Souris
Peptides AntiMicrobiens (PAM) de l’extrême pour combattre les infections pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour plus de la moitié. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie nasale sous anesthésie puis suivies jusqu'à quatorze jours, pour tester des peptides antimicrobiens issus d'invertébrés et mesurer leur toxicité. Le porteur indique surveiller perte de poids, prostration et tremblements, et prévoit de tuer les souris avant l'apparition des signes de morbidité. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'infection pulmonaire et que la souris constitue un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider l’utilisation des Peptides Antimicrobiens (PAM), antibiotiques naturels, produit par des invertébrés issus d’environnement extrême. Ces PAM ont des propriétés physico-chimiques originales qui pourraient créer de nouveaux médicaments actifs, dirigé contre les infections pulmonaires. En amont des expérimentations animales, des expériences menées in-vitro ont permis de démontrer que certains peptides antimicrobiens issus d’environnement extrême, notamment certains membres de la famille des BRICOS-PAM ont obtenus d'excellentes valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) contre six pathogènes bactériens hautement virulents et résistants aux antibiotiques) ainsi qu’une thermostable (toujours actifs après 1h à 90 °C), pas activité hémolytique, activité anti-biofilm et une absence de toxicité sur lignées cellulaires. De ce fait, les résultats donnent une fenêtre thérapeutique très large. Cependant, il reste à évaluer son activité (pharmacologie), décrire son comportement et le devenir de la substance dans un organisme vivant (pharmacocinétique, PK) et déterminer le degré de toxicité (dose maximum tolérée, DMT) dans un organisme. Dans un premier temps, pour évaluer l'efficacité de nos candidats médicaments sur des modèles infectieux pulmonaires pathogène (notamment des genres Pseudomonas), une preuve de concept (POC) sera mise en évidence. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Bénéfices attendus
Détermination de la dose du PAM à administrer par voie pulmonaire, intraveineuse ou par voie intrapéritonéale aux souris pour déterminer la meilleure fenêtre thérapeutique. Connaissance de la stabilité et du devenir de chaque composé dans les organes de la souris après une ou plusieurs administrations. Validation chez la souris de l’effet thérapeutique curatif des composés contre une infection Pseudomonas aeruginosa.
Procédures
Pour les procédures « détermination du degré de toxicité » et « la pharmacocinétique », les composés seront administrés par voie intranasale ou par voie intraveineuse 1 fois par expérience sous anesthésie. L’infection des souris avec Pseudomonas est réalisée par voie intranasale sous anesthésie, 1 fois par expérience de preuve de concept (POC). Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés une ou deux fois par 24h sous anesthésie pour la POC. Les animaux après infection seront suivis jusqu’a 14 jour maximum
Impact sur les animaux
Lors de la détermination du degré de toxicité et de la pharmacocinétique, les souris des temps courts (5, 15, 30 et 60 min) seront étroitement surveillées pendant la première partie du protocole puis surveillées toutes les deux heures par jours par la suite (pour les temps supérieurs à 2h) pour observer l’absence de douleur, de lésions et de maladie. Lors de ces observations la perte de poids sera également surveillée. Dans le cas où l'injection des composés testés entrainerait tout changement de comportement : prostration, tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d’aspect physique externe une grille d'évaluation a été mise en place. Pour limiter la peur et le stress physique de l’injection du composé cela sera fait sous anesthésie. Pour limiter la peur, la détresse et le stress physique de l’infection, les souris seront infectées une seule fois par voie intra-nasale en début de protocole expérimental (n°4) , après anesthésie à l’isoflurane 2% et leur état physique et comportemental sera évalué.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d’expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Seules les études in vivo permettent de déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution d’un composé, ainsi que son efficacité face à une infection pulmonaire aigüe. L’efficacité chez la souris constitue un prérequis avant toutes phases cliniques sur l'homme. A ce jour, aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à une infection pulmonaire aigüe. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable. En amont, la démonstration de la validité scientifique de méthode in vitro sera effectué sur lignées cellulaires, notamment pour tous les aspects de toxicité.
Réduction
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, poumon, reins, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement analysables. La taille minimale de groupe nécessaire pour mener spécifiquement à bien la procédure a été faite. Ce nombre d’individus tient compte de la précision des mesures et de la différence statistique significative entre animaux témoins et animaux testés. Les tests seront réalisés de façon séquentielle plutôt que simultanés. De plus, le premier type d’étude nous permettra de réduire le nombre d’animaux pour les études deux et trois.
Raffinement
Le stress ayant une influence directe sur les mesures réalisées, le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toutes douleurs, souffrances, angoisses ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : Les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés. De façon à réduire le stress, l’inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l’infection ou l’injection du peptide. De plus, la surveillance sera accrue, de façon quotidienne, selon les procédures. L’apparence physique, le poids, l’alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plutôt possible une éventuelle morbidité. Des grilles de signes cliniques ont été établies et seront utilisées pour évaluer un « score » de douleur et permettre d’évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum à 14 jours post-infection, avant l’apparition des signes de morbidité. Si des signes de morbidité sont observés, les points de cinétiques seront revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocement par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
La souris possède d'importantes similitudes génétiques (98% des gènes sont communs à l’Homme) mais aussi immunologiques, physiologiques et pathologiques. Une très bonne connaissance anatomique et physiologique et de nombreux outils sont disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre les cellules immunitaires, des cytokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. La faible variabilité intra-individuelle et interindividuelle est à prendre en compte. De nombreuses pathologies infectieuses expérimentales ont été validées, notamment lors d'infection par Pseudomonas aeruginosa chez les modèles murins et notamment en C57BL/6 et BALB/c. La différence de gravité de l'infection pulmonaire induite par Pseudomonas aeruginosa peut être déterminée par des différences dans les réponses inflammatoires de l'hôte. Le choix de la souche sera effectué en fonction du choix de l’étude la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire. Dans un modèle de pneumonie chez la souris simulant également les concentrations pulmonaires mesurées chez l’Homme. Les modèles chez la souris ont permis d’établir l’efficacité in vivo des molécules mais aussi d’en évaluer les critères d’efficacité microbiologique d’un point de vue pharmacodynamique, indispensable à l’optimisation des doses chez l’Homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8 semaines au moment de la procédure expérimentale. Les souris possèdent un poids d’environ 21g à 8 semaines. Chez les souris, le mâle atteint sa maturité sexuelle à l'âge de 8 semaines et la femelle à seulement 7 semaines. Cet âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Rôle de CerS2 dans la modulation de la masse et de la fonction musculaires ainsi que dans l’homéostasie glucidique musculaire et systémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements sanguins répétés, des tests d'effort où des chocs électriques sont appliqués, des injections de vecteurs viraux dans le sinus de l'œil sous anesthésie et un tatouage, pour étudier le rôle d'une enzyme sur la masse musculaire et l'obésité. Le porteur indique qu'un régime gras peut créer une obésité et une résistance à l'insuline sources d'inconfort, et qu'une souris est retirée du test d'effort au-delà de vingt chocs électriques. Il décrit des essais préalables sur cellules musculaires mais juge l'animal entier "indispensable" pour relier les taux de lipides à la fonction musculaire.
Objectifs
Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques et notamment au cours du vieillissement. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire, la performance physique et l’homéostasie glucidique et ce, chez des animaux adultes jeunes, mais également au cours du vieillissement et dans le contexte de l’obésité et de la thermoneutralité, qui sont des contextes favorisant le développement de la résistance à l’insuline.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires notamment lors de l'obésité et/ou du vieillissement.
Procédures
A l'issue de leur réception, après 15 jours d'acclimatation et durant ce projet, les animaux seront soumis à trois tests permettant d'évaluer leur métabolisme glucidique. Ceux-ci durent moins de 3 heures et nécessitent le prélèvement de 3 à 5 µL de sang via la veine caudale à 9 reprises durant un test. Une mesure de la composition corporelle, entraînant un isolement et une contention dans un tube en plexiglas, causera un inconfort à l'animal qui n'excèdera pas 2 minutes. Cette manipulation sera répétée une fois en fin de protocole pour les jeunes mâles et de manière mensuelle pour les mâles âgés. Les tests d'exploration des capacités musculaires, d'une durée maximale de 5 minutes, vont générer soit de l'inconfort soit du stress. Ce dernier sera diminué par la présence de personnel formé et attentif, par l'entraînement des animaux et par la diminution de l’intensité des chocs électriques, lors du test d'endurance, à la valeur seuil minimale de détection. Les animaux recevront des vecteurs viraux par voie rétro-orbitaire, ceci sera réalisé une seule fois sur animaux anesthésiés ce qui diminuera grandement la douleur, d'autant qu'un collyre anesthésiant sera appliqué en per opératoire. Cette partie des procédures expérimentales n'excède pas 10 minutes entre l'endormissement et le réveil de l'animal. De même, l'identification par tatouage sera faîte sur animaux anesthésiés et une fois en début de protocole, acte rapide (15 secondes environ) et peu invasif.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés. Un stress lié à l'isolement, même s'il est de courte durée, pourrait être constaté lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance. Un stress lié à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des tests in vivo de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline. Un inconfort pourrait être constaté au réveil des animaux anesthésiés pour l'injection des vecteurs viraux via le sinus rétro-orbitaire ou pour leur identification par tatouage. La mise en régime enrichi en lipides en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance voire à un diabète pourrait engendrer un grand inconfort à l'animal.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.
Remplacement
Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, les perfomances physiques ainsi que l'homéostasie glucide, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages, quantité qui sera augmentée au moment de l'administration des vecteurs viraux. Après l'identification par tatouage, si une inflammation locale ou systémique (encore plus rare que la précédente) survenait, les souris seraient traitées par un mélange antibiotique/anti-inflammatoire. Si cette médication ne suffisait pas elles seraient alors mises à mort. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme ce qui devrait diminuer le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées; elle permettra également de vérifier l'absence de perte de poids qui, si elle excède 20% du poids corporel, entraînerait une mise à mort de l'animal concerné. Le réveil de l'animal, après anesthésie par un mélange isoflurane-oxygène, pour l'injection des vecteurs viraux, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. Enfin, la mesure du test d'exercice en endurance ne sera réalisée qu'une fois en toute fin des procédures, donc avec des animaux habitués à la manipulation et après deux tests à blanc de courte durée. Malgré toutes ces précautions, un animal sera sorti du protocole si le nombre de chocs devient supérieur à 20.
Choix des espèces
L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (3 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) ou âgés (15 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 21-22 mois en fin de protocole) seront utilisés. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes contrôles et les comparer soit à des animaux rendus obèses par un régime nutrionnel approprié ou par modification de leur température d'hébergement ou âgés, pour lesquels une obésité associée à une insulino-résistance peut s'installer et se développer.
Etude de la distribution de canaux endo-lysosomaux dans le cerveau de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un analgésique puis un anesthésique avant une perfusion de fixateur dans le cœur, qui permet de prélever le cerveau pour étudier un canal calcique impliqué dans les échanges entre neurones et astrocytes. Le porteur ne signale comme effet indésirable que le stress possible lié à la contention et aux injections. Il affirme qu'une étude sur système in vitro ne serait "pas pertinente" et que la modification génétique requise n'est disponible que chez la souris.
Objectifs
Les interactions neuro-gliales sont essentielles aux activités cérébrales, en particulier dans les régions telles que l’hypothalamus, fortement liées au flux sanguin et régulant des fonctions physiologiques vitales. Les astrocytes contactent à la fois les vaisseaux et les neurones, pour détecter et intégrer les changements sanguins et des activités neuronales. En réponse, les astrocytes génèrent des élévations de calcium qui modulent l'activité des neurones adjacents en sécrétant des modulateurs. Cependant l'origine des élévations locales de calcium restent obscures. Une source de calcium peu explorée est une nouvelle famille de canaux calciques (CC) qui, dans plusieurs systèmes, contrôlent les processus de sécrétion. Les astrocytes présentant des niveaux élevés de ce CC, nous émettons donc l'hypothèse que, dans les astrocytes, ce CC participe aux signaux calciques déclenchant les voies de régulations neurone-astrocytes. En particulier, ces régulations contrôlent l'activité des neurones hypothalamiques modulant ainsi la sécrétion de neurohormones par ces neurones. Ces dernières sont notamment essentielles à la régulation de fonctions vitales telles que la parturition et la lactation. Nos données récentes indiquent que la délétion du CC que nous étudions réduit drastiquement la sécrétion de neurohormones. Nous proposons donc d'étudier si ce CC astrocytaire participent au contrôle des astrocytes sur les fonctions hypothalamiques en se focalisant sur ces régulations neurohormonales.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre par quels mécanismes les hormones sont libérés par l'hypothalamus et l'hypophyse. Ce projet permettra d'apporter de nouvelles bases expérimentales et conceptuelles qui permettront d'identifier une nouvelle cible pour une stimulation pharmacologique de la libération de neurohormones pour une intervention thérapeutique dans des pathologies neurodéveloppementales où des déficits de neurohormones ont été incriminées.
Procédures
Une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. Pour cela, les animaux seront injectés avec un analgésique puis après 30 minutes, les animaux seront injectés avec un anesthésiant pour obtenir une anesthésie profonde avant la réalisation de la perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables potentiels sont lié au stress possible lors de la contention de l'anima l'injection de l'analgésique et de l'anesthésique.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car nous prélevons le cerveau pour des études d'immunomarquages
Remplacement
Le but du projet est de comprendre le rôle du canal CC dans les interactions neurogliales et la sécrétion de l'ocytocine et de vasopressine qui régissent de nombreuses fonctions physiologiques. Dans ce contexte il est nécessaire d'utiliser un tissu nerveux intact afin de déceler les processus physiologiques impliqués. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque échantillon nécessaire pour une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec un analgésique puis un anesthésique pour une anesthésie profonde pour que l'animal ne manifeste plus de réflexes aux stimulations avant la réalisation d'une perfusion intracardiaque. Des points limites précoces ont été défini pour prendre en charge un mal être constaté de l'animal
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris (délétion des CCs). Les animaux seront utilisés de p21 à p60, afin de pouvoir comparer nos résultats avec la tranche d'âge pour laquelle la plupart des expériences d'électrophysiologie et d'imagerie calcique sur des tranches d'hypothalamus sont conduites. A ce stade les tranches ex vivo présentent un meilleur taux de survie des neurones et permet une plus grande reproductibilité des résultats.
Mise au point d’un modèle murin récapitulant l’inflammation chronique intestinale observée dans une nouvelle maladie génétique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont génotypées par biopsie de la queue et, pour 240 d'entre elles, une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson pendant six jours, afin de reproduire l'inflammation intestinale associée à une maladie génétique rare. Le porteur indique que la colite peut entraîner perte de poids et sang dans les selles, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il interférerait avec les objectifs scientifiques. Il décrit des travaux in vitro préalables mais conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" à l'étude chez la souris pour observer la migration des cellules immunitaires vers l'intestin.
Objectifs
Le protocole animal que nous souhaitons soumettre a pour but d’étudier une souris déficiente pour un gène responsable du une nouvelle maladie du tissu conjonctif que se transmet sur le mode homozygote en combinant principalement des anomalies vasculaires et squelettiques. Cette maladie est associée à une dérégulation de la voie de signalisation contrôleant la prolifération et la différenciation cellulaires mais aussi modulant les réponses immunitaires. En effet, nous avons observé chez l’homme que ce défaut est associé dans 50 % des cas à des anomalies immunitaires et notamment à une maladie inflammatoire intestinale. Le rôle exact de ce gène dans l’inflammation chronique intestinale reste à définir. Notre but est donc de mettre au point un modèle de colite mimant celle compliquant le défaut génétique pour comprendre les mécanismes à l’origine des dysfonctionnements de l’immunité intestinale et éventuellement disposer d’un modèle préclinique pour tester des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce modèle de souris nous permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de l'inflammation intestinale chronique qui complique une nouvelle maladie monogenique du tissu conjonctif causée par des mutations récessives du gène étudié. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale chez ces patients atteints. À terme, ce projet pourrait conduire au développement de traitements permettant de prévenir ou d'arrêter le développement de maladies digestives chez les patients présentant ce défaut génétique.
Procédures
1980 animaux seront génotypés par biopsie de la queue. La colite sera induite dans 240 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson pour 6 jours. Aucun prélèvement ou procédure chirurgicale est prévu.
Impact sur les animaux
Le génotypage invasif (par biopsie de queue) pourrait provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. L’invalidation constitutive du gène d’intérêt pourrait déclencher de l’inflammation intestinale soit spontanée chez les animaux adultes soit induit par administration de DSS (âgés de plus de 8 semaines) avec perte de poids ou sang dans les selles.
Devenir
Afin d'avoir accès au tissu intestinal pour caractériser le système immunitaire, tous les animaux seront tués à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. Par exemple, les conséquences moléculaires de la perte du gène IPO8, responsable de l'inflammation chronique intestinale observée dans une nouvelle maladie génétique, ont déjà été étudiées in vitro pour réduire le besoin d'expérimentation animale. Cependant, les maladies inflammatoires intestinales impliquent la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, suivie de l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.
Réduction
Le nombre de souris utilisé a été déterminé dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en minimisant les variations inhérentes à la recherche biologique in vivo. Le protocole d'induction de l'inflammation intestinale aiguë a été optimisé pour obtenir un développement homogène des maladies chez des souris génétiquement identiques. Ce nombre tient compte d'un minimum de cellules à collecter pour les analyses et inclut également le nombre de contrôles nécessaires pour analyser les résultats avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Des points limites et intermédiaires ont été établis pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement par le personnel de l'animalerie et trois fois par semaine par les chercheurs. Cela permet une prise en charge immédiate de l'animal et donc une réduction de la souffrance, puisque l'utilisation d'analgésiques ne peut pas être envisagée car ceux-ci interfèrent avec les objectifs scientifiques de l’étude. De l’aliment et de l’eau gélifiés seront ajoutés dans les cages des animaux présentant des signes cliniques mais n’ayant pas encore atteint les point limites finaux. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des maisonnettes en cartons, de coton de nidification, de bâtonnets à ronger et de cylindres sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement.
Choix des espèces
La souris est un modèle d'étude pertinent pour comprendre les réponses immunitaires chez les mammifères, car elle possède tous les composants clés du système immunitaire inné et acquis. Le fonctionnement et les molécules du système immunitaire des souris sont bien caractérisés et présentent de nombreuses similitudes avec le système immunitaire humain. Par conséquent, les résultats expérimentaux obtenus avec des souris sont souvent transposables aux humains. De plus, la souris offre un modèle de référence pour les études immunologiques, notamment grâce à la disponibilité de nombreux modèles transgéniques et knock-out, ce qui permet d'approfondir les mécanismes impliqués. En plus, le modèle de colite aiguë proposé ici est bien standardisé, permettant de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin.
Evaluation de l’effet des substances pharmacologiques sur le transit intestinal et la vidange gastrique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 3000
2 000 souris et 3 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 4 000 tués à l'issue et 1 000 rats réutilisés. Les animaux sont mis à jeun jusqu'à 24 heures, reçoivent les substances testées par voie orale, subissent des prélèvements sanguins répétés puis, quand un prélèvement d'organes est requis, sont tués pour analyser l'estomac et l'intestin. Le porteur indique que certaines substances peuvent provoquer constipation ou diarrhée et un inconfort, dans le cadre d'évaluations réglementaires exigées avant la mise sur le marché de candidats médicaments. Il décrit des tests in vitro préalables mais affirme que les modèles animaux restent "plus adaptés" pour évaluer l'effet global sur la motilité intestinale.
Objectifs
Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. Ils contribuent directement à un certain nombre de problèmes cliniques courants et représentent d'importantes dépenses liées aux soins de santé. La motilité gastro-intestinale (vidange gastrique et transit intestinal) est une interaction entre les muscles lisses, le système nerveux entérique qui fait partie intégrante des processus digestifs et d'absorption de l'intestin. Elle permet de propulser le contenu luminal, de le mélanger aux sécrétions digestives et éliminer les déchets. Les troubles de la motilité et du transit sont fréquents et entraînent des conséquences cliniques importantes pouvant être associées à une intolérance alimentaire, à la malnutrition, au reflux gastro-œsophagien, à la prolifération bactérienne, à la dyspepsie et au syndrome du côlon irritable. Le présent projet consiste d’une part à évaluer l’efficacité de candidats médicaments à modifier le transit intestinal et la vidange gastrique, et d’autre part à anticiper les effets secondaires affectant la motilité gastrique et intestinale pouvant apparaitre lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament. Le but est d’identifier les potentiels effets indésirables lors d’études dites de pharmacologie de sécurité. Ces évaluations sont recommandées d’un point de vue réglementaire dans le cadre de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité d’un traitement à modifier (accélérer ou retarder) le transit intestinal ou la vidange gastrique et à évaluer les potentiels effets indésirables de candidats médicaments sur le transit intestinal. Ces tests permettent une compréhension unifiée des effets du médicament sur l'activité péristaltique dans différentes parties du système gastro-intestinal.
Procédures
Les substances d'essais peuvent être administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. L’effet des substances sur le transit intestinal et/ou la vidange gastrique des animaux est évalué après l’administration orale unique d’un réactif (durée de quelque secondes à quelques minutes) ou par mise à disposition d’une quantité connue de nourriture. Les animaux sont préalablement mis à jeun pour une durée maximale de 24 heures et peuvent être privés d’eau 1h avant le test . Ils sont euthanasiés 20 à 240 minutes plus tard pour prélever l'estomac et/ou le tractus intestinal. Des prélèvements de sang (durée de quelques secondes, 6 maximum) peuvent être réalisés. Enfin, les animaux peuvent également recevoir au préalable (selon l'objectif de l'étude) une substance réactive ralentissant artificiellement la vidange gastrique ou le transit (administration unique , durant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Quelques procédures peuvent induire un stress lié à la privation de nourriture temporaire et à l'hebergement sur grille (pour une durée maximale de 24 h), à la répétition des prélevements sanguins intermédiaires et à l'administration des élements d'essais. Par ailleurs, certaines substances pouvant altérer la fonction gastrointestinale (constipation ou diarhée) peuvent créer un inconfort.
Devenir
Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelles thérapies et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est déterminé par approche statistique et sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité gastrointestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Par ailleurs, certaines procédures decrites dans ce projet peuvent être testées dans le cadre de tests supplementaires pour évaluer l'effet secondaire des substances. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soit des rats ou des souris, conformément aux recommandations internationales.
Utilisation de souris pour le maintien de tiques saines en élevage
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris porte sur le dos un bouchon contenant des tiques qui se gorgent de son sang pendant quatre à cinq jours pour les larves et jusqu'à deux semaines pour les adultes, l'objectif étant d'entretenir un élevage de tiques destiné à de futures expériences d'infection. Le porteur signale un stress lié à l'isolement pendant les gorgements et une perte de poids possible, sans détailler d'autre suivi que l'observation de l'apparence. Il décrit une méthode de gorgement sur membrane artificielle mais la juge trop complexe et inapplicable aux adultes, concluant qu'il est "nécessaire" de recourir aux souris.
Objectifs
Les tiques jouent un rôle majeur en tant que vecteurs de maladies et ont un impact significatif sur la santé publique. Comprendre leur biologie, déterminer leur potentiel et la cinétique de transmission et développer des stratégies de prévention sont essentiels pour minimiser les risques pour la santé humaine. Les tiques sont responsables de la transmission de divers agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des parasites. Parmi les maladies les plus notables transmises par les tiques, on peut citer la maladie de Lyme, la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, l'encéphalite à tiques, la babésiose et l'anaplasmose. Ces infections peuvent avoir des conséquences graves sur la santé humaine si elles ne sont pas diagnostiquées et traitées à temps. Les tiques peuvent jouer un rôle dans l'émergence de nouvelles maladies, car elles peuvent transmettre des agents pathogènes d'animaux sauvages à l'homme. Comprendre la biologie et l'écologie des tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention et de contrôle efficaces. Cela inclut le développement de vaccins, de mesures de protection individuelle (comme l'utilisation de répulsifs), et la gestion des populations de tiques dans les zones à risque élevé. Pour mieux faire face à l’émergence des tiques et des maladies à tique, nous souhaitons pouvoir bénéficier d’un élevage de tiques de différentes espèces qui seront utilisées pour des expériences d’infection chez la souris afin de reproduire le mode de transmission naturelle de pathogènes. Cet élevage consiste à obtenir les différents stades d’évolution de différentes espèces de tiques dures à partir des œufs (larves, nymphes, adultes). Le passage d’un stade à l’autre nécessite la prise de sang sur un animal et nous avons depuis plusieurs années établi les conditions d’élevage afin que chaque espèce puisse se développer dans les meilleures conditions.
Bénéfices attendus
Les tiques jouent un rôle majeur en tant que vecteurs de maladies et ont un impact significatif sur la santé publique. Comprendre leur biologie, déterminer leur capacité à transmettre des pathogènes émergents, et développer des stratégies de prévention sont essentiels pour minimiser les risques pour la santé humaine.
Procédures
Pose du bouchon sur le dos de la souris vigile : 10 secondes Gorgement des tiques sur souris vigile : 4-5 j pour les larves, 5-7 j pour les nymphes , 2 semaines pour les adultes
Impact sur les animaux
Stress engendré par l’isolement des animaux au cours des gorgements Perte de poids éventuelle durant le gorgement des tiques
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été mis en contact avec des tiques.
Remplacement
Il existe des méthodes de gorgement des larves et des nymphes sur membrane artificielle. Les avantages d'un système de gorgement par membrane artificielle sont cependant contrebalancés par la complexité de la mise au point, les facteurs environnementaux supplémentaires qui peuvent avoir un impact sur le succès du gorgement et la nécessité d'affiner la technique pour chaque nouvelle espèce et chaque nouveau stade de vie des tiques. Cette méthode n’est pas non plus applicable au stade adulte pour lequel le temps de gorgement est très long et les pièces buccales de la tique finissent toujours par percer le dispositif et produire des fuites de sang. Il est donc nécessaire lorsque l’on veut obtenir suffisamment d’individu par stade de recourir aux gorgements sur animaux.
Réduction
Nous utiliserons le minimum d’animaux nécessaire à l’entretien de l’élevage et à la fourniture d’individus nécessaires aux expériences prévues. Ces souris proviendront soit d’un établissement fournisseur, soit de la zone élevage de l’animalerie. Les souris seront utilisées à deux reprises lors du gorgement des larves et des nymphes. Nous ne pouvons réutiliser plus souvent les mêmes animaux car des anticorps sont produits qui interfèrent avec le cycle de vie des tiques.
Raffinement
Les animaux seront observés pour l’apparition de symptômes génériques: modification de l’apparence (manque de toilettage, poil hérissé, amaigrissement). Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement notable ou bien si leur mobilité diminue. Une observation bi-quotidienne sera alors exercée. Si l’état n’est pas amélioré, les animaux seront mis à mort. Les animaux doivent être isolés lors des gorgements. Du coton sera mis à leur disposition pour former un nid ainsi que du matériel d’enrichissement (petites balles).
Choix des espèces
Les souris sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants dans le cadre de l’élevage de tiques. Elles sont facilement manipulables, tolèrent bien le bouchon que l’on colle sur leur dos. Les tiques obtenues sont propres et en bonne santé. Nous estimons à 200 le nombre de souris qui seront nécessaires chaque année pour gorger les larves, les nymphes et les adultes. Nous utiliserons 50 souris pour les larves et les adultes. Il y a en effet beaucoup de larves à gorger mais on peut en mettre jusqu’à 100 sur le dos d’une même souris. Les adultes sont moins nombreux mais l’on ne peut en poser que 2 par bouchon. Pour ce qui est des nymphes, on ne peut poser que 20 d’entre elles dans le bouchon. Il s’agit d’un stade très important car il conduit à l’émergence des adultes donc on doit prévoir suffisamment de souris, donc 100.
Étude du rôle des neutrophiles dans l’accident vasculaire cérébral ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère cérébrale, reçoit des injections puis est tuée pour prélever son sang et ses tissus, afin d'étudier le rôle des cellules sanguines dans le défaut de recirculation. Le porteur indique que le modèle induit une douleur et une perte sensorimotrice, avec perte de poids et déshydratation possibles. Il justifie le recours aux souris par la durée de vie très courte des cellules sanguines et affirme que le projet ne peut s'envisager que dans un "organisme entier".
Objectifs
Chaque année, les accidents vasculaires cérébraux touchent plus de 13,7 millions de personnes, ce qui représente la deuxième cause de décès et la première cause d'invalidité dans le monde. Ceux-ci sont dans 80% des cas liés à l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La recirculation sanguine peut être réalisée par le retrait du caillot lors d’une intervention chirurgicale ou par sa dégradation grâce à l’injection intraveineuse d’un traitement médicamenteux. Cependant, même après la dégradation du caillot par ce traitement, la circulation sanguine reste insuffisante chez plus de 50 % des patients ce qui est à l’origine d’une évolution défavorable voire de leur décès. De nombreuses études cliniques et précliniques semblent indiquer que la principale cause de l'absence de flux sanguin est l’obstruction des capillaires par des cellules sanguines. L’objectif de la présente étude est de déterminer les mécanismes par lesquels les cellules sanguines bloquent les capillaires cérébraux. Notre hypothèse est que leur propriété de déformation et d’élasticité est diminuée après un accident vasculaire cérébral. Il a été récemment démontré qu’une enzyme modifie la forme des cellules sanguines et que l’inhibition de celle-ci améliore la circulation de ces cellules. L’inhibiteur n’a pas été testé dans un contexte d’accident vasculaire cérébral, mais pourrait être un outil intéressant pour réduire l’obstruction des vaisseaux cérébraux. Pour étudier cela, nous souhaitons réaliser des mesures d’élasticité des cellules sanguines de souris ayant subi un accident vasculaire cérébral traitées ou non par l’inhibiteur, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’obstruction des capillaires. Cette étude pourrait permettrait d’améliorer la recirculation sanguine chez les patients victimes d’un accident vasculaire cérébral. La demande de ce projet d’expérimentation animale est justifiée par le fait que le modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris ne peut pas être remplacé par une approche in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’obstruction des capillaires cérébraux par les cellules sanguines à la suite d’un accident vasculaire cérébral est due à une modification de leur élasticité ; à terme cela pourrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques afin de rétablir cette élasticité et d’augmenter la recirculation sanguine après un accident vasculaire cérébral et ainsi d’améliorer le pronostic des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : Les quatre traitements analgésiques seront réalisés par injection en sous cutanée. Chaque injection sera réalisée sur les souris vigiles et aura une durée d’environ 30 secondes. Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générales (avec une analgésie préalable) avec une durée d’anesthésie / chirurgie d’environ 45 minutes. Deux traitements par voie intraveineuse seront réalisés 30 minutes après le début de l’ischémie sur souris anesthésiées et seront d’environ 1 minute pour l’injection de l’inhibiteur ou de son solvant et de 30 minutes pour l’injection de l'activateur tissulaire recombinant du plasminogène; en effet, dans ce cas, 10% de la dose sont injectés en environ une minute, le reste (90%) est injecté pendant les 29 minutes suivantes à l’aide d’un pousse seringue. Une anesthésie générale profonde, avec aussi une analgésie préalable, d’environ 10 minutes sera réalisée lors de la fin de l’étude pour le prélèvement sanguin. Deux injections de solution physiologique pour la réhydratation post opératoire seront réalisées sur souris vigile en sous cutanée. Chaque injection sera d’une durée d’environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le modèle d’accident vasculaire cérébrale induit une douleur peropératoire et une perte sensorimotrice. Une perte de poids et une déshydratation peuvent également être attendues. Un stress lié à l’anesthésie et des douleurs associées aux injections peuvent être présents lors des manipulations.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer le sang et des tissus
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier le rôle des cellules sanguines dans la mauvaise recirculation sanguine survenant après un accident vasculaire cérébral. Les cellules sanguines ont une durée de vie très courtes (quelques heures) et il est nécessaire d’utiliser des cellules fraichement isolées de souris pour étudier leur comportement et maintenir leurs propriétés afin de mieux comprendre leur implication dans les vaisseaux sanguins après l’accident vasculaire cérébral. Ce projet ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. De plus, le nombre de cellules sanguines isolées à partir d’une souris est élevé, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- et post-opératoire. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée sur la zone de chirurgie. La chirurgie est par ailleurs réalisée au cours d’une anesthésie générale. En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Après leur réveil, quelques croquettes pulvérisées au pilon humidifiées seront placée dans la cage, pour faciliter l’alimentation. De l’eau sous forme d’hydrogel sera également proposée. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score. En cas de réouverture de la plaie chirurgicale lors du suivi post opératoire, elle sera nettoyée et un point de suture sera réalisé sous anesthésie générale ; pour permettre à l’animal de récupérer dans un environnement calme, il sera isolé dans une autre cage pendant le reste de l’expérience (inférieur à 24h). Les souris seront gardées 24 heures après l’accident vasculaire cérébral et le prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde et traitement analgésique.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence de la souris pour étudier les maladies cardiovasculaires. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne réalisé chez la souris est lui-même reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral, et permettre de mieux comprendre le phénomène chez l’humain. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte, le modèle sera réalisé sur des souris adultes d’au moins 2 mois.
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Rôle des tissus adipeux bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.
Devenir
Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).
Effets de bactéries anti-inflammatoires dans un modèle murin d’inflammation de la muqueuse intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant onze jours, elles reçoivent des gavages quotidiens et une injection d'un agent anticancéreux qui enflamme la muqueuse intestinale, avec pesées et prélèvements répétés, pour tester des bactéries probiotiques contre cette mucosite. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, un pelage hérissé et une apathie comme dommages attendus, et tue les souris en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que l'animal reste "le seul moyen" de reconstituer les interactions entre le microbiote et le système immunitaire.
Objectifs
La mucosite est une inflammation et/ou une ulcération de la muqueuse du tractus digestif, en particulier buccale et intestinale. Elle est un problème majeur rapporté chez 50 à 80 % des patients subissant une chimiothérapie, affectant significativement leur qualité de vie. Cette inflammation peut être provoquée par l´agent anti-cancéreux utilisé. Plusieurs études ont montré qu’elle était associée à une modification du microbiote sain et induisant une aggravation des effets de la chimiothérapie (diarrhée, saignement dans les selles, douleurs abdominales, perte de poids). Dans ce contexte, il est nécessaire de trouver des traitements qui restaurent un microbiote intestinal sain. De nombreuses bactéries probiotiques ont été décrites comme des outils prometteurs pour le traitement et la prévention des inflammations intestinales. Ceci a été démontré dans de nombreux modèles précliniques. Le but de ce travail est d'étudier les effets anti-inflammatoires d’une famille de bactéries probiotiques, sur la mucosite murine expérimentale induite par un agent anticancéreux particulier. L’emploi de ces bactéries comme agent préventif et thérapeutique contre la mucosite constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de l’inflammation intestinale chez les patients sous traitement par l´agent anti-cancéreux. Dans ce modèle, l’agent anticancéreux induit une inflammation des tissus semblable à celle retrouvée chez des patients présentant des effets secondaires. La réponse immunitaire développée suite au traitement peut être étudiée en détail. Le projet sera réalisé en 2 étapes : • Validation du modèle de mucosite dans nos conditions expérimentales • Evaluation des effets préventifs et thérapeuthiques des bactéries ou de composés qui en dérivent sur l’inflammation intestinale ; Analyser l'effet de ces administrations sur la composition du microbiote intestinal avant, pendant et après mucosite ; Evaluer l'action des bactéries ou composés dans l'amélioration des signes cliniques en cas de mucosite due à l´agent anti-cancéreux. Ces bactéries ainsi que leurs composés ont été testées précédemment lors d’essais in vitro et in vivo sur un modèle d’inflammation aigüe reproduisant les symptômes des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Suite à des résultats positifs concernant leur effet anti-inflammatoire sur une inflammation aigüe, nous souhaiterions évaluer leur efficacité sur une inflammation due à l’agent anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des patients cancéreux traités par cet agent anti-cancéreux développe des effets secondaires au niveau intestinal tels qu’une inflammation de la muqueuse appelée mucosite, due principalement à la réponse inflammatoire. Ceci induit des modifications tissulaires et favorise l’altération du microbiote et de l’équilibre intestinal. L’ensemble de ces modifications participe au développement de diarrhée et d’hémorragies intestinales. Ces effets, en plus des contraintes liées au traitement et à la maladie, contribuent très souvent à une baisse de moral des patients combinée à une importante perte de poids. De plus, à l'exception des traitements palliatifs (anesthésiques ou antibiotiques dans les cas graves), il n'existe aucune option thérapeutique connue pour prévenir la mucosite intestinale induite par la chimiothérapie. Il est donc important de développer d’autres approches complémentaires qui préservent les effets thérapeutiques de cette chimiothérapie mais qui protègent contre ses effets secondaires au niveau intestinal. Parmi ces nouveaux traitements se trouvent les probiotiques, qui sont des micro-organismes (bactéries ou levures) vivants ayant des effets bénéfiques sur l’organisme. Beaucoup de bactéries déjà utilisées comme probiotiques, sont des candidates potentielles car leurs effets anti-inflammatoires au niveau intestinal ont déjà été prouvés sur d’autres pathologies, sans effet secondaire. Des bénéfices en termes de connaissances sur l’interaction hôte - microorganisme, plus particulièrement microbiote intestinal - santé intestinale pourront être obtenus au cours de ce projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Nous aimerions savoir si les bactéries testées sont capables d'améliorer les signes cliniques de la mucosite et quels changements induisent-elles au niveau de la réponse immunitaire et histologiques pour y parvenir. Pour les nouveaux microorganismes n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera plus longue mais constitue un objectif d’amélioration du bien-être (réduction des effets secondaires au niveau intestinal du traitement et amélioration de la qualité de vie des patients sous traitement).
Procédures
- Pesée quotidienne pendant 11 jours, une pesée dure environ 5-10 secondes, animal vigile, 448 animaux. - Gavage intra gastrique quotidien de 10 secondes maximum pendant 11 jours, animal vigile, 448 animaux. - Isolement des souris pendant 10 minutes maximum dans des pots transparents pour prélever des crottes fraiches. 3 fois pendant les 11 jours , animal vigile, 448 animaux. - Injection intrapéritonéale unique de 10 secondes d’un agent anti-cancéreux (ou de son solvant pour contrôle), animal vigile, 448 animaux. - Isolement quotidien des souris pendant 10 minutes maximum pour réaliser le score clinique. 4 fois pendant les 11 jours (2 de ces isolements seront communs à ceux réalisés pour la collecte de feces). Animal vigile, 448 animaux - injection unique pour l’anesthésie de 10 secondes pendant le 11 jours (avant le prélèvement de sang). Animal vigile, 448 animaux - Prélèvement de sang de 30 secondes après l´administration d’un traceur fluorescent (par gavage) une fois pendant le 11 jours. Animal anesthésié, 448 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole viennent du traitement par l´agent anti-cancéreux qui provoque une inflammation des muqueuses. Les dommages principaux liés au traitement peuvent se manifester par une perte de poids, une diarrhée légère (crotte molle) ou une déshydratation due à la diarrhée. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voutée, yeux clos ou mi-clos, apathie. Lors du prélèvement de crottes et lors de la réalisation du score clinique, les animaux seront isolés pendant 10 minutes maximum, cela peut induire un stress le temps de l’isolement. Les animaux conservent cependant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres animaux. Aussi, les gavages des bactéries et des composés bactériens ainsi que l’injection intrapéritonéale et le prélèvement de sang peuvent entrainer un stress et/ou une douleur le temps de la manipulation.
Devenir
A l’issue de chaque prodédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes pour de futures analyses.
Remplacement
Le présent projet vise à étudier l’effet du microbiote intestinal, plus particulièrement d´une espèce bactérienne en particulier, sur la réponse immunitaire des animaux, principalement son effet anti-inflammatoire lors d’une inflammation due à un agent anti-cancéreux précis (et déjà employé en médecine humaine). A l’heure actuelle, l’utilisation des animaux reste le seul moyen qui permet de reconstituer l’environnement et les interactions complexes que l’on retrouve entre le microbiote et le système immunitaire d’un être vivant.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données issues de la littérature et acquises les années précédentes sur des modèles similaires comparables ont permis de calculer les tailles de groupes. Le nombre obtenu correspond au maximum d’animaux qui peuvent être utilisés par groupe. Au total, nous utiliserons 448 animaux.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où nous injectons l’agent anti-cancéreux aux animaux, un score clinique individuel est établi chaque jour. Les critères observés seront l’aspect des fécès (diarrhée), l’aspect du pelage, la posture, la réponse face au stimulus, la locomotion et la déshydratation de chaque animal. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Des traitements seront mis en place si les animaux présentent des signes de douleur ou stress. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux seront hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton ou en polycarbonate. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. La surveillance, les injections, prélèvements et manipulations seront réalisés par des expérimentateurs formés et maitrisant ces gestes afin de réduire au maximum le temps de manipulation et donc le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est le modèle d’étude dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, car leur développement intestinal est relativement similaire à celui de l'intestin humain et elles possèdent un grand nombre de réponses immunitaires, de microbiomes et de gènes identiques aux l´homme. Il est possible d’induire une mucosite chez la souris avec différents produits chimiques. Les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 semaines. Les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits bactériens sur une mucosite induite. De plus, cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données.
Elevage d’animaux avec un phénotype dommageable.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.
Procédures
L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.
Impact sur les animaux
Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.
Devenir
Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.
Choix des espèces
La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.