Souris
Modèles aigus et chroniques d’insuffisance rénale induite par ischémie-reperfusion chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 936
Chaque animal subit une ou deux opérations sous anesthésie pour bloquer puis rétablir la circulation sanguine dans le rein, avec incision de la peau et du muscle, et reçoit des composés tous les jours pendant trois jours à quatre semaines. 3 186 souris et 936 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 836 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur énumère parmi les effets attendus la perte de poids, la déshydratation, l'inflammation de la suture, la prostration et les tremblements, puis écrit que l'ensemble de ces procédures "vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal". Il justifie l'effectif de quinze animaux par groupe par "le risque de perte lors de la procédure chirurgicale".
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique. Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes du tissu rénal conduisant à la perte de fonction de l’organe. Il a été démontré que les problèmes cardiovasculaires et métaboliques, tels que l’hypertension et le diabète, mais également la prise de médicaments, accélère le développement d’insuffisance rénale à la suite de lésions aigües de l’organe. Ceci peut aboutir à des décès prématurés des patients atteints, nécessitant un traitement par dialyse et/ou greffe de rein. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi, les tests précliniques d’efficacité de nouveaux médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Le projet se déroulera en deux phases. La première, dite de validation, impliquera un nombre restreint d’animaux afin de mettre en place les conditions expérimentales basées sur des protocoles d’ischémie-reperfusion référencés dans la littérature. La seconde phase, consacrée aux tests, visera à évaluer l’efficacité de candidats médicaments par an. Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant toute intervention. Selon les procédures, ils recevront différentes interventions et traitements : - Administrations de médicaments sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou orale durant toute la période expérimentale (pouvant aller de trois jours à quatre semaines) - Des prélèvements sanguins et d'urine pourront être réalisés au moins une fois par semaine p - Chaque animal subira une ou deux interventions sous anesthésie et analgésie. Ils seront surveillés deux fois par jour post-opératoire jusqu’à la fin de l’expérimentation. - La fonction rénale pourra être évaluer, soit par la mesure de la production urinaire sur 24 h en cage métabolique, soit par la mesure de la filtration. - A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et des prélèvements (tissus et de fluides biologiques) seront réalisés pour analyses complémentaires. L’ensemble de ces procédures vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont les suivants : - Stress à la contention, au traitement, au cage métabolique ; - Douleur légère et de courte de durée lors de l’injection de médicament ; - Perte de la fonction de rénale entrainant une réduction diminution de la tonicité et des problèmes urinaires ; - Douleurs post-opératoires en raison de l’incision cutanée et musculaire, mais aussi de l’acte chirurgical ; - Les effets indésirables en post-opératoire tels que la perte de poids, des démangaïsons, de l’inflammation au niveau de la suture, une déshydratation, une diminution de la locomotion, une prostration et tremblements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de fluides biologiques et de tissus seront réalisés pour des analyses complémentaires.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rat, souris), nous travaillons sur le développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Le nombre d’animaux par groupe sera réduit au maximum, permettant d’anticiper les différences interindividuelles et de réaliser des analyses descriptives et quantitatives. Pour la première phase de ce projet, concernant la validation des modèles et la mise en place des conditions expérimentales basées sur la littérature, un nombre restreint d'animaux (n=18) par procédure pour les deux espèces, si l’on considère trois groupes de 3 animaux (groupe contrôle, groupe opérée, groupe traité avec une molécule de référence). Un total de 72 animaux sera utilisé pour la première partie. Cette première phase permet également de s’assurer de la robustesse de la procédure et de l’habituation des manipulateurs, afin de s’assurer de la réussite des gestes pour la réalisation des procédures chirurgicales par la suite et donc de limiter le nombre d’animaux. Sur la deuxième phase de test de mécidaments, un nombre de 15 animaux par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les animaux seront également randomisés afin d’éviter les biais. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures rigoureuses seront mises en place pour assurer le bien-être des animaux utilisés. Le personnel en charge rendra visite aux animaux durant leur période d’acclimatation afin de les habituer à la présence humaine et à la manipulation, réduisant ainsi leur stress. Les animaux seront logés en groupes sociaux stables de 2 à 5 individus, conformément à l’espèce et à la réglementation en vigueur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et analgésie pour limiter douleur et inconfort, accompagnée de sérum physiologique pour l’hydratation. Pendant la chirurgie, les paramètres physiologiques (température, fréquence cardiaque, respiratoire, muqueuses) seront surveillés. Les animaux seront installés sur un tapis chauffant pendant et après l’intervention pour prévenir l’hypothermie. Un suivi clinique sera réalisé 2 à 3 fois par jour après la chirurgie. La buprénorphine pourra être administrée par injection ou dans l’eau de boisson pendant les jours suivant l’opération, afin d’atténuer d’éventuelles douleurs. Pour favoriser l’alimentation, des aliments facilement accessibles (croquettes mouillées, gel) seront placés au fond des cages afin de limiter les mouvements post-opératoires. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être administrée si nécessaire. Un système de scoring des signes cliniques et points limites spécifiques aux procédures sera appliqué. Les conditions d’hébergement respecteront les standards de bien-être : propreté des cages, accès libre à l’eau et à la nourriture, et enrichissement (igloo, safe crinklets, batonnet). De l’enrichissement supplémentaires pourra être ajouté (sopalin, croquette en fond de cage). Durant le traitement avec les candidats médicaments, une attention particulière sera portée au suivi de la masse corporelle et de l’état général (sutures, pelage, respiration, locomotion…).
Choix des espèces
Dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion, les rongeurs sont largement utilisés par la communauté scientifique. Un des avantages de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. Les animaux utilisés auront atteint l'âge adulte, c'est à dire plus de 8 semaines. Le choix de cet âge est basé sur les données de la littérature, qui ont identifié que 8 semaines représentent l'âge optimal pour la réussite de cette procédure chirurgicale.
Impact de la mutation du gène responsable de la maladie rare de l’aniridie sur la cornée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une éraflure volontaire de la cornée, que le porteur compare à un grain de sable dans l'œil, attend une partie des souris de ce projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, l'autre modérée. Elles portent une mutation qui les prive d'iris ou leur donne des yeux anormalement petits, et dont la cornée s'opacifie avec l'âge, pour étudier une maladie humaine qui touche une personne sur 100 000. Le porteur conclut qu'"aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l'animal", tout en décrivant des douleurs passagères après l'abrasion et l'administration systématique d'antidouleurs.
Objectifs
L’aniridie est une maladie génétique très rare qui touche environ 1 personne sur 100 000. Une des caractéristiques principales de la maladie est l’absence partielle ou totale de l’iris, la partie colorée de l’œil. Elle peut aussi entraîner une sécheresse oculaire et une opacification progressive de la cornée, la couche transparente à l’avant de l’œil. Cela peut provoquer une baisse importante de la vision au fil du temps. Chez les personnes atteintes d’aniridie, la cornée est souvent plus fine, moins bien protégée et moins bien "innervée", c’est-à-dire moins bien reliée aux nerfs. Cela peut entraîner une perte de sensibilité et, dans les cas avancés, une opacification qui rend la vision floue. Beaucoup de patients deviennent malvoyants à partir de la soixantaine, même s’ils gardent souvent une perception de la lumière et des couleurs. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement pour guérir cette maladie. C’est pourquoi il est important de mieux comprendre comment cette mutation affecte l’œil, en particulier la cornée et son environnement. Dans notre laboratoire, nous étudions l’aniridie à l’aide d’un modèle animal (la souris) mimant ou reproduisant la maladie humaine. Nous allons analyser différents éléments de l’œil de ces souris : la composition des larmes, la pression à l’intérieur de l’œil, et l’état des fibres nerveuses de la cornée. Ces analyses nous aideront à mieux comprendre comment l’aniridie perturbe le fonctionnement normal de l’œil et à identifier, à terme, de nouvelles pistes de traitement.
Bénéfices attendus
Dans l’aniridie, la perte de vision s’aggrave lentement au fil du temps. Cela donne une chance précieuse d’intervenir avant que les dégâts ne deviennent irréversibles. Malheureusement, les traitements disponibles aujourd’hui sont très limités. À un stade précoce, certains collyres (gouttes pour les yeux) peuvent soulager les symptômes. Mais lorsque la maladie est plus avancée, la seule option est souvent une greffe de cornée. Or, cette opération est lourde, comporte des risques de rejet, et n’apporte parfois qu’un soulagement temporaire. Face à ce manque de solutions, notre projet de recherche a pour but de mieux comprendre ce qui ne fonctionne pas dans la cornée dans le cadre de cette maladie. Ainsi, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour développer des traitements innovants, plus efficaces et moins invasifs. Nous cherchons notamment à comprendre en détail les réactions en chaîne, au niveau moléculaire, qui mènent à la dégradation de la cornée. Ce travail devrait aussi donner lieu à des publications scientifiques, et peut-être à des dépôts de brevets, contribuant ainsi à faire avancer la recherche dans ce domaine encore peu exploré.
Procédures
Les souris seront manipulées pour permettre la mesure de certains paramètres importants, comme la sensibilité de la cornée ou la pression à l’intérieur de l’œil. Ces examens sont similaires à ceux réalisés régulièrement chez l’humain lors de consultations ophtalmologiques. Nous effectuerons une éraflure volontaire et contrôlée de la cornée, dans le but d’étudier l’étape de cicatrisation chez les souris malades. Cette blessure est légère, équivalente à un grain de sable dans l’œil, et guérit spontanément en trois jours. Durant toute cette période, les animaux sont suivis, et des antidouleurs leur sont administrés en cas de nécessité afin de garantir leur bien-être.
Impact sur les animaux
L’aniridie est une maladie génétique rare qui touche principalement les yeux. Pour mieux l’étudier, nous utilisons un modèle animal (la souris) qui mime cette maladie. Elle est caractérisée par une absence de l’iris, la partie colorée de l’œil et/ou par des yeux d’un volume anormalement petit. Ces animaux développent progressivement une opacification de la cornée due à la maladie, entraînant une diminution de leur acuité visuelle. Cela n’impacte pas leur comportement ni leur espérance de vie. Tout comme les patients, ces animaux ne présentent pas de signes de douleur liés à la maladie. Pendant les expériences, certaines manipulations sont nécessaires, comme mesurer la sensibilité de la cornée ou réaliser une blessure sur celle-ci. Cette blessure, appelée abrasion cornéenne, est faite sous anesthésie générale. Chez l’Homme, l’abrasion de la cornée est la première étape des traitements de la myopie au laser. L’abrasion est un modèle de blessure pouvant induire des douleurs passagères équivalente à une irritation dû à un grain de sable dans l’œil. Elle est superficielle et guérit spontanément en trois jours. Des médicaments antidouleur sont systématiquement administrés après chaque intervention, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront manipulées par les expérimentateurs, ce qui pourra générer du stress. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie générale répétée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée, les larmes, l’iris et le cristallin.
Remplacement
Les méthodes en laboratoire sur des cellules seules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier comme l’œil, avec toutes ses parties et son fonctionnement. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, en particulier des souris porteuses d’une maladie rare comme l’aniridie. Ce modèle nous aide à mieux comprendre la maladie et ses effets sur l’ensemble de l’œil, un organe complexe.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à cette étude a été rigoureusement déterminé à l’aide de logiciel permettant de calculer statistiquement le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Sur l’ensemble de la durée du projet (5 ans), un maximum de 252 souris sera utilisé. Parmi les animaux utilisés, la moitié sera porteuse de la maladie et l’autre moitié sera saine afin de comparer les résultats.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe de 2 individus minimum, environnement adapté et enrichi. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention, avec l’utilisation d’antidouleurs et anesthésiques adaptés. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal.
Choix des espèces
Le système visuel de la souris ressemble beaucoup à celui de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier l’aniridie, une maladie rare de l’œil. Nous travaillons sur des souris adultes de 12 semaines, âge auquel l’œil a fini de se développer. Pour compléter, nous étudions aussi l’impact de la maladie au cours du développement, donc sur des souris plus jeunes : de 2, 3 et 4 semaines.
Etude d’une protéine impliquée dans l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin pour que leur cerveau soit prélevé, 774 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 346 d'entre elles inhalent un agent convulsivant cinq jours de suite, 146 reçoivent des injections pendant cinq jours, l'ensemble servant à créer deux lignées génétiquement modifiées pour étudier une protéine liée à l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'accompagne les crises, par analogie avec la perte de conscience décrite chez l'humain, tout en signalant que les souris épileptiques meurent subitement dans moins de 5 % des cas et que les crises provoquées pourraient augmenter cette fréquence. Il conclut que le recours à des animaux vivants est "absolument nécessaire".
Objectifs
L’épilepsie est une maladie cérébrale qui se manifeste par des crises soudaines et répétées. Ces crises sont causées par une activité électrique anormale dans les neurones. L’objectif de ce projet est de générer deux modèles de souris génétiquement modifiée afin d’étudier les mécanismes neuronaux impliqués dans cette pathologie à différents moments de la vie et lors des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Cette recherche pourrait aider à mieux comprendre les causes de l’épilepsie afin de développer de nouveaux traitements qui restaureraient l'excitabilité neuronale normale et atténueraient l'activité épileptique.
Procédures
Une injection sera faite pendant 5 jours sur 146 animaux. 346 animaux seront soumis à l’exposition répétée (5jours consécutifs) à un agent convulsivant par inhalation.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les injections peuvent entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute, suivi d'une période d’immobilité d’environ 1 minute. Les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement avec une fréquence faible (moins de 5%). Les inductions artificielles de crises pourraient augmenter la fréquence des morts soudaines. Aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place (épileptogenèse) peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardio-vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes cellulaire et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. En effet, il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques dans les modèles murins d'épilepsie. Les schémas d’accouplement ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales ; Le nombre minimum d’animaux nécessaires a été calculé pour utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les animaux seront stabulées avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées et éviter toute souffrance ou inconfort. Une grille d'observation est utilisée par le personnel pour surveiller attentivement l'état des animaux pendant l'expérimentation. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement est notée. Les animaux concernés sont alors suivis chaque jour et peuvent recevoir un traitement contre la douleur si nécessaire. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont l’épilepsie. Les crises peuvent être induite sans limite à partir du 19eme jour postnatal jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge de 3 semaines pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes ainsi qu’a l’âge adulte.
Rôle de l’inflammation microcristalline dans l’athérosclérose expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois millilitres d'air injectés sous la peau du dos pour former une poche, puis des cristaux injectés dans cette poche, subissent l'ablation de la rate au cours d'une opération de trente minutes, jusqu'à vingt-huit gavages quotidiens et huit semaines de régime gras. Le porteur annonce l'identification, "à moyen terme", de cibles thérapeutiques contre les lésions cardiovasculaires liées à la goutte et à la chondrocalcinose, et une amélioration des soins "à long terme". Sur le remplacement, il décrit des tests sur lignées cellulaires qui servent à caler les doses avant le passage aux souris.
Objectifs
Les maladies à dépôts de microcristaux de pyrophosphate de calcium (PPC) et d’urate de sodium (UMS) sont les rhumatismes inflammatoires les plus fréquents de l’adultes, responsables respectivement de la chondrocalcinose et de la goutte. Ces cristaux déclenchent des arthrites aiguës récidivantes qui dépendent de médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-1β. Les crises inflammatoires déclenchées par ces 2 types de cristaux sont associées à un risque accru d’événements et d’accidents cardiovasculaires (CV). L’élévation persistante de l’urate sanguin et l’inflammation modifient la réponse immunitaire et stimulent des changements des précurseurs des cellules immunitaires dans la moelle osseuse en stimulant la formation de cellules plus inflammatoires. Cette modification de la réponse immunitaire, appelée immunité innée entraînée peut accélérer l’athérosclérose et contribuer à l’augmentation du risque CV observée chez des patients goutteux ou souffrant de la maladie à dépôts de cristaux de PPC. Dans les modèles expérimentaux d’athérosclérose, un régime riche en gras en alternance accélère les lésions vasculaires et favorise les ruptures de plaque qui dépendent de l'IL-1β, cytokine clé de l’inflammation microcristalline. Les objectifs de ce projet sont, d'une part, de caractériser l’impact des crises inflammatoires microcristallines dans le changement des cellules immunitaire de la moelle, d'autre part, d'étudier l’implication de cette mémoire entrainée sur le développement de l’athérosclérose expérimentale, et enfin, d’en identifier les mécanismes physiopathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à moyen terme : 1. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d'athérosclérose liées aux crises inflammatoires microcristallines, 2. L'identification de cibles thérapeutiques pour prévenir les lésions cardiovasculaires, 3. L'identification des mécanismes de régulation épigénétique et métabolique liés aux crises inflammatoires microcristallines et 4. L'identification des mécanismes de régulation inflammatoire par l'urate soluble. A long terme, il permettra l'amélioration des soins chez des patients en identifiant des cibles thérapeutiques permettant de mieux contrôler les conséquences de l'inflammation microcristalline et de réduire les risques cardiovasculaires et donc la mortalité.
Procédures
Création d'une poche à air par injection dans la région dorsale de 3 ml d'air sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 2 fois, 30 secondes par geste. Injection dans la poche à air de cristaux sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 1 fois, 30 secondes. Injection d'agent pharmacologique sur animaux vigiles: 1 fois, 30 secondes. Prélèvement sanguin sur animal endormi : 1 à 4 fois, 1 minute ; Splénectomie sur animaux anesthésiés : 30 minutes. Gavage quotidien pendant 1 à 4 semaines. Un gavage par jour, nombre de gavage maximal par animal: 28. Régime riche en graisse pendant 8 semaines
Impact sur les animaux
Dans le modèle de splénectomie des douleurs sont attendues durant au maximun 3 jours avec possiblement une perte de poids et une réduction de l'activité. De plus, la répétition de manipulation des animaux peut engendrer un stress notamment pour les injections répétées d’anticorps. Les injections et prélèvements pourraient également entrainer des douleurs locales très légères. La technique de gavage pourrait également entrainer une gêne chez l’animal du fait d’une contention serrée durant le passage de la canule
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. L'évaluation finale nécessite la mise à mort de l'animal car les analyses sont effectuées sur des tissus de plusieurs compartiments
Remplacement
Des tests in vitro seront utilisés au maximum pour déterminer les conditions optimales des études in vivo : tests sur des lignées cellulaires pour déterminer la dose thérapeutique efficace d'un agent pharmacologique avant son utilisation chez l'animal; tests in vitro pour identifier le meilleur modulateur de l'immunité entraînée avant de l'étudier chez l'animal : blocage de médiateurs inflammatoires par exemple et tests in vitro pour valider les mécanismes cellulaires avant validation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses de l’inflammation dans les liquides de lavage des poches à air, analyses anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et composition cellulaire de l’aorte, analyses métabolomiques dans le sang et transcriptomes des cellules de la moelle.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies en cotons, maisons, bois, papiers dans les conditions standardisées d'hébergement et d'élevage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, une surveillance quotidienne et/ou hebdomadaire sera mise en place. La réalisation de la splénectomie sera effectuée en plaçant les animaux sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C après anesthésie générale. Les animaux recevront deux doses d’analgésique en pré (30 min) et post opératoire (6 heures). Une 3ème injection peut être réalisée le lendemain si l'animal est douloureux. Une anesthésie locorégionale sera réalisée en péri-opératoire sur les plans cutanés et musculaire . Une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place après les injections, le gavage et la splénectomie. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été établis et en cas de douleur ou comportements anormaux les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous sédation préalable.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux reproduisent les maladies humaines et sont reconnus sur le plan international : modèle de poche à air pour étudier l’inflammation, modèle génétiquement modifié et régime WD pour étudier l’athérosclérose Les souris génétiquement modifiées développent, sous régime riche en matières grasses, des lésions d’athérosclérose similaires aux plaques d’athérosclérose humaines. Ces souris développent sous régime riche en matières grasses une hypercholestérolémie principalement sur la fraction des LDL, comme chez l’homme. Ces 2 modèles (inflammation dans poche à air et athérosclérose chez souris génétiquement modifiées) sont nécessaires dans l’exploration des mécanismes physiopathologies impliqués dans le développement de l’athérosclérose lié à l’inflammation microcristalline. Les souris génétiquement modifiées (Gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. Jeune adulte entre 2 et 5 mois permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent.
Test de l’efficacité de 5 médicaments sur un modèle souris du syndrome de Barth (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Nés avec un déficit de poids d'environ 20 %, stériles chez les mâles, les souris modèles du syndrome de Barth ne représentent que 10 % des portées au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur tapis roulant et sur roue en rotation, subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, une IRM d'une heure trente, une échocardiographie, et un gavage quotidien pendant trois mois si le traitement dans l'eau de boisson ne suffit pas. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et prévoit des transferts en voiture entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélever leur sang et leurs organes.
Objectifs
Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.
Procédures
Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris mâles seront privées de vitamine D pendant dix semaines, accouplées, et leur descendance tuée à quatre jours de vie, après le sevrage puis à l'âge adulte. 60 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Elles sont isolées une demi-heure pour un recueil de fèces, mises à jeun la veille de leur mort, puis tuées par dislocation cervicale après anesthésie au sévoflurane. Le porteur affirme qu'aucune souffrance n'est attendue du régime carencé, et annonce que les données serviront à formuler des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer. Il mentionne aussi une anesthésie lors d'un prélèvement de sperme, geste absent de la description des procédures.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les mâles carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. L'étude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Durant toute la durée du protocole, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les héberger individuellement pendant ~30 minutes sera réalisé, une fois. Enfin, après 10 semaines d'alimentation contrôlée, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie au sevoflurane 6% dans une cage d'induction.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance ni nuisances n'est attendue. Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuisance de gravité légère, courte durée). Les animaux seront mis à jeûn la veille de la mise à mort (nuisance de gravité légère, durée modérée). Enfin l'induction de l'anesthsie peut constituer une source de nuisance (nuisance de gravité légère, courte durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Une anesthésie et une analgésie sont prévues lors du prélèvement de sperme.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique: Etude éléctrophysiologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées du crâne pour recevoir une injection de virus, implantées, puis maintenues sous anesthésie pendant quatre à huit heures pour l'enregistrement de leurs neurones, 2 176 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines sont isolées de leurs congénères dès le sevrage à trois semaines et gardées seules jusqu'à l'âge adulte, d'autres soumises à un stress par contention. Le projet cartographie les circuits d'une structure cérébrale impliquée dans l'anxiété, chez des souris suivies jusqu'à dix-huit mois. Un animal encore douloureux trois jours après l'opération sera tué. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une dissection des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Le noyau du lit de la strie terminale (BNST) joue un rôle central dans l’anxiété. Notre projet sera conduit chez des souris C57B6/J et des souris transgéniques afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel dans le BNST chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes sous-populations du BNST dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique des circuits du BNST, structure clef dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération d’une sous-population ou d’une afférence spécifique du BNST pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stade précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 2176 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés. La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance (power analysis). Ces analyses permettent de garantir que les groupes sont suffisamment grands pour détecter des différences significatives entre les conditions expérimentales tout en limitant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Etude de l’effet de traitements pharmacologiques sur le foie de souris ayant une maladie métabolique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Issues des mêmes croisements que les souris témoins, les souris mutantes de ce projet naissent avec un retard de croissance et une hypoglycémie inscrits dans leur génome. 621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À 48 heures de vie, certains nouveau-nés reçoivent une toxine injectée dans l'estomac, tous subissent une coupe du bout de la queue pour génotypage, puis les juvéniles reçoivent gavages et injections intrapéritonéales chaque jour pendant quatorze jours, avec une coupure hebdomadaire de la queue pour mesurer la glycémie. Les adultes reproducteurs sont tués eux aussi, après les mois d'accouplement imposés pour obtenir les portées.
Objectifs
La malformation des voies biliaires est une maladie rare du foie (chez les nouveaux nés et les jeunes enfants). Son origine est à l'heure actuelle inconnue c'est pourquoi nous devons comprendre les mécanismes moléculaires impliqués afin de développer de nouvelles thérapies. Le but de ce projet est de tester des traitements pharmacologiques dans des souris génétiquement modifée et servant de modèle préclinique de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de définir de nouvelles thérapies dans un modèle de maladie métabolique rare et sans réel traitement. De plus ces thérapies seront testées à différentes doses afin d’avoir une dose thérapeutique efficace transposable à l’Homme. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie avec l’utilisation de toxines en complément du facteur génétique pour le déclenchement de la maladie.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de sera prélevé pour le génotypage. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection (quelques secondes) dans l'estomac 48h après la naissance. Les animaux juvéniles auront des administrations de molécules par gavages et par injections intrapéritonéale (quelques secondes) répétées tous les jours pendant 14 jours. Pour mesurer la glycémie les animaux seront prélevés d'une goutte de sang drainée de la pointe de la queue une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Notre modèle de souris génétiquement modifiée présente un phénotype dommageable qui doit être pris en compte lors de l’élevage de ces souris. Notamment le retard de croissance, le poids en dessous de la norme à 5 semaines d'âge et une hypoglycémie pour les souris mutantes. Egalement l’extrémité de la queue des souriceaux sera coupée pour avoir une biopsie permettant le génotypage des animaux (douleur légère et de courte durée). Lors des procédures le gavage est un mode d’administration stressant et peut entraîner une douleur modérée. De même l’injection intrapéritonéale entraine une douleur légère et passagère. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection dans l'estomac 48h après la naissance qui entraine une douleur légère. La prise de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang à la base de la queue et nécessite donc une légère coupure entraînant une douleur légère.
Devenir
Les animaux qui recevront les injections et les gavages seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux adultes des croisements seront mis à mort après les plusieurs mois d'accouplement nécessaires pour générer les souris utilisées dans les procédures.
Remplacement
Nous utilisons des cellules de foie issus de patients en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études sur souris qui sont indispensables pour les essais précliniques pour évaluer la réponse thérapeutique aux traitements pharmacologiques.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les souris contrôles et mutantes proviennent des mêmes croisements. Nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour ces souris. Nous analyserons de multiples paramètres pour chaque souris. Sur la base de nos études précédentes nous estimons que 10-20 animaux par génotype et par conditions seront suffisants au niveau statistique pour les analyses. Afin de vérifier que nos résultats sont statistiquements significatifs nous utiliserons des tests adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour notre lignée à phénotype dommageable nous avons des points limites adaptés et spécifques. L’injection sera faite avec une aiguille adapté à la taille et au poids de l'animal. De plus en cas d'inflammation locale due à la répétition des injections les animaux recevront une crême anti-inflammatoire. Le gavage chez les animaux sera effectué avec des sondes adaptées à la taille de l’animal. Des aiguilles de taille adaptées seront utilisées lors des injections intragastrique. Pendant toutes nos procédures des points limites ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi du poids des souris deux fois par semaine et de leurs glycémies une fois par semaine en plus de suivi journalier des animaliers qui préviennent le responsable de projet lorsque qu’une souris présentes des symptômes de souffrance ou de perte de poids. Une perte de poids rapide ou une glycémie trop basse, si prolongées, conduiront à une mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation du métabolisme du foie entre l'humain et la souris. En particulier,le développement du foie et des canaux biliaires sont similaire entre les deux espèces. Les souris juvéniles (5-7 semaines) seront utilisées car c’est à cet âge que notre modèle de souris génétiquement modifiée à les symptômes les plus prononcés reproduisant la maladie humaine. Les traitements seront faits durant cette période afin d’évaluer les différentes thérapies. Les souris à 48h après la naissance seront utilisés pour la maturation du système biliaire et étudier l’effet de toxines dans notre modèle génétique.
Impact des fongicides sur le neurodéveloppement (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes sont gavées chaque jour pendant sept semaines pour être exposées à un fongicide, et 72 souris reçoivent à 7 semaines une puce sous la peau, sous anesthésie, puis passent des tests d'anxiété, de fonctions sensori-motrices, de coordination motrice, d'apprentissage et de mémoire, dont un d'une heure au plus par jour pendant deux semaines, de force musculaire, d'activité circadienne sur 32 heures et d'interactions sociales. Le fongicide n'est pas nommé. Les résultats "pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité" avant la commercialisation de ces fongicides, écrit le porteur.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons leur comportement, leur motricité et leurs capacités cognitives, tout en analysant les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées.
Bénéfices attendus
L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de comportement, de motricité et de cognition, dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). 72 animaux seront soumis à une chirurgie mini-invasive à l’âge de 7 semaines pour l'insertion d’une puce radio-fréquence sous la peau (5 min sous anesthésie gazeuse avec un anti-douleur local). Ces animaux seront également soumis à des tests comportementaux permettant d’évaluer l’anxiété (5 minutes, deux fois par animal), les fonctions sensori-motrices (30 minutes, deux fois par animal), la coordination motrice (deux tests de 5 minutes chacun, deux fois par animal), l’apprentissage et la mémoire (un test de 30 minutes, une fois par animal, ainsi qu’un test de moins d’une heure par jour pendant deux semaines), la force musculaire (5 minutes, une fois par animal), l’activité circadienne (32 heures, une fois par animal) et les interactions sociales (50 minutes, une fois par animal).
Impact sur les animaux
Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'oesophage. La chirurgie mini-invasive entrainera une légère douleur. L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée quotidienne lors du gavage et hebdomadaire pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Lors de la pose de puce radiofréquence nécessaire au suivi des animaux, une anesthésie et une analgésie seront mises en place pour prévenir tout stress et douleur. MODIFICATION : De plus, nous avons ajouté une étude pilote (PE3) dans le but de vérifier que le gavage pendant la gestation et la lactation n'affecte pas la gestation ni la survie des portées, et que l'administration du fongicide permet une gestation normale ainsi qu'une bonne survie des portées. Si nous devions constater un impact important sur cette étude pilote, le projet serait suspendu afin d’adapter la suite des procédures expérimentales (PE1 et PE2).
Choix des espèces
Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques et comportementales pertinentes pour évaluer la toxicité. Une partie des animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation et seront utilisés à 8 semaines. Les souris issues de cette gestation seront analysés à partir de 3 semaines d'âge jusqu'a 18 semaines.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souriceaux sont biopsiés à la queue entre 4 et 7 jours de vie pour leur génotypage, des femelles gestantes reçoivent une injection par jour pendant trois jours et une chirurgie de 45 minutes sous anesthésie générale, et des embryons sont injectés. D'autres souris subissent une chirurgie d'une heure avec points de suture, une injection de 20 minutes sous anesthésie générale ou sept injections intrapéritonéales en deux semaines, et un test d'induction de l'épilepsie peut provoquer, selon le porteur, une "détresse". 2 494 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère. Les souris de la première procédure sont gardées en vie pour des accouplements, celles des autres procédures sont tuées pour des prélèvements, et 52 femelles doivent passer par la quatrième procédure. Il s'agit de comprendre le rôle d'une population transitoire de neurones dans la survenue des crises et de tester un nouveau traitement préventif. Le porteur ne précise ni la méthode d'induction des crises, ni le traitement testé, ni la répartition des 2 494 souris entre les procédures.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.
Criblage pharmacocinétique de composés de thérapies ciblées anticancéreuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris qui atteignent un point limite de la grille de score sont mises à mort avant la fin. 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 d'entre elles réutilisées ensuite. Elles reçoivent un candidat médicament puis subissent des prélèvements sanguins répétés, veine caudale, saphène ou sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal de grand volume qui peut provoquer un arrêt cardiaque. Le projet mesure le devenir sanguin de composés anticancéreux, afin de caler les doses des futurs essais chez l'humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole sont "reformées" vers l'entraînement aux gestes techniques, puis mises à mort.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les paramètres pharmacocinétiques (PK), c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme et son temps de demi-vie dans la circulation sanguine. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), une stratégie d’échantillonnage ainsi que des groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) optimisés seront mis en œuvre. Celle-ci permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe pour un suivi PK à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.
Bénéfices attendus
La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance ainsi qu'à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.
Procédures
1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection par intraveineuse ou par d’autres voies d’administration (par exemple : intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, per os…) des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. Pour tous les types de prélèvements envisagés (e.g. veine caudale, saphène, submandibulaire, Sinus rétro orbital (SRO)…), l'anesthésie générale n'est pas nécessaire, mais une contention efficace est requise, excepté pour les prélèvements SRO. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) éventuelles anesthésies (fixe ou gazeuse s'il y a lieu pour prélèvement terminal). # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection des candidats médicaments et (2) de chacun des prélèvements sanguins aux différent temps (par exemple, 10 minutes, J1, J7, J14, J21 et /ou J28 post traitement). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. Ici, des volumes toujours inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.
Devenir
Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation) avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.
Réduction
Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie (données générées in vitro, propriétés physico-chimiques), permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux a été choisi en fonction des statistiques adaptées au petit nombre ainsi que de nos connaissances sur la classe thérapeutique de ces candidats médicaments, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés (micro-échantillonnage ou volumes standards dans la limite des 7,5 % hebdomadaires, ou 10% sur deux semaines glissantes), ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions aseptiques. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période minimale de 5 jours dans le but de limiter leur stress. Afin de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque prélèvement. Les animaux seront également pesés avant chaque manipulation ainsi qu’au minimum deux fois par semaine en suivi régulier. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Pour le prélèvement à l’œil une anesthésie gazeuse ainsi qu’une crème anesthésique locale permettra de diminuer la douleur liée au prélèvement. En fonction des besoins, une exsanguination terminale pourra être effectuée (en fin d’expérience ou en cas d’atteinte de point limite), par ponction intracardiaque ou incision sous-claviculaire de l’artère subclavière ou prélèvement à l'oeil, sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. A la fin du prélèvement, la mort sera assurée par dislocation cervicale ou surdosage d’anesthésique afin de conserver les organes intacts en cas de besoin. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation ainsi qu’en cas d’atteinte des points limites. Les analyses statistiques seront appliquées sur l’ensemble de la courbe et non uniquement sur chaque temps indépendamment, augmentant ainsi considérablement la robustesse de ces statistiques. Les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement à des gestes (DAP_FormationHabilitation) permettant la formation du personnel. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Choix des espèces
Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (abacs permettant une allométrie comparative de ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Nous utiliserons préférentiellement la souche CD-1, plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Cependant d’autres souches de souris (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) pourront être utilisées en fonction des modèles utilisés lors des études d’efficacité anticancéreuse, ainsi qu’en fonction de la structure et du profil des candidats médicament qui seront testés. Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Les souris CD1 seront préférentiellement utilisées. A titre d’exemple le poids de ces animaux sera compris entre 30 g et 37 g au moment de l’inclusion. Cette échelle de poids permet un prélèvement sanguin compris entre 157 µL et 222 µL par semaine (soit un maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pouvant être prélevé en toute sécurité par semaine glissante). Si d’autres souches (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) sont utilisées, le volume de sang prélevé sera toujours déterminé selon les recommandations internationales.
Immunophénotypage d’un nouveau mutant
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, à six, huit, dix et douze semaines d'âge, attendent chaque souris de ce projet. 46 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour observer les effets d'une mutation reproduite d'après le cas d'un nourrisson de sept jours atteint d'un déficit immunitaire. Le texte des objectifs annonce 32 souris "nécessaires pour obtenir des résultats fiables", quand le tableau des dommages attendus en déclare 46. Le porteur reconnaît qu'une partie de la caractérisation du gène se fait sans animaux vivants, sur des lignées cellulaires, puis conclut que la souris reste "indispensable" pour l'"organisme entier". Toutes sont tuées à la fin, pour collecter leurs organes.
Objectifs
Notre recherche porte sur une protéine présente dans les cellules, qui joue un rôle important dans la régulation du calcium. Ce calcium est essentiel à de nombreuses fonctions du corps : il participe à la croissance, à la production d’énergie, au bon fonctionnement des cellules et même à leur disparition quand cela est nécessaire. Cette protéine semble donc impliquée dans plusieurs mécanismes clés, bien que son rôle exact ne soit pas encore totalement compris. Un cas particulier nous a récemment interpellés : un bébé de 7 jours souffrant d’un trouble rare du système immunitaire. Il présente une anomalie génétique inhabituelle, jamais décrite auparavant et portant sur la protéine mentionnée ci-dessus, qui pourrait être liée à son déficit en cellules immunitaires. Ce lien possible a poussé notre équipe à explorer cette piste plus en détail. Pour mieux comprendre les effets de cette anomalie, nous avons mis au point un modèle animal, en modifiant le patrimoine génétique de souris grâce à une technique de pointe. Le but est d’observer les conséquences de cette modification, en particulier sur le sang et le système immunitaire. L’étude prévoit d’analyser deux groupes de souris : celles qui portent la modification, et celles qui ne l’ont pas. Des prélèvements sanguins seront effectués pour comparer leur état de santé et leur fonctionnement immunitaire. Au total, 32 souris seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude du système immunitaire, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation du gène d'intérêt et son effet sur l'immunité des souris.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, quatre prélèvements de sang seront réalisés sur chaque animal à 6 semaines, 8 semaines, 10 semaines et 12 semaines d'âges. Pour compenser la perte de volémie, la quantité de sang prélevé sera équilibré par une injection sous-cutanée de sérum physiologique d’un volume équivalent. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction immunitaire, un faible risque de faiblesse immunitaire pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte de différents organes afin de les analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude de mutation génétique notamment au sein de consortiums, des groupes de 8 animaux par sexe sont nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Durant cette étude nous allons générer des données (analyses sanguines, caractérisation des populations cellulaires du système immunitaire) qui seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle souris est très pertinent et est nécessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intérêt à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Le modèle de souris est très étudié pour les fonctions immunitaires. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous possédons des techniques éprouvées pour obtenir une lignée génétiquement modifiée. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Les prélèvements commenceront sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses, mais aussi un âge où le système immunitaire est développé et permet une analyse fonctionnelle. Les prélèvements sont échelonnés sur quelques semaines pour permettre d'observer une modification du système immunitaire si la modification devait apparaitre plus tardivement. Les prélèvements s'arrêteront au plus tard à 12 semaines d'âge. Sur le temps des prélèvements, les résultats nous permettront de déterminer l'intérêt de ce gène. Si les résultats devaient montrer une modification importante des paramètres immunitaires, les animaux pourraient être sacrifiés avant pour prélèvement des organes.