Souris
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses de mutations qui leur font développer une maladie neurodégénérative avec l'âge, les souris de ce projet reçoivent en plus un sepsis provoqué par chirurgie, à six mois ou à douze mois. 200 d'entre elles vont être utilisées, 96 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 64 modéré et 40 léger, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles présentent pendant 24 à 48 heures une baisse d'activité, le poil hérissé et parfois des diarrhées liquides, avant d'être transportées vers un second établissement pour une imagerie cérébrale sous anesthésie profonde. Les souris qui servent à produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leurs modifications génétiques.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Etude de la vascularisation au cours de la démyélinisation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 30 d'un niveau léger. Une encéphalomyélite auto-immune leur est provoquée par deux administrations sous anesthésie, puis une injection sur animal vigile deux jours plus tard. Les troubles de la marche, de la coordination, la faiblesse musculaire et la perte de poids s'installent en deux semaines et culminent trois à cinq jours. L'objectif reste descriptif, caractériser la chronologie des modulations de la vascularisation cérébrale, et le porteur affirme que ce travail exige l'"organisme entier" parce que les modèles ex vivo ne rendent pas les échanges entre tissu nerveux et cellules immunitaires du sang.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurodégénérative chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Au début de la maladie, la barrière hémato-encéphalique perd son imperméabilité, ce qui permet l'infiltration ultérieure de cellules immunitaires périphériques qui provoquent une démyélinisation neuronale et des dommages axonaux. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions). En particulier, une augmentation du débit sanguin cérébral précède l'apparition des lésions et la démyélinisation. Les mécanismes cellulaires impliqués dans le remodelage vasculaire dans les maladies démyélinisantes n'ont pas encore été entièrement définis. L’objectif de ce projet sera donc de caractériser précisément les modulations de la vascularisation et leur chronologie dans un modèle murin de la SEP, notamment l’étude de l’angiogénèse, la prolifération des cellules endothéliales et vasculaire et l'expression de facteurs d’hypoxie dès l’apparition des premiers symptômes.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier des processus pathologiques et réparateurs dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi compléter et valider des mécanismes qui semblent d’intérêt dans la pathologie d’après les études IRM récemment obtenues chez l’homme. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront deux administrations d’un produit pour la mise en place de notre modèle pathologique et du groupe contrôle (10 minutes maximum). 2 jours après ils recevront une deuxième injection (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Afin de tester la perméabilité cérébrale, nous injecterons une molécule 1h avant l’euthanasie des animaux (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée, prise en charge par la stérilisation du lieu d’injection avant manipulation.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Un environnement enrichi leur est fourni, comprenant nidification (coton de nidification, kraft), et bâtonnet à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à l’équipe de recherche, à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour éviter toute souffrance de l’animal. Ils seront également surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de suivre l’évolution des signes cliniques une grille de score adaptée à notre modèle est utilisée quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux. On s’assurera du maintien de la température physiologique des animaux tout au long de l’anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant) et on appliquera un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. L’injection intraveineuse avant euthanasie sera également réalisée sous anesthésie générale afin de réduire le stress induit pour les animaux. L’euthanasie médicamenteuse sera ensuite réalisée après une pré-sédation des animaux pour éviter tout stress ou douleur lors de l’injection létale. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proche de l'Homme. Le modèle de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques (SEP), permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Il s’agit donc d’un modèle particulièrement adapté pour notre objectif scientifique de suivi de l’évolution de la vascularisation au cours du développement des lésions de SEP. Des animaux adultes de souche commerciale, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’EAE (de même pour les contrôles), seront utilisés pour cette étude. Après une semaine d’acclimatation, les animaux sont tatoués. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’EAE. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs les conditions d’initiation de la SEP chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
MISE EN PLACE D’UN MODELE MURIN DE MYASTHENIE GRAVIS (FORME ACHR) ET EVALUATION DE CANDIDATS MEDICAMENTS AVEC CE MODELE
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Créer chez la souris une maladie auto-immune qui n'y existe pas, pour y faire ensuite passer des candidats médicaments : 1 248 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La myasthénie leur est induite par des injections répétées d'un fragment de récepteur avec un adjuvant qui peut provoquer une nécrose ou un durcissement de la peau, puis elles reçoivent jusqu'à trois administrations quotidiennes pendant onze semaines et un électromyogramme sous anesthésie. La faiblesse musculaire et la perte de mobilité attendues sur dix semaines sont classées en souffrance modérée, le porteur précisant qu'elles n'atteindront pas de signes cliniques sévères. L'effectif se décompose en 48 souris pour mettre le modèle au point et jusqu'à vingt études d'efficacité de 60 souris chacune, sans que ce nombre d'études soit rattaché à autre chose qu'un plan sur cinq ans.
Objectifs
La myasthénie gravis (MG) est une maladie auto-immune qui perturbe la communication entre les nerfs et les muscles, entraînant une faiblesse musculaire et une fatigabilité. Cette condition affecte la qualité de vie des patients et peut mener à l'isolement social. L'incidence de la MG est estimée entre 3 et 28 personnes par million, avec plus de 700,000 patients dans le monde. Les traitements actuels sont principalement des immunosuppresseurs, nécessitant des mois de traitement et souvent associés à des effets secondaires graves. De plus, 10 à 15 % des patients sont résistants à ces traitements. La MG est causée par la production d'auto-anticorps qui attaquent les molécules de la jonction neuromusculaire, perturbant la transmission des signaux entre les nerfs et les muscles. La majorité des patients (85 %) possèdent des anticorps contre le récepteur de l'acétylcholine (AChR), une protéine essentielle pour une bonne communication nerveuse et musculaire. Ce projet vise à établir un modèle murin de la forme la plus courante de la MG chez l’homme (AchR), car aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité biologique de cette pathologie. Ensuite, il s'agit d'évaluer l'action de candidats médicaments sur le développement de cette maladie. Pour ce faire, des souris recevront une petite partie de la protéine AchR (peptide) afin que leur système immunitaire produise des anticorps contre cette protéine, perturbant ainsi la communication nerf/muscle. Comme pour toute immunisation, un adjuvant sera ajouté pour optimiser la réaction immunitaire et la production d'auto-anticorps. Les études prévues dans ce projet incluent des évaluations cliniques et biologiques, comme des prélèvements sanguins pour mesurer la présence d'anticorps et des prélèvements d'organes pour valider l'expression des cibles thérapeutiques. Ces études peuvent être réalisées sur des souris génétiquement modifiées ou non pour un gène d'intérêt impliqué dans la maladie. Nous prévoyons 48 souris pour la mise au point du modèle. Puis, sur 5 ans, jusqu’à 20 études d'efficacité ou d’évaluation de l'effet dose de candidats médicaments, nécessitant chacune un maximum de 60 souris (maximum 5 groupes de 12 souris par étude).
Bénéfices attendus
Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des tests en laboratoire sur des cellules et des simulations informatiques. L'objectif est de choisir les candidats médicaments qui peuvent réduire l'activité du système immunitaire dans la Myasthénie Gravis. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Affiner le modèle de test pour cette pathologie sur les animaux, en réduisant au maximum leur souffrance et en améliorant les conditions des expériences. 2. Améliorer la qualité de vie des patients en sélectionnant les médicaments qui ont un effet positif sur les mécanismes de la myasthénie gravis, avant de passer aux essais cliniques, et offrir ainsi une nouvelle option de traitement.
Procédures
- Immunisation par l’agent inducteur (peptide + adjuvant) de la pathologie/du modèle : 3 injections sous-cutanées par jour (sur 2 jours à 4 semaines d’intervalle), moins de 30 secondes pour chacune des 3 injections - Administration des candidats médicaments / produits évalués (>1min) avec au maximum 3 administrations quotidiennes sur une durée maximum de 11 semaines. - Prélèvement de sang : (faible volume, moins de 30 secondes) avec une fréquence en accord avec les recommandations de la structure de Bien-Etre Animal : 2 prélèvements sur les 11 semaines que dure l’’étude - Electromyogramme : étude de la fonction des nerfs et des muscles sous anesthésie générale avec utilisation d’électrodes musculaires réalisé une seule fois par souris (en fin d’étude) - Prélèvement de sang terminal sous anesthésie générale et analgésie (une seule fois, 30 secondes) - Certaines études d’efficacité pharmacologique pourront nécessiter l’utilisation de souris génétiquement modifiées élevées et commercialisées par un éleveur : préalablement à leur expédition dans notre établissement utilisateur, elles auront eu un prélèvement de tissus (biopsie de l’extrémité de la queue) pour confirmer leur modification génétique.
Impact sur les animaux
Selon les données de la littérature, les nuisances estimées sont les suivantes : 1. Administration de peptide avec adjuvant sous-cutané (3 sites d’administration, 2 jours d’immunisation) : Moins de 30 secondes par injection, 2 fois. Risque de nécrose ou durcissement de la peau (douleur modérée) dans les jours suivant les administrations et dépendant du type d’adjuvant (risque accru avec l’adjuvant de l’article de référence, pondéré par l’administration préventive d’un antalgique 5 minutes avant). 2. Microprélèvements de sang : 30 secondes maximum, 2 fois. Stress et douleur ponctuels (douleur légère) . 3. Développement de myasthénie gravis sur 10 semaines : Faiblesse musculaire et réduction de la mobilité (souffrance modérée), sans atteindre des signes cliniques sévères 4. Administration de candidats médicaments : Stress et douleur passagers pendant l’administration, avec un maximum de 3 injections par jour sur une période de 11 semaines (douleur modérée). 5. Electromyogramme : 5 électrodes en sous cutané via de très fines aiguilles hypodermiques sous anesthésie gazeuse : Stress léger (une fois, 10 minutes) 6. Prélèvement de sang terminal sous anesthésie et analgésie : Sans réveil, donc sans douleur post-procédure.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus nécessaires pour les analyses in vitro des échantillons (immunohistochimie, etc) nécessaires à la caractérisation complète du candidat médicament
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Pour ce projet spécifiquement, le modèle présenté permettrait d’évaluer différents mécanismes cellulaires impliqués dans cette pathologie dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré après la première étude afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe. La technique de micro-prélèvement décrite en 5.10.3. pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet.
Raffinement
Lorsqu’on utilisera l’adjuvant de l’article de référence, l’administration d’un antidouleur sera effectuée 5 minutes en amont. Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique de micro-prélèvements de la souris, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. L’adjuvant de référence (dont le but est d’activer le système immunitaire et le rendre plus sensible à l’agent que va induire le modèle) sera associé à un antidouleur car il peut être mal toléré pas la souris. Nous évaluerons cependant un second adjuvant jamais utilisé dans ce modèle mais connu pour être mieux toléré. Les cages d’hébergement en cours d’études pourront selon les études être placées sur un portoir connecté permettant d’obtenir des données complémentaires en termes d’activité locomotrice des groupes de souris de manière non invasive ni stressante. Si grâce à ces cages connectées, nous voyons un impact sur la locomotion des souris non visible par l’expérimentateur ou par le test d’effort, ces mesures pourraient remplacer le test d’effort.
Choix des espèces
L’espèce murine est exclusivement utilisée dans la bibliographie pour reproduire ce type de pathologie de par sa transposition à l’homme. De plus, la souche de souris que nous utiliserons dans ce projet est un fond génétique largement utilisé dans les modèles de Knock in (changement du gène murin d’intérêt par le gène humain) nous permettant d’évaluer la cible humaine dans un modèle animal. Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle (en comptant les premières étapes de pesées avant le début d’induction de la pathologie à 8 semaines).
Effet du composé X , administré seul ou en combinaison avec la sémaglutide, sur la force de préhension, les performances à l’exercice et la contractilité musculaire chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Rendues obèses par quatorze semaines de régime enrichi en graisses chez leur fournisseur, 116 souris arrivent déjà malades dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent 91 administrations de sémaglutide et 14 du candidat médicament, subissent 25 pesées, deux prélèvements sanguins après quatre heures de jeûne, des mesures de force d'agrippement et deux séances de course forcée sur tapis roulant où quelques chocs électriques de faible intensité les relancent. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et la performance musculaire. Il ajoute que l'étude in vivo reste une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier de demande de premiers essais chez l'humain.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, la sémaglutide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. La Sémaglutide présente une excellente efficacité mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultante de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de faiblesse musculaire. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Le composé testé a pour intérêt majeur de cibler des voies de signalisation impliquées à la fois dans la régulation du poids corporel et dans la fonction musculaire. Des données préliminaires ont en effet permis de montrer que le composé testé était capable d'améliorer la fonction et la masse musculaire dans plusieurs pathologies musculaires et qu'il induisait une perte de poids chez des modèles obèses. Le composé testé sera ainsi testé en administration seule ou combinée avec la sémaglutide. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul, mais également de contrer les effets délétèrres de la sémaglutide sur la fonction musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont la sémaglutide qui est la plus efficace et la plus prescrite. Néanmoins, la sémaglutide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé testé pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec la sémaglutide, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (25 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament (14 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide (91 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (7 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (2 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de force d'agrippement (2 sessions de mesures de 5 minutes); 7) Mesures de performance sur tapis roulant (2 mesures, durée: 35 minutes); 8) Mesures de la force musculaire in vivo v(2 mesures, Durée :20 minutes); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations, les mesures de composition corporelle, les administrations des traitements et les test d'agrippement pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée (Durée maximum des pesées : 2 minutes / Durée maximum de mesure de la composition corporelle : 2 minutes). Les administrations des traitements occasioneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les mesure de performance sur tapis roulant occasionne un exercice forcé pour les animaux pouvant être source de stress, de fatigue et de douleur légère du fait de quelques chocs électriques de faible intensité. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim et les deux prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses biochimiques et histologiques
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, et les paramètres de performance musculaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Les animaux seront sous contrôle direct et permanent des expérimentateurs pendant les tests de course sur tapis roulant et pendant les tests d'agrippement. Les mesure de force musculaire in vivo seront réalisées sur animal anesthésié et une attention particulière sera apportée pendant la phase de réveil. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Evaluation de stratégies thérapeutiques afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion hépatique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une chirurgie de 90 minutes interrompt puis rétablit la circulation sanguine dans le foie de 836 souris, qui subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une ou deux injections des molécules testées, puis deux prélèvements sanguins pour 616 d'entre elles et six pour les 220 autres. L'opération peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, ainsi qu'une fatigue et une baisse de mobilité. Les organes sont prélevés sur des animaux tués, ce que le porteur justifie par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'architecture et la vascularisation du foie, d'où il conclut qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal.
Objectifs
La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une greffe. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Des recherches récentes ont montré qu’un traitement agissant sur le métabolisme des cellules permettait de réduire ces lésions, du moins dans le cas du rein. Le but de notre projet est de tester cette approche sur un autre organe : le foie. Pour cela, nous allons tester trois molécules différentes sur un modèle de souris pour voir si elles peuvent protéger le foie contre les effets de l’ischémie-reperfusion.
Bénéfices attendus
A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu dans la protection des lésions l’ischémie-reperfusion hépatiques, afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le rein, le coeur, le pancréas, les poumons. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.
Procédures
Tous les actes décrits concernent toutes les souris. 1 ou 2 injections des molécules testées (durée de l'intervention 1 minute). En fonction du site d'injection, elles seront faites sur animal vigile ou anesthésié. S'il y a 2 injections, elles seront espacées au moins de 90 minutes. 1 acte chirurgical sous anesthésie d'une durée de 90 minutes pour provoquer l'ischémie-reperfusion du foie. 2 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (616 animaux), et 6 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (220 animaux), pour mesurer différents paramètres biologiques. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'un minimum de 20 heures.
Impact sur les animaux
Les injections sur animal vigile pourront induire un stress transitoire de moins d'1 minute ainsi qu'une légère douleur de moins de 5 minutes. La douleur liée aux injections et aux prélèvements de sang sur animal anesthésié sera minorée par l'utilisation d'antalgique local. Suite à l'anesthésie de 90 minutes, l'effet attendu au réveil est un stress léger et un inconfort léger, tous deux d'une durée de 15 minutes. En post-opératoire, la chirurgie peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, qui sont minorées par l'administration d'antalgiques. Une légère perte de poids peut aussi être observée qui sera reversée en 72 heures. Après ischémie-reperfusion hépatique, une fatigue et une diminution de la mobilité sont attendues ; elles disparaissent sous 72 heures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro du foie, cependant ces modèles sont très limités pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Les groupes contrôles serviront à plusieurs conditions expérimentales. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Certaines injections et les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. La procédure chirurgicale sera réalisée en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être et diminuer leur stress.
Choix des espèces
Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2). La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude.
Restauration et protection des fonctions de l’oreille interne par administration de composés ou thérapie génique chez le rongeur et rongeur génétiquement altéré
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1200
Rendues sourdes par une exposition sonore ou par chimiothérapie, opérées sous anesthésie générale, puis soumises chaque semaine à une heure de test auditif sous anesthésie, 14 880 souris et 1 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des tests comportementaux deux fois par semaine, que le porteur ne nomme pas, et des administrations hebdomadaires par voie orale ou par injection. Le porteur annonce que la prise en charge garantit le bien-être des animaux non-humains dans la phrase même où il indique que tous seront anesthésiés puis tués, et décrit par ailleurs des récompenses alimentaires distribuées après chaque manipulation. Sur les 16 080 rongeurs, dix rats jugés en bonne santé et non utilisés dans les expériences pourront être proposés à l'adoption, les autres étant tués pour analyses.
Objectifs
466 millions de personnes souffrent de déficience auditive dans le monde (OMS, 2020). D’ici 2050, ce chiffre devrait s’élever à 900 millions. Les surdités et les pathologies de l’oreille interne représentent une problématique majeure de santé publique, en raison de leur fréquence et de leur impact sur la qualité de vie et l’inclusion sociale. Notre projet vise donc à développer des solutions innovantes pour restaurer les fonctions de l’oreille interne, en particulier l’audition. Pour cela, nous testons différentes approches thérapeutiques sur des modèles animaux (rongeurs), certains présentant des altérations génétiques ou acquises similaires à celles que l’on retrouve chez les patients en clinique. L’objectif final est d’identifier des traitements efficaces et sûrs, afin de les faire évoluer vers des essais cliniques et, à terme, améliorer la prise en charge des personnes souffrant de pertes auditives dans différents contextes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer et affiner des modèles précliniques de surdité (congénitale, induite par le bruit ou par chimiothérapie) chez le rongeur (rats et souris), dans le but d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques destinées à restaurer l’audition, dans un contexte où les solutions actuellement proposées aux patients (appareils auditifs, implants cochléaires) restent imparfaites et ne permettent pas toujours une récupération satisfaisante des capacités auditives. Plusieurs bénéfices sont attendus à différentes échelles : A court terme : amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes de la surdité dans différents contextes (génétiques, environnementaux, toxiques). A moyen terme : développement de modèles animaux robustes et transposables aux pathologies humaines, permettant une meilleure évaluation des traitements candidats. Long terme : Passage en phase clinique de certaines approches thérapeutiques testées avec succès en phase préclinique, pouvant aboutir à la restauration partielle ou totale de l’audition chez des patients atteints de surdité, améliorant ainsi leur qualité de vie, leur communication et leur inclusion sociale. Indirectement, ce projet contribue à la mise en place de méthodes expérimentales optimisées et éthiques, visant à réduire le nombre d'animaux nécessaires grâce à des modèles plus prédictifs et à l’intégration de marqueurs précoces d’efficacité et de toxicité. Ce projet se distingue par la diversité des modèles de surdité étudiés, couvrant plusieurs causalités majeures de cette pathologie. Il offre une plateforme préclinique complète et pertinente pour le développement de traitements innovants, en lien direct avec des applications cliniques concrètes. Il s’inscrit pleinement dans une logique de recherche relationnelle entre le laboratoire et le patient, avec un fort potentiel d’impact sociétal.
Procédures
LE PROJET COMPREND LES INTERVENTIONS SUIVANTES SUR DES RATS ET DES SOURIS : •CHIRURGIE SOUS ANESTHESIE GENERALE - DUREE MOYENNE DE 30 MINUTES - UNE FOIS PAR ANIMAL •TESTS AUDIOMETRIQUES SOUS ANESTHESIE GENERAL - DUREE DE 1 HEURE - UNE FOIS PAR SEMAINE •EXPOSITION SONORE SUR ANIMAUX VIGILES - DUREE DE 15 MINUTES - UNE FOIS PAR ANIMAL •TESTS COMPORTEMENTAUX SUR ANIMAUX VIGILES (APRES PERIODE D'HABITUATION) - DUREE DE 10 A 30 MINUTES - DEUX FOIS PAR SEMAINE •ADMINISTRATION DE SUBSTANCES PAR VOIE ORALE OU PAR INJECTION - DUREE DE 1 HEURE - UNE FOIS PAR SEMAINE
Impact sur les animaux
LES CHIRURGIES PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS PASSAGERES QUI SERONT SOIGNEES PAR LA PRISE D'ANTIDOULEURS. CERTAINS TRAITEMENTS, NOTAMMENT DE CHIMIOTHERAPIE, PEUVENT ENTRAINER DES EFFETS SECONDAIRES TEMPORAIRES COMME UNE PERTE DE POIDS, DES TROUBLES DIGESTIFS OU UNE BAISSE DE TEMPERATURES. LES TESTS AUDITIFS, LES OBSERVATIONS DU COMPORTEMENT, AINSI QUE CERTAINES MANIPULATIONS PEUVENT AUSSI CAUSER UN STRESS DE COURTE DUREE.
Devenir
A LA FIN DU PROJET, LA PRISE EN CHARGE DES ANIMAUX EST STRICTEMENT ENCADREE POUR GARANTIR LEUR BIEN-ETRE. TOUS LES ANIMAUX INCLUS DANS LES PROJETS SERONT ANESTHESIES PUIS EUTHANASIES SELON DES METHODES LEGALES ET ETHIQUES AFIN DE PERMETTRE DES ANALYSES SCIENTIFIQUES. LES ANIMAUX QUI NE PARTICIPENT PAS AUX EXPERIENCES POURRONT ETRE PROPOSES A L'ADOPTION APRES AVIS FAVORABLE DU VETERINAIRE DU A LA BONNE SANTE DE L'ANIMAL.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études in vitro sur des cellules de lignées humaines ou des organoïdes, nous ne pouvons pas remplacer le modèle animal car les composés doivent être testés sur des modèles entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes avant de passer en phase clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini grâce à des études pilotes dans un précédent projet comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence sur les paramètres étudiés lors d’études. Un même animal peut être son propre contrôle lorsque cela est possible pour participer à la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
LES ANIMAUX SONT HABITUES PROGRESSIVEMENT AUX CHERCHEURS, AUX MANIPULATIONS ET AUX TESTS, SOUVENT AVEC DES PETITES RECOMPENSES ALIMENTAIRES. POUR FAVORISER LEUR BIEN-ETRE, LES CAGES SONT ENRICHIES D'ELEMENTS PERMETTANT DES INTERACTIONS SOCIALES, ET UNE AIRE DE JEUX A ETE CREEE POUR REFORMER DES GROUPES SOCIAUX SI NECESSAIRE. DES MESURES SPECIFIQUES SONT MISES EN PLACE POUR LIMITER LA DOULEUR ET LE STRESS : SUIVI ATTENTIF APR7S LES OPERATIONS, COMPLEMENTS ALIMENTAIRES, REHYDRATATION, CHAUFFAGE, APPORT EN OXYGENE ET TRAITEMENT DE LA DOULEUR. APRES CHAQUE MANIPULATION, LES ANIMAUX RECOIVENT EGALEMENT UNE RECOMPENSE.
Choix des espèces
LES RATS ET LES SOURIS ONT ETE CHOISIS CAR LEUR SYSTEME AUDITIF RESSEMBLE BEAUCOUP A CELUI DE L'ETRE HUMAIN. LES SOURIS PEUVENT AUSSI ETRE GENETIFQUEMENT ALTEREES, CE QUI PERMET DE REPRODUIRE CERTAINES FORMES DE SURDITE OU DE MALADIES PRESENTES CHEZ L'HOMME. LES TRAITEMENTS SONT TESTES DES LE PLUS JEUNE AGE POUR MIEUX COMPRENDRE LEUR EFFICACITE, MAIS AUSSI A L'AGE ADULTE POUR SIMULER DES PERTES D'AUDITION LIEES A L'EXPOSITION AU BRUIT OU A D'AUTRES CAUSES.
Apprentissage des gestes de base sur modèle murin dans le cadre de la formation à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques niveau concepteur.
- Formation professionnelle
Réformées par l'éleveur ou le fournisseur et déjà destinées à être tuées, 900 souris vont être utilisées pour la formation réglementaire des personnes qui concevront des expériences sur des animaux non-humains. Chaque stagiaire dispose d'un animal : il lui injecte un anesthésique alors qu'elle est éveillée, lui injecte ensuite une solution saline sous anesthésie, puis la met à mort sans réveil. Les nuisances déclarées se limitent au stress de la contention et à la douleur de la piqûre. Le porteur indique que la partie théorique s'appuie sur des vidéos et une peluche, ce qui réduirait le nombre d'animaux, chaque stagiaire en utilisant tout de même un.
Objectifs
La mise en œuvre de la réglementation portant sur l’expérimentation animale inscrite dans le droit français depuis février 2013 précise les obligations réglementaires de formations pour les chercheurs/ingénieurs/techniciens qui souhaitent concevoir et réaliser des expériences utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Dans ce contexte, une «Formation spécifique destinée aux personnes concevant et appliquant des procédures expérimentales » avec un module « rongeurs » a été mise en place. Ce projet s’inscrit dans le cadre des travaux pratiques de cette formation. L’objectif de ce projet est de permettre aux personnes suivant cette formation d’acquérir d’un point de vue théorique et pratique les gestes techniques de base nécessaires à la manipulation des souris dans le cadre de procédures expérimentales, conformément aux exigences réglementaires et aux principes éthiques encadrant l’expérimentation animale. Afin de garantir une maîtrise progressive et éthique de ces manipulations, ce projet s’appuie d’une part sur les cours délivrés dans le cadre de la formation « concepteur » et d’autre part sur une progression pédagogique rigoureusement encadrée dans ce projet s’organisant en deux temps : 1- un enseignement théorique portant sur les gestes de bases en mettant en avant les notions essentielles de bien-être animal, de réduction du stress, de raffinement et de responsabilité de l’expérimentateur, 2- une phase d’exercices pratiques réalisés, dans un premier temps, sur des modèles inertes (peluches) afin de permettre une appropriation des gestes techniques dans un cadre sécurisé avant d’intervenir sur l’animal vivant dans un second temps. Lors de cette phase pratique, le taux d’encadrement est d’un encadrant pour quatre apprenants. Ce dispositif vise à garantir l’acquisition des bonnes pratiques dès le départ, en assurant un haut niveau de compétence technique et éthique avant toute implication dans un projet utilisant des souris.
Bénéfices attendus
Cette formation pratique permet aux participants une initiation aux gestes de base dans le respect des bonnes pratiques. Ces gestes devront être répétés dans l’EU d’affectation pour garantir leur bonne mise en œuvre.
Procédures
les animaux vigiles seront soumis à une injection pour l'administration d’anesthésique (durée de l'injection: 1 minute max) puis, après anesthésie, à une injection de solution saline (durée de l'injection: 1 minute max)
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. L’injection de l’anesthésique entraînent une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issue de la procédure, la formation intègre une méthode de mise à mort réglementairement autorisée.
Remplacement
La partie théorique qui précède la partie pratique utilise différents supports et méthodes alternatives à notre disposition (vidéos, peluche) afin que les stagiaires appréhendent et visualisent au mieux les manipulations et étapes des différents gestes présentés avant de débuter la pratique sur l’animal. Ces apprentissages dans un cadre propice, dirigé et à la veille des évolutions et raffinement techniques assurent une formation initiale de qualité indispensable pour stimuler l’esprit critique et s’assurer que l’acquisition, dans leurs structures, de leurs futures compétences techniques soit l’occasion d’identifier les pratiques inadaptées et de les améliorer.
Réduction
La totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme destinés à être mis à mort. Afin de limiter au maximum l'utilisation d'animaux tout en permettant l’acquisition des différents gestes, chaque stagiaire dispose d’un animal pour l’ensemble des gestes. Le nombre d’animaux est réduit au maximum grâce à la partie théorique de la formation qui précède la partie pratique et utilise différents supports et méthodes alternatives et grâce à la mise en pratique sur peluche qui permet aux stagiaires d’appréhender au mieux les gestes avant de débuter la manipulation sur animaux.
Raffinement
La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Détermination du point limite : Les animaux seront observés quotidiennement dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur afin de rechercher toute modification comportementale pouvant refléter un mal-être. Si un changement de comportement est observé chez un individu, l’avis du responsable de la mise en œuvre du projet, de la SBEA ou du vétérinaire sera demandé et les mesures adéquates seront prises. Lors de l’anesthésie La souris est observée le temps de sa mise en place puis la profondeur de l’anesthésie est contrôlée tout le long de la procédure.
Choix des espèces
La souris est une des espèces les plus utilisées dans les laboratoires de recherche et de nombreux modèles de pathologies et modèles transgéniques existent chez la souris d'où la nécessité d'être formé et d'acquérir les techniques de contention / manipulation de base sur cette espèce. Pour ce projet de formation, les souris seront utilisées à un stade adulte afin de faciliter l’apprentissage des gestes techniques (organogenèse terminée, taille adulte) et de pouvoir utiliser des animaux de réforme initialement destinés à être mis à mort chez l’éleveur ou le fournisseur.
Effet probiotique de certaines souches de Clostridium butyricum dans le traitement de la colite à Clostridioides difficile dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Gavées chaque jour pendant vingt et un jours, infectées à J0 par Clostridioides difficile après une injection d'antibiotique, 60 souris âgées de douze à dix-huit mois subissent neuf prélèvements de sang et neuf prélèvements de fèces. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées sous anesthésie profonde après un dernier prélèvement. L'objet déclaré est de vérifier si une souche de Clostridium butyricum réduit la mortalité de cette colite, première cause de diarrhée nosocomiale dans le monde. La rubrique des effets indésirables tient en trois lignes, mentionne des "changements temporaires dans l'appétit ou le comportement" et des effets "potentiellement réversibles", sans décrire ni la diarrhée ni la mortalité que le projet annonce pourtant vouloir réduire.
Objectifs
La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisite à évaluer l’efficacité et la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.
Bénéfices attendus
- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.
Procédures
Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.
Remplacement
Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.
Réduction
L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 60 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 20 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.
Raffinement
Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.
Etude chez la souris de l’impact de l’hypergravité sur la biodisponibilité relative et absolue d’un composé utilisé en prévention du mal de l’espace, et sur les performances de mémoire à court terme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Ajuster la dose d'un antinauséeux pour les astronautes et le personnel des vols paraboliques : 160 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur plasma et leur cerveau. La moitié passe trente minutes en centrifugeuse en hypergravité, l'autre moitié est placée dans une nacelle à côté pour subir le bruit et le stress de la machine. Le porteur décrit une sensation d'alourdissement, une modification de la température centrale, une baisse de la prise alimentaire et une réduction de l'activité locomotrice à la sortie, puis annonce un test de mémoire à court terme de cinq minutes sans préciser lequel. Les bénéfices avancés tiennent à la sécurité des astronautes et à la nécessité de "rentabiliser au mieux possible les investissements humain et financier colossaux" des vols paraboliques.
Objectifs
Ce projet est situé dans le domaine de la recherche expérimentale. Il vise à étudier les conséquences d’une altération du champ gravitationnel sur la pharmacocinétique d’un médicament utilisé pour le traitement du mal de l’espace. Ce médicament est une molécule d’origine naturelle, extraite principalement de plantes. Elle agit en bloquant certains récepteurs aux neurotransmetteurs. A faible dose, elle est utilisée pour traiter le mal des transports, notamment les nausées et les vomissements – que ce soit sous forme de patch ou en sous-cutané dans le cadre des campagnes de vols paraboliques. A forte dose, ce médicament présente de nombreux effets indésirables centraux, tels que des hallucinations, une confusion mentale et une amnésie. Cette molécule est d’ailleurs utilisée comme modèle pharmacologique de troubles cognitifs induits, que ce soit chez l’animal ou chez l’homme. Du fait de l’hypergravité, une augmentation de perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) a été décrite à la fois chez l’homme et chez l’animal. D’un point de vue théorique, l’augmentation de la perméabilité de la BHE pourrait modifier la posologie du médicament dans une indication du traitement préventif du mal de l’espace. Ainsi, l’objectif de notre étude est de mesurer plus particulièrement l’impact de l’augmentation de la BHE sur la biodisponibilité à la fois absolue (plasmatique) et relative (centrale) du médicament. In fine, il s’agira d’émettre des recommandations d’adaptation posologique du fait de la prise en compte de l’environnement de gravité modifiée lors d’une prescription de ce médicament pour le traitement du mal de l’espace.
Bénéfices attendus
2/3 des astronautes subissent les symptômes du mal de l’espace lors des 72 premières heures en orbite. Par ailleurs, la durée des missions spatiales s’est allongée ces dernières années pour mieux préparer les premiers voyages vers Mars. La prise en charge optimisée du mal de l’espace permet aux astronautes de travailler dans des conditions de sécurité et de santé optimales, ce qui est primordial au vu de leur préparation longue et rigoureuse, et des investissements mis en place pour ces missions. Les conséquences néfastes du mal de l’espace s’appliquent également aux vols paraboliques, durant lesquels le personnel de recherche se doit de rentabiliser au mieux possible les investissements humain et financier colossaux. Si l’hypergravité augmente la distribution de la molécule au niveau cérébral, induisant secondairement des altérations cognitives, une adaptation posologique devra s’imposer pour rester dans la fenêtre thérapeutique. Des travaux d’optimisation des doses administrés devront alors être entrepris. A terme, les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de l’hypergravité à court terme sur la perméabilité de la BHE des souris, et de savoir si son altération provoque des modifications de la distribution de la molécule, induisant/aggravant ou non un phénotype comportemental de déficit de mémoire spatiale à court terme. Ainsi, pour de futurs travaux, si notre hypothèse est validée, il s’agira de déterminer par exemple une gamme de dose qui sur terre est suboptimale, mais qui avec l’altération de la BHE, reste efficace et non-toxique. Par ailleurs, ce champ de recherche trouve également un domaine d’application sur terre. En effet, le corps humain en apesanteur subit des changements accélérés comparables à ceux observés au cours du vieillissement. La recherche en pharmacologie spatiale pourrait aider à une meilleure prise en charge thérapeutique des maladies liées au vieillissement.
Procédures
- Tous les animaux recevront une injection unique d’une durée de 1 minute - La moitié des animaux sera soumise à une session de centrifugation d’une durée totale de 30 minutes. La 2ème moitié des souris sera placée dans une nacelle à proximité de la centrifugeuse, afin de les exposer au bruit et au stress engendré par la centrifugation. - Tous les animaux seront soumis une fois au test comportemental de mémoire à court terme, pendant une durée de 5 minutes. - Enfin, l’ensemble des animaux seront exposés à une intervention terminale (prélèvement sanguin) d’une durée inférieure à 5 minutes, menée sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les nuisances seront : a) L’administration nécessitant une contention. Un stress physique et une douleur légère dus à l’injection sont attendus lors de cette manipulation (nuisance légère). b) La mise en gravité modifiée des animaux induit une sensation d’alourdissement / d’allégement modifiant les capacités de l’animal à se déplacer, une modification de la température centrale et une altération de prise alimentaire induisant un ralentissement de la prise de poids des animaux. Au vu de la courte durée d’exposition à l’hypergravité, les animaux n’ont pas le temps de s’habituer aux variations d’intensité gravitationnelle (passage en hypergravité puis retour en gravité normale en 30 minutes). Ces variations rapides sont source d’une augmentation importante du niveau de stress et d’une réduction de l’activité locomotrice en sortie de centrifugation (nuisance modérée). c) Le prélèvement sanguin sous anesthésie générale (acte sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le plasma et les cerveaux pour des investigations post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l’impact d’une modification de gravité sur les caractéristiques pharmacocinétiques (biodisponibilité et concentration plasmatiques et sanguines) d’un médicament utilisé dans le cadre du mal de l’espace. L’étude des caractéristiques pharmacocinétiques nécessite de faire appel à une approches in vivo. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici test évaluant la mémoire de travail à court terme). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatiques) ne peut être réalisé.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans cette étude a été réduit au maximum – au regard du test comportemental envisagé (test comportemental de mémoire à court terme) pour lequel le laboratoire possède une expertise internationale ainsi que sur la base de la littérature. Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. De même, afin de réduire le nombre d’animaux, chaque souris se verra prélever sang et cerveau. Le calcul de taille d’échantillon prend en compte la nécessité d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure sur les effets observés. En effet, un calcul d’effectif nous a permis d’aboutir à ce nombre (n=10 par groupe et par sexe) sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Par ailleurs, l’utilisation des 2 sexes permettra d’obtenir de potentielles différences de résultats entre les mâles et les femelles, ce qui peut éviter la réalisation d’une étude supplémentaire pour cet aspect.
Raffinement
Les cages d’hébergement seront enrichies avec du kraft et une maison en papier mâché. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling (1 semaine) dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Ceci aura principalement pour but de réduire le stress lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection. Les souris seront placées 30 minutes dans la pièce de la centrifugeuse pour acclimatation, et un délai d’au moins 90 minutes séparera la fin de la centrifugation et le début du test de mémoire à court terme. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins, qui seront placés dans une nacelle à proximité de la centrifugeuse, dans la même pièce). Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, un responsable des animaux vérifiera l’apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…) des animaux en permanence, et particulièrement à la sortie de la centrifugeuse. Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude (non réalisation du test comportemental) et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA (Structure chargée du Bien-Etre Animal) concernant son éventuelle mise à mort selon des points limites précoces. De plus, une anesthésie générale sera réalisée sur les animaux pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. La plupart des études auxquelles nous nous sommes référés utilisent des souris du même âge. La souris est un bon modèle car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité. De plus, leur génome est connu et, des modifications de celui-ci sont possibles et pourraient nous être utiles par la suite (Animaux Génétiquement Altérés (AGA)). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données.
Comprendre les maladies de l’aorte à l’aide de modèles de souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une incision dans le dos, une mini-pompe implantée sous la peau, vingt-huit jours de perfusion d'angiotensine II pour faire gonfler l'aorte : 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses de tissus. Le suivi tient à une échographie cardiaque de dix minutes et à un transport à pied entre deux établissements. Le porteur résume les nuisances à un "léger stress" et à une suture "légèrement irritée", avant d'indiquer qu'une dissection de l'aorte et une mort subite peuvent survenir en fin de traitement. Il précise aussi que l'absence complète de l'un des quatre gènes étudiés tue les souriceaux à la naissance.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Les anévrysmes de l’aorte thoracique (AAT) sont un gonflement d'une region spécifique de l'aorte qui relie le coeur au reste du corps humain. Ce gonflement à pour conséquence une fragilsation importante du reste du réseau cardiaque. La rupture de l’aorte qui consiste en un dechirement de celle-ci est alors favorisée et mortelle. Aucun traitement n’est pour le moment disponible pour ralentir la progression de la pathologie en raison de connaissances insuffisantes sur les mécanismes impliqués. Le but de notre recherche est d’identifier les gènes impliqués dans les AAT (anévrysme aortique thoracique) car a ce jour, seuls 30 % des patients ont une cause génétique connue. Il a été identifié 4 gènes qui sont potentiellement impliqués dans les anévrysmes mais leur rôle exact reste à établir. Pour mieux comprendre leur implication dans les anévrysmes de l'aorte thoracique, des modèles murins ont été générés afin de pouvoir etudier leur mécanismes. Un modèle de souris par gène identifié sera mis en place pour lequel nous induirons par la suite un anévrysme de l'aorte à l'aide d'une molécule déjà connue de la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider des gènes impliquées dans les AAT et ainsi réduire le nombre de patient dont la cause génétique n'est à ce jour pas connue. L'identification du rôle de ces gènes nous amenera a mieux comprendre leur mécanisme et ainsi offrir un meilleur suivi de l'anévrysme aux patients. La connaissance approfondie des potentiels acteurs impliqués dans les anévrysmes nous permettra de prévenir les conséquences fatales de la progression de cette pathologie et potentiellement de développer des solutions thérapeutiques.
Procédures
Dans l'EU1, une incision sous la peau au niveau du dos sera réalisée sur animal anesthésié pour implanter une mini-pompe qui délivrera une molécule pendant 28 jours pour induire un anévrysme. La durée de l’acte est de 10 min. Au préalable, sur un groupe d’animaux, il sera administré pendant une semaine dans l’eau de boisson une molécule connue de la littérature pour augmenter l’apparition de l’anévrysme. Pour suivre l'évolution du développement des anévrysmes, une imagerie cardiaque sera effectuée dans l'EU2 soit 10 min par souris.
Impact sur les animaux
La mise en place des pompes à AngII (pompes avec Angiotensine II qui est un hypertenseur) peut induire un léger stress à la souris. La suture peut être irritée légèrement. En fin de traitement, une possible dissection aortique peut survenir et donc une mort subite. Les échographies sont rapides et bien supportées par les animaux. L'un des gènes étudiés entraine la mort de l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés et des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour analyses.
Remplacement
Les prélèvements chez l'humain après opérations sont limités en nombre et en nature (seulement des petites parties de la paroi anévrysmale sont retirées par les chirurgiens). Cette pathologie est complexe et fait intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bein sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, le modèle murin nous permet d'être en mesure de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler un gène en particulier. Des expériences ont été menées sur des cellules humaines isolées afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux. Cependant, la complexité des mécanismes à l'origine des anévrysmes requiert l'utilisation d'un organisme complet.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Un lot expérimental nécessite 10 souris pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif est déduit de nos expériences précédentes. Toutefois, si nous constatons une différence statistiquement significative à un effectif plus faible, nous conclurons l'étude. La production d'animaux nécessaire sera réduite au minimum des besoins expérimentaux.
Raffinement
Nous raffinerons l'environnement des animaux par enrichissement de leur milieu de vie. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture ainsi que de la boisson. Nous veillerons à ce que les animaux ne soient pas laissé isoler dans les cages durant toutes les expériences afin de ne pas perturber les groupes souciaux. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés lors du projet pour couvrir les douleurs opératoires. De plus, les yeux seront couverts d'ocrygel pour eviter la déshydratation des yeux. Une surveillance quotidienne sera efféctué par l'expérimentateur ainsi que le personnel de l'animalerie, cette surveillance pourra être augmentée en cas de nécéssité. Le suivi sera quotidien. Nous établirons une grille d'évaluation des effets/nuisances susceptibles de toucher les animaux. Les critères observés seront l’apparence, le comportement, la mobilité et la perte poids. Les animaux recevront une injection d'un anti-douleur toutes les 8 heures pendant 2 jours en cas de besoin. En cas de déshydratation, les animaux recevront une injection de sérum physiologique au niveau de l’abdomen. Lors du transport des animaux de l'EU1 à l'EU2, nus ferons ce transport à pied (5min), à l'abri des regards, avec des hydrogels dans les cages et un peu de nourriture et des igloos en carton pour éviter le stress.
Choix des espèces
Les lignées murines impliquant les 4 gènes étudiés ont déjà été générées et nous y avons accès. De nombreux modèles murins ont déjà été décrits et développés pour les AAT nous permettant ainsi de comparer les modèles entre eux afin de mieux comprendre les mécanismes sous jacents. Les animaux seront utilisés au stade adulte (12 semaines), car les anévrismes de l’aorte thoracique se déclarent majoritairement chez l’Homme adulte et chez la souris à 12 semaines.
Etude pré-clinique in vivo d’efficacité et de sécurité d’une nouvelle thérapie cellulaire innovante (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
63 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont irradiées, puis reçoivent sans anesthésie une injection de cellules sanguines humaines qui déclenche une maladie du greffon contre l'hôte, atteignant la peau, le tube digestif et le foie, avec une perte de poids progressive sur quatre à six semaines. Une leucémie humaine leur est également greffée, puis suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à un volume tumoral fixé à l'avance. L'objectif immédiat est le dépôt d'un dossier non clinique auprès de l'ANSM, le porteur affirmant qu'aucune simulation informatique ne reproduit ces interactions et que le modèle murin reste "le seul modèle validé".
Objectifs
La greffe de cellules sanguines issues d'un donneur volontaire sain est considérée comme le seul traitement permettant d’obtenir la guérison de certains cancers du sang chez l'Homme. La greffe permet que le système immunitaire du donneur reconnaisse comme étrangères les cellules cancéreuses du receveur et les tue : c’est ce qu’on appelle l’effet anti- tumoral (ou anti-leucémique) du greffon. Toutefois, les cellules du système immunitaire du donneur sont incapables de faire la différence entre une cellule cancéreuse et une cellule saine du receveur. L’attaque des cellules saines du receveur par le système immunitaire du donneur s’appelle la maladie du greffon contre l’hôte. Une stratégie prometteuse qui permettrait de moduler la maladie du greffon contre l’hôte sans altérer l’effet l’effet anti- tumoral du greffon est la thérapie cellulaire, notamment avec les cellules myéloïdes régulatrices (MDSCs). Notre objectif est de développer un médicament de thérapie innovante pour moduler les conflits hôtes/greffon dans le contexte de la transplantation de cellules sanguines à partir d’un donneur volontaire sain. Nous avons développé une méthode pour obtenir rapidement des "MDSCs" obtenues à partir d’un échantillon de greffon de donneur sain, conduisant au dépot d'un brevet. Précedemment, nous avons identifié la dose injectée minimale pour obtenir une diminution de l'incidence et de la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte dans un modèle pré-clinique murin. L'objectif de ce projet est triple 1/Reproductibilité de l'efficacité des MDSCs injectées au moment de la transplantation, en injectant des MDSCs issues de 3 lots différents de production. 2/L'évaluation de la dispertion des cellules dans les organes cibles et l'infiltration/différenciation des cellules injectées dans ces organes. 3/ L'absence d'effet néfaste de la thérapie notamment de l'absence de favorisation de cellules leucémiques. Il s’agit d’un projet multisite dans deux EU différents.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à moyen terme de ce projet sont de déposer un dossier technique complet (dossier non clinique) auprès de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) afin de proposer un jour notre thérapie cellulaire chez l’Homme. Le projet va permettre de 1/ de confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/Etudier la répartition tissulaire des cellules après l'injection. 3/ Vérifier l'absence d'aggravation de la leucémie (leucémie, principale indication actuelle en clinique pour la greffe de cellules sanguines humaines à partir d'un donneur sain). A plus long terme, si ce produit de thérapie cellulaire est efficace et peu toxique dans la greffe de cellules sanguines, il pourrait s'étendre à d'autres applications comme la transplantation d'organes solides pour moduler les conflits hôte/greffon.
Procédures
-Une irradiation faible dose, de chaque animal pour 63 souris réalisée une seule fois (durée d'environ 2 minutes sur une journée).: -Une injection intraveineuse sur animal conscient (non anesthésié) de cellules sanguines humaines, une seule fois en début d’expérience pour 63 souris (dure environ 5 secondes sur une journée). -Une anesthésie générale répétée (X4 maximum) pour 63 souris (anesthésie générale de 15 à 30 minutes maximum sur une journée). L'anesthésie générale est prévue soit 4 fois dans 1 semaine pour suivre par imagerie la dispertion et répartition tissulaire des cellules une fois par semaine (maximum 4 semaines) pour le suivi de la leucémie.
Impact sur les animaux
-la douleur légère induite par la piqure d’aiguille à l’injection des cellules (J0) -stress modéré lors de la procédure d'irradiation à faible dose, -Potentielles mais rares lésions d'inflammation de la muqueuse de la bouche après irradiation (pendant 3-5 jours) -Stress lié aux injections et aux anesthésies générales -Potentiels signes de maladie du greffon contre l’hôte (atteinte de la peau, du tube digestif et/ou du foie), avec une sévérité habituellement modérée. Les souris vont alors très progressivement (sur 4 à 6 semaines) perdre du poids et montrer des signes de fatigue et d’altération de l’état général. -Développement leucémique lent infiltrant la rate, le foie et les ganglions. Cette infiltration leucémique des organes est contrôlé par l'imagerie hebdomadaire basée sur la bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) qui permet d'arrêter l'expérimentation à un volume tumoral cible sans laisser se développer les symptômes terminaux de la leucémie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques et de bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) par des données microscopiques. Tâche1: prélèvement des organes cibles de la maladie du greffon contre l'hôte (peau, tube digestif, foie) pour analyse au microscope de la sévérité de la maladie développée. Tâche 2: prélèvement des organes cibles dans lesquels patrouillent les MDSCs pour observer par microscopie la localisation exacte et le devenir des MDSCs. Tâche 3: prélèvement des organes envahis par la leucémie pour explorer d'éventuels contacts cellulaires entre les cellules leucémiques et les MDSCs.
Remplacement
Nous avons optimisé in vitro nos connaisances sur le mécanisme d'action des MDSCs. Toutefois, pour proposer les MDSCs comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré-clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans les cancers liquides, aucune simulation informatique ("modèle in silico" )ne permet aujourd'hui de reproduire en laboratoire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules en thérapie. A ce jour, le seul modèle validé est le modèle murin.
Réduction
Nos études antérieures ont révélé un effet important de nos traitements, aboutissant à des différences significatives entre des groupes même avec un faible nombre d'animaux (n=3). Ainsi pour chaque tâche expérimentale, des groupes de taille minimale de trois animaux seront constitués.Des analyses statistiques seront réalisées pour interpréter les résultats. Afin de prendre en compte une viariabilité liée au donneur (variation d'efficacité d'un produit cellulaire en fonction du donneur humain d'origine), chaque tâche sera repétée trois fois avec des cellules issues de trois donneurs différents.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un secteur spécifique pour les animaux avec une déficience profonde de leur système immunitaire, en animalerie exempte d'organisme pathogène spécifique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les expérimentations d'imagerie seront atourées d'une anesthésie. Les points limites sont clairement identifiés : des signes généraux sur l'évaluation clinique de l'état général de la souris et le développement de signes cliniques de conflits hôte/greffon) et des signes spécifiques de chaque expérimentation ( suivi de la croissance tumorale), conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.
Choix des espèces
La modèle animal murin utilisé est un modèle mondialement reconnu pour étudier la greffe de cellules sanguines humaines. Ces souris n'ont pas de système immunitaire fonctionnel capable de rejeter des cellules sanguines de l'Homme (ce qui permet une étude à long terme des cellules sanguines humaines injectées). En revanche elles ont des cellules présentatrices d'antigènes qui peuvent activer les cellules sanguines humaines acceptées. Ainsi, ce modèle reproduit la maladie du greffon contre l'hôte couramment observé chez les patients greffés. On observe une réactivité des cellules sanguines humaines contre les organes cibles de la souris ( la peau, le tube digestif et le foie), ce qui mime ce qui est observé chez l'Homme. D'autre part, la greffe de cellules sanguines d'un donneur sain vers un patient est en général indiquée pour véhiculer un effet du greffon contre la leucémie. Or l'adjonction de lignées leucémiques humaines dans ce modèle de souris reproduit le contexte leucémique d'un patient. Notre projet vise à étudier l'administration d'un nouveau médicament (produit à partir de cellules du greffon du donneur) dans ce contexte de greffe de cellules sanguines. Nous devons étudier l'impact de ce nouveau médicament sur l'incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte et l'absence d'effet qui pourrait favoriser la leucémie. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe de cellules humaines est meilleure dans cette période de vie
Etude pilote pour l’utilisation de nouvelles nanoparticules dans deux modèles de cancer du pancréas chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
216 souris privées de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec un volume de tumeur autorisé jusqu'à 1 500 mm3. Cent quarante-quatre d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas sous la peau, cent huit une injection intraveineuse de nanoparticules, trente-six une injection directe dans la tumeur. Le porteur écrit pouvoir "imaginer" une perte de poids et de motricité chez les animaux dont la tumeur grossit. Aucun traitement n'est évalué à ce stade : les 216 souris sont utilisées pour choisir la souche, la dose et la voie d'administration de l'essai thérapeutique à venir, dont l'effectif n'est pas indiqué.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est Hommes : environ 9 % et Femmes : environ 10 %. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lèvera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des cellules qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, les nanoparticules seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement du cancer du pancréas. Cette première partie, courte et considérée pilote nous aidera dans le choix de souche de souris d'intérêt, le type de cellules vecteurs plus pertinentes, la dose de nanoparticules et la voie d'administration d'intérêt. Cela permettra donc de réduire le nombre de groupes expérimentaux par la suite pour l’étude thérapeutique.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales : 144 souris concernées = 5 min /souris - injection intraveineuse : 72 souris saines + 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris - injection intra-tumorale : 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris
Impact sur les animaux
D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Afin d’éviter cela, nous avons prévu un volume maximum de tumeur à atteindre de 1500mm3. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des particules véhiculées dans les différents types cellulaires est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui-même est une étude pilote pour établir le bon choix de souche de souris, de modèle tumoral et de voie d’administration de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers du pancréas. Une suite est prévue une fois ces informations traitées.
Réduction
Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur ainsi que la voie d’administration et les doses optimales à utiliser pour l’utilisation des nanoparticules dans les cellules vectrices. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature complétées par des simulations à l’aide d’outils en ligne régulièrement utilisés en recherche.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de trois individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il s'agit d'animaux OGM, au système immunitaire affaibli. Ils sont donc hébérgés en animalerie spécifique, en environnement controlé afin d'éviter tout risque d'infection et donc éviter un phénotype dommageable.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales qui peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris au système immunitaire déficient « SCID » qui sont considérées les plus pertinentes dans l’étude de tumeurs pancréatiques. Nous utiliserons des mâles et des femelles, tenant compte que la prévalence du cancer du pancréas touche aussi bien les hommes que les femmes. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.