Souris

Les 680 souris de ce projet sont immunodéficientes, sans système immunitaire fonctionnel, pour accepter des greffes de cellules souches sanguines humaines porteuses d'un gène lié à une leucémie de l'enfant. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : deux injections de cellules sous anesthésie, puis vingt injections sur souris éveillées, dont le contenu n'est pas précisé. Si la leucémie se développe, le porteur décrit perte de poids, dos courbé, yeux rétrécis et moindre exploration, et il évoque la gêne de mini-os humanisés dont la pose ne figure pas parmi les procédures. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever moelle osseuse, rate et mini-os, et y compter les cellules pré-leucémiques.

Objectifs

L’hématopoïèse est le processus par lequel notre corps fabrique toutes les cellules du sang. Après la naissance, ce phénomène a lieu dans la moëlle osseuse, à partir de cellules souches et de cellules directement issues des cellules souches appelées progéniteurs hématopoïétiques. Si une étape est modifiée dans ce processus ou si l’environnement de la moëlle osseuse est perturbé, cela peut entraîner des maladies du sang, comme les leucémies. La leucémie aiguë lymphoblastique B (LAL-B) de l’enfant est liée à un gène anormal. Elle représente une part importante des cas de leucémie pédiatrique. Ce gène anormal s’exprime dans une cellule dont on ne connaît pas encore l’origine, déclenchant des changements précoces pouvant mener aux symptômes cliniques de la leucémie. Actuellement, nos connaissances sur les modifications cellulaires précoces induites par ce gène anormal sont limitées, car la plupart des études sur ce sujet se concentrent sur des jeunes patients déjà diagnostiqués pour cette LAL-B. Nous pensons qu’au cours du développement, certaines cellules spécifiques du tissu hématopoïétique pourraient être particulièrement sensibles à ce gène anormal. Nous utiliserons des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques humains sur lesquels nous travaillons depuis de nombreuses années, dans lesquels sera exprimé le gène anormal, et nous suivrons le devenir des cellules modifiées après leur transplantation dans des modèles de souris immunodéficientes permissives aux greffes d’origine humaine. Notre projet a deux objectifs principaux : 1) Identifier les cellules à l’origine des changements pré-leucémiques (modifications cellulaires précoces), afin de mieux comprendre comment la maladie est initiée. 2) Étudier l’influence d’un environnement de moëlle osseuse humanisée (mini-os humanisés), sur le développement des étapes pré-leucémiques induites par l’anomalie génétique.

Bénéfices attendus

Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients. Dans le cas de leucémies lymphoblastiques pédiatriques de type B, les premières cellules sensibles à la transformation pathologique ne sont pas connues. De plus l'environnement autour de ces cellules jouerait un rôle important dans ce processus. Ainsi, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies de l’enfant.

Procédures

- 2 injections de cellules sous anesthésie, avec analgésie, 5 minutes, 680 animaux - 20 injections sur animaux vigiles, 30 secondes, 680 animaux

Impact sur les animaux

Toutefois, si le développement d’une leucémie se produit, la souris peut avoir des comportements évocateurs d’une souffrance, d’une douleur, d’un mal-être tels que : une perte d’appétit, une perte de poids, une négligence d’entretien du poil et de son hygiène, une courbure au niveau du dos, une perte d’intérêt à l’exploration et la découverte de son environnement, un rétrécissement des yeux, une réduction des mouvements.Les injections en vigile peuvent entrainer une douleur ; d’autre part la présence des mini-os humanisés peut être source de gêne, ou d’inconfort pour l’animal.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure. Les tissus/organes hématopoïétiques (moëlle osseuse, rate, mini-os) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront analysées pour identifier la quantité et la qualité des cellules pré-leucémiques (modifiées) présentes dans les organes en question.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un organisme entier. Les méthodes de culture cellulaire (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui ont lieu dans un corps entier vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir mimer fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moëlle osseuse ou dans d'autres organes. Par ailleurs, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire.

Réduction

Les groupes d’étude comprendront 20 souris. Ce nombre de 20 souris correspond au nombre de répétitions de manipulations intégrant le nombre d’expériences prévues et le nombre de souris par expérience ; ceci permettra d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, elles seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des maisons en cartons pour plus de confort. Les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.

Choix des espèces

La génétique et le comportement des souris étant bien connus, il est facile de mesurer leur bien-être, souffrance et stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.

Pour mettre au point l'administration de molécules marquées par un régime liquide, à la place d'une perfusion par cathéter posé chirurgicalement, 60 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent deux prises de sang à la queue, 24 d'entre elles une échographie sous anesthésie, et 12 sont hébergées deux mois à 30 °C pour rendre leur graisse brune dysfonctionnelle. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Un avis vétérinaire est prévu à partir de 10 % de perte de poids, et la mise à mort au-delà de 20 %.

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

La moitié des 2 064 souris passent jusqu'à 24 semaines seules en cage, toutes subissent une chirurgie et développent une douleur chronique, puis un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 à 72 heures pour certains tests. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, après une chirurgie terminale de prélèvement de tissus. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", qui cherche comment l'isolement aggrave la douleur chronique chez les patients. Il annonce quatre tests de douleur et sept tests comportementaux d'anxiété et de dépression sans en nommer aucun, ni dire comment la douleur chronique est provoquée.

Objectifs

La douleur chronique affecte environ 7 à 10 % de la population mondiale et demeure, dans de nombreux cas, réfractaire aux approches thérapeutiques actuellement disponibles. Elle représente ainsi un enjeu majeur de santé publique en raison de son impact considérable sur la qualité de vie des patients, mais également sur les systèmes de soins et les coûts socio-économiques qui lui sont associés. Par ailleurs, cette pathologie est fréquemment accompagnée de troubles affectifs, notamment l’anxiété et la dépression, avec un taux de comorbidité supérieur à 50 %. Il apparaît donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de cette comorbidité ainsi que les facteurs susceptibles de l’exacerber. Un nombre croissant d’études suggère que le stress chronique joue un rôle déterminant dans l’aggravation de la douleur et des troubles émotionnels associés. Sur la base d’observations cliniques rapportées par nos collaborateurs, l’isolement social a été identifié comme un facteur susceptible d’influencer l’intensité de la douleur, sa chronicisation ainsi que la durée de récupération. En effet, les patients souffrant de douleurs chroniques présentent fréquemment une tendance au retrait social, phénomène qui peut être à la fois une conséquence et un facteur aggravant de leur état. De plus, plusieurs études ont mis en évidence une augmentation des comportements d’isolement social au sein de la population générale, associée à une prévalence accrue des troubles anxieux et dépressifs. Dans ce contexte, le présent projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents de l'impact de l'isolement sur la comorbidité de la douleur chronique et des troubles émotionnels. Cette étude s’inscrit dans une démarche translationnelle multicentrique réunissant plusieurs équipes de recherche précliniques et cliniques en Europe avec pour objectif de mieux appréhender la complexité de cette comorbidité et de favoriser le transfert des connaissances entre la recherche fondamentale et la pratique clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques et les circuits cérébraux impliqués dans la douleur chronique ainsi que dans les troubles anxio-dépressifs qui lui sont associés. Il permettra également d’évaluer l’impact de l’isolement social en tant que facteur susceptible d’aggraver cette comorbidité. Les connaissances acquises contribueront à une meilleure compréhension des interactions entre douleur chronique, environnement social et santé mentale, et pourraient, à terme, favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de stratégies de prise en charge plus efficaces.

Procédures

- la moitié des animaux est soumise à un isolement social inévitable, qui constitue l’objet de notre étude pour une durée maximale de 24 semaines. - Les animaux développent une douleur chronique associée à l’apparition de troubles de type anxieux et dépressif. - Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale et durent au maximum 45 minutes. - Les animaux sont soumis à quatre tests d’évaluation de la douleur (durée moyenne de 15 minutes, avec une stimulation brève n’excédant pas 60 secondes) ainsi qu’à sept tests comportementaux destinés à évaluer les troubles anxio-dépressifs (environ 5 minutes par test), avec un intervalle de 24-48 entre chaque test dans la limite de 3 tests par semaine. - Les animaux sont soumis à un unique épisode de jeûne de 24 heures dans le cadre d’un test comportemental, ainsi qu’à une période unique d’isolement de 24 à 72 heures pour la réalisation de deux autres tests. - À l’issue de l’étude, les animaux font l’objet d’une chirurgie terminale de prélèvement tissulaire réalisée sous anesthésie profonde, d’une durée d’environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La moitié des animaux seront hébergés dans des cages individuelles nous permettant de mieux comprendre l’effet de l’isolement social sur la comorbidité de la douleur et de ses conséquences émotionnelles. - la présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

l’objectif de cette étude est d’élucider les mécanismes sous-jacents par lesquels l’isolement social influence la comorbidité de la douleur et les troubles anxio-dépressifs qui y sont associés. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions physiopathologiques ni d’étudier les conséquences comportementales de cette comorbidité. Le recours à un modèle in vivo est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de cette étude.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux en condition d’isolement social sont hébergés dans des cages individuelles transparentes permettant de limiter le stress en maintenant un contact sensoriel minimal (olfactif, auditif et visuel) avec les congénères. Les cages seront enrichies (carrés de coton, frisures, bâtons en bois à ronger, tunnel) afin de favoriser le bien-être animal. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences

Jusqu'à huit séances d'imagerie de 45 minutes sous anesthésie, avec pose d'un cathéter dans la queue pour injecter l'agent de contraste : 1 092 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Leur arthrose ou leur arthrite est provoquée par une injection dans le genou ou par une chirurgie de 20 minutes, pour valider des agents de contraste censés rendre visible l'inflammation articulaire. Le porteur choisit les souris Swiss pour leurs "veines plus larges" et les C57BL/6J pour la reproductibilité de leurs lésions articulaires. Il affirme que ces procédures présentent "un caractère de stricte nécessité" et que seul un "organisme entier" permet de suivre la distribution des agents.

Objectifs

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par la destruction progressive du cartilage, un remodelage de l'os sous-chondral et une inflammation synoviale. Ces altérations, qui touchent l’ensemble de l’articulation, entrainent notamment des douleurs chroniques et une diminution de la mobilité. En préclinique, si l'étude de la physiopathologie arthrosique est bien établie, peu de techniques permettent un suivi longitudinal non invasif, pourtant indispensable pour évaluer l'efficacité de traitements potentiels. De plus, les techniques d’imageries actuelles en pratique clinique se limitent globalement à une évaluation de la destruction articulaire, mais ne sont pas en mesure d’évaluer la participation inflammatoire à un temps donné, ce qui limite les propositions thérapeutiques et ne permet pas de proposer une médecine personnalisée. L’objectif de ce projet est donc de valider une nouvelle approche d’imagerie moléculaire non invasive permettant de visualiser l’inflammation articulaire dans des modèles murins d’arthrose. Chez l'homme, il a été démontré que l'inflammation synoviale est marquée par une surexpression de marqueurs de l’inflammation des vaisseaux sanguins et de la membrane synoviale. Ces protéines sont impliquées dans le recrutement de cellules immunitaires induisant une inflammation de l’articulation. Les taux circulants de certaines de ces protéines sont d'ailleurs reconnus comme biomarqueurs prédictifs du risque de chirurgie de la hanche et du genou en cas d’arthrose sévère. L’imagerie permettra de visualiser l’inflammation grâce à des agents de contraste magnétiques ciblant les protéines d’adhésion cellulaire. Cette stratégie permettra de caractériser la dynamique inflammatoire au cours de différentes formes d’arthrose expérimentale, et d’évaluer la possibilité de proposer un traitement ciblé (anti-inflammatoire ou anti-arthrosique selon la prédominance ou non de l’inflammation). Collectivement, ces résultats permettraient une approche non invasive, translationnelle, permettant in fine de mieux appréhender la maladie arthrosique chez les patients pour leur proposer le traitement le plus adapté.

Bénéfices attendus

Cette étude serait la première à démontrer la possibilité d'imager l'inflammation articulaire de manière aussi précise in vivo, dans des modèles murins d’arthrose et d'arthrite. La validation de cette technique fournirait une méthode d'étude non invasive permettant un suivi longitudinal et diminuerait significativement le nombre d'animaux nécessaires aux études précliniques. De plus, les produits de contraste sont développés de manière à être biocompatible et biodégradable, afin de pouvoir être utilisés en clinique. De cette manière, cette méthode permettrait de faciliter le diagnostic de l’arthrose et d’autres maladies inflammatoires ainsi que l’évaluation de l’efficacité des traitements. L’utilisation d’agents de contraste biodégradables renforcent la possibilité de translation clinique.

Procédures

Les animaux seront exposés à des pesées 1 fois par semaine (durée inférieure à 5 minutes) ; injection dans le genou (environ 2 min) pour l’induction d’arthrite ou d’arthrose chimique et pour l’administration de traitements ; une chirurgie rapide pour l’induction de l’arthrose mécanique (environ 20min) pratiquée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie (environ 45 minutes). Les traitements anti-arthrosiques auront lieu soit par injection soit par prise orale 1 à 5 fois par semaine selon le protocole. L’ensemble des souris passeront maximum 1 fois par semaine en imagerie sur une période de 8 semaines.

Impact sur les animaux

L’induction d’arthrite ou d’arthrose (modèle chimique) n'entraîne pas de souffrance particulière à l’animal (pas de boiterie ou de douleur particulière). L’induction de l’arthrose chirurgicale peut entraîner des douleurs liées à l’ouverture des différents plans (peau et muscle). Après les différents protocoles d’induction de l’arthrose, aucune douleur n’est attendue après 24h. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux. Cependant, la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir procéder à l’analyse des tissus.

Remplacement

Les tests in vitro réalisés sur des lignées de cellules ne permettent pas d’évaluer l’action des agents de contraste dans un organisme entier, leur distribution dans l’organisme, ni leur capacité à détecter une inflammation articulaire dans un contexte physiopathologique réaliste. Les modèles in vitro ne permettent pas non plus de reproduire fidèlement la complexité de l’articulation, qui repose sur des interactions entre plusieurs tissus (os, cartilage, synoviale, endothélium) et sur une composante mécanique essentielle dans l’apparition et l’évolution de l’arthrose. Le recours au modèle murin permet d’intégrer ces différents paramètres au sein d’un organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet présentent un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives sans animaux permettant d’obtenir un niveau d’information équivalent.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide de tests statistiques de puissance afin d’utiliser un effectif suffisant pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Le recours à l’imagerie permet un suivi non invasif des mêmes animaux au cours du temps, réduisant ainsi le nombre total de souris nécessaires par rapport à des approches nécessitant des mises à mort à différents temps. De plus, la validation de l’imagerie de l’inflammation permettra sa réutilisation dans d’autres projets portant sur les maladies inflammatoires, permettant à terme une réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce domaine de recherche.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites spécifiques ont été définis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l’administration d’un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus maximum par cage, avec un accès à la nourriture et à l’eau à volonté et du matériel de nidification et un igloo.

Choix des espèces

Pour les expériences de validation des agents de contraste dans un modèle d’arthrite, des souris Swiss seront utilisées. Cette souche est particulièrement adaptée car elle présente un accès vasculaire facile facilitant la pose du cathéter (veines plus larges) et le modèle d’arthrite sur cette souche est bien décrit dans la littérature. Pour les expériences d’arthrose, des souris C57BL/6J seront utilisées, car cette souche est largement utilisée et validée dans les modèles murins d’arthrose, notamment pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-arthrosiques. Elle présente une bonne reproductibilité des lésions articulaires et des réponses inflammatoires. L’ensemble des souris SWISS et C57BL/6J seront âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à des animaux adultes, en fin de croissance.

180 souris, issues d'une lignée privée d'un gène ou d'une lignée porteuse d'un gène rapporteur, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection d'interféron, qui peut provoquer une douleur locale, un stress aigu, une inflammation des organes ou une stéatose du foie, puis sont tuées pour prélever foie, muscle, tissu adipeux et cerveau. Le but est d'identifier les ARN ciblés par une protéine que le porteur appelle "notre protéine d'intérêt", impliquée selon lui dans la défense antivirale. Il présente la souris comme "le modèle le plus adapté", tout en indiquant que des cultures de macrophages et de cellules dendritiques servent déjà à une partie des analyses.

Objectifs

Notre gène d'intérêt permet la production d'une protéine multifonctionnelle impliquée dans la régulation du métabolisme des lipides, la biologie des acides ribonucléiques, et la réponse immunitaire. Bien que son rôle dans le métabolisme soit bien documenté (résistance à l’obésité et au diabète sous régime riche en graisses), des études récentes suggèrent qu’elle joue également un rôle clé dans la défense antivirale. En effet, elle est induite par l’interféron (IFN), une protéine produite naturellement par notre organisme pour aider à se défendre contre les infections, surtout les virus, et semble impliquée dans la réponse aux infections par des virus tels que ceux de l’hépatite C et de la dengue. Ses activités enzymatiques lui permettent de moduler la stabilité des ARN et de participer à la régulation de l’expression génique, ce qui en fait une candidate idéale pour étudier son implication dans la réponse immunitaire, notamment via les voies de l’interféron. Deux lignées de souris ont été générées : une lignée avec une inactivation complète de son expression, et une lignée avec un gène rapporteur permettant de suivre son expression dans l'organisme. Les souris n'exprimant plus la protéine sont viables et ne présentent pas de phénotype délétère, ce qui permet d’étudier leur réponse immunitaire sans biais lié à une pathologie sous-jacente. Ce projet vise à explorer le rôle de cette protéine dans la réponse antivirale et la régulation immunitaire, en se concentrant sur : 1) L’expression spatio-temporelle de cette protéine dans les tissus immunitaires (rate, foie, ganglions lymphatiques, poumons) après stimulation par de l’interféron. 2) L’identification de ses acides ribonucléiques cibles par séquençage du transcriptome, en comparant les profils d’expression génique entre tissus de souris sauvages et mutantes.

Bénéfices attendus

L'étude de cette protéine et la réponse interféron apporte des avancées scientifiques, médicales et sociétales. Elle clarifie le rôle de notre protéine d'intérêt dans la signalisation interféron et la réponse antivirale, en identifiant ses acides ribonucléiques cibles via le séquençage du transcriptome, révélant ainsi ses mécanismes moléculaires. Sur le plan médical, cette protéine pourrait devenir une cible thérapeutique pour renforcer les thérapies antivirales (hépatite C, dengue) ou moduler les réponses immunitaires excessives dans les maladies auto-immunes. Des modulateurs de cette protéine pourraient améliorer la réponse antivirale ou limiter l’inflammation, tandis que son expression pourrait servir de biomarqueur pour évaluer la sévérité des infections ou la réponse aux traitements. Méthodologiquement, ces sourisoffrent des outils pour explorer son rôle dans d’autres pathologies comme le cancer. Les techniques transcriptomiques, protéomiques et histologiques permettent une analyse complète de la réponse immunitaire. Enfin, cette étude pourrait réduire les coûts des maladies virales chroniques et préparer aux futures épidémies en développant des antiviraux ou modulateurs immunitaires ciblant cette protéine, impactant ainsi la santé publique et la médecine personnalisée.

Procédures

Cette étude sur le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse interféron implique une injection d’interféron, qui ne prends que quelques secondes, par animal. À la fin de l’étude, les souris sont mises à mort pour prélever divers tissus (foie, muscle, tissu adipeux, cerveau) afin d’effectuer des analyses approfondies.

Impact sur les animaux

Cette étude sur le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse interféron implique des nuisances animales. Les injections d’interféron peuvent causer une douleur locale et un stress aigu. Les organes cibles (foie, rate, poumons) pourront présenter des réactions spécifiques, comme une inflammation ou une stéatose hépatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure expérimentale afin de prélever les tissus d'intérêt.

Remplacement

Dans cette étude, il n’existe pas d’alternative in vitro ou in silico permettant d’étudier la réponse interféron systémique dans un contexte physiologique complet. Cependant, des approches complémentaires sont utilisées pour limiter le recours aux animaux. Par exemple, des cultures cellulaires primaires (macrophages, cellules dendritiques) sont employées pour certaines analyses ex vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences in vivo. De plus, les résultats obtenus chez la souris pourront être validés in vitro sur des lignées cellulaires murines ou humaines, ce qui permettra de réduire le nombre d’expériences animales futures.

Réduction

Dans cette étude, le nombre d’animaux est limité à 8 par groupe expérimental, un effectif qui permet d’atteindre une puissance statistique de 80 à 90 % pour détecter des différences significatives dans la réponse interféron ou l’expression des gènes stimulés par l’IFN. HELZ2 étant une ribonucléase, notre hypothèse est qu’elle aura un impact significatif sur le transcriptome suite à son induction et conduit à un effectif minimal de 8 animaux par groupe permettant de détecter les différences biologiquement pertinentes attendues tout en respectant le principe de réduction du nombre d'animaux utilisés. Les échantillons prélevés sont réutilisés pour plusieurs analyses (histologie, qPCR, Western blot), maximisant ainsi les données obtenues par animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies (nids, tunnels, matériaux à ronger) pour réduire leur stress environnemental. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé aux techniques douces, et les injections sont effectuées avec des aiguilles fines pour minimiser la douleur. Une surveillance rapprochée des animaux est assurée, avec des évaluations régulières du comportement des animaux. Des critères d’arrêt stricts sont définis : tout animal présentant une léthargie persistante ou une souffrance apparente sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus adapté pour étudier le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse à l’interféron. Son génome hautement conservé avec l’humain, notamment pour les gènes impliqués dans la réponse immunitaire, permet une extrapolation fiable des résultats. Les lignées génétiquement modifiées, spécifiques à cette étude, permettent d’analyser précisément les effets de l’inactivation ou de l’expression de notre protéine sur la signalisation de l’interféron, sans interférence avec des phénotypes pathologiques sous-jacents. La souris est également le modèle de choix pour les études immunologiques, grâce à la disponibilité d’outils spécifiques (anticorps, cytokines recombinantes) et à sa réponse immunitaire bien caractérisée. Son utilisation permet d’étudier les interactions cellulaires complexes et les effets systémiques de notre protéine, impossibles à reproduire in vitro. Aucun autre modèle animal ne combine ces avantages pour une étude aussi complète. L'âge des souris utilisées dans cette étude, 6 à 8 semaines, a été choisi pour des raisons scientifiques, physiologiques et pratiques. À cet âge, les souris ont atteint une maturité immunitaire complète, ce qui est crucial pour étudier les réponses immunitaires innées et adaptatives. Leur système immunitaire est pleinement développé, avec des populations cellulaires (lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques) et des voies de signalisation (comme celles de l’interféron) comparables à celles des adultes. Cela permet d'éviter les variations liées à l'immaturité immunitaire des souris plus jeunes ou aux altérations liées au vieillissement chez les souris plus âgées. De plus, les souris de 6 à 8 semaines présentent une taille et un poids optimaux pour les manipulations expérimentales. Leur taille facilite les injections intrapéritonéales et les dissections. Enfin, cet âge correspond à une période de stabilité physiologique, où les souris ne sont ni en croissance rapide (comme les jeunes) ni sujettes aux pathologies liées à l’âge (comme les souris plus âgées). Cela garantit des résultats reproductibles et minimise les variations inter-individuelles, assurant ainsi la rigueur scientifique de l’étude.