Souris
Étude de démangeaisons induites chez la souris afin d’étudier les mécanismes biologiques impliqués – Phase 2
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Jusqu'à cinq séances de trente minutes d'enregistrement des démangeaisons, puis cinq autres séances de trente minutes de stimulation au toucher léger : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après un rasage sous anesthésie, elles reçoivent des injections locales d'une substance qui déclenche des démangeaisons chez l'humain, et le porteur décrit des démangeaisons spontanées d'intensité faible à modérée réparties sur les vingt à trente minutes qui suivent chaque injection. Le projet cherche à identifier quels nerfs de la peau cette substance active, avec l'espoir de traiter un jour les démangeaisons de l'eczéma ou du psoriasis. La substance n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé comme "la substance étudiée".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier les nerfs de la peau activés par une substance induisant des démangeaisons chez l’homme. Pour cela, il étudiera si la substance étudiée est capable d'augmenter les démangeaisons induites par des substances de référence, qui induisent des démangeaisons en activant des nerfs bien identifiés. Inversement, il étudiera si ces substances augmentent les démangeaisons induites par la substance étudiée.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Identifier les nerfs affectés est une première étape d'étude des mécanismes impliqués. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).
Procédures
1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection locale des substances de référence (1 ou 2 fois), de la substance étudiée (1 fois) et/ou d’une substance-contrôle (1 fois), durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 2 fois ou 4 fois). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un espace dédié (durée 30 min ; réalisé 3 ou 5 fois). 4) Stress lors des mesures des démangeaisons induites par le toucher léger dans un espace dédié (durée 30 min, réalisées 3 ou 5 fois). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection (réalisée 2 ou 4 fois). 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité très faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué. Épreuve réalisée 3 ou 5 fois, durée 30 min.
Devenir
En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux (480) car leur exposition à la substance étudiée interdit leur réutilisation, replacement ou adoption et/ou ils sont destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses.
Remplacement
Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les mécanismes des démangeaisons induites. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.
Réduction
L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.
Raffinement
Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages (matériel de nidification et igloo), habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif (coupelle de gel appétant en récompense pendant l'habituation), points limites et stratégie d’analgésie. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.
Evaluation pré-clinique de nouvelles thérapeutiques anticancéreuses dans les modèles murins de cancer.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées pour des analyses post mortem, 11 182 souris vont être utilisées, 9 782 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 400 un niveau sévère. Ce sont des souris immunodéficientes, choisies pour leur incapacité à rejeter les tumeurs humaines qui leur sont greffées. Elles subissent une implantation de cellules tumorales sous anesthésie, parfois une castration chirurgicale de vingt minutes, des traitements pouvant aller jusqu'à trois fois par jour pendant quatre semaines, des mesures de tumeur deux fois par semaine et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les souris n'ayant pas développé de tumeur en étude d'efficacité sont réaffectées aux études de tolérance, où trois souris par dose suffisent selon lui à détecter les effets secondaires fréquents.
Objectifs
Le cancer demeure l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques, le développement de nouveaux traitements efficaces nécessite des modèles précliniques pertinents, capables de reproduire fidèlement les caractéristiques des tumeurs humaines. Parmi ces modèles, les xénogreffes—issues de l’implantation de tumeurs humaines sur des souris —constituent aujourd’hui l’une des approches les plus fiables, reflétant la diversité et l’hétérogénéité du cancer chez l’humain. Elles permettent de mener des études pharmacologiques à fort potentiel prédictif clinique, facilitant ainsi l’identification précoce des thérapies prometteuses. Ces modèles jouent un rôle clé dans l’évaluation de l’efficacité des nouvelles molécules, des combinaisons thérapeutiques innovantes ou encore de l’optimisation des schémas d’administration. Ces essais constituent une étape essentielle avant les phases cliniques, chez les patients. En identifiant les traitements les plus prometteurs, ils orientent le développement des nouvelles thérapies et permettent d’optimiser leur utilisation chez l’homme. L’objectif principal de ce projet est d’étudier les effets anticancéreux de nouveaux traitements. Ces recherches visent non seulement à développer de nouveaux traitements contre le cancer, mais aussi à identifier des biomarqueurs permettant de prédire la réponse aux thérapies. Elles permettront également d’explorer les mécanismes de résistance des tumeurs, afin d’optimiser l’efficacité des traitements et d’adapter les stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les études menées sur les xénogreffes issues de l’implantation de tumeurs humaines sur des souris jouent un rôle clé dans le développement des médicaments anticancéreux. En testant les thérapies dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients, elles augmentent les chances d’obtenir des résultats transposables en clinique. Ce projet contribuera ainsi à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer, dont certaines pourront être testées ultérieurement chez l’homme lors d’essais cliniques. Il offrira également une meilleure compréhension des mécanismes d’action des traitements et des résistances tumorales, permettant d’optimiser la prise en charge des patients
Procédures
Dans un premier lot de souris , des traitements seront administrés aux animaux vigiles, chaque administration durant moins de 10 secondes. Cette phase durera 4 semaines, avec une fréquence variant d’une fois toutes les 3-4 semaines à 3 fois par jour selon les thérapies. Dans un deuxième lot de souris, des cellules tumorales seront implantées sous anesthésie générale lors d’une intervention chirurgicale d’environ 10 minutes. Puis, les souris recevront un traitement dont la fréquence et la durée seront identiques à celles du premier lot d’animaux. Dans certains cas, le traitement consistera en une castration sous anesthésie générale, cette chirurgie durant environ 20 minutes. Les effets du traitement sur la croissance tumorale pourront être suivis par imagerie non invasive une à deux fois par semaine sur animal anesthésie (15 minutes). Dans un troisième lot de souris, des cellules tumorales seront implantées sous anesthésie générale au cours d’une intervention de 10 minutes. En fonction des traitements testés, les souris recevront une administration unique ou répétée des molécules étudiées. Afin d’analyser la distribution et l’action du traitement dans l’organisme, des prélèvements sanguins (durée inférieure à 1 minute) seront réalisés à différents intervalles, allant de 30 minutes à 21 jours après la dernière administration. Des biopsies tumorales sous anesthésie générale (intervention d’environ 10 minutes) pourront également être réalisées 1 fois. Dans un quatrième lot de souris, des cellules tumorales seront injectées à l’aide d’une seringue chez des souris vigiles. Les souris recevront un traitement dont la fréquence et la durée seront identiques à celles du premier lot d’animaux. Dans certains cas, le traitement consistera en une castration sous anesthésie générale, cette chirurgie durant environ 20 minutes. Les effets du traitement sur la croissance des métastases seront suivis par imagerie non invasive 1 à 2 fois par semaine. Des prélèvements sanguins (3 fois– même conditions que les études de cinétique) permettront d’évaluer l’effet des traitements sur les cellules cancéreuses dans le sang.
Impact sur les animaux
Des cellules tumorales seront implantées chez les souris. Selon le site d’implantation, les tumeurs pourront se développer sur le flanc, entre les omoplates, au niveau de la glande mammaire ou du côlon entrainant une gêne locale lors de la greffe (quelques jours) puis lorsqu’elle atteint une taille plus grande (quelques semaines). Pour les modèles métastatiques, une gêne respiratoire pourrait apparaître lors du développement de métastases pulmonaires (quelques jours). Les souris recevront ensuite des traitements. Les effets secondaires attendus dépendront du mode d’administration. Les injections pourront occasionner une gêne passagère au site de la piqure (quelques secondes), le gavage un inconfort en raison de la contention (1 min). Certains traitements pourraient provoquer une perte de poids ou des épisodes de diarrhée au fil des administrations. En cas de traitement par ablation des ovaires ou des testicules, les désagréments seront liés à l’intervention chirurgicale (incision de la peau ou du péritoine, baisse de température due à l’anesthésie, douleurs post-opératoires). Ces douleurs pourront persister jusqu’à 48 heures après l’intervention. Tout au long des tests d’efficacité, les volumes tumoraux seront mesurés deux fois par semaine. Ces mesures seront effectuées soit sur des souris vigiles à l’aide d’un pied à coulisse, après une légère contention, soit par imagerie (au moins une fois toutes les 2 semaines) sous anesthésie générale (10 min) pouvant entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Enfin, certaines expériences nécessiteront des prélèvements sanguins ou tumoraux. Les prises de sang ne provoqueront qu’un inconfort momentané lié à la piqûre. Quant aux biopsies tumorales, elles impliqueront une anesthésie suivie d’une incision cutanée, pouvant entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Toutefois, ces désagréments resteront de courte durée (quelques jours).
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Avant d’initier une étude d’efficacité sur l’animal, une première étude des molécules est réalisée in vitro sur des lignées cellulaires et/ou sur des organoïdes (cultures cellulaires en 3D). Ces organoïdes, dérivés de tumeurs humaines, représentent des modèles physiologiques avancés permettant une étude précise des mécanismes cellulaires. Cette première étape de validation peut être réalisée au préalable par les collaborateurs ou au laboratoire en utilisant notre banque d'organoïdes issus directement de prélèvements de patients ou de xénogreffes dérivées de tumeurs humaines. Cependant, il reste nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré, tenant compte de la complexité d’un organisme vivant, des multiples interactions biologiques, de la toxicité potentielle et des difficultés qu’une molécule peut rencontrer pour atteindre sa cible. Les xénogreffes de tumeurs dérivées de patients constituent aujourd'hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de l’utilisation clinique. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l’évaluation préclinique reste une étape cruciale dans le développement de tout médicament avant son application clinique. Cette évaluation, combinant les modèles comme les organoïdes et les xénogreffes, optimise les modalités thérapeutiques, prédit les effets des médicaments en association et identifie des marqueurs de réponse ou de résistance. De plus, les effets des thérapies sur la dissémination métastatique et les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés, renforçant ainsi la robustesse des données obtenues
Réduction
Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous avons mis en place plusieurs stratégies visant à optimiser nos études tout en garantissant la fiabilité des résultats. Nombre minimal de souris par type d’étude 1. Études de tolérance : 3 souris par dose suffisent pour détecter les effets secondaires fréquents. 2. Études d’efficacité (sur tumeur primaire et métastases) : Le nombre de souris est calculé pour détecter une différence de réponse de 30 % entre groupes, en intégrant la variabilité et le développement tumoral. 3. Études de cinétique : 5 souris permettent de réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses, en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Ce nombre pourra être ajusté selon les besoins des projets. Stratégies pour limiter l’utilisation des animaux 1. Optimisation des doses : Dans les études de tolérance, nous nous appuyons sur la littérature et les données de toxicité de nos collaborateurs pour identifier la dose tolérée par les souris, représentative de celle administrée à l’homme et efficace contre les tumeurs. L’objectif est de tester un minimum de doses sur le plus petit nombre d’animaux possible. 2. Réutilisation des souris : Les souris n’ayant pas développé de tumeurs en étude d’efficacité peuvent être réaffectées aux études de tolérance. 3. Recherche d’effet francs dans les études d’efficacité : Pour certaines molécules, viser une efficacité antitumorale de 80 % (plutôt que 30 %) permet de réduire le nombre de souris à 5 par groupe au lieu de 10. 4. Prélèvements en fin d’étude : Des analyses sanguines et tumorales peuvent être effectuées en fin d’expérience d’efficacité pour éviter des études de cinétique séparées. 5. Lors des études de cinétique, plusieurs prélèvements sur un même animal permettent de suivre l’évolution du traitement tout en limitant le nombre total de souris.
Raffinement
Un protocole rigoureux est mis en œuvre afin de minimiser les contraintes et la douleur infligées aux animaux. Le personnel est spécifiquement formé aux gestes techniques requis. L'utilisation d'anesthésiques et d’analgésiques est systématique lors des interventions chirurgicales, et des mesures sont prises pour réduire l'hypothermie pendant la chirurgie. L'utilisation de tapis et de lampe chauffante est systématique du début de l'anesthésie jusqu'au réveil des animaux. L'analgésie est prolongée systématiquement 48h pour toutes les chirurgies abdominales. Des gels nutritifs sont proposés aux souris après l'opération, et une hydratation supplémentaire est fournie en cas de perte de poids ou de difficulté à se déplacer. Une surveillance étroite des animaux est mise en place le jour de l’intervention pour les greffes de cellules tumorales, et étendue à 48 heures pour les chirurgies abdominales. Par la suite, un suivi clinique hebdomadaire au minimum est assuré par du personnel qualifié afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience, et rapproché si baisse de l’état général de l’animal. Une grille de score est utilisée pour évaluer objectivement l'état des animaux et déterminer les points-limite. En cas de signes de douleur, des analgésiants sont administrés. L'expérience est interrompue lorsque la tumeur atteint la limite éthique ou si d'autres points limites décrits dans cette grille sont atteints.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : - En tant que mammifère, la souris possède une physiologie proche de celle de l’Homme, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier l’effet antitumoral de nouvelle molécule ; - Les souches immunodéprimées de souris permettent la création de xénogreffes de tumeurs humaines sans provoquer de rejet de ces tumeurs ; - La disponibilité de souches immunodéficientes chez la souris offre la possibilité de greffer des cellules humaines, une approche souvent plus complexe avec d’autres espèces (le poisson zèbre, par exemple, se révèle moins immunodéprimé) ; - Enfin, la réglementation exige que tout développement de médicament soit évalué sur deux espèces vertébrés différentes pertinentes avant une administration chez l’Homme. La souris constitue alors le modèle de choix en première instance. Jeune adulte : la greffe est réalisée entre 5 et 8 semaines, une période au cours de laquelle les souris ont terminé leur croissance. Ce choix est stratégique, car il permet d’augmenter les chances de prise de la tumeur greffée, l’immunodéficience des souris ayant tendance à diminuer avec l’âge. À cet âge, les souris supportent également mieux les interventions telles que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.
Rôle du récepteur des produits finaux de glycation avancée (RAGE) et impact thérapeutique de son inhibition dans le vieillissement rénal
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles cardiaques
Les souris qui perdent 15 % de leur poids, se prostrent ou cessent de répondre aux stimulus sont tuées. 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, à des âges allant de 13 à 86 semaines pour couvrir l'équivalent d'une vie humaine de 25 à 70 ans. Elles subissent des prélèvements de sang sous anesthésie, une dépilation du dos pour y fixer un dispositif de mesure, une injection intraveineuse de produit fluorescent et jusqu'à deux heures d'évaluation de leur fonction rénale, en plus de l'administration de molécules ciblant le récepteur RAGE. Le porteur écrit qu'aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet, afin de collecter les organes sans avoir à réserver un lot de souris à cette fin, et présente cette mise à mort générale comme une mesure de réduction.
Objectifs
Avec l’âge, les reins perdent progressivement de leur efficacité, même en l'absence de toute pathologie. Ce vieillissement naturel du rein peut entraîner des troubles chez les personnes âgées. Or, malgré les efforts pour mieux traiter les facteurs connus qui abîment les reins (comme l’hypertension artérielle ou le tabac), ces mesures ne permettent pas de prévenir ce vieillissement rénal. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles pistes pour mieux comprendre et peut-être ralentir ce phénomène. Nos recherches s’intéressent à une molécule appelée RAGE, présente naturellement dans l’organisme. Il s’agit d’un récepteur, c’est-à-dire une sorte d’antenne située à la surface des cellules, qui peut, dans certaines conditions, activer des mécanismes qui favorisent l’inflammation, la formation excessive de tissu cicatriciel, la mort de certaines cellules, ou encore des modifications des vaisseaux sanguins. Tous ces phénomènes sont connus pour être associés au vieillissement des reins. Dans des études précédentes, nous avons observé que des souris génétiquement modifiées pour ne pas produire ce récepteur RAGE semblaient mieux protégées contre certains effets du vieillissement rénal, en particulier au niveau des vaisseaux sanguins des reins. Cela suggère que RAGE pourrait jouer un rôle-clé dans ce processus, et que les lésions visibles dans les reins apparaissent après celles des vaisseaux. Bien que les preuves du rôle de ce récepteur RAGE dans les processus de vieillissement rénal s'accumulent, les mécanismes moléculaires doivent être clarifiés et l'impact des thérapeutiques ciblant ce récepteur reste à démontrer. Dans ce nouveau projet, nous allons poursuivre ces travaux en étudiant des souris de laboratoire mâles et femelles, d’une souche très courante dans la recherche médicale (appelée C57Bl/6J), dont certaines produisent naturellement la molécule RAGE, et d’autres ont été modifiées pour ne pas la produire. Nous suivrons ces animaux jusqu’à un âge avancé, équivalant à environ 50–65 ans chez l’être humain, afin d’observer les effets du vieillissement sur le rein. Les objectifs scientifiques de ce projet sont donc 1) de mieux comprendre le rôle du récepteur RAGE dans le vieillissement du rein, 2) de caractériser les mécanismes responsables de ces effets et 3) d’évaluer si des médicaments ciblant ce récepteur pourraient ralentir dommages rénaux liés au vieillissement.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moteurs du vieillissement rénal ne sont pas clairement élucidés et, compte tenu de l'augmentation prévue de la proportion de personnes âgées dans la population et des morbidités qui y sont associées, il est urgent d'améliorer cette compréhension. Dans ce but, ce travail contribuera à décrypter le rôle du récepteur RAGE dans le vieillissement rénal, à fournir une vision plus complète du rôle de ce récepteur dans la santé et à comprendre comment moduler avantageusement son activation pour un vieillissement plus réussi, notamment en utilisant des thérapeutiques antagonistes de RAGE. Ceci constituera, si les résultats sont au rendez-vous, une ouverture passionnante vers l'évaluation clinique d’inhibiteurs pharmacologiques de RAGE dans la prévention du vieillissement rénal.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de sang d’un volume maximal de 100µL (sur animaux anesthésiés) pour analyse, une évaluation non invasive de la fonction rénale pour une durée maximale de 2h à la suite de la pose d’un dispositif miniature sur une zone préalablement dépilée au niveau du dos et de l’injection intraveineuse d’un produit fluorescent à élimination exclusivement rénale (sur animaux anesthésiés), un recueil d’urine, une évaluation de l’activité et l’administration de molécules pharmacologiques.
Impact sur les animaux
Les souris sont soumises à des prélèvements et injections et peuvent développer des douleurs légères liées à ces piqures.
Devenir
L’ensemble des animaux prévus sera utilisé pour le projet et mis à mort à la fin du projet. Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet afin de collecter les organes et tissus sans avoir à réserver un lot de souris à cette fin. Cela permet de réduire le nombre d'animaux.
Remplacement
Nous utilisons des approches complémentaires à l’expérimentation animale qui permettent de mimer le vieillissement des cellules de la paroi des vaisseaux au niveau du rein avec principalement des modèles de vieillissement cellulaire à partir de cellules humaines issues de cordons ombilicaux ou issues de glomérules rénaux. Cependant ces approches in vitro ne suffisent pas à reproduire la complexité et les caractéristiques du vieillissement endothélial rénal, seuls l’étude des mammifères in vivo le permet. En effet, les mécanismes impliqués dans ce vieillissement endothélial rénal impliquent les différentes structures composant le rein mais également des interactions avec les organes du corps entier et le système immunitaire.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été effectués pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour ce projet. Le nombre d’animaux est cohérent avec la littérature. Ce nombre d'animaux permettra de générer des données scientifiquement solides permettant de les analyser statistiquement. Cela permet de réduire le nombre total d'animaux nécessaires. En outre, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus (reins, muscles squelettiques, cœur, foie, poumons, vaisseaux, tissus adipeux) de tous les animaux afin de garantir la collecte d'un maximum d'informations sur chaque animal. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont également été revus et approuvés par un biostatisticien expérimenté.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (5 à 6 souris par cage ; présence de tubes en cartons ou coton pour améliorer leur bien-être). Les souris seront manipulées de manière appropriée et les interactions avec elles seront fréquentes, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Les lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. Néanmoins, nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en suivant les paramètres cliniques suivants, définissant les points limites : - Perte de poids de 15% déterminée après pesée des animaux (et, le cas échéant variations de l’ingestion de nourriture et d’eau) - Apparence physique externe (pilo-érection, dos rond, signes d’infection, respiration anormale...) - Changement du comportement (hypoactivité, démarche anormale, prostration) - absence de réponse comportementale au stimulus externe Les animaux présentant un de ces critères seront euthanasiés. Ce monitoring sera réalisé en lien avec le responsable du bien-être animal. Les possibilités d’améliorer les procédures seront continuellement explorées (veille bibliographique) et mises en œuvre autant que possible. Le groupe de recherche maintiendra une interaction forte avec les animaliers et le bureau du bien-être animal, afin de permettre une surveillance optimale des animaux et rechercher un enrichissement de leur environnement.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les altérations subies par le rein au cours du vieillissement. Dans un contexte physiopathologique complexe, le modèle animal ne pourra être remplacé. L'organe entier et l'invalidation du récepteur d’intérêt (RAGE) ne peuvent pas être modélisés ou reproduits in vitro. L'invalidation du RAGE a été réalisée chez la souris et ce modèle a déjà fait l’objet de nombreux travaux publiés. Nous utiliserons ainsi des souris adultes âgées de 13 à 86 semaines (mâles et femelles) dont les stades de développement correspondent à ceux d’un humain jeune adulte (point d’étude à 3 mois), d’un humain âgé d’environ 50 ans (point d’étude à 10 mois), d’un humain âgé d’environ 60 ans (point d’étude à 15 mois) et d’un humain âgé d’environ 70 ans (point d’étude à 20 mois).
Exploration des mécanismes moléculaires et cellulaires du renforcement des connections entre neurones induit par la dopamine dans le cerveau de la souris anesthésiée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées sous anesthésie à la fin d'une seconde chirurgie qui peut durer six heures, 120 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'environ 90 minutes leur injecte un vecteur viral, avec une douleur post-opératoire modérée attendue pendant 24 à 48 heures. Pendant la seconde, dont elles ne se réveillent pas, l'équipe stimule leurs neurones à dopamine et enregistre l'activité de l'hippocampe, puis, après leur mise à mort, prélève des organes pour des analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucune autre méthode, "ni modélisation ni culture cellulaire", ne permet cette étude, parce que les données sur le sujet sont "trop rares et parcellaires". Une meilleure compréhension de la maladie de Parkinson, de l'addiction ou du TDAH reste renvoyée "à plus long terme".
Objectifs
Dans ce projet nous explorerons par quels mécanismes la dopamine permet la plasticité neuronale responsable de la mémorisation chez la souris. Pour cela, nous provoquerons la modification des connexions entre neurones de l’hippocampe en stimulant les neurones à dopamine. Après la mise à mort des souris, nous prélèverons des organes pour étudier les modifications moléculaires et cellulaires déclenchées par de cette plasticité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de la mémoire chez les mammifères en général et chez l’homme en particulier. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles cognitifs associés à des dysfonctionements de la transmission dopaminergique, comme par exemple dans la maladie de Parkinson, dans l’addiction ou les désordre neurodéveloppementaux comme le Trouble du Déficit de l'Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH).
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, une première permettant l’injection d’un vecteur viral durera environ 90 minutes et une seconde pour les enregistrements électrophysiologiques et la stimulation des neurones à dopamine durera de 1 à 6 heures.
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à deux anesthesies générales, une première d'une durée inferieure à 90 minutes et une seconde sans réveil (durée comprise entre 1h et 6h). La première chirurgie est susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48 heures. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger de quelques dizaines de secondes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer comment la dopamine déclenche la plasticité dans l’hippocampe. Ceci nécessite l’intégrité de l’ensemble du cerveau (l’hippocampe et le système à dopamine) et l’utilisation de souris transgéniques qui permettent de stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une résolution de l’ordre de la milliseconde. Il n’est pas possible, à l'heure actuelle, d’étudier cela par d’autres moyens que l’expérimentation animale in vivo (ni modélisation ni culture cellulaire) car les données biologiques sur ce sujet sont trop rares et parcellaires.
Réduction
Cette étude étant exploratoire, le nombre d’animaux par groupe (n= 12) a été déterminé sur la base de d’études antérieures utilisant les mêmes techniques de mesure des modifications neurobiologiques induites par des plasticités synaptiques s’approchant de celle étudiée ici. Les tissus prélevés seront réutilisés pour mesurer plusieurs types de modifications moléculaires et cellulaires.
Raffinement
Pendant les jours qui suivent la première chirurgie, une fiche de suivi est remplie quotidiennement pendant tout le temps nécessaire à la récupération totale de l'animal. Si une altération de l’état de l’animal est observée suite à la chirurgie une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant le début de la première chirurgie. Des analgésiques seront également administrés en post opératoire le lendemain. Pendant les semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux seront anesthésiés pendant toute la durée de la seconde chirurgie et tout au long des enregistrements électrophysiologiques, jusqu’à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utilisons la souris en raison de sa pertinence comme modèle en neurosciences et de la disponibilité d’outils adaptés pour manipuler précisement les circuits neuronaux. Les animaux seront des jeunes adultes afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.
Evaluation de l’efficacité d’un produit immunologique par épreuve virulente sur rongeurs.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Inoculées avec la bactérie Bordetella bronchiseptica, 1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 780 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 220 un niveau sévère. La moitié reçoit deux vaccinations à quatorze jours d'intervalle, l'autre moitié rien du tout, puis les deux groupes sont infectés. Le porteur indique que des mortalités soudaines surviennent entre le deuxième et le quatrième jour, et que des souris peuvent être trouvées mortes sans aucun signe avant-coureur permettant d'anticiper leur souffrance. Le projet contrôle des lots de vaccin contre la toux du chenil avant leur commercialisation, selon une méthode que le porteur décrit comme exigée par les autorités australiennes et pour laquelle il affirme qu'aucune alternative réglementaire n'existe.
Objectifs
La toux du chenil (TC) est une maladie respiratoire qui affecte les chiens. Elle peut être causée par plusieurs agents pathogènes, dont la bactérie Bordetella bronchiseptica. Ce projet cherche à vérifier si la partie du vaccin visant la bactérie Bordetella est efficace pour protéger les chiens contre cette maladie. Ce test est un requis réglementaire avant commercialisation.
Bénéfices attendus
Garantir la commercialisation de vaccins efficaces contre la toux des chenils.
Procédures
- 10 souris sont vaccinés à deux reprises à 14 jours d'intervalle (injection d'une durée de 3 secondes) - 10 souris témoins ne sont pas vaccinées. - 14 jours après la dernière vaccination, les 2 groupes (vaccinés et témoins) sont inoculés par la souche d’épreuve de Bordetella bronchiseptica (Durée de 15 secondes) A l'issue de la procédure tous les animaux sont euthanasiés
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux incluent un stress bref lié à la contention et une douleur transitoire lors des injections de vaccination. Suite à l'infection expérimentale par Bordetella bronchiseptica, des signes cliniques sont attendus, au sein du groupe témoin. La période la plus critique se situe entre le deuxième et le quatrième jour post-inoculation, où des mortalités soudaines peuvent être observées. Ainsi malgré les observations quotidiennes réalisées, des souris peuvent être retrouvées mortes lors de cette observation quotidienne , sans que l'on ait observé de signes avant-coureurs, qui auraient permis de le prévoir et ainsi anticiper toute souffrance. Pour pallier ce risque, la surveillance sera intensifiée à un rythme biquotidien durant cette phase critique auprès des tous les groupes de souris (groupe témoin et groupe vacciné). Conformément aux principes éthiques, toute souris atteignant les points limites prédéfinis sera immédiatement mise à mort afin de limiter sa souffrance.
Devenir
Tous les animaux étant exposés à l'agent pathogène, ils représentent un risque biologique et ne peuvent donc être conservés. Leur euthanasie est par conséquent requise à la fin de l'expérimentation.
Remplacement
Il s'agit de la méthodologie officielle exigée par les autorités australiennes, avec laquelle elles contrôlent le produit pour procéder à sa libération. Il n'y a pour le moment pas de références réglementaires pouvant être présentées comme des alternatives de substitution.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque essai est conforme à la Réglementation australienne. Afin de réduire le nombre d’animaux, chaque fois que c’est possible, il est utilisé des témoins communs à plusieurs lots de vaccins. Le personnel est formé permettant la reproductibilité et la robustesse de l’essai afin d’éviter au maximum des re-contrôles.
Raffinement
Les conditions réglementaires d’hébergement et d’environnement sont respectées. Les installations sont suivies en températures, hygrométrie. Toute anomalie sur les installations est directement remontée à un poste de garde (24/h/24h) permettant une intervention rapide y compris les weekend. Les animaux sont observés quotidiennement et de manière biquotidienne durant la phase critique (2ème au 4ème jour post-infection) et au-delà de 4 jours si l’état de santé d’un animal l’exige. Des points limites spécifiques ont été mis en place afin d’anticiper la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de petite taille, comparativement à une étude similaire menée chez le chien, elle offre des avantages logistiques et éthiques notables. Elle constitue un modèle puissant et polyvalent pour étudier B. bronchiseptica. Elle permet une infection respiratoire contrôlée, une analyse fine de la réponse immunitaire et la mise en place de stratégies thérapeutiques vaccinales, tout en respectant des critères éthiques et scientifiques. L'abondance des données préexistantes offre une base solide, évitant la duplication d'expériences et le recours inutile à des essais in vivo Les souris utilisées sont des souris adultes car le test nécessite que leur système immunitaire soit mature.
Etude de l’impact d’une modification génétique sur la réponse physiologique de la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
36 souris privées d'un fragment d'ADN vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent huit heures à 4 °C, suivent quatorze semaines de régime riche en graisses, subissent deux prélèvements de sang sur animal vigile et deux anesthésies de quinze minutes, avec un isolement en cage individuelle pouvant durer quatre jours. Les bénéfices avancés, de nouvelles cibles contre l'obésité, le diabète ou les troubles rénaux, tiennent au conditionnel et supposent que ce fragment d'ADN joue bien le rôle qu'on lui prête. Le porteur affirme que ces fonctions métaboliques ne sont modélisables que dans un organisme complet, et que seul un mammifère permet une première collecte de données.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle d’une partie de l’ADN qui ne code pas pour une protéine, et qui était autrefois considérée comme peu utile. Pourtant, des recherches récentes suggèrent qu’elle pourrait jouer un rôle important dans le fonctionnement du corps, notamment dans la gestion de l’énergie, la régulation de la température corporelle et le bon fonctionnement des reins. Pour étudier cela, nous utiliserons des souris chez lesquelles cette portion de l’ADN a été supprimée. Elles passeront une série de tests pour évaluer leur métabolisme, leur comportement, leur poids et d’autres aspects de leur santé. Elles seront ensuite soumises à un régime alimentaire enrichi pendant 14 semaines, avec un suivi régulier. À la fin de l’étude, plusieurs organes seront analysés afin de mieux comprendre les effets de cette absence. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à de nouvelles pistes de recherche sur les maladies métaboliques ou rénales.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous utilisons une approche complète pour étudier l’impact d’une portion particulière de l’ADN qui ne produit pas de protéine. En combinant des tests sur le comportement, l’activité du métabolisme, des analyses sanguines et l’étude de plusieurs organes à la fin de l’expérimentation, nous espérons obtenir une vision globale de son rôle dans le corps. Si cette partie de l’ADN est effectivement impliquée dans la régulation de la température, la production d’énergie ou le bon fonctionnement des reins, elle pourrait devenir une cible intéressante pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme l’obésité, le diabète ou les troubles rénaux. Les résultats de cette recherche pourraient aussi nous permettre d’améliorer la détection de certains problèmes de santé grâce à de nouveaux marqueurs biologiques, ou même de proposer des traitements plus ciblés à l’avenir.
Procédures
Les animaux seront exposés à un environnement à 4 °C pendant 8 heures. Ils suivront ensuite un régime riche en graisses pendant 14 semaines. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles par contention, chaque prélèvement durant environ une minute. Les animaux seront également soumis à deux anesthésies médicamenteuses d’une durée de 15 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances attendues, des contentions seront pratiquées, ce qui entraîne un stress léger. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une légère douleur. Les animaux seront isolés, ce qui entraîne un léger stress. Les animaux seront soumis au froid, pouvant entraîner une diminution transitoire de leur température corporelle.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence l’impact de l’inhibition d’un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation (thermorégulation, fonction hépatique, fonction rénale). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, dérèglements mitochondriaux et biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses informations qui pourront ensuite être utilisées dans une approche translationnelle visant à mieux comprendre la physiologie humaine..
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l'eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Si nécessaire, des soins locaux seront administrés. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Concernant les tests deux d’entre eux se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 4 jours maximim. A la fin de ces tests, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement), les animaux sont surveillés afin de vérifier qu'ils ne se battent pas. . Les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 8h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C, montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test et remis quelques minutes dans un environemment à 37°C.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle d'intérêt porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 10 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.
Influence de l’absence de Somatostatine et Polypeptide Pancréatique des îlots pancréatiques sur l’activité des cellules β chez la souris mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
800 souris vont être utilisées, chacune mise à jeun quinze à seize heures avant de subir neuf prélèvements de sang au cours d'une séance de deux à six heures, l'opération étant répétée une semaine plus tard. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur pancréas. Après anesthésie locale, la queue est incisée, puis vient une injection de glucose et, pour certains lots, un gavage avec une solution lipidique. Le porteur reconnaît que les contentions et le jeûne stressent les animaux, que les incisions font mal et que le gavage irrite l'œsophage. Les retombées annoncées, savoir s'il suffira un jour de greffer les seules cellules productrices d'insuline chez des personnes diabétiques, restent une perspective lointaine face à ces atteintes immédiates.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur le maintien du taux de sucre sanguin dans des valeurs « normales » à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).
Bénéfices attendus
Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules, les principales cellules des îlots sécrétent l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir supprimer certaines des autres hormones pancréatiques que l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types d’hormones. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.
Procédures
Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 1 semaine d’écart (durée du test de 2 à 6h) : animaux mis à jeûn la veille au soir (durée 15 à 16h), le jour J, une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie locale , s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 6 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 3 prélèvements (1 à 2minutes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 15min à 45min), prélèvements de sang effectués dans le respect de la réglementation. Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après injection de glucose).
Impact sur les animaux
Les contentions pourront être sources de stress, les mises à jeûns source de faim et de stress, les injections et les incisions sources de douleur et les administrations orales d'irritation de l’œsophage. Nous veillerons à réduire le stress au maximum, tous les gestes seront effectués par une personne formée et expérimentée et un anesthésique local sera appliqué avant les incisions. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mise à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant les tests. Des souris de ce type sont actuellement en élevage pour un autre projet, et d'après notre expérience avec ce type de protocoles, aucun effet délétère n’a été observé chez ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront mises à mort en utilisant une méthode réglementaire et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.
Remplacement
Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant la suppression sélective des cellules dont nous voulons étudier le rôle dans les îlots pancréatiques. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale dans le futur.
Réduction
Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Les expériences effectuées lors de précédents tests montrent sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courants largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs pancréas pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 800 animaux des 2 sexes maximum avec l’application des mesures précédentes seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisés assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).
Raffinement
Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine et les 3 jours suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Des points limites adaptés sont établit et seront appliqués si l'état des animaux le nécessite.
Choix des espèces
Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une suppression sélective de certaines hormones dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier dans ce projet. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte, de 14 à 22 semaines.
Etudes des effets toxiques de xénobiotiques chez le rongeur (rat, souris)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7600
Une partie des rats et des souris peut provenir d'autres procédures expérimentales, à condition d'y avoir subi une gravité réelle légère ou modérée, sans recevoir de substance en test, et après deux semaines de repos. 9 500 rongeurs, soit 7 600 rats et 1 900 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour mesurer la toxicité de molécules avant leur mise sur le marché et tout essai chez l'humain. Aux prises de sang systématiques, sur rongeurs éveillés, s'ajoutent selon le produit l'administration répétée de la molécule, un isolement jusqu'à 16 heures pour recueillir l'urine, des prélèvements d'autres fluides jusqu'à une fois par semaine et des biopsies de peau sous anesthésie. Le porteur écrit que ce type de nuisances est "difficilement estimable", les effets toxiques pouvant être neurologiques, immunologiques, inflammatoires ou métaboliques, et indique que ces études "nécessitent généralement" une analyse pathologique et donc la mise à mort des rongeurs. Il affirme que le projet s'inscrit dans une "démarche d'amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R".
Objectifs
Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de molécules avant leur utilisation, selon les recommandations internationales des instances médicales et pharmaceutiques, chez deux espèces de rongeurs : la souris et le rat. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires et nécessaire pour leur mise sur le marché et avant tout utilisation chez l’humain. Pour chaque molécule, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires qui permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures. Elles aident également à déterminer les effets du xénobiotique afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie, qui ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé, en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale. Elles permettent aussi de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique du xénobiotique avant que son utilisation soit autorisée. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, et de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique nécessaire à leur autorisation d’utilisation. Ces données sont des prérequis avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Par ailleurs, le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.
Procédures
Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à recueil d'urine ou bien de 16h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (autres que le sang) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies de peau par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée de la molécule testée peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus,, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de prélèvement d’urine. - Liées à une toxicité de la molécule testée : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable : selon le mécanisme d’action (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore la biodistribution, divers effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).
Devenir
Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires (ou de pharmacocinétique) après une période de repos (wash-out, dépendant de la demi-vie du xénobiotique testé), dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. La réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test et après une période de repos d'au moins 2 semaines. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animale.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum pour les rongeurs est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux peuvent bénéficier d’un programme d’habituation adapté aux procédures qu’ils vont subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animale. est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations.. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi structure en charge du bien-être animale.. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles comme des gilets de télémétrie permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implants par chirurgie. Les volumes prélevés/administrés respectent lesrecommandations vétérinaires.
Choix des espèces
D’un point de vue réglementaire, ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques. Les lignes directrices instances médicales et pharmaceutiques internationales requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Des demandes d’autorisations de projet pour des espèces non rongeurs ont déjà été déposées par l’établissement. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains après sevrage. Les rongeurs sont inclus en étude en général à partir de 6 semaines.
Rôles des microglies dans le développement de la barrière hémato-encéphalique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 668 souris vont être utilisées, toutes tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. 548 subissent des procédures menées sous anesthésie sans jamais être réveillées, 958 un niveau de souffrance léger et 1 162 un niveau modéré. Les femelles gestantes reçoivent des injections dans l'abdomen et des antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la gestation, puis les mères, les embryons et les souriceaux sont tués. Le projet vise à décrire comment les microglies participent à la fermeture de la barrière hémato-encéphalique pendant le développement, les liens annoncés avec l'autisme et la schizophrénie restant lointains et conditionnels. Le porteur affirme que les cultures cellulaires et les organoïdes ne reproduisent pas les signaux venus du reste du corps, et conclut à la nécessité d'un "organisme entier".
Objectifs
Les objectifs du projet sont centrés sur l'étude du rôle des principales cellules immunitaires du cerveau, les microglies dans le développement et le fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui régule les échanges entre le cerveau et le reste du corps. La BHE joue un rôle clé dans le contrôle des substances et des cellules qui entrent et sortent du cerveau, et des défauts dans son fonctionnement sont impliqués dans diverses pathologies cérébrales, allant des troubles neurodéveloppementaux aux maladies neurodégénératives. Cependant, les mécanismes précis de ces dysfonctionnements et leur implication dans ces maladies demeurent largement incompris. Il est donc primordial de mieux comprendre comment la BHE se développe et interagit avec les cellules cérébrales, tant en conditions physiologiques que pathologiques. Nous voulons explorer : (1) comment les microglies interagissent avec la BHE pendant le développement, (2) leur impact sur la maturation des vaisseaux sanguins et la fermeture de la BHE ; et (3) l’influence de l’environnement maternel sur ces processus. Grâce à des études sur des modèles murins, nous espérons mieux comprendre le rôle des microglies dans la formation de la BHE et leur implication dans certaines maladies cérébrales.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment se forment et fonctionnent certaines structures du cerveau, notamment la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui protège le cerveau et contrôle les échanges avec le reste du corps. Les microglies, des cellules qui jouent un rôle clé dans le cerveau, interagissent avec cette barrière dès le développement embryonnaire, mais ces interactions sont encore mal comprises. Des anomalies dans la formation de ces structures sont liées à des pathologies cérébrales, notamment dans les maladies du développement. Ce projet pourrait offrir des bénéfices importants pour notre compréhension de certaines maladies neurologiques, qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Des troubles comme l’autisme et la schizophrénie touchent une grande partie de la population et ont des conséquences profondes sur le quotidien des personnes affectées. En comprenant mieux ces mécanismes, ce projet pourrait contribuer à éclairer des processus fondamentaux du développement du cerveau et offrir des pistes pour mieux comprendre certains troubles, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour la prévention et le traitement.
Procédures
Injection intrapéritonéale de molécules. La durée de l’injection est estimée à 2 minutes. Administration d’antibiotiques dans l’eau du biberon au moins une semaine avant la mise en accouplement et pendant toute la durée de la gestation.
Impact sur les animaux
Lorsqu'un animal doit recevoir une injection dans l'abdomen, il est parfois nécessaire de le maintenir immobile pendant un court instant. Cette manipulation peut provoquer un stress temporaire chez l'animal, qui pourrait perturber son comportement habituel et entraîner des signes d'anxiété. De plus, l'ajout de certains traitements dans l'eau de son biberon peut parfois réduire la quantité d'eau qu'il boit, ce qui pourrait éventuellement affecter son poids. Ces aspects sont attentivement surveillés pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures.
Devenir
Toutes les mères traitées ainsi que les embryons, souriceaux et adultes seront euthanasiés en fin de procédures afin de réaliser un prélèvement d’organes.
Remplacement
L’étude du rôle des microglies, des cellules de défense du cerveau, dans la formation et le fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) pendant le développement prénatal nécessite l’utilisation d’un organisme entier, comme la souris. En effet, cette barrière est influencée par de nombreux signaux provenant du reste du corps, comme des hormones, des facteurs immunitaires et la circulation sanguine, qui modulent de manière dynamique ses fonctions. Ces signaux aident à guider le comportement des microglies, leur migration et leur intégration dans le cerveau ainsi qu’à la création d’une barrière efficace et sélective, capable de protéger le cerveau des substances indésirables. Les interactions entre les microglies et la BHE dépendent de nombreux facteurs du corps entier, qui sont difficiles à reproduire dans des expériences en laboratoire. Les systèmes en culture cellulaire (in vitro) ou les modèles réduits (organoïdes) ne peuvent pas reproduire les interactions complexes et les signaux venant de l’ensemble de l’organisme, ce qui ne permet pas d’étudier en profondeur des processus encore mal compris. Dans le cadre de ce projet, nous poursuivons nos recherches précédentes sur la façon dont les différentes cellules du cerveau se développent et interagissent pour former des circuits neuronaux et gliaux complexes. Pour observer ces processus dans leur contexte naturel et complet, un modèle vivant, comme la souris, est essentiel. Ce modèle nous permettra d’étudier comment les microglies et la BHE interagissent et réagissent aux signaux provenant du reste du corps pendant le développement. Toutefois, dès que cela sera possible et avant d'étudier ces mécanismes dans l'organisme vivant, nous testerons certains gènes candidats sur des cellules en culture pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux phénotypes que nous observerons, avant de les analyser plus en détail in vivo.
Réduction
Notre projet est conçu pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, tout en garantissant des résultats fiables et précis. Nous avons pris en compte la nécessité d'obtenir plusieurs échantillons pour vérifier que les résultats sont cohérents et reproductibles, tout en limitant les influences des différences biologiques (comme le sexe ou les caractéristiques génétiques) et environnementales (par exemple, les effets de l'interaction avec la mère). Pour garantir la stabilité génétique des souris et lorsque cela est possible, nous réalisons ces croisements de manière à obtenir à la fois des animaux témoins et des mutants issus de la même portée. Cette méthode permet de comparer des animaux génétiquement similaires, réduisant ainsi les variations liées à la génétique, et évite les risques de dérive génétique que pourrait engendrer des croisements consanguins. En optimisant cette approche, nous réduisons la variabilité des résultats, ce qui permet de diminuer le nombre d'animaux nécessaires. Nous avons également optimisé la taille des groupes expérimentaux pour garantir des résultats statistiquement fiables avec un nombre réduit d'animaux. Grâce à notre expérience passée, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) suffisent pour obtenir des résultats significatifs tout en respectant les critères de rigueur scientifique. Cela permet de minimiser l'impact sur les animaux tout en maintenant la robustesse des conclusions. De plus, dans nos différentes expériences, si les premiers tests (comme l’observation des tissus au microscope ou l’analyse de la barrière qui protège le cerveau) ne donnent pas de résultats clairs, nous ne réaliserons pas les autres expériences prévues (comme les analyses biochimiques, génétiques ou sur des cellules en laboratoire). Cette approche permet d’utiliser moins d’animaux tout en conservant la rigueur de nos recherches. Enfin, après le sevrage des souriceaux, les mères qui n'ont pas été traitées pourront être réutilisées pour de nouveaux accouplements, ce qui contribue également à réduire le nombre total d'animaux nécessaires, tout en respectant les normes éthiques et scientifiques de notre projet.
Raffinement
Les conditions dans lesquelles les souris sont élevées, hébergées et soignées sont soigneusement optimisées pour minimiser au maximum toute douleur, souffrance, stress ou dommage à long terme. Notre priorité est de réduire l'inconfort des animaux. Par exemple, des éléments comme des dômes en carton, du coton et des baguettes en bois seront ajoutés pour permettre aux femelles de construire un nid plus confortable, réduire leur stress et favoriser l'usure naturelle de leurs dents. De plus, en dehors des périodes d'accouplement, les souris seront maintenues en groupes pour favoriser leur bien-être social. Pendant les périodes d’accouplement, les souris sont dès que possible groupées par lot de deux pour ne pas qu’elles soient isolées. Les animaux traités, ou dont la mère a été traitée, seront quotidiennement surveillés jusqu'à leur euthanasie. Si une souris ou un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress, tels que des souriceaux hors du nid, des difficultés à se nourrir (absence de lait dans l'estomac), une posture anormale, des problèmes de croissance, de la léthargie, l'absence de nid ou un pelage négligé, l’expérimentateur pourra consulter l'équipe de l'animalerie ou un vétérinaire pour évaluer la situation et, si possible, administrer un traitement approprié. En cas de souffrance grave ne pouvant pas être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié, sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas disponible. Cette approche garantit que le bien-être des animaux est toujours une priorité.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris.
Développement de nouveaux traitements pour prévenir un cancer du sang (leucémie myéloïde aiguë)
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées sans anesthésie de cellules leucémiques dans la veine de la queue, des souris développent une leucémie myéloïde aiguë, avec perte de poids et paralysie des pattes arrière en quatre semaines sans traitement, jusqu'à douze avec traitement. 172 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Chaque semaine pendant 4 ou 12 semaines, elles subissent une prise de sang à la joue, et les souris traitées reçoivent pendant 6 ou 12 semaines, jusqu'à deux fois par jour, un médicament déjà existant, parfois deux, par la veine de la queue, par gavage à la sonde métallique ou dans le ventre, toujours sans anesthésie. Le porteur écrit que ces essais pourraient "éventuellement" l'aider à comprendre l'effet de ces traitements chez les patients. Les souris sont mises à mort "dès l'apparition des signes de la paralysie des membres inférieurs" ou en cas de chute des plaquettes.
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de divers médicaments déjà existants, administrés seuls ou en combinaison, sur des souris atteintes de leucémie myéloïde aiguë, un type de cancer du sang, afin d’explorer de nouvelles associations thérapeutiques. L'objectif est de voir comment ces traitements peuvent aider à combattre la maladie chez ces modèles de souris, ce qui pourrait éventuellement nous aider à mieux comprendre leur impact sur les patients humains.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles souris pour étudier et tenter de guérir la leucémie myéloïde aiguë (LMA), un type de cancer du sang, afin de tester des traitements, offre plusieurs avantages. Elle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie, d'évaluer l'efficacité des traitements, d'optimiser les doses et les schémas thérapeutiques, d'étudier les résistances aux traitements et de réduire les risques pour les patients. Ces modèles de souris constituent une étape cruciale pour sélectionner et affiner les stratégies thérapeutiques avant leur mise en application clinique, ce qui contribue à accélérer le développement de traitements plus efficaces contre la leucémie myéloïde aiguë.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules malades dans la veine de la queue (sans anesthésie; durée: 1 min), suivie de prélèvements sanguins hebdomadaires pendant 4 semaines pour certaines et 12 semaines pour d’autres (prélèvement dans la veine de la joue; durée: 1 min sans anesthésie). Elles seront ensuite traitées avec cinq médicaments différents, administrés une ou deux fois par jour (tous les deux jours pendant 6 ou 12 semaines selon le médicament), selon le protocole (chaque groupe de souris recevra un médicament parmi ces cinq et parfois une combinaison de deux médicaments). Les traitements seront délivrés dans la veine de la queue (sans anesthésie, durée: 1 min), par gavage (à l'aide du sonde métallique de taille adaptée à la souris, sans anesthésie; durée: 1 min) ou par injection dans le ventre (sans anesthésie; durée: 30 secondes). À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées, et leurs organes seront prélevés pour des analyses approfondies.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des souris sont greffées avec des cellules leucémiques, ce qui leur fera développer des symptômes comme la perte de poids et la paralysie des pattes arrières quelques semaines ( 4 semaines pour les souris non traitées et jusqu’à 12 semaines si avec traitements) après la greffe. Les traitements ne causent pas de problèmes importants, mais les méthodes d'administration, comme les injections ou le gavage, peuvent provoquer de légers effets secondaires, comme des blessures légères au site d'injection ou des saignements. Les souris peuvent aussi ressentir un inconfort temporaire lors des injections ou des prélèvements sanguins.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées dès l’apparition des signes de la paralysie des membres inférieurs ou si elles présentent une quantité faible de plaquettes pour éviter leur souffrance. L’euthanasie des animaux en fin d’expérience est nécessaire afin de récupérer leurs organes en post-mortem pour effectuer des analyses.
Remplacement
Pour réaliser notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire, car c’est uniquement dans un organisme vivant que l’on peut observer les interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et les autres éléments du corps. Ces interactions sont cruciales pour tester de façon précise l’efficacité des traitements, en tenant compte de leur distribution dans l’organisme, de leurs effets secondaires et de l’évolution de la maladie au fil du temps.
Réduction
Pour déterminer combien de souris sont nécessaires dans chaque groupe de l’étude, nous avons utilisé un test statistique, qui est une méthode mathématique permettant de vérifier si les différences observées entre les traitements sont significatives. Dans cette étude, certains groupes de souris ne recevront pas de traitement, ce sont les groupes témoins. Ces groupes sont composés des mêmes souris (même fond génétique) que celles des groupes expérimentaux, ce qui permet de les comparer plus facilement. En testant plusieurs traitements en même temps, on peut utiliser un seul groupe témoin pour plusieurs expériences, ce qui permet de réduire le nombre de souris. Les expériences seront menées de manière très similaire pour réduire les différences entre les groupes et ainsi obtenir des résultats fiables.
Raffinement
En plus de la surveillance quotidienne, qui permettra de détecter rapidement toute anomalie liée au geste technique de la greffe, un suivi clinique hebdomadaire sera réalisé. Pour cela, l'analyse sanguine permettra aussi de vérifier le taux de plaquettes, une baisse progressive étant associée avec l'apparition la maladie. En dessous d'une certaine valeur, de la nourriture sera ajoutée dans la cage et lorsque cette faible valeur est associée à d'autres signes cliniques (affaiblissement avec paralysie des pattes arrières), la souris sera immédiatement euthanasiée. L'évaluation clinique prendra également en compte le comportement des souris et leur poids. L'ensemble des paramètres permettra de mettre en place rapidement des actions adaptées. Un enrichissement des cages sera également fait (buchette en bois à ronger, papier pour faire un nid/cachette).
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Implication du système immunitaire dans la résistance du cancer bronchique à une nouvelle combinaison d’agents thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
960 souris vont être utilisées, toutes injectées de cellules cancéreuses puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs poussent sur leurs flancs, avec un œdème possible au point d'injection qui peut gagner les pattes arrière et gêner la marche, et des métastases dont le porteur reconnaît ne pas savoir évaluer les effets sur les organes touchés. Elles reçoivent un traitement par la bouche cinq jours sur sept et une prise de sang à la queue chaque semaine sous anesthésie, pour tester une association de deux médicaments déjà approuvés contre les rechutes du cancer du poumon. L'effectif, lui, est calé sur "le nombre d'animaux communément accepté pour une publication".
Objectifs
Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent, chez environ 15% des patients, des altérations dites primaires de l'EGFR, un Récepteur du facteur de croissance EGF. Malheureusement, après traitement par thérapie ciblée, une récidive de la tumeur est observée avec apparition, dans plus de 50% des cas, d'une mutation secondaire de l'EGFR pour laquelle un inhibiteur de dernière génération a été développé, l'osimertinib. Finalement, de nouveaux mécanismes de résistance ont été constatés chez des patients traités plusieurs mois avec l'osimertinib, tels qu'une amplification d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, des mutations touchant des acteurs des voies de signalisation contrôlant la survie et la prolifération cellulaire, ainsi que l'apparition d'une mutation tertiaire de l'EGFR pour laquelle il n'y a pas encore de traitement spécifique utilisé en clinique. Par des méthodes de génie génétique, nous avons généré plusieurs modèles cellulaires de résistance du cancer bronchique humain en introduisant, dans une petite sous-population de cellules de CBNPC humaine, différentes mutations de l'EGFR décrites chez les patients. Sur ces modèles cellulaires, nous avons réalisé un criblage de molécules potentiellement capables d'inhiber l'émergence de clones résistants. Finalement, un inhibiteur déjà approuvés en clinique, le sorafenib, utilisé en combinaison avec l'osimertinib, s’est montré efficace in vitro pour limiter la croissance cellulaire des lignées arborant plusieurs mécanismes de résistance décrits chez les patients récidivant. Ces résultats ont aussi été obtenus in vivo sur l’inhibition de la pousse tumorale de ces lignées dans des souris immunodéprimées. Au vu de l'importance du contexte physiologique, de la toxicité des inhibiteurs utilisés en thérapie et du microenvironnement tumoral, nous avons créé un modèle syngénique murin de cancer du poumon qui n’existait pas. Nous avons généré 6 lignées cellulaires qui récapitulent les principaux mécanismes de résistances observés dans les CBNPC. Les études in vitro menées sur ces nouvelles lignées cellulaires ont révélé des caractéristiques de croissance et de résistance à la thérapie ciblée similaires à celles observées précédemment sur les lignées humaines. Ces nouveaux modèles murins vont nous permettre désormais d'étudier l'implication du système immunitaire dans la tumorigenèse et dans la réponse au traitement, avant d'envisager tout essai clinique.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations permettront tout d’abord de déterminer la capacité de ces nouvelles lignées cellulaires à former des tumeurs chez l’animal ; il sera possible alors de comparer les résultats de croissance tumorales de ces lignées cellulaires murines à ceux déjà obtenus avec les lignées cellulaires humaines dans des souris immunodéficientes, et confirmer ainsi l'intérêt de ce nouveau modèle d’étude syngénique de cancer du poumon chez la souris. Dans la littérature, l’implication d’EGFR muté dans l’installation d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur reste controversé ; notre étude va nous permettre de mesurer et caractériser l’éventuelle infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs en fonction des mécanismes de résistance mais aussi des traitements. La possibilité de mesurer la bioluminescence des cellules cancéreuses à l'aide d'un imageur du petit animal va nous premettre de détecter et suivre le développement de foyers tumoraux secondaires qu'il aurait été difficile de mettre en évidence par des méthodes d'analyses macroscopiques traditionnelles. Ces métastases pourront être mieux caractérisées (culture cellulaire, analyses génétique et moléculaire) et identifier d'éventuels nouveaux mécanismes de résistance. L'intérêt de notre étude est de mieux comprendre les mécanismes responsables de la rechute tumorale de la tumeur primaire et des métastases en fonction du contexte immunitaire et des traitements.
Procédures
Les animaux seront injectés avec une aiguille adaptée de petite taille et de petit diamètre et sous anesthésie et analgésie. Des prélèvements sanguins au bout de la queue seront réalisés sur animaux anesthésiés chaque semaine. Les animaux recevront 5 jours par semaine un traitement par voie orale. Cet acte est rapide et non douloureux pour l'animal.
Impact sur les animaux
Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux injectés en sous-cutané. Il pourrait être observé cependant dans de rares cas des démangeaisons ou un œdème au point d’injection qui s’il s’étend aux pattes arrière pourrait perturber la locomotion quelques jours, le temps qu’il se résorbe. La croissance des tumeurs sur les flancs de la souris, ne perturbe pas la vie de la souris, il n'y a normalement pas de modification du comportement individuel ou social. Une nuisance possible serait que la tumeur, dans sa croissance, puisse gêner les déplacements de l’animal ou altérer sa souplesse entrainant un défaut d'alimentation ou de sa toilette. Concernant les animaux développant des métastases, il est difficile d'évaluer leurs effets sur la fonction des organes touchés, mais un suivi très régulier permettra de détecter le moindre signe clinique défavorable et de procéder à l'arrêt immédiat de l'expérimentation.
Devenir
La totalité des animaux de l'étude sera injectée avec des cellules cancéreuses puis mise à mort pour études.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable pour confirmer in vivo l’efficacité de la combinaison d’inhibiteurs identifiée in vitro sur les lignées humaines. Dans le protocole présenté ici, la souris est utilisée comme modèle préclinique obligatoire pour évaluer l'implication du système immunitaire dans la croissance tumorale. Ceci n’est pas possible autrement que chez l’animal vivant, et nécessaire avant toute évaluation chez l’Homme.
Réduction
Les transplantations de nos modèles cellulaires seront réalisées sur l'animal uniquement après obtention de résultats in vitro significatifs permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux par groupe en fonction de l'importance de l'effet obtenu. L'objectif est de collecter un nombre suffisant de données pour respecter le nombre d'animaux communément accepté pour une publication, et appliquer des tests statistiques fiables et adaptés. Les traitements ne concerneront que les lignées cellulaires pour lesquelles une croissance tumorale significative aura été observée. A noter que s'il n'y a pas de différence statistique entre mâles et femelles, la taille des effectifs pourra être réduit à 6 au lieu de 10 animaux (3 mâles et 3 femelles).
Raffinement
Afin d'éviter toute souffrance ou stress, les animaux seront hébergés dans une zone exempte de germe pathogène, à 5 maximum par cage (530 cm2 au sol) dans un environnement enrichi (tube en polycarbonate rouge et Arbrocel Roll), et anesthésiés avant chaque intervention. Nous serons vigilants pour évaluer chaque jour l'apparition d'éventuels signes de souffrance (perte de poids, poils hérissés, prostration) et dans le cas de critères présents, une prise en charge analgésique appropriée sera mise en place ; et dans le cas d'une non amélioration des symptomes, l'animal serait mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'étude de la croissance tumorale car il permet de mimer les conditions de formation des tumeurs de manière assez proche de celles rencontrées chez l'Homme. La greffe récapitule les évènements se déroulant lors d'une tumorigenèse : croissance 3D, interaction avec le stroma et le système immunitaire, angiogenèse et métastase. Enfin la souris est le modèle d'étude le plus utilisé dans la communauté scientifique, cela permet des échanges à un niveau international. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrites dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines.
Nouvelle approche des risques d’expositions aux cendres volcaniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
La pointe de la queue est coupée, puis sept gouttes de sang sont prélevées au même endroit, une toutes les quinze minutes pendant deux heures, sur des souris à jeun ayant reçu du glucose ou de l'insuline dans le ventre. 240 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Elles descendent de parents exposés à des cendres volcaniques par la bouche et par le nez, l'objet étant de mesurer ce que cette exposition transmet à la génération suivante, en particulier sur le foie et la fertilité des mâles. Les atteintes annoncées se limitent au stress de la manipulation et à l'hypoglycémie des tests, sans un mot sur celles que le porteur attribue lui-même aux cendres dans ses travaux antérieurs.
Objectifs
Ce projet vise à quantifier les effets sanitaires induits par une exposition chronique par voies multiples (orales et nasales) aux cendres volcaniques et de mieux comprendre l’héritage intergénérationnel de ces altérations en vue de préserver les populations les plus exposées. Dans une étude récente menée sur des souris mâles adultes, nous avons démontré qu’une exposition prolongée (2 mois) à des cendres volcaniques riches en métaux entrainent une altération métallomique (accumulation de métaux et variations isotopiques). Ces altérations, fortement marquées dans les testicules, sont associées à des altérations testiculaires qui conduisent à une hypofertilité. Après deux mois d’exposition, des signes d’altérations hépatiques et une augmentation du stress oxydant sont également visible pouvant aussi contribuer aux troubles de la fertilité masculine. A noter que la hausse de stress oxydant est fonction des variations isotopiques, apparaissant comme des biomarqueurs émergents. A l’inverse, nous n’avons pas connaissance des effets intergénérationnels. Est-ce que les générations exposées de par leurs géniteurs possèdent à leur tour des dérèglements métallomiques pouvant conduire à l’émergence de syndrômes métaboliques et/ou troubles de la fertilité ? En s’appuyant sur une recherche transdisciplinaire, l’objectif de ce projet est d'étudier les dysfonctionnements physiologiques majeurs transmis entre deux générations suite à une exposition chronique aux cendres volcaniques, avec un focus sur les dérèglements hépato-testiculaires. Ce projet est divisé en trois axes: 1.Caractériser les propriétés physicochimiques des cendres (étude comparative) afin d’évaluer leur degré de toxicité, 2. Identifier les dérèglements biologiques (e.g., troubles de la fertilité masculine, altérations métaboliques) transmises d’une génération à l’autre.
Bénéfices attendus
L’ensemble des données obtenues dans ce projet permettra de quantifier les effets intergénérationnels et d’identifier les fonctions biologiques et les mécanismes d'actions dérégulées par une exposition chronique aux cendres volcaniques, avec un focus sur les troubles de la fertilité et l’émergence potentielle de syndromes métaboliques. Au-delà de l’aspect intergénérationnel, ce projet permettra de quantifier les altérations induites au-delà du système respiratoire et pulmonaire communément analysé. Avec près d’un milliard de personne quotidiennement exposées aux cendres volcaniques, et considérant la souris comme un modèle animal analogue de l'homme du fait de la forte homologie génétique avec celui-ci (99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain), ce projet aura des retombées en santé animale et humaine. Les analyses isotopiques, émergentes dans ce domaine, permettront quand à elles de valider le développement de nouveaux biomarqueurs de troubles hépato-testiculaire dans le but de prévenir l'émergence de maladies associé à ce risque volcanique encore mal connu. Les résultats obtenus au regard des dérèglements physiopathologiques testiculaires et des troubles métaboliques seront accessibles à court terme i.e., avec des premiers résultats attendus dès 15 semaines post-sevrage. A l’inverse, le développement de biomarqueurs isotopique nécessitera une phase de validation sur l’humain, avec de fait une projection à plus long-terme (2 ans), bien que les résultats préliminaires obtenus à l’échelle du modèle murin seront accessibles à court terme (6mois après collection des organes et fluides biologiques).
Procédures
Aucune procédure chirurgicale ne sera conduite sur les animaux. Les animaux seront uniquement soumis à des tests métaboliques (i.e., tests de tolérance au glucose (GTT) et à l’insuline (ITT)) à 13 et 14 semaines, ce qui se traduit par des prélèvements sanguins sur animaux vigiles réalisés à intervalles réguliers toutes les 15min (t = 0, 15, 30, 45, 60, 90 120 minutes, avec t0 correspondant à un prélèvement avant injection de glucose et insuline) au niveau de l’extrémité de la queue (amputation unique de la pointe de la queue limitée à environ 0,5 à 1,0 mm de longueur). Au total, cela fait donc 7 prélèvements sanguin par animal à intervalle régulier de 15 min. Les tests ITT et GTT seront réalisés une seule fois à une semaine d’intervalle soit à 13 et 14 semaines. Pour chaque prélèvement sanguin, une seule goutte de sang sera collectée soit un volume total prélevé
Impact sur les animaux
Au regard des tests métaboliques (ITT/GTT), les nuisances sont liées à la préhension des animaux, une mise à jeun, une injection intrapéritonéale et à une cinétique de prélèvement sanguin toutes les 15min au niveau de l’extrémité de la queue (amputation unique de la pointe de la queue). Dans ces procédures, les animaux sont donc susceptibles d’éprouver une angoisse légère et du stress du fait de leur préhension (principaux effets indésirables) mais de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux, qui relèvent donc de la classe «légère». De la même manière, l'amputation unique de la pointe de la queue et le prélèvement sanguin au niveau de la queue sont des techniques qui se justifient chez la souris au regard du volume de sang prélevé (volume total prélevé
Devenir
A l'issu de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux pour lesquels des analyses chimiques, isotopiques et biochimiques sont envisagées (soit l’ensemble des animaux), seront mis à mort. Les souris ayant fait l'objet d'une exclusion de la procédure scientifique suite à l'atteinte d'un point limite seront mises à mort. Cela nous permettra de collecter et d'analyser les organes de souris soumises à un stress physiologique anormal voir excessif (en cas d'atteinte de point limite) et de comparer les résultats obtenus avec des souris saines et/ou exposées aux particules volcaniques sans atteintes de points limites.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour quantifier les effets néfastes induits à l'ensemble de l'organisme par une exposition chronique aux particules volcaniques et seule une approche in-vivo sur modèle souris s'avère adéquate dans ce projet. Ni les modèles de cultures cellulaires, ni les organoïdes ne permettent de reproduire une exposition chronique aux particules volcaniques par voies multiples (orales et nasales) et de quantifier les effets intergénérationnels affectant le système hépato-testiculaire. Seul le modèle vivant intégré permet une compréhension et une quantification intégrale du problème.
Réduction
Ce projet repose sur des animaux (génération F1) issus de croisement entre des souris mâles et femelles, avec un nombre de couples géniteurs total de 48 dont le nombre a été défini, sur la base de données préliminaires, comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence significative sur les paramètres étudiés . Avec une moyenne de 6 à 10 souriceaux par portée, ce projet comptera entre 288 et 480 souris (mâles et femelles confondues), dont environ la moitié appartiendra au groupe « contrôle » et l’autre moitié au groupe « exposé ». A noter que le phénotype sexuel et le biais du sexe en recherche animale pouvant significativement impacter les résultats biologiques, l’ensemble des descendants (génération F1), incluant mâles et femelles sera considéré dans ce projet. Toutes les données obtenues dans ce projet feront l'objet d'analyses statistiques de types paramétriques ou non-paramétriques selon le nombre de données considérées et selon le fait que les données suivent ou non une distribtuion gaussienne normale (test paramétrique: ANOVA, test non-paramétrique: Mann-Whitney U test; implémentés sous MATLAB).
Raffinement
Le stress, tout comme la souffrance, peuvent affecter les résultats biologiques, l'homéostasie et le métabolisme des métaux et ainsi biaiser nos résultats dans leur ensemble. Il est ainsi primordial d'éviter toutes sortes de souffrance des animaux. Pour cela, nous adopterons un raffinement adapté reposant sur un hébergement et une surveillance quotidienne des animaux ainsi que sur l'élaboration de protocoles optimisant le bien-être animal. Cela passera dans un premier temps sur un enrichissement adapté des cages. Dès la naissance, nous prendrons également soin de maintenir plusieurs animaux par cage pour conserver l'interaction sociale. Nous prendrons soin également dans la mesure du possible de ne pas mélanger les animaux des différentes portées et de conserver le matériel d'enrichissement et de nidification présent dans les différentes cages d’accouplement, afin de préserver la continuité olfactive. Pour chaque cage, la litière sera changée régulièrement (toutes les deux semaines). Nous ferons également attention à ne pas exposer les animaux à un environnement stressant (bruits) qui peut augmenter le comportement agressif.
Choix des espèces
Les fonctions biologiques tout comme le métabolisme des métaux chez l'homme sont conservés chez la souris qui de fait, font de cette espèce un modèle animal entièrement adapté pour conduire notre étude. Par ailleurs, la souris reste un modèle simple d'utilisation avec des besoins d'hébergement et d'entretien faciles à subvenir. Le modèle murin est par ailleurs un modèle déjà utilisé dans ce cadre d'étude ce qui nous permettra de comparer les résulats obtenus dans ce projet avec les résultats bibliographiques antérieurs.