Souris

Deux chirurgies, l'une d'une heure, l'autre d'une heure quarante-cinq, séparées d'au moins cinq jours, implantent des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au thorax et une canule nasale. Viennent ensuite des sessions d'enregistrement en contention allant jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, et pour une partie des 128 souris un entraînement quotidien à une tâche auditive qui peut se prolonger plusieurs mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, et subissent de brefs stimuli aversifs, goût amer ou jet d'air. À la fin, chaque souris est opérée sans réveil pour le prélèvement de son cerveau, destiné à l'analyse histologique.

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

MODIFICATION [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs.] Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à 260 gavages ou 260 injections abdominales étalés sur douze mois. Le protocole commence tôt : biopsie de la queue à six jours pour l'identification génétique, injection unique d'un composé cancérogène à quinze jours, puis à partir de huit semaines l'administration répétée de benzo[a]pyrène, un polluant issu de la combustion, avec pour certains groupes des injections destinées à provoquer une fibrose du foie. Une inflammation hépatique, du tissu cicatriciel et des tumeurs du foie sont attendus et se développent progressivement. Les retombées annoncées, mieux évaluer le risque lié aux polluants et ouvrir des pistes de prévention, sont formulées au long terme, quand les atteintes du foie, elles, sont provoquées d'emblée.

Objectifs

Les polluants présents dans l’environnement peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé humaine. Parmi eux, le benzo[a]pyrène (B[a]P) est une substance produite lors de la combustion incomplète de matières organiques, par exemple par le trafic routier, le chauffage, certaines activités industrielles ou le tabagisme. L’être humain y est exposé quotidiennement, notamment par l’alimentation et l’air ambiant. Plusieurs études suggèrent qu’une exposition prolongée à cette substance pourrait favoriser le développement de maladies du foie, notamment la fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) et le cancer du foie. Cependant, les mécanismes par lesquels ce polluant agit sur le foie restent encore mal connus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une exposition chronique au benzo[a]pyrène influence l’apparition et l’aggravation des maladies hépatiques. Le projet vise également à déterminer si le benzo[a]pyrène peut aggraver une maladie hépatique déjà présente et favoriser la progression du cancer du foie. Enfin, il permettra d’évaluer si un traitement expérimental capable de bloquer certains effets de ce polluant peut limiter le développement des lésions hépatiques et du cancer. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les effets des polluants environnementaux sur le foie et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains polluants présents dans l’environnement, et en particulier le benzo[a]pyrène, peuvent contribuer au développement de maladies du foie lorsqu’une exposition se prolonge sur une longue période. Les connaissances acquises aideront à identifier les mécanismes responsables de l’apparition de la fibrose hépatique et du cancer du foie liés à ces polluants. Elles permettront également de mieux comprendre comment certaines cellules du foie sont affectées par l’exposition chronique à ces substances. Le projet évaluera par ailleurs l’intérêt d’une approche thérapeutique expérimentale visant à limiter les effets nocifs du benzo[a]pyrène sur le foie. Ces travaux pourraient ainsi contribuer, à plus long terme, au développement de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies hépatiques associées à l’exposition aux polluants environnementaux. Enfin, les résultats obtenus permettront d’améliorer l’évaluation des risques liés à l’exposition à ces polluants et pourront contribuer à l’élaboration de recommandations destinées à mieux protéger la santé humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions consistant principalement en l’administration répétée de substances par voie orale (gavage) ou par injection dans la cavité abdominale. Selon les groupes expérimentaux, les souris recevront : une biopsie de queue réalisée à l’âge de 6 jours pour l’identification génétique ; une injection unique à l’âge de 15 jours ; deux injections par semaine pendant 12 semaines (soit 24 injections au total) ; deux gavages par semaine pendant 12 semaines (soit 24 administrations) ; cinq gavages par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations) ; cinq injections par semaine pendant 12 semaines (soit 60 injections au total) ; cinq injections par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations). La durée de chaque intervention est courte : environ 5 à 30 secondes pour un gavage et environ 15 secondes pour une injection. À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux afin de permettre les analyses nécessaires au projet.

Impact sur les animaux

Les animaux participeront à des études nécessitant l’administration répétée de substances par voie orale ou par injection. Ces manipulations pourront entraîner un stress ou une gêne légère et de courte durée liés à la contention et à l’administration des traitements. Certaines souris seront exposées à une substance polluante susceptible d’induire progressivement des atteintes du foie. Selon les groupes expérimentaux, ces atteintes pourront se traduire par une inflammation du foie, l’apparition de tissu cicatriciel (fibrose) ou le développement de tumeurs hépatiques. Ces effets apparaîtront de manière progressive au cours de l’étude. Les animaux seront surveillés régulièrement tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets du B[a]P.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet. En effet, l’étude de l’impact d’une exposition chronique au benzo[a]pyrène (B[a]P) sur le développement de la fibrose et du cancer du foie nécessite l’analyse de processus physiopathologiques complexes impliquant de multiples types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ainsi que leurs interactions au sein d’un organisme intact. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière intégrée les phénomènes de fibrogenèse, d’inflammation chronique et de carcinogenèse hépatique induits par une exposition prolongée à un polluant environnemental. Les modèles in vitro, bien que complémentaires, ne permettent pas de recapituler l’ensemble des interactions cellulaires, des réponses systémiques et de la cinétique d’évolution des lésions observées in vivo. L’utilisation de la souris constitue un modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies hépatiques humaines, en particulier dans les modèles de fibrose et de carcinome hépatocellulaire chimio-induits. Elle permet notamment d’étudier de manière intégrée les effets du B[a]P sur le foie dans un contexte physiologique pertinent, incluant le métabolisme des xénobiotiques et les réponses inflammatoires et vasculaires. Ainsi, en l’absence de méthodes substitutives adaptées, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été limité à celui nécessaire pour obtenir une validation statistique des résultats expérimentaux. Il a été déterminé de manière à permettre la mise en évidence d’une différence statistiquement significative de 30 % d’un principal paramètre étudié, l’aire de fibrose hépatique. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques adaptés aux effectifs. Ce choix permet de garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier la fibrose et le développement du cancer du foie. Ce modèle présente également l’avantage de permettre l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous utilisons notamment des souris dans lesquelles le gène AhR, impliqué dans la réponse au stress cellulaire, est inactivé uniquement dans les cellules des vaisseaux sanguins du foie (cellules endothéliales). Cette inactivation est ciblée grâce à un système génétique permettant de supprimer ce gène uniquement dans ce type cellulaire, sans modifier les autres tissus de l’organisme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs des expériences. Dans les procédures visant à induire un cancer du foie, les souris recevront une injection unique d’un composé chimique (DEN) ou d’un produit contrôle à l’âge de 15 jours. Ce moment est choisi car le foie est encore en développement et les cellules se divisent activement, ce qui favorise l’apparition de modifications nécessaires à l’initiation de tumeurs. À l’âge adulte (8 semaines), certaines souris recevront des injections répétées de d’un autre composé chimique (CCl4) ou du produit contrôle afin d’induire une fibrose du foie, c’est-à-dire une accumulation excessive de tissu cicatriciel. Enfin, dans toutes les procédures, un polluant environnemental (B[a]P) ou son véhicule sera administré à partir de l’âge de 8 semaines, correspondant à l’âge adulte chez la souris.  

Jusqu'à deux injections sous-cutanées par jour, trois injections intraveineuses par semaine, et selon les protocoles une injection dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine : 1 185 souris et 1 185 rats, soit 2 370 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est provoquée par immunisation, avec des atteintes motrices progressives allant de la faiblesse de la queue à une paralysie partielle, une perte de poids et une baisse de la vision. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre la sclérose en plaques et la névrite optique qui l'accompagne. Le porteur donne d'abord des raisons anatomiques et physiologiques au recours aux rongeurs, puis indique que "les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de névrite optique chez le rongeur dans le but de tester des traitements potentiels. La névrite optique (NO) est une inflammation aiguë du nerf optique qui entraîne une altération de la transmission des signaux visuels entre la rétine et le cerveau, elle survient essentiellement chez les jeunes adultes. Les symptômes sont une perte visuelle chez le jeune adulte, des douleurs optiques modérées qui sont amplifiées par des mouvement oculaires, chez l’homme les symptômes ne touchent généralement qu’un seul œil. Dans la majorité des cas la névrite optique est une manifestation de la sclérose en plaque. C'est une maladie auto-immune inflammatoire du SNC, dans laquelle des lymphocytes T et B auto-réactifs dirigés contre des antigènes de la myéline sont activés, traversent la barrière hémato-encéphalique, et produisent une inflammation du nerf optique avec une démyélinisation prédominante. D’autres causes sont possibles comme des maladies infectieuses (virales ou bactériennes), maladies auto-immunes (lupus, sarcoïdoses), toxiques ou médicamenteuses (plomb, tabac, antibiotiques). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour le développement préclinique de candidats médicaments destinés au traitement de la sclérose en plaques (SEP) et de la névrite optique associée en reproduisant de manière concomitante l’activation immune systémique, l’inflammation du SNC, la démyélinisation et la dégénérescence axonale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer au développement de traitements thérapeutiques destinés aux maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et les névrites optiques associées, en évaluant l’efficacité de candidats dans un contexte physiopathologique complexe intégrant inflammation, démyélinisation et atteinte neuro‑axonale.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par injection sous-cutanée en début d'étude, accompagnée de 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile pour stimuler le système immunitaire et déclencher la maladie auto-immune. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Le nombre d’administration varie en fonction du traitement à tester et du mode d’injection, avec un maximum de 2 injections par jour en sous cutané, une administration orale ou intrapéritonéale par jour ou de 3 injections intraveineuses par semaine. Si le produit doit être administré par injection au niveau de l’œil, l’animal sera anesthésié de façon générale et locale. La fréquence sera plus limitée, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle d’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale (EAE) et à l’évolution de la maladie. L’induction par immunisation induit un inconfort transitoire lié aux injections avec une réaction inflammatoire locale modérée au site d’injection. Au cours du développement de l’EAE, les animaux vont présenter des altérations motrices progressives, pouvant aller d’une faiblesse de la queue ou des membres postérieurs à une paralysie partielle, évaluée quotidiennement par un score clinique standardisé. Une diminution de l’activité spontanée et de la mobilité est observée, ainsi qu’une perte de poids liée à l’inflammation systémique et à la diminution de l’activité. La sévérité du projet est classée modérée, des points limites (score moteur, altération de l’état général, perte de poids excessive) permettront d’éviter l’apparition de cas sévères. Les animaux auront également une altération de la vision, d'après notre expérience pour d'autres modèles expérimentaux, les rongeurs qui ont une baisse de la vision, ont un comportement comparable aux animaux naifs, en terme de mobilité dans la cage, acces à la nourriture et l'eau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procedure pour réaliser des évaluation ex vivo des tissus, histologie, immuno marquage, dosage de biomarqueurs.

Remplacement

L’étude de la pathologie et des effets de potentiels traitements nécessitent l’analyse intégrée et dynamique des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central, la barrière hémato‑encéphalique et les cellules gliales, ainsi que l’évaluation de conséquences fonctionnelles et structurelles au niveau du nerf optique et de la rétine. À ce jour, aucune méthode alternative non animale (modèles in vitro, ex vivo, organoïdes, approches in silico) ne permet de reproduire la complexité de la réponse auto‑immune systémique impliquée dans l’EAE, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central, la démyélinisation inflammatoire in vivo, ni l’évolution temporelle des atteintes neuro‑axonales et visuelles. Les approches in vitro et ex vivo disponibles sont utiles pour l’étude de mécanismes cellulaires isolés ou pour le criblage préliminaire de composés, mais ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale et la tolérance d’un candidat médicament dans un contexte physiopathologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse de puissance, sera systématiquement réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Un test statistique sera utilisé pour conclure sur la significativité des résultats. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. L’induction de l’EAE repose sur un protocole standardisé et maîtrisé, largement validé dans la littérature et par l’expérience de l’équipe, afin de limiter la variabilité et la sévérité excessive du modèle. L’accès facilité à l’eau et à la nourriture sera facilité pour les animaux présentant des troubles moteurs (abreuvoirs et nourriture placés à hauteur accessible). La durée d’exposition à la maladie est strictement limitée aux temps nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques. Des points limites précoces et clairement définis sont appliqués (score moteur élevé, perte de poids excessive, altération marquée de l’état général). En cas d’atteinte sévère ou de dépassement des points limites, une mise à mort anticipée est réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs qui seront dejà formés aux techniques de manipulations, d'injections ou d'administration de substances avant d'intervenir sur le projet, ainsi qu' à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, dans le contexte de l’étude de névrite optique. Les rongeurs sont bien caractérisés pour l’étude de l’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale modèle de référence des maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central. Les mécanismes d’inflammation du système nerveux central, la démyélinisation et l’atteinte axonale secondaire du nerf optique est bien documentée. Les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat. Les rongeurs sont adaptés aux administrations systémiques, péri-oculaires et intra-oculaires, potentiellement utilisées dans les tests d’efficacité de traitement. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes. Les publications indiquent un âge de 8 à 10 semaines pour les souris et 8 à 12 semaines pour les rats au moment de l’induction. Le système immunitaire est alors pleinement mature pour obtenir une induction fiable et reproductible. Le système nerveux central est complètement développé et permet d’étudier la démyélinisation, d’inflammation et d’atteinte neuro‑axonale au niveau du nerf optique, de la rétine et de la moelle épinière. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Une puce implantée sous la peau après incision, une pompe posée sous la peau ou dans la cavité abdominale pour cinq semaines de traitement continu, puis jusqu'à seize heures de tests par souris réparties sur quatre semaines : 2 784 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des crises d'épilepsie leur sont provoquées et leur sensibilité à la douleur est mesurée, deux points dont le porteur indique qu'ils entraînent un inconfort supérieur à celui des autres tests. L'objet déclaré est d'évaluer cinq médicaments déjà autorisés pour d'autres maladies neurologiques et de chercher des mécanismes communs à deux troubles du neurodéveloppement. Les tests restent désignés par leurs catégories, sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés, sans qu'aucun dispositif soit nommé, et l'effectif tomberait à 864 souris si deux mesures de réduction s'appliquaient, écart que le résumé laisse sans commentaire.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau touchent environ 1% de la population mondiale. Ils sont fréquemment associés à des formes d’autisme, des déficits intellectuels et moteurs, ainsi qu’à de l’anxiété, de l’épilepsie et à des altérations des sensations, notamment de la perception de la douleur. À ce jour, ces troubles ne disposent encore que de peu ou pas de médicaments efficaces. Dans le cadre d’un projet financé par le programme Européen sur les maladies rares (ERDERA) réunissant quatre associations de patients et cinq équipes de recherche, ces travaux, dans leur ensemble, visent à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces troubles, à identifier des marqueurs biologiques et à évaluer le potentiel de repositionnement de candidats médicaments dans des modèles murins. Comme ces troubles pourraient partager certains mécanismes communs, le premier objectif de cette étude est de les identifier en étudiant le comportement et le fonctionnement de ces neurones dans deux modèles murins de ces troubles. Le second objectif du projet consiste à évaluer cinq médicaments déjà approuvés pour d’autres maladies neurologiques (repositionnement) afin de déterminer s’ils pourraient également être bénéfiques pour ces deux troubles. Leur efficacité sera étudiée dans ces deux modèles murins en analysant leurs effets sur les anomalies comportementales et sur le fonctionnement neuronal. Les résultats de cette étude, intégrés au projet européen dans son ensemble, permettraient d’envisager un transfert vers la clinique et les patients à court terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau. Cette étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes communs à l’origine de ces maladies et évaluera le potentiel de médicaments déjà utilisés pour d’autres maladies. Dans leur ensemble, ces travaux permettront d’accélérer le développement de médicaments pour les patients concernés par ces troubles.

Procédures

Les souris anesthésiées seront implantées avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Si un des médicaments ne peut pas être donné oralement dans l’eau de boisson ou la nourriture, une pompe placée sous la peau pourra également être utilisée pour administrer certains traitements de façon continue pendant cinq semaines (en même temps que les puces). Si aucune de ces voies n’est possible, une intervention chirurgicale sera réalisée pour placer la pompe dans la cavité abdominale. Les souris seront évaluées sur leurs comportementaux sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés et leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition aux crises d’épilepsie (maximum 60 minutes par jour sur 4 semaines, soit un total de 16 heures par animal).

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. Leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition à l’épilepsie peuvent entraîner un inconfort modéré, supérieur à celui associé aux autres tests comportementaux. L'implantation des puces et des pompes peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. Des crises d’épilepsie seront induites, ce qui pourrait entraîner une diminution de leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Les médicaments seront d’abord testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour les expériences de comportement et tester des médicaments, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection, leur passage dans le cerveau jusqu’à l’observation de leurs effets in vivo.

Réduction

Le nombre de 2784 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé lors de la caractérisation des modèles, le nombre de souris sera réduit de moitié pour l’évaluation des effets des médicaments. De plus, si la dose la plus faible d’un médicament permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 864.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, mais également pour vérifier leur état de santé. Les caractéristiques génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition de signes indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour injecter des puces d’identification ou les pompes libérant le médicament seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. Les études seront réalisées chez des souris adultes âgées de deux mois, ayant un cerveau mature, qui recevront les traitements avec ces médicaments un mois ou une semaine avant l’évaluation de leurs comportements.

Les souris employées ici portent un marquage fluorescent de leurs fibroblastes, obtenu par modification génétique, pour suivre ces cellules pendant que la tumeur se développe. 2 862 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène chimique identique à ceux du tabac, une fois par semaine pendant dix semaines pour les tumeurs du poumon, ou dans l'eau de boisson pendant quatre à quatorze semaines pour celles de la vessie, et pour une partie d'entre elles une greffe de cellules tumorales introduite dans la vessie par un cathéter urétral sous une heure d'anesthésie, une tumeur trop volumineuse pouvant ensuite obstruer l'organe et provoquer une rétention d'urine douloureuse. Toutes sont tuées, celles dont le génotype ne sert pas au projet dès l'élevage, les autres pour l'analyse de leurs tumeurs après la mort.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines. (MODIFICATION) Dans une 3ème expérience, les animaux recevront une greffe de cellules tumorales avec ou sans fibroblastes directement dans la vessie via l’urètre. Ce geste provoque uniquement une gêne à l’animal, ce même geste étant appliqué aux patients atteints de tumeurs de vessie pour apporter localement le traitement anticancéreux[VD1.1]. Les animaux seront anesthésiés au début de l’expérience par injection d’un produit non douloureux pour effectuer ce geste afin de les stabiliser pour le succès de la greffe. Les animaux seront anesthésiés pendant 1 heure le temps de garantir l’entrée des cellules dans la vessie et éviter leur sortie à cause d’une potentielle miction des souris.

Impact sur les animaux

Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre) Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle. (MODIFICATION) Une gêne de courte durée peut survenir suite à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre afin d’injecter les cellules tumorales/fibroblastes dans la vessie.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. (MODIFICATION) En effet, nous avons montré in vitro que les CAFs issus de tumeurs humaines de vessies favorisent l’invasion des cellules tumorales de stade précoce. Cependant, l’invasion vers le muscle de la vessie étant critique cliniquement et ne pouvant être mimée in vitro, il nous est indispensable d’utiliser des modèles murins pour le montrer. De plus, seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’étudier l’origine et le devenir de ces populations au cours de la progression tumorale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici. Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure. MODIFICATION L’utilisation de l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés et suivre la progression tumorale in vivo. Une variabilité interindividuelle est attendue, notamment en raison des différences potentielles de prise de greffe et d’implantation tumorale. Ceci nécessite 15 animaux par groupe afin de pouvoir observer des différences biologiquement pertinentes entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. (MODIFICATION) Les souris opérées seront anesthésiées afin de réduire la gêne liée à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la greffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.