mort des animaux

Impact sur les animaux

Nuisances liées au phénotype dommageable : la lignée génétiquement modifiée présente une susceptibilité accrue à l'épilepsie, congénitales et stables. Une surveillance dédiée est mise en place. Nuisances liées aux procédures : • L'IRM sous anesthésie entraîne une diminution de la température corporelle et un risque de dépression respiratoire, gérés par le chauffage et le monitorage en continu. • Le transfert entre sites engendre un stress, atténué par les cages sécurisées et l’acclimatation de 2 semaines. • La chirurgie terminale est réalisée sous anesthésie profonde sans réveil. Elle induit un stress et une douleur de courte durée au moment de l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie et une dépression cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêt (cerveaux).

Remplacement

La compréhension des mécanismes physiopathologiques et des altérations cérébrales associées au syndrome de déficience intellectuelle étudié nécessite l'étude d'un organisme entier. La caractérisation in vivo de la connectivité cérébrale, de la microstructure tissulaire et des mécanismes chimiques impliquant le glutamate nécessite l’utilisation d’animaux vivants et de techniques d’imagerie comme l’IRM. De même, l’évaluation comportementale ne peut être réalisée que sur un organisme entier. À l’heure actuelle, les méthodes alternatives telles que les cultures de cellules, les organoïdes ou les simulations informatiques ne sont pas capables de reproduire toute la complexité du cerveau adulte et de son fonctionnement. La souris est l'espèce mammifère la plus proche de l'Homme dans laquelle nous disposons d'un modèle génétique reproduisant fidèlement la pathologie humaine.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été dimensionnés sur la base de nos études IRM antérieures permettant de déterminer le minimum d'animaux pour une analyse statistique de puissance suffisante. L'utilisation des animaux issus de l'élevage existant et la mutualisation des animaux entre modalités (comportement → IRM → prélèvements terminaux sur le même animal) permettent de réduire le nombre à 130 animaux expérimentaux (146 total).

Raffinement

Compte tenu du phénotype dommageable de la lignée étudiée, une surveillance dédiée est mise en place, intégrant la grille faciale de douleur de la souris et un suivi spécifique des crises épileptiques spontanées. Les conditions d'élevage sont enrichies (nidification doublée, tunnel) et l'hébergement en groupes assure une vie sociale, particulièrement importante pour cette lignée présentant des phénotypes de type Trouble du Spectre Autistique. Une semaine avant les tests de comportement les animaux sont habitués à être manipulés par l’expérimentateur. Le transport entre les 2 établissements utilisateurs se fait dans des cages spécialisées avec nourriture et eau gélifiée. Une période d’acclimatation de 2 semaines est respectée avant les examens IRM. L'anesthésie IRM est optimisée sur des animaux indépendants ; le monitorage continu (respiration, température) et le maintien thermique limitent les complications anesthésiques. Les yeux des animaux sont protégés à l’aide d’un gel ophtalmique et ils sont réhydratés à l'issue des IRM. Les prélèvements terminaux sont réalisés lors de la chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies génétiques humaines : sa physiologie et sa génétique sont bien connues, et les méthodes de manipulation génétique y sont les plus développées. La nécessité d'utiliser une lignée transgénique est liée à l'absence de modèle spontané de la lignée génétiquement modifiée. Le modèle utilisé dans ce projet reproduit fidèlement les phénotypes clés observés chez les patients. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 2 mois). À cet âge, le développement cérébral est complet, le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont stables, et les phénotypes neuroanatomiques de la lignée génétiquement modifiée (microcéphalie, microstructure tissulaire) sont pleinement exprimés.

60 souris âgées de quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une dent leur est extraite puis réimplantée, avec ou sans une molécule censée régénérer le ligament qui la relie à l'os, et elles peuvent ensuite avoir du mal à se nourrir, d'où une alimentation molle. Les analyses ont lieu quatre semaines après l'opération, sur la mâchoire supérieure prélevée après la mise à mort, et les applications annoncées en dentisterie restent au conditionnel. Parmi les bénéfices, le porteur affirme que sa molécule pourrait remplacer le traitement de référence, un produit d'origine animale, pour "réduire l'utilisation de produits d'origine animal".

Objectifs

Le ligament parodontal est un tissu souple qui relie la dent à l’os de la mâchoire. Très fin (environ un quart de millimètre), il agit comme un véritable amortisseur et permet à la dent de résister aux forces exercées lors de la mastication. Grâce à un réseau de fibres et de cellules spécialisées, il joue un rôle essentiel dans le maintien de la dent et dans le renouvellement des tissus environnants, comme l’os et la surface de la racine dentaire. Il s’agit d’un tissu vivant, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins, capable de s’adapter en permanence. Avec l’âge, les infections bactériennes ou certaines maladies chroniques inflammatoires, ce ligament s’amincit, se fragilise et perd progressivement ses fonctions. Cela peut conduire au déchaussement des dents. Dans certaines situations cliniques, notamment lors de la pose d’implants dentaires, ce ligament est totalement absent. Si les fibres et les cellules responsables de l’attachement de la dent et du renouvellement des tissus ont déjà été largement étudiées, les vaisseaux sanguins du ligament restent en revanche mal connus. Pourtant, ils sont indispensables à la vitalité du tissu : ils assurent l’apport de nutriments, le bon fonctionnement des nerfs, le renouvellement des cellules et le maintien de la structure du ligament. Il existe des molécules naturellement présentes dans ce tissu, qui jouent un rôle clé dans la formation et le maintien des vaisseaux sanguins. Lorsque ces molécules sont altérées, le ligament perd sa structure et sa capacité à fonctionner correctement. À partir de ces découvertes, nous avons développé une nouvelle molécule capable de stimuler la réparation des vaisseaux et de favoriser la régénération du tissu. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet réparateur de cette molécule sur la régénération du ligament parodontal. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, basé sur l’extraction puis la réimplantation d’une dent. Les résultats obtenus avec cette nouvelle approche seront comparés à ceux d’un traitement de référence déjà utilisé en dentisterie, ainsi qu’à un support neutre servant de contrôle [MAIS AUSSI UNE NOUVELLE MOLECULE PROMETTEUSE]. Nous analyserons différents paramètres, tels que l’épaisseur du ligament, la dégradation de la racine dentaire ou la fusion anormale entre la dent et l’os. Des analyses microscopiques permettront également de suivre l’évolution du tissu pendant un mois et d’évaluer la qualité de sa régénération.

Bénéfices attendus

L’ambition du projet est d’exploiter des propriétés nouvelles mise en évidence pour une molécule recombinante pour améliorer les performances du ligament parodontal. Cela pourrait permettre une meilleure prise en charge des traumatismes dentaires, le développement d’implants dentaires bio-intégrés, l’optimisation des traitements orthodontiques et le traitement des maladies du ligament parodontal. De plus, le traitement utilisé actuellement est un produit d’origine animale dont le mode d’action est peu connu. Notre molécule recombinante pourrait remplacer ce produit pour réduire l’utilisation de produits d’origine animal.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie avec extraction dentaire puis réimplantation avec ou sans la molécule d'intérêt. Cette intervention durera quelques minutes. Les analyses se feront 4 semaines après l'intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Des douleurs d'intensités légères pourront être ressenties sur une durée limitée (quelques heures) lors des injections et après la chirurgie. Il y a également des risques d'infection ou de saignement du site opératoire au moment de l'extraction. Les souris pourront ensuite avoir des difficultés à se nourrir correctement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par du personnel formé afin que les prélèvements du maxillaire en vue des études histologiques prévues puissent être faits.

Remplacement

Ces expériences doivent être réalisées sur un modèle animal, car il n’est pas possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un tissu vivant. Seules des études menées chez l’animal permettent d’observer des phénomènes essentiels comme la formation des vaisseaux sanguins et la cicatrisation, dans des conditions proches de celles du corps humain. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés pour mettre au point la molécule utilisée et définir la meilleure façon de l’employer. Toutefois, avant toute application chez l’humain, il est indispensable de passer par des études précliniques sur l’animal. Dans le cadre de ce projet, ces travaux seront menés chez le rongeur. Ces études permettent de vérifier si la molécule est efficace, si elle fonctionne correctement dans un organisme vivant et si elle favorise réellement la régénération du ligament qui maintient la dent. Les résultats obtenus chez l’animal constituent une étape clé avant toute évolution vers une application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique a priori. Des expérimentations in vitro ont déjà été menées sur cette nouvelle molécule pour déterminer la formulation optimale

Raffinement

Afin de limiter leur stress, une période d’adaptation est prévue pour les habituer progressivement aux déplacements vers la salle de chirurgie. Pendant l’intervention, les animaux seront endormis puis maintenus sous anesthésie de façon adaptée à la chirurgie réalisée dans la bouche. Des traitements contre la douleur seront administrés avant et après l’opération afin d’assurer leur confort. Un gel protecteur sera appliqué sur les yeux pendant l’intervention pour éviter toute sécheresse. À la fin de la chirurgie, une solution hydratante tiède sera administrée afin de prévenir la déshydratation. Le réveil se fera dans des conditions contrôlées, sur un support chauffant, et chaque animal sera placé temporairement dans une cage individuelle pour éviter tout risque lié au contact avec d’autres animaux encore éveillés. Une fois complètement réveillé, l’animal sera replacé dans sa cage habituelle. Après l’intervention, une alimentation molle sera proposée pour faciliter la prise de nourriture et éviter tout déplacement de la dent traitée. Une attention particulière sera également portée à une bonne hydratation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à ce que les points limites définis ne soient pas atteints. Une procédure précise de décisions sera mise en place par l'expérimentateur en collaboration avec le personnel de l'animalerie.

Choix des espèces

Le projet utilise un modèle murin déjà décrit. La molécule que nous voulons tester a déjà été utilisée dans le modèle de rétine postnatale de souris et s’est avéré fonctionnelle et sans effet délétère dans cette espèce. Les souris utilisées seront âgées de 4 semaines qui correspond à un âge ou le ligament parodontal est bien établi et fonctionnel.

Chaque souris subit une chirurgie du cerveau d'une trentaine de minutes, pour y injecter un virus ou y implanter des canules et des sondes de microdialyse. 630 souris mâles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si le prucalopride, un médicament contre la constipation, réduit rapidement l'anxiété, en comparaison avec la fluoxétine et le diazépam. Le porteur affirme que "Les nuisances pour ces animaux sont faibles" et que l'implantation n'est qu'une "gène légère", au motif que le cerveau est dépourvu de fibres de la douleur, et il ne nomme pas le test comportemental que passe chaque souris. Toutes sont tuées à l'issue par perfusion d'un fixateur sous anesthésie, qui vide leur corps de leur sang, pour étudier leur cerveau.

Objectifs

Les troubles anxieux sont parmi les maladies psychiatriques les plus fréquentes dans le monde. Ils impactent de façon important la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que leur capacité à travailler et à mener une vie normale. Aujourd’hui, les traitements disponibles ne sont pas efficaces pour tout le monde : environ 40 % des patients ne répondent pas suffisamment. Les médicaments les plus utilisés, appelés antidépresseurs, mettent plusieurs semaines avant d’agir. Pour soulager plus rapidement les symptômes, d’autres médicaments comme les benzodiazépines sont souvent prescrits, mais ils peuvent entraîner des effets secondaires importants comme une dépendance, une somnolence ou des troubles de la mémoire. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques, à la fois plus rapides et mieux tolérées. Une piste prometteuse serait de cibler des récepteurs à la sérotonine présent dans les régions du cerveau impliquées dans la régulation de l’humeur. Un médicament déjà utilisé chez l’Homme pourrait agir sur ces récepteurs et produire des effets bénéfiques sur l’anxiété et l’humeur. Des études chez l’animal ont déjà montré des résultats encourageants, notamment après des traitements prolongés. L’objectif de ce projet est d’évaluer si ce médicament peut également agir rapidement après une seule administration, et de comparer ses effets à ceux des traitements actuellement utilisés pour soulager rapidement les troubles anxieux. Le projet vise aussi à mieux comprendre les mécanismes dans le cerveau qui expliquent ces effets, en s’intéressant à des régions cérébrales impliquées dans les réponses au stress. Ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une prise en charge plus rapide et plus sûre des troubles anxieux

Bénéfices attendus

Cette étude sera la première à examiner les effets anxiolytiques rapides après une administration unique du prucalopride, utilisé chez l’homme dans la prise en charge symptomatique de la constipation chronique idiopathique, dans le modèle de souris adultes mâles, comparé à un antidépresseur de référence, la fluoxétine et à une benzodiazépine de référence, le diazépam. Les résultats de cette étude fourniront des informations sur l’intérêt de repositionner le prucalopride en tant que nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des troubles anxieux. Cette approche permettra de diminuer le recours aux benzodiazépines et donc d’offrir une alternative thérapeutique plus sécurisée pour les patients. Vu que le prucalopride est actuellement approuvé pour l’utilisation chez l’Homme il est réaliste d’envisager une future inclusion du prucalopride au sein de l’arsenal thérapeutique actuel pour la prise en charge des troubles anxieux. De plus nous serons les premiers à mettre en évidence les effets prosociaux du prucalopride, ce qui représente un intérêt certain dans la prise en charge du troubles anxieux et fournira également un point de départ pour des recherches concernant d’autres troubles impliquant une altération de la sociabilité. Enfin, cette étude s’inscrit dans la continuation des travaux explorant simultanément les dimensions comportementales et les circuits neuronaux, en lien avec la modulation des comportements de type anxieux. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes qui sous-tendent l'activité des anxiolytiques et pourraient conduire au développement de nouveaux traitements pour les troubles anxieux d’une façon plus ciblées.

Procédures

Les chirurgies d'administration de virus et d'implantation des canules au niveau du cerveau seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques, une seul fois par animal, et durent environ 30 minutes par opération. Chaque animal ne subira qu’un seul test comportemental lors des procédures et ceux-ci durent moins de 30 minutes et n'impliquent pas de douleur. Après les expériences, les animaux seront perfusés sous anesthésie (sans réveil) par une solution de fixation pour permettre de préserver les cerveaux en vue de les étudier.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations intracérébrales seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportementaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable, la dialyse a lieu pendant 3 à 4 heures sans manipulation de l'animal et les tests comportementaux effectués 30 minutes après administration locale ne durent que 5 minutes. Les implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. En effet, le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires sont réalisées chez l'humains sous simple anesthésie locale. La perfusion des animaux par la solution de fixation tissulaire implique d’extraire le sang de l’animal inconscient, sous anesthésie et antidouleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales car nous souhaitons explorer différents paramètres neuronaux à partir de tissus cérébraux prélevés après euthanasie.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui induisent une réponse neurochimique ou comportementale n'est à ce jour pas modélisable. Ainsi seul un animal entier vivant et vigile permet d'appréhender ces éléments.

Réduction

Une étude statistique préalable nous a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour pouvoir mener cette étude. Cela a été fait grâce à un calcul de puissance effectué pour nos tests comportementaux dont les données présentent la plus grande variance.

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Par ailleurs un anti inflammatoire est utilise le jour de la chirurgie. Si l'animal présente un état physiologique anormal (immobilité, prostration, signes de souffrances, perte de poids supérieur à 20% par rapport au poids à 8-10 semaines), l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

À ce jour, les mécanismes impliqués dans les effets anxiolytiques restent mal compris et ne peuvent être reproduits ni simulés par des modèles in vitro. Des animaux adultes seront utilisés car nous nous intéressons à l’étude de l’effet anxiolytique chez l’adulte. De plus, l’espèce choisie permet de faire les modifications génétiques nécessaire pour étudier l’activités des circuits de neurones impliqués.

Les souris qui font plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique sont mises à mort. 66 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie, et 50 d'entre elles, issues d'une lignée transgénique, sont rendues malades d'une glycogénose de type Ia par cinq jours d'injections. Après une biopsie à l'âge de 7 à 10 jours, elles reçoivent un virus modifié dans la circulation sanguine, puis des tests au glucose et à l'insuline avec jusqu'à six gouttes de sang prélevées à la queue par test, et un jeûne final de 6 ou 16 heures. Le porteur décrit des hypoglycémies sévères qui entraînent "un mal-être qui peut être important, voire le décès de l'animal s'il n'est pas pris en charge". Pendant ce jeûne, une souris en hypoglycémie est exclue du projet, l'injection de virus étant alors jugée inefficace.

Objectifs

La glycogénose de type I est une maladie génétique rare causée par un défaut dans un gène qui joue un rôle clé dans la production de sucre (glucose) par le foie. Lorsqu'il ne fonctionne pas correctement, le corps ne peut pas produire de glucose en interne, ce qui entraîne de graves baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies). De plus, des accumulations de glycogène (polymère de glucose) et de graisses se forment dans le foie, ce qui peut provoquer des problèmes hépatiques à long terme, allant jusqu’au développement de tumeurs pouvant nécessiter une greffe du foie. Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour cette maladie. Les patients doivent suivre un régime alimentaire très strict pour éviter les hypoglycémies, en mangeant régulièrement des sucres lents (Maïzena crue). La thérapie génique est une piste prometteuse ; elle consiste à introduire un gène fonctionnel dans le foie à l’aide de virus modifiés qui servent de « transporteurs » du gène médicament. Une étude sur un modèle viable de souris atteintes de glycogénose de type I a montré que l’injection unique de ce traitement permettait de restaurer la production de glucose par le foie et d’éviter l’apparition de tumeurs. Deux types de vecteurs ont été testés. Mod le 5/09/26 Le premier semble plus efficace mais l’expression du gène médicament n’est pas régulée par l’insuline. Le deuxième, bien que moins efficace, est sensible aux régulations hormonales. Ces régulations sont importantes car l’insuline est une hormone qui contrôle le taux de sucre dans le sang. Elle est produite par le pancréas après un repas pour éviter que les taux de glucose dans le sang soient trop élevés. L’absence de régulation hormonale de l’expression du gène médicament pourrait dérégler l’équilibre de glucose dans le corps, et potentiellement favoriser une résistance à l’insuline, surtout en cas d'alimentation déséquilibrée, voire une hyperglycémie, qui sont les caractéristiques du diabète. Mod le 5/09/26 Les objectifs de ce projet seront 1) d’étudier l’impact de la thérapie génique sur l’équilibre du glucose et la réponse à l’insuline chez des souris atteintes de glycogénose, et 2) de comparer l’efficacité des deux vecteurs utilisés en analysant l’expression du gène médicament dans des conditions optimales, c’est-à-dire au cours du jeûne, lorsque l’organisme a besoin de produire du glucose pour maintenir sa glycémie.

Bénéfices attendus

Le taux de sucre dans le sang (glycémie) doit être très bien régulé. Si le foie produit trop de glucose, cela peut entraîner un risque de diabète, surtout chez les personnes ayant une alimentation déséquilibrée et un excès de poids. Les patients atteints de glycogénose de type I ne produisent pas de glucose eux-mêmes, donc ils doivent manger régulièrement des sucres lents tout au long de la journée et même la nuit. Ce régime constant peut les rendre moins sensibles à l'insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. La thérapie génique pourrait leur permettre de produire du glucose, mais selon la méthode utilisée, elle pourrait aussi modifier l’équilibre glycémique et, à long terme, augmenter le risque de diabète, surtout si leur alimentation n’est pas adaptée. Ce projet vise à mieux comprendre comment la thérapie génique influence la régulation du glucose chez des souris atteintes de glycogénose, en particulier après les repas et au cours du jeûne. L’objectif est de trouver la meilleure approche pour optimiser ce traitement et, si nécessaire, donner des recommandations alimentaires aux patients pour éviter d’éventuels effets secondaires.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Toutes les souris transgéniques seront traitées par thérapie génique par une injection unique du vecteur dans la circulation sanguine. Pour cela, les souris seront immobilisées dans un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (durée d’environ 1 minute). Mod le 05/09/26 Toutes les souris seront nourries en régime standard. Pour analyser la régulation de leur glycémie, les souris recevront une injection de glucose ou d’insuline (quelques secondes) et leur glycémie sera mesurée régulièrement pendant 2 heures. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 6 fois au cours de chaque test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Au total, 3 prises de sang (par massage de la queue pendant 30 secondes) seront aussi réalisées avant et après l’injection du glucose pour suivre la sécrétion d’insuline. Mod le 05/09/26 En fin de procédure, les souris seront mises à jeun, 6h ou 16h. Une prise de sang (durée quelques secondes) sera réalisée juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : -l’induction de la glycogénose de type I qui est une maladie entrainant des hypoglycémies sévères quand les animaux ne mangent pas (entre les repas). Le développement des hypoglycémies entraine un mal-être qui peut être important, voire le décès de l’animal s’il n’est pas pris en charge. -la biopsie de tissu et les injections peuvent entrainer une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour réaliser ces gestes induit un léger stress. -la prise de sang peut entrainer une légère douleur. Mod le 05/09/26- la période de jeûne de 16h qui peut rendre les animaux agités.

Devenir

Mod le 5/09/26- Afin de caractériser l’effet des traitements sur le métabolisme hépatique et déterminer le pourcentage de cellules du foie guéries et le nombre de particules virales, le foie sera prélevé en fin d’expérience. Pour cela, tous les animaux devront être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui, on sait fabriquer en laboratoire de mini-foies appelés organoïdes, qui contiennent différents types de cellules du foie (comme les hépatocytes, les cellules biliaires ou encore les cellules immunitaires). Cependant, la thérapie génique ne peut pas être testée uniquement sur ces mini-foies, car elle repose sur l’injection de virus modifiés dans le sang pour transporter le gène médicament. Pour fonctionner, ces vecteurs doivent atteindre les cellules du foie (hépatocytes) en traversant les petits vaisseaux sanguins. Or, toutes les cellules du foie ne seront pas forcément corrigées. L’efficacité du traitement dépend donc de la quantité de cellules qui reçoivent le gène. C'est pourquoi il est essentiel de tester cette thérapie dans un organisme entier, où la circulation sanguine et le fonctionnement du foie sont aussi proches que possible de la réalité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour cette étude a été calculé avec précision, en tenant compte des connaissances actuelles sur la maladie, du modèle animal choisi, du fonctionnement du métabolisme du sucre et de l’énergie, des résultats d’expériences précédentes et d’une approche statistique. Au total, ce projet réalisé sur 2 ans nécessitera 66 (mod le 5/09/26) souris mâles, dont 50 souris atteintes de la maladie et traitées par thérapie génique et 16 souris saines servant de groupe témoin.

Raffinement

-Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, l’induction de la maladie sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. -La maladie étudiée ne se développe que dans le foie des souris adultes, ce qui évite des complications comme des hypoglycémies graves et protège les souris pendant leur développement. - Avant que la maladie n’apparaisse, les souris seront habituées à boire du glucose à la pipette. Ainsi, si leur taux de sucre baisse légèrement, elles accepteront plus facilement cette solution. - Pour éviter les hypoglycémies, les souris auront un accès facile à la nourriture (croquettes dans la cage, biberons adaptés). En cas d’hypoglycémie sévère, une injection de glucose sera réalisée, et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir leur température. Une grille d’évaluation permettra de surveiller les signes d’hypoglycémie. L’apparition de plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique constitue un point limite nécessitant l’euthanasie de la souris pour raison éthique. Mod le 5/09/26- lors de mises à jeu, les souris seront hébergées dans des grandes cages, en conservant un enrichissement, ainsi que l’accès à l’eau; et les cages seront mises en partie sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle de l’animal. Nous nous assurerons de l’efficacité de la thérapie génique au cours de ce test par mesure de la glycémie. En cas d’hypoglycémie, la souris sera exclue du projet puisque l’injection de virus n’aura pas été efficace. -Les souris seront manipulées avec un tunnel pour limiter leur stress. -Pour réduire la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones de ponction du sang et d’incision. -Une grille de score aidera à prendre des décisions en cas d’observation d’un mal-être et décrit les points limites au-delà desquels les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. La maladie sera induite à l’âge de à 5 semaines. Une période de 5 semaines suivant ces injections permet la disparition des effets potentiels sur le métabolisme du produit injecté lors de l’induction de la maladie. Les souris seront traitées par thérapie génique à l’âge de 10 semaines. Les souris saines témoins seront commandées dès l’âge de 4 semaines.