Souris

Quatorze jours consécutifs d'injections sous-cutanées d'hormones, six prélèvements de sang, une transplantation de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses de trois semaines : 5 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélever leurs glandes mammaires et leurs tumeurs. Le projet relève de la recherche fondamentale, comprendre comment le gène p16 limite la plasticité des cellules mammaires hors de son rôle dans le cycle cellulaire. Le porteur estime à un à deux mois l'inconfort lié au développement des tumeurs mammaires, et à 24 ou 48 heures la douleur modérée qui suit la pose d'un implant ou la greffe. Il justifie le recours à la souris par les cinq paires de glandes collectables sur un même individu, et étudie des femelles vierges, gestantes, allaitantes, ou âgées de 18 mois selon le stade visé.

Objectifs

La glande mammaire est un organe doté d’une plasticité exceptionnelle et d’un développement postnatal dynamique. Elle contient des types cellulaires spécifiques, essentiels pour les remaniements morphologiques postnataux. Cependant, les mécanismes permettant à ces cellules de maintenir leur plasticité restent encore mal compris. Le cancer du sein de type basal, un sous-type particulièrement agressif, se caractérise par la perte d'expression des récepteurs hormonaux et du récepteur du facteur de croissance épidermique humain. Certaines cellules ont été identifiées comme les cellules d’origine de ce cancer, suggérant qu’elles acquièrent une plasticité anormale lors de la tumorigenèse. Ainsi, l’un des objectifs centraux de ce projet est d’élucider comment ces cellules limitent leur plasticité en situation d’homéostasie. Nos résultats préliminaires indiquent qu’un gène pourrait réguler la plasticité de cellules mammaires qui nous intéressent même en dehors de son rôle classique dans le contrôle du cycle cellulaire. Ce projet s’articule autour de deux questions majeures : 1. Comment notre gène d’intérêt régule-t-il la plasticité dans un contexte normal ? 2. Quelles sont les conséquences d’une dérégulation de cette plasticité sur les processus physiologiques (comme la lactation et/ou l’involution) et pathologiques (comme la tumorigenèse) de la glande mammaire ? En répondant à ces questions, nous espérons approfondir notre compréhension des mécanismes qui gouvernent la plasticité cellulaire mammaire et leurs implications dans la tumorigenèse.

Bénéfices attendus

La souris est fréquemment utilisée pour étudier le développement de la glande mammaire après la naissance, car il s’agit d’un mammifère dont l’organisation de la glande mammaire présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. De plus, il existe des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettent d’étudier précisément le rôle de certains gènes, dans différentes étapes de la vie de la glande mammaire comme la gestation, la lactation et l’involution (retour de la glande à son état normal après l’allaitement). Ces modèles permettent également d’étudier les mécanismes impliqués dans la régénération des tissus et dans le développement des cancers du sein. La souris possède également plusieurs glandes mammaires, ce qui permet de réaliser différentes analyses à partir d’un même animal afin de limiter le nombre de souris utilisées. Les tissus prélevés permettront d’étudier la structure des glandes, l’expression de certains gènes ainsi que l’activité de mécanismes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal ou pathologique des cellules mammaires. Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre comment certaines cellules de la glande mammaire conservent leurs caractéristiques tout en étant capables de s’adapter aux besoins du tissu au cours de la vie. Nous cherchons également à comprendre pourquoi des dérèglements de ces mécanismes peuvent favoriser l’apparition de cancers du sein. Plus précisément, nous étudierons le rôle d’un gène qui produit une protéine connue pour limiter la multiplication des cellules et prévenir la formation de tumeurs. Nos premiers résultats obtenus en laboratoire suggèrent que cette protéine pourrait aussi jouer un rôle important dans le maintien de l’identité des cellules mammaires.

Procédures

Dans ce projet, 9 types de manipulations sont prévues : 1/ Implantation ou retrait d’implants hormonaux : 1 fois, 15 minutes par souris 2/ Injection de substance en intrapéritonéal (dans la cavité abdominale) : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 3/ Administration de substance par gavage : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 4/ Injection sous cutanée d’hormones : 14 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 5/ Procédure chirurgicale de transplantation sous anesthésie gazeuse, de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses pré-pubères de 3 semaines : 1 fois, 15 minutes par souris 6/ Prélèvement de sang : 6 fois sur plusieurs semaines, quelques secondes par souris 7/ Injection d’une autre substance en intrapéritonéal : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 8/ Injection de cellules tumorales dans la glande mammaire (sous cutanée) : 1 fois, quelques secondes par souris 9/ Procédure chirurgicale de retrait de tumeur primaire sous anesthésie : 1 fois, 15 minutes par souris

Impact sur les animaux

Pour les femelles qui entreront dans ces procédures, ce projet occasionnera essentiellement un stress léger à modéré dû : 1- à l’administration des différentes molécules destinées à moduler l’expression d’un gène ou d’une protéine (introduction d’une aiguille ou d’une sonde de gavage). La durée de ce stress est estimée à quelques secondes lors de l’introduction de l’aiguille ou de la sonde de gavage. 2- à la procédure chirurgicale de transplantation cellulaire ou de greffe d’implant (gène de déplacement lié à l’implant dorsal). La durée de ce stress (inconfort et douleur modérée) est estimée à 24h (implant) à 48h (greffe), mais sera contrôlée par la mise en place d’un traitement analgésique 3- au développement des tumeurs (gène de déplacement lié au développement du tumeurs mammaires). L’inconfort lié à cette procédure expérimentale est estimé à 1 à 2 mois

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car pour l’ensemble des procédures expérimentales, le but est de collecter les glandes mammaires et/ou tumeurs en vue de leurs analyses.

Remplacement

Pour étudier le rôle de p16 dans le développement et la tumorigenèse de la glande mammaire, nous ne pouvons pas utiliser exclusivement la culture cellulaire in vitro. En effet, nous n’avons pas réussi pour le moment à mimer fidèlement l’organisation 3D du tissu et à reproduire l’ensemble du cycle reproductif de la glande mammaire ainsi que du développement tumoral. Nous souhaitons donc utiliser la souris comme organisme modèle. Cet animal présente de nombreux avantages pour notre étude. C’est un mammifère dont l’organisation du tissu mammaire est similaire à celle de l’être humain.

Réduction

Toutes les souris utilisées seront du même fond génétique entre les groupes contrôles et les groupes traités ou génétiquement modifiés, ce qui préviendra la fluctuation des résultats due aux variations génétiques entre les animaux et permettra d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant moins d’animaux. Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux est déterminé par rapport aux expériences préliminaires ne nécessitant pas d’autorisation (mise à mort des animaux afin de collecter leurs tissus sans utilisation de gestes technique au préalable), ainsi que sur les méthodes employées dans la littérature scientifique relative à l’élaboration de ces modèles animaux. De plus, la souris possède 5 paires de glandes mammaires, permettant de réaliser à partir d’une seule souris de nombreuses analyses et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous allons utiliser le nombre minimum d’animaux nous permettant d’obtenir des résultats homogènes et suffisant pour obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes contrôles vs les groupes expérimentaux (Mutants ou traités). Les animaux seront générés à partir de croisement nous permettant de garder le maximum d’animaux d’une même portée pour les utiliser soit dans des procédures expérimentales, soit maintenir les génotypes pour les accouplements. Par conséquent, la majorité des animaux obtenus à partir des accouplements pourront être utilisés dans des expériences en évitant ainsi la surproduction inutile de souris. Les mâles seront utilisés comme mâles reproducteur afin d’induire les gestations. Lors de procédures nécessitant des gestations synchronisées de façon très précises entre 2 groupes et éviter de faire se reproduire des animaux qui ne pourraient finalement pas être inclus dans notre études, nous mettrons également en place une procédure chirurgicale légère consistant à l’introduction d’un implant en silicone permettant la libération d’hormones en continue afin de mimer une pseudo gestation et garantir la synchronisation des animaux.

Raffinement

La manipulation des animaux sera strictement limitée aux interventions décrites dans les protocoles et aux soins, afin de limiter leur stress. Nous surveillerons régulièrement les souris et respecterons les points limites définis pour limiter la souffrance des animaux. Quelles que soit les procédures mises en place : injection intra-péritonéale, gavage, transplantation dans le coussin adipeux et prélèvement sanguin, les souris serons systématiquement évaluées quotidiennement pendant 3 jours, puis de façon hebdomadaire ou bi-hebdomadaire dans les procédures induisant un développement tumoral mammaire et des points limites spécifiques et précoces seront mis en place. La douleur chez les souris sera évaluée selon l’apparence (normale, pelage ébouriffé avec expression modérée, dos voûté avec expression sévère), le score de condition corporelle, le poids corporel et l’apparition de lésion nécrotique. Du gel nutritif sera mis à disposition des animaux dès l’apparition des signes cliniques afin de favoriser leur hydratation et un traitement avec un désinfectant sera appliqué sur les petites lésions nécrotiques. De plus, une litière douce et adaptée sera utilisée lorsque les souris commenceront à développer des tumeurs.

Choix des espèces

En tant que mammifère, la souris est le modèle animal le plus approprié pour étudier le développement de la glande mammaire car la structure du tissu mime fidèlement celui retrouvé chez la femme. De plus, il existe déjà de nombreux modèles murins génétiquement modifiés mimant les altérations existantes dans les pathologies humaines, notamment pour le cancer du sein. Enfin, la souris possède 5 paires de glandes. A partir d’un seul individu, nous pouvons donc collecter une grande quantité de matériel, réduisant ainsi la quantité d’animaux utilisés dans cette étude. Les animaux utilisés pour les expériences seront pour la plupart des souris adultes âgées de plus de 8 semaines. Nous étudierons soit des souris vierges et donc avant leur mise en accouplement, soit des souris qui auront été accouplées et que nous analyserons au cours du cycle de développement de la glande mammaire, à savoir : la gestation, la lactation et l’involution. De plus, certaines procédures expérimentales incluront des souris de 6 semaines afin d’analyser les glandes mammaires au cours de la puberté. Le choix de ces stades de développement est totalement dicté par le développement de la glande mammaire qui est essentiellement post natal et qui subit de nombreuses modifications au cours des cycles reproductifs que nous souhaitons étudier. Enfin, nous utiliserons également des souris âgées de 3-4 semaines dans les expériences de transplantation (souris receveuses) et des souris de 18 mois afin de suivre le développement des tumeurs.

Jusqu'à neuf gavages sur animal éveillé et huit prélèvements de fèces, chacun précédé de cinq minutes seule dans un pot transparent : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte d'organes et de tissus. Le projet doit vérifier si des mélanges de bactéries intestinales mis au point par un partenaire industriel s'implantent dans l'intestin de la souris et y produisent les métabolites attendus. Le porteur décrit la souris comme un "modèle établi" pour la recherche sur le microbiote intestinal, d'une "pertinence démontrée pour la situation humaine", et retient des adultes de 8 à 12 semaines. Il ne retient comme atteintes que le stress des gavages et des prélèvements de fèces, plus une légère douleur à l'injection de l'anesthésique, pour un projet qu'il classe en souffrance modérée.

Objectifs

Ce projet vise le développement de technologies permettant d’accéder à l’ensemble de la diversité des bactéries intestinales en vue de concevoir un ensemble de souches bactériennes fonctionnelles pour des patients atteints de maladie métabolique et inflammatoire. Il cherche à traiter les déséquilibres des relations entre le microbiote et l’organisme de ces patients. L’objectif du projet est de vérifier l’implantation des bactéries dans le système intestinal de la souris et d’en évaluer la production métabolique

Bénéfices attendus

Les avancées scientifiques ont souligné le rôle des bactéries intestinales dans diverses maladies humaines. L'introduction de grandes quantités de bactéries intestinales non caractérisées chez des individus malades comporte des risques significatifs, soulignant l'urgence de développer des produits davantage définis, contrôlés et fonctionnels. Des mélanges de bactéries, soigneusement étudiés en laboratoire pour ressembler à une flore intestinale saine, pourraient aider à rééquilibrer un intestin perturbé et ouvrir la voie à des traitements efficaces et accessibles contre plusieurs maladies du système digestif. Pour comprendre comment y parvenir, des expériences sont nécessaires pour transposer nos résultats de laboratoire dans un modèle animal plus complexe. Les résultats de ce projet permettront de vérifier si les mélanges bactériens mis au point par le partenaire industriel remplissent leur fonction. A long terme, les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de maladie métabolique ou inflammatoire de l’intestin.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - Gavage (1 à 2 minutes) sur animal vigile, 9 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Prélèvement de fèces (5 minutes) sur animal vigile, 8 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Pesée des animaux (5 minutes), 4 fois au cours de l’expérimentation - Injection (1 minute) sur animal vigile, 1 seule injection pour anesthésier les animaux - Injection (1 minute) sur animal anesthésié, 1 seule injection pour l’analgésique local - Deux prélèvements sanguins (1 à 2 minutes) sur animal anesthésié, 1 seule fois

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour dans le pot transparent). De plus, les animaux subiront un léger stress et une légère douleur lors de l’injection des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte d’organes et de tissus pour des analyses métaboliques.

Remplacement

Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le système intestinal et en évaluer les effets sur les différents organes. Par contre, les données cliniques recueillies dans ce projet serviront à créer des modèles informatiques du système digestif et des microbes qui y vivent (modélisation in silico). Les microbes étudiés sont d’abord analysés en détail en laboratoire, ce qui permet de mieux comprendre comment ils interagissent entre eux et ce qui se passe lorsqu’on les associe différemment. Grâce à ces informations, les expériences sur les animaux peuvent être mieux préparées et le nombre de souris utilisées est ainsi réduit.

Réduction

Le nombre d'animaux requis a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation des résultats. Étant donné que ces expériences testent des effets encore peu documentés, elles comportent un niveau d'incertitude. Pour contrer cela, les calculs s'appuient sur des données publiées, permettant d'estimer les effets attendus. Pour les groupes témoins, le nombre de souris testées lors de ces expériences a été diminué et les données seront regroupées afin d’avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales. Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur de leur cage, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Les animaux seront dans des cages standards à couvercle filtrant par groupe de 3 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des abris en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Des points limites ont été déterminés dans ce projet et seront mis en place si besoin. De plus, avant les prélèvements sanguins en phase terminale, les souris seront placées sous anesthésie profonde. Des points limites adaptés sont définis et seront appliqués en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgés de 8 à 12 semaines. En effet, l’utilisation de souris à l’âge adulte garantit qu’elles ont dépassé les phases critiques du développement et que leurs systèmes immunitaire et hormonal sont relativement stables et matures, ce qui constitue une condition préalable à l’étude des différences liées au traitement.

7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs organes soient collectés. Chacune peut subir jusqu'à quarante-sept prélèvements d'urine, vingt-trois prélèvements sanguins et six injections, avec un suivi allant jusqu'à douze mois. Le projet teste des transporteurs naturels censés délivrer un traitement à une population précise de cellules rénales, sur deux lignées de souris génétiquement modifiées. De ces dizaines de manipulations répétées, le porteur ne retient qu'une "douleur légère de courte durée" et un "stress léger de courte durée", et écrit que la souris en fait un "modèle de choix".

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie où les reins, dont le rôle est de filtrer le sang, s’abîment lentement et silencieusement, entrainant une insuffisance rénale grave et obligeant les patients à suivre des traitements lourds et coûteux (dialyse, greffe de rein). En l’absence de traitement curatif, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour empêcher/ralentir l’évolution vers l’insuffisance rénale. Des défauts dans différentes populations de cellules rénales sont à l’origine de ces maladies. Ce projet vise à tester de nouveaux transporteurs naturels capables de délivrer un traitement directement à une population spécifique de cellules rénales défaillantes, afin de restaurer leur fonctionnement et ralentir, voire d’empêcher, la progression de la maladie. Ces transporteurs seront d’abord validés sur des cellules rénales en laboratoire, puis testés sur deux modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie rénale humaine. Ces souris recevront une injection de transporteurs ou du placebo à différents stades de leur vie pour évaluer l’efficacité d’un traitement préventif, précoce et tardif. L’objectif est de découvrir de nouveaux transporteurs capables d’aider à protéger, voire réparer, la population de cellules rénales malades et d’empêcher la progression vers l’insuffisance rénale grave, évitant aux patients d’avoir recours à une greffe de rein.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est d’identifier des transporteurs ayant une plus grande spécificité pour les cellules défaillantes ciblées permettant de prévenir/retarder l’évolution de la maladie dans deux modèles de souris. Les résultats obtenus valideront l’utilisation de ces transporteurs comme nouvelle approche thérapeutique pour certaines maladies rénales chroniques, permettant sur le long terme d’éviter la greffe rénale aux patients et d’espérer étendre cette approche thérapeutique à d’autres maladies rénales chroniques impliquant d’autres populations de cellules rénales.

Procédures

Prélèvement de tissu caudal (animal vigile, 1 fois, 10 secondes), prélèvements d’urines (animal vigile, 47 fois au maximum, 30 secondes), prélèvements sanguins (animal vigile ou sous anesthésie générale, 23 fois au maximum, 30 secondes), injections (animal vigile ou sous anesthésie générale, 6 fois au maximum,

Impact sur les animaux

Pour le prélèvement de tissu caudal: douleur légère et localisée de courte durée. Pour la contention : stress léger de courte durée lié à la contention manuelle ou au tube de contention. Pour les injections: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour les prélèvements sanguins: douleur légère de courte durée liée à la piqûre. Pour le prélèvement d’urines: stress léger et de courte durée lié à la préhension.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour les analyses biologiques et moléculaires.

Remplacement

Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des souris. Le rein des mammifères et son fonctionnement en conditions normales et pathologiques (maladie rénale) sont bien caractérisés chez la souris avec de nombreux modèles génétiques, et de nombreuses études ont été publiées utilisant une approche similaire avec des transporteurs naturels sur des modèles murins, ce qui en fait un modèle de choix. Ce projet s’intéresse particulièrement à une population de cellules pour laquelle il n’existe à ce jour aucun équivalent in vitro (cultures de cellules rénales). Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire adéquat, il n’est pas possible de remplacer les modèles de souris utilisés dans ce projet par des modèles cellulaires rénaux in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour les lots expérimentaux a été ajusté en prenant en compte l’expérience acquise au laboratoire sur différents modèles de souris similaires et en intégrant les données de la littérature utilisant ces transporteurs. Ce nombre correspond au nombre minimal nécessaire pour chaque expérience, qui permet à la fois d'être assuré de la reproductibilité des phénomènes observés et d’avoir la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale des modèles employés et des protocoles . Les réponses aux traitements seront étudiés à la fois sur les mâles et les femelles et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués. L’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout au long de l’étude permet de surveiller l’état général de l’animal. Ainsi, les souris seront surveillées plusieurs fois par semaine lors des pesées par les personnes en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans un environnement enrichi adapté afin de diminuer leur stress.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés pour cette espèce animale. Enfin, la souris développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Pour le premier modèle (défaut rénal à la naissance), l’injection des transporteurs et du placebo sera effectuée dans les premiers jours de vie du souriceau (traitement à un stade précoce de la maladie) et les souris seront suivies jusqu’à l’âge adulte (6 mois), temps déjà étudié dans d’autres maladies rénales chroniques. Pour le second modèle (maladie rénale induite), l’induction de la maladie et l’injection des transporteurs et du placebo seront réalisées à l’âge adulte (entre 4 et 10 semaines) (traitement à des stades précoces et modérés de la maladie) et les souris suivies jusqu’à 12 mois.

Injectées une fois avec des cellules humaines de cancer du sein, sous la peau, dans la veine de la queue ou directement dans le cœur par voie percutanée, 640 souris immunodéficientes entrent dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la tumeur ou la métastase détectable, elles reçoivent jusqu'à trente-trois injections ou soixante gavages, quotidiens ou hebdomadaires selon le traitement, pendant soixante jours au maximum. Le porteur indique que les injections intracardiaques disséminent les cellules tumorales dans tout le corps et peuvent produire des métastases osseuses et cérébrales, avec douleurs et troubles neurologiques. Toutes sont mises à mort pour études sur organes post-mortem.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif constitue une forme particulièrement agressive de cancer mammaire. L’absence d’expression des récepteurs hormonaux et de la protéine HER2 limite les options thérapeutiques ciblées, rendant l’identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques cruciale pour la prise en charge des patientes. Des travaux préliminaires menés au laboratoire ont permis d’identifier deux biomarqueurs d’intérêt, dont l’expression est corrélée à la progression tumorale et au phénotype agressif de ce cancer. Nos approches in vitro ont révélé des cibles thérapeutiques potentielles liées à ces protéines, suggérant leur implication dans des voies critiques de survie et de prolifération. L’objectif principal de ce projet est de valider in vivo le rôle fonctionnel de ces biomarqueurs ainsi que l’efficacité des cibles thérapeutiques associées. Le passage au modèle animal est indispensable pour étudier ces mécanismes au sein d’un microenvironnement tumoral complexe (interactions stroma, vascularisation), ce que les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire. Plus spécifiquement, se projet vise à caractériser l’impact de la modulation des biomarqueurs d'intérêt sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique, évaluer l’efficacité des stratégies thérapeutiques ciblant ces voies, seules ou en combinaison avec la chimiothérapie de référence, et à déterminer la valeur prédictive de ces biomarqueurs vis-à-vis de la réponse thérapeutique dans un contexte physiologique global.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein triple négatif est le sous-type le plus agressif et le plus démuni en thérapies ciblées. La validation de l'efficacité préclinique de molécules d'intérêt (seules ou en combinaison avec le Taxol) offrira un rationnel solide pour de futurs essais cliniques. De plus, en corrélant la réponse aux traitements avec le niveau d'expression des biomarqueurs étudiés, ce projet permettra d'en évaluer la valeur prédictive. Ce projet vise ainsi à établir des preuves de concept solides en faveur de l’utilisation de ces biomarqueurs non seulement comme cibles thérapeutiques innovantes, mais aussi comme outils de stratification des patientes. Cela s'inscrit dans la perspective concrète de développer de nouvelles approches personnalisées, maximisant l'efficacité des traitements tout en limitant les toxicités inutiles pour les patientes atteintes de cancer du sein triple-négatif.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de cellules de cancer du sein humain. Selon le but de l'étude, cette injection sera réalisée sous la peau (pour former une tumeur locale, n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), dans une veine de la queue (n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), ou directement dans le cœur par voie percutanée (pour étudier la dissémination des métastases, n=1, durée 1 minute, anesthésie générale). Dès que la tumeur ou la métastase sont détectables (la métastase est détectable par imagerie), les animaux recevront des traitements (chimiothérapie classique ou nouvelles molécules) administrés soit par injection (n=7 à 33, durée 1 minute, anesthésie locale), soit par voie orale (gavage, n=60 au maximum, durée 1 minute, animaux vigiles) quotidiennement ou une fois par semaine selon le traitement. L'évolution de la maladie sera évaluée deux fois par semaine en mesurant la taille des tumeurs (pied à coulisse) et des métastases (Imagerie intravitale). Durée des procédures : maximum 60 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’engendrer des nuisances d’intensité variable. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale au niveau du flanc peut induire une douleur légère et transitoire au point d’injection. Le développement tumoral progressif est susceptible d’entraîner une gêne locomotrice, un inconfort, voire perte d'appétit modérés. Les injections intraveineuses par la veine caudale peuvent provoquer un stress lié à la contention, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Ces injections peuvent conduire au développement de métastases, notamment pulmonaires, susceptibles d’induire à terme une détresse respiratoire modérée. Les injections intracardiaques, réalisées sous anesthésie générale, comportent un risque de risque douleur ou d'inconfort au réveil. Elles induisent une dissémination systémique des cellules tumorales pouvant conduire à des atteintes métastatiques multiples (notamment osseuses et cérébrales), pouvant provoquer des douleurs, des troubles neurologiques et une altération de l’état général modérés. L’administration des traitements par voie intrapéritonéale et par gavage oral peut provoquer une douleur transitoire et induire un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour études sur organes post-mortem.

Remplacement

Dans cette étude, les hypothèses de travail seront au préalable validées par des expériences in vitro. Un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) en présence de matrice extracellulaire a été spécifiquement mis au point au laboratoire. Ce modèle permet de mimer l'architecture tumorale et de se rapprocher des conditions in vivo. Ce modèle se substituera aux modèles animaux pour valider le choix des composés thérapeutiques et de leur combinaison et pour réaliser l'analyse moléculaire de la réponse au traitement. Néanmoins, les expériences in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier (interactions systémiques, vascularisation, métabolisme global), ce qui peut modifier significativement l'efficacité et la biodistribution du traitement. Seules les expériences in vivo permettent de valider les résultats obtenus in vitro, constituant ainsi une étape préclinique indispensable pour un éventuel transfert futur vers la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum requis pour garantir une significativité statistique et une robustesse scientifique des résultats. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé a priori sur la base de nos résultats préliminaires in vitro et de la littérature sur ces modèles précliniques. L’analyse des résultats sera réalisée à l'aide de tests statistiques appropriés pour maximiser l'exploitation des données générées. Outre l'approche statistique, la mesure de la croissance tumorale et le suivi des métastases par imagerie intravitale permettent d'obtenir des données cinétiques répétées sur le même animal. Ce suivi longitudinal permet de réduite le nombre total de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les contraintes, la douleur et le stress subis par les animaux, plusieurs mesures de raffinement seront systématiquement appliquées à toutes les étapes du projet. Les procédures potentiellement douloureuses ou nécessitant une immobilité stricte (injection intracardiaque, imagerie par bioluminescence) seront réalisées sous anesthésie générale . Pour les injections répétées, une anesthésie locale sera appliquée et les sites d'injection seront alternés. Pour le gavage, des canules souples de taille adaptée seront utilisées pour éviter toute lésion œsophagienne. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de bonne pratique. L'utilisation de l'imagerie intravitale constitue un raffinement majeur car elle permet un suivi interne longitudinal et non invasif de la progression métastatique. Une surveillance clinique quotidienne pour l'état général et bi-hebdomadaire pour les pesées et les mesures tumorales sera mise en place. Une euthanasie anticipée sera immédiatement pratiquée si un animal atteint l'un des points limites préalablement définis.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris, qui constitue le modèle préclinique de référence pour l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques en oncologie. L'utilisation de modèles de souris immunodéficientes garantit en outre la prise et la viabilité de la xénogreffe cellulaire sans risque de rejet et permet le suivi longitudinal de la croissance tumorale et du développement métastatique. L'âge des animaux au début des expérimentations a été spécifiquement adapté aux contraintes biologiques et techniques de chaque modèle d'étude, afin d'optimiser la réussite des procédures et de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Pour les modèles de croissance tumorale (injections sous-cutanées), des souris âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées. L'utilisation d'animaux jeunes à ce stade de développement physiologique et immunitaire permet d'optimiser le taux de prise de greffe tissulaire et de favoriser une cinétique de croissance tumorale homogène et reproductible. Pour les modèles de formation de métastases, des souris légèrement plus âgées, de 7 à 8 semaines, seront privilégiées. Ce choix repose sur des impératifs anatomiques et techniques, un développement corporel plus avancé étant indispensable pour faciliter la réalisation des injections intracardiaques ou intraveineuses. Cela permet d'augmenter significativement le taux de succès du geste chirurgical, de réduire le temps d'intervention sous anesthésie, et par conséquent, de minimiser les risques de complications et de mortalité per-procédure pour l'animal.

Les souris sont tuées à partir d'une taille de tumeur fixée à l'avance, mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. 46 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Elles reçoivent une injection unique de cellules humaines de cancer du sein triple négatif sous anesthésie locale, et la tumeur qui pousse peut provoquer une gêne mécanique et une perte d'appétit. Le projet ajoute deux lignées cellulaires à un projet antérieur mené jusqu'à son terme, pour les tester dans les mêmes conditions et comparer.

Objectifs

Ce projet est la suite d'un projet déjà validé et qui a donné les résultats prévus. Nous avons depuis obtenu deux nouveaux modèles cellulaires (ajout d'un gène déficient) qui nécessitent d’être testés dans les mêmes conditions pour comparaison. Cette demande a donc pour objectif de compléter le projet précédent et renforcer l’analyse biologique associée. Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Dans une étude menée par notre équipe, nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations du gène en question pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Le projet de départ initial comportait trois lignées cellulaires : une lignée normale et deux clones mutés pour le gène d'intérêt. Ce projet a pour objectif de rajouter deux nouveaux modèles cellulaires qui complémentent le gène déficient des deux clones mutés (pour récupération du gène initialement muté). Les informations apportées par ces deux nouvelles lignées seront très importantes pour valider les résultats obtenus par les trois lignées du projet initial. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gène d'intérêt dans des tumeurs triple-négaitf est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations du gène étudié dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein triple-négatif. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si ce gène pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif, de mauvais pronostic et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales : une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de cancer du sein triple négatif métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances modérées pour les souris. La greffe des cellules, engendre du stress et une douleur transitoire et légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. La tumeur par elle même peut induire une gène mécanique et une perte d'appétit modérées

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle orthotopique et xénogénique de souris.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les souris sont laissées une semaine en quarantaine après leur arrivée pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en locaux confinés dans des portoirs ventilés, avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux seront au nombre maximum de 5 par cage, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux sont surveillés et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permet de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Un pied à coulisse est utilisé pour mesurer la taille de la tumeur. Le sacrifice des animaux est effectué à partir d’une taille tumorale limite définie dans la procédure de suivi des animaux. Si une souris semble souffrir, elle reçoit une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Afin de répondre à la directive européenne 2010/63/UE sur les conditions de vie des animaux confinés, de l’enrichissement environnemental a été ajouté dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi régulier de l’état de santé des animaux et contrôle du poids).

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. Le modèle de souris immunodéficientes NSG sera utilisé pour éviter un rejet de la greffe des cellules humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris avec la lignée MDA-MB-231. Nous devrions faire des mises au point supplémentaires en utilisant un autre modèle et nous utiliserions plus d’animaux pour cela. Enfin, l’animalerie du site n’héberge que des souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).

Rendues obèses par un régime riche en graisses maintenu jusqu'à vingt-deux semaines, des souris reçoivent ensuite une implantation de tumeur mammaire, puis jusqu'à trente administrations de molécules en trente jours. 1 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec quinze prélèvements sanguins répartis sur deux journées. Le porteur écrit que "seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet", après avoir compté cette même température parmi les sources de stress et d'altération de la thermorégulation des souris. Les tumeurs, la rate et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, ainsi que le tissu adipeux, l'intestin et le foie, destinés à d'autres projets.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l’alimentation et la perte de poids influencent le système immunitaire dans un contexte d’obésité. Des souris rendues obèses par un régime riche en graisses seront utilisées pour comparer deux approches : une amélioration de l’alimentation (vitamines et prébiotiques) et une perte de poids par retour à un régime normal. Leur impact sera évalué sur le développement d’un cancer du sein et sur la réponse immunitaire. Le microbiote intestinal des animaux sous différents régimes sera également analysé, afin de mieux comprendre les interrelations possibles entre la flore intestinale, l’alimentation et l’immunité. Certaines molécules seront également testées pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. L’objectif est de déterminer si ces approches peuvent améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale chez des individus en situation d’obésité. Si ces résultats sont confirmés, ils pourraient contribuer à développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et thérapeutiques pour améliorer la réponse immunitaire et la prise en charge des cancers chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des interactions entre alimentation, obésité, système immunitaire et développement du cancer du sein. Cette première étude permettra d’explorer les mécanismes immunitaires et métaboliques impliqués, notamment au sein du micro-environnement tumoral, et d’identifier des cibles potentielles grâce à des analyses globales et quantitatives. Elle vise également à évaluer l’intérêt d’approches nutritionnelles, seules ou en combinaison avec des immunothérapies, pour améliorer la réponse immunitaire et limiter la progression tumorale. Cette étude constitue une preuve de concept qui pourrait ouvrir la voie à des études précliniques et cliniques chez des patients en situation d’obésité, afin d’évaluer l’efficacité de stratégies nutritionnelles innovantes, notamment via l’alimentation et le microbiote, dans la prévention et la prise en charge du cancer du sein.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en thermoneutralité à 30 degrés (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Des animaux pouront être sous régime alimentaire obésogène (animal vigile, 22 semaines maximum en continu). Une partie changera ensuite en passant avec une alimentation contrôle ou sous régime avec supplémentation (animal vigile, 14 semaines maximum en continu). Des challenges métaboliques seront effectués : un test de tolérance au glucose (animal vigile, 1 fois, 2 heures) et un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 1 fois, 2 heures). Ces tests nécessiteront une administration (animal vigile, 4 fois, 1 minute) et des prélèvements sanguins répétés de faible volume (une goutte) (animal vigile, 15 prélèvements au total : 7 sur une journée, 6 sur une autre, l'acte dure quelques secondes). Certains animaux auront une implantation tumorale (animal anesthésié, 1 fois, 10 minutes) combinée ou non avec l'administration de molécules (animal vigile ou anesthésié, 30 fois maximum sur 30 jours, durée 1 minute). En fin de procédure un dernier prélèvement sanguin sera effectué (animal anesthésié, 1 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Le régime alimentaire riche en gras pourra entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires. 3) Les différentes températures d'hébergement pourront entrainer un stress chez les animaux et une altération de leur thermorégulation. 4) L'anesthésie pourra engendrer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de rares cas. 5) La pousse tumorale pourra induire une gène et une douleur modérée. 6) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids. 7) Les différentes administrations peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections répétées peuvent induire risque de péritonite ou une irritation à la zone d'injection. 8) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo ou une hyperglycémie durant quelques heures. Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun. 9) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car les tumeurs, la rate, les ganglions doivent être prélevés pour analyse dans le cadre de ce projet. D’autres prélèvements seront réalisés (tissus adipeux, intestin, foie…) pour faire bénéficier des résultats pour d’autres projets.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de l’alimentation et de l’obésité sur la réponse immunitaire et le développement tumoral. Ces mécanismes impliquent des interactions complexes entre différents organes (tissu adipeux, système immunitaire, tumeur, microbiote) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles in vitro ou in silico. L’étude de la réponse immunitaire dans un contexte d’obésité, ainsi que son influence sur la progression tumorale, nécessite donc une approche intégrée à l’échelle de l’organisme. L’utilisation de modèles murins est particulièrement adaptée, notamment grâce à la possibilité de reproduire des situations physiopathologiques pertinentes (obésité induite par régime, modèles de cancer) et d’étudier finement le micro-environnement tumoral et les réponses immunitaires associées. Toutefois, dans une démarche de réduction de l’utilisation animale, des approches complémentaires in vitro seront utilisées en amont lorsque cela est possible, afin de sélectionner et de valider certaines hypothèses avant leur exploration in vivo.

Réduction

Cette étude nécessitera 1225 souris. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude. Pour l’analyse statistique, les groupes seront comparés avec des tests statistiques classiques. A la fin du projet, différents organes seront prélevés pour analyse afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux. De plus, nous optimiserons les groupes expérimentaux en partageant les témoins entre protocoles compatibles afin de limiter le nombre total de souris utilisées. Toutes les analyses seront réalisées par des experts en bio-informatique et en biostatistiques au sein du laboratoire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, seule la température d'hébergement sera modifiée pour améliorer les résultats du projet. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en armoire thermostatée avec biberon et un accès ad libitum à l'eau et la nourriture. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Quand cela est nécessaire pour limiter la douleur et le stress des animaux, les actes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. La durée des administrations sera réduite au maximum et quand cela sera possible. Les volumes injectés seront également toujours réduit au maximum. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris permet de reproduire de manière fiable des situations physiopathologiques humaines, notamment l’obésité induite par un régime riche en graisses ainsi que des modèles de cancer du sein orthotopiques, dans lesquels la tumeur se développe dans un environnement proche de celui observé chez l’homme. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier finement tous les mécanismes qui rentrent en jeu dasn ces situations. Par ailleurs, les interventions nutritionnelles et pharmacologiques peuvent être contrôlées de manière précise et reproductible. Ainsi, le modèle murin constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour répondre aux objectifs du projet. Des souris âgées de 5 semaines seront utilisées. Après une semaine d’acclimatation, les animaux entrent dans le protocole expérimental. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes présentant un système immunitaire fonctionnel et stable, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires et métaboliques. Ce choix est également justifié par la durée du protocole, qui s’étend sur plusieurs mois. L’utilisation de jeunes adultes permet ainsi de mener l’ensemble des expérimentations sur une période prolongée tout en limitant les effets liés au vieillissement.