Souris

1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.

Bénéfices attendus

Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.

Procédures

Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.

Devenir

Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.

2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.

Procédures

Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.

Remplacement

La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.

Réduction

Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées

Raffinement

Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.

Une lignée de souris du syndrome de Wolfram, qui perd la vue et l'audition vers un mois et développe un trouble vestibulaire source d'hyperactivité, est exploitée pour tester cinq composés chimiques fournis par des chimistes. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Après un marquage à l'oreille, elles reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine pendant quinze jours, un test de vision éveillées à un mois et deux anesthésies à trois jours d'intervalle pour un test d'audition d'une heure et un test de vision de 30 minutes, des tests que le porteur dit tous "indolores". Le texte justifie des lots de 10 souris par groupe par plus de vingt ans de mesures, sans détailler comment ces groupes aboutissent à 800 souris pour cinq composés.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par gavage, des mesures répétées de la tumeur et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester un composé inhibiteur associé à une immunothérapie. Les bénéfices annoncés pour les patients ne répondant pas à l'immunothérapie restent formulés au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit encore les interactions de l'environnement tumoral et que ce modèle est "nécessaire".

Objectifs

Dans le microenvironnement tumoral, les fibroblastes associés à la tumeur favorisent la malignité en sécrétant des facteurs empêchant le système immunitaire de s'attaquer aux tumeurs fibreuses et favorisant ainsi les métastases. Des immunochemothérapies ont été testées, lors d'un précédent projet collaboratif, pour améliorer la réponse immunitaire naturelle qui reconnaît le cancer comme étranger. Cela n'a produit que peu d'effet dans ces cancers riches en fibroblastes. L'inhibition (par un de nos composés en développement clinique) d'une enzyme spécifique a permis de stopper la migration et invasion de cellules tumorales (métastases) et de cibler l’activation des fibroblastes pour aider le système immunitaire. Inhiber cette enzyme pour des cancers fibreux est alors devenu une voie de traitement envisagée. Le cancer du côlon est connu pour présenter des tumeurs solides présentant une enveloppe fibreuse exprimant fortement cette enzyme. Pour tester l’effet des composés inhibiteurs de cette enzyme spécifique sur les fibroblastes et la réponse de la tumeur à l’immunothérapie dans ce cancer précisément, nous allons utiliser le modèle murin sous-cutané de cancer du colon, qui développe des tumeurs immunogènes répondant à des anticorps inhibiteurs d’un contrôle immunitaire.

Bénéfices attendus

Un composé inhibant cette enzyme spécifique est important à tester dans le contexte de cancers fibreux, dans un objectif de ciblage des fibroblastes associés à la tumeur. Ceci pourra affecter les caractéristiques de la malignité, y compris la prolifération des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases, mais aussi l'effet sur le phénotype du myofibroblaste dans la tumeur et la réponse immunitaire anti-tumorale. Cela peut atténuer la réaction tissulaire stromale entourant les tumeurs solides, permettant la pénétration accrue des molécules de chimiothérapie dans le noyau tumoral pour faciliter la destruction des cellules cancéreuses. Le composé peut également permettre de rompre cette barrière fibreuse construite par les fibroblastes et de permettre à nouveau un environnement immunocompétent, conduisant le système immunitaire à voir les cellules cancéreuses comme étrangères pour augmenter la mortalité de ces cellules chez les patients qui n'ont pas répondu à l'immunothérapie.

Procédures

induction après rasage : une injection sous cutanée dans le bas du dos (moins de 30 secondes), pesées et traitements par gavage (voie orale, 2 maximum par jour, moins de 10 secondes chacun), mesure de la tumeur 2 fois par semaine - 30 secondes / prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse profonde (à J7 pour 4 animaux par groupe et en final pour tous) 3 minutes - et de la tumeur après la mort.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à plusieurs types de contraintes engendrant du stress et douleur légère : injection de cellules tumorales en sous-cutané sous anesthesie gazeuse, traitements par voie orale grâce une sonde oesophagienne, injections intraperitonéales, contention pour la mesure de la tumeur et la pesée des souris.

Devenir

mise à mort pour prélevement de sang et de la tumeur.

Remplacement

Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur le développement tumoral afin de traiter in fine des tumeurs humaines. L'environnement tumoral qui va se développer va interagir avec plusieurs éléments de l'organisme. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs de Nox au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données ADME des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Différents tests statistiques nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les animaux seront monitorés quotidiennement (à chaque traitement) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont une espèce de choix pour l’étude de modèles cancéreux de par les nombreuses études déjà réalisées. Ce modèle de xénogreffe est très bien décrit dans la littérature. Les souris femelles seront utilisées car nous avons une expérience antérieure d’études in vivo sur ce modèle avec des souris femelles. Nous utiliserons des animaux de 8 à 10 semaines. Il est maintenant prouvé que les processus de fibrose sont réversibles dans le jeune âge et les biomarqueurs associés à la fibrose ont un turnover plus faible en vieillissant. Il n’y a pas nécessité d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par amputation de phalanges, subissent des prélèvements de sang à la veine temporale, des injections et des mesures de force musculaire, pour tester une thérapie génique et une thérapie pharmacologique contre une myopathie rare. Les souris des procédures thérapeutiques sont tuées pour l'analyse histologique des muscles, tandis que la lignée d'élevage est gardée vivante pour des projets ultérieurs. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "essentiel" et la souris "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui un tissu vivant.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares avec un fort impact sur la qualité et la durée de vie. Les CNM se caractérisent par une faiblesse des muscles volontaires (= muscles squelettiques). Les patients montrent des retards moteurs ou n’apprennent jamais à marcher, et ils ont des restrictions respiratoires. Notre projet vise à : -Comprendre les étapes du développement de la maladie afin d’identifier des biomarqueurs qui serviront à diagnostiquer cette maladie à un stade précoce à partir d’une simple prise de sang, et à évaluer l’efficacité d’un traitement en comparant la valeur de ces marqueurs avec des sujets sains. -Tester une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades). -Tester une approche thérapeutique pharmacologique en injectant des composés chimiques avant et après l’apparition des signes de la maladie pour évaluer leur potentiel d’anticiper et d’invertir la maladie. Suite aux injections des molécules et composés chimiques, nous évaluerons la force et la structure musculaire des souris afin de pouvoir quantifier l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir de nouvelles connaissances sur les voies cellulaires impliquées dans le développement des CNM, et ainsi permettre de valider des biomarqueurs circulants (= dans le sang) permettant l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. En outre, nous allons tester deux nouvelles approches thérapeutiques sur un modèle souris de CNM : une approche de thérapie génique et une approche de thérapie pharmacologique. Les résultats sont d’un grand intérêt médical et pourraient conduire à des essais cliniques dans l’objectif de traiter les patients CNM.

Procédures

Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) Identification de souris par amputation de phalanges - une fois entre 7 et 10 jours - durée 2 minutes. 2) Prélèvement sanguin à partir de la veine temporale - durée 2 minutes. 3) Injection de petites molécules - durée 2 minutes. 4) Injection de composés pharmacologiques - durée 2 minutes. 5) Mesures de force musculaire - durée 20 minutes

Impact sur les animaux

Les souris CNM présentent une faiblesse musculaire modérée sans impact majeur sur la qualité et la durée de vie. Les approches thérapeutiques par molécules ou composés pharmacologiques visent à augmenter la force musculaire des animaux. Il est néanmoins possible que les traitements aient des effets secondaires indésirables. L'identification, de même que les injections a visées thérapeutiques ou d'anesthésiants pour la mesure de force musculaire peuvent engendrer un stress ou une douleur temporaire chez l'animal.

Devenir

Procédure maintien de la lignée : les souris seront gardées pour des projets ultérieurs. Procédure thérapie génique et pharmacologique : les souris seront soumises à des test de force musculaire puis mis à mort pour des analyses histologiques des muscles.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les voies cellulaires impliquées dans le développement de la myopathie centronucléaire (CNM) et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction musculaire. Pour ces raisons, un modèle animal est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles cellulaires (qui ne reflètent pas un tissu vivant). Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Pour l’étude transcriptomique (étude des voies cellulaires), nous prévoyons d’utiliser 6 souris par groupe (souris malades et souris saines), et pour les approches thérapeutiques un nombre de 8 par groupe pour la thérapie génique et la thérapie pharmacologique. Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable, et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris lors des traitements par approche génique ou pharmacologie, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages ventilées et enrichies (barreaux à ronger, matériel de nidification), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement afin de détecter des signes des souffrance à l’aide d’une grille de suivi adaptée. Cette grille de score prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés, perte de poids …) : 2) Le comportement / la mobilité́ de l'animal (mobilité́, prostration, dos voûté, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière journalière sur toute souris traitée par approche thérapeutique et sur les souris CNM non traitées à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant dans le domaine des myopathies. Son système musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. La dissection des muscles pour les études transcriptomiques se fera à l’âge de 7 semaines afin de pouvoir analyser la régulation des gènes musculaires et de comparer les données avec d’autres résultats obtenus préalablement sur d’autres modèles souris de la maladie au même âge. Pour évaluer l’efficacité des approches thérapeutiques géniques (molécules) et pharmacologiques (composés chimiques), nous allons traiter les souris avant et après l’apparition des signes de la maladie, soit à 4 et à 8 semaines.

6620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des flavivirus neurotropes par injection, voie orale ou injection intracrânienne, subissent des biopsies de queue, des prises de sang et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'influence du fond génétique sur la sensibilité à l'infection. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, apathie et paralysie, et que les animaux sont tués parce qu'infectés par des pathogènes dangereux pour l'humain. Il affirme que ces phénomènes se développent à l'échelle de l'"organisme entier" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par les flavivirus neurotropes. En particulier, la survenue de formes sévères de la maladie et l’apparition de troubles neurologiques et comportementaux secondaires à l’infection restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par un flavivirus neurotrope ? 2. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par un flavivirus neurotrope ? 3. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de flavivirus ? 4. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 5. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier de nouveaux modèles de souris qui pourront être utiles pour étudier la physiopathologie des infections virales neuroinvasives ou pour le développement de mesures préventives et thérapeutiques. De plus, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection. La caractérisation poussée de l’infection par les flavivirus neurotropes dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser les connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement des infections virales neuroinvasives. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard de l’émergence ou la réémergence actuelle des flavivirus en Europe et dans le monde et des conséquences neurologiques dramatiques causées par ces infections.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par injection une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par administration orale dans la bouche à l’aide d’une seringue une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec flavivirus neurotrope par une injection intracraniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Des tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance).

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 4 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids faible et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur le virus Zika montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience avec le virus Zika. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. Certaines inoculations seront réalisées sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par les flavivirus neurotropes chez la souris. 2. La souris fait partie des espèces « réservoir » des virus de l’encéphalite à tiques. 3. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 4. La dangerosité des flavivirus neurotropes impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par les flavivirus neurotropes sur le développement post-natal du cerveau.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent 29 gavages sur 22 semaines, un régime riche en graisse, un produit irritant ajouté à l'eau de boisson pour accentuer une colite et plusieurs prélèvements sanguins, pour tester une association de bactéries, d'extraits de plante et d'activité physique censée réduire l'inflammation intestinale. Les retombées annoncées pour les patients atteints de la maladie de Crohn, une thérapie personnalisée modulant le microbiote, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de valider le cocktail à l'échelle d'un "organisme entier" et que l'ajout de l'activité physique impose de recourir à la souris.

Objectifs

Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, dans de nombreuses pathologies, certaines populations de bactéries ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Dans la maladie de Crohn, il a été observé une quantité anormale de bactéries aux propriétés adhérentes et invasives au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients. Une fois attachées à la muqueuse iléale, ces bactéries adhérentes et invasives peuvent traverser la muqueuse et déclencher ou aggraver l’inflammation intestinale. Chez l’animal, ces bactéries adhérentes et invasives sont capables d’aggraver une inflammation intestinale déjà existante et elles sont également capables de coloniser l’intestin et d’induire une inflammation intestinale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir définitivement la maladie de Crohn, les traitements actuels visent à contrôler les poussées inflammatoires sans cibler les causes de l’inflammation. Ce projet a pour but de tester l’efficacité d’une stratégie ciblant le microbiote, et plus précisément les bactéries adhérentes et invasives, afin de limiter leur présence et ainsi, diminuer une des origines de l’inflammation intestinale. Lors du projet, une combinaison de bactéries dites « bénéfiques » et d’extraits de plante, préalablement sélectionnée in vitro pour leurs propriétés à lutter contre les bactéries adhérentes et invasives, sera administrée à des souris, en plus d’une activité physique. L’efficacité de ce traitement à éliminer les bactéries agressives présentes dans le microbiote digestif des animaux et à restaurer un microbiote « sain » dans le but de diminuer les symptômes inflammatoires sera évaluée.

Bénéfices attendus

Les investigations chez l’animal permettront de compléter les résultats des analyses in vitro obtenus avec la combinaison bactéries/extraits de plante à l’échelle d’un organisme entier, en prenant en considération l’environnement du tractus digestif, le microbiote intestinal et le système immunitaire. A court terme, les bénéfices attendus de ce projet sont d'éliminer spécifiquement les bactéries adhérentes et invasives de l’intestin afin de diminuer les symptômes inflammatoires. Plus largement, le bénéfice attendu est de restaurer un microbiote intestinal global « sain » et ainsi, de protéger et renforcer la muqueuse intestinale. A moyen terme, ce projet permettra de comprendre l’importance de combiner ou non un traitement de type « probiotique » avec une activité physique. A plus long terme, cette investigation permettra de mieux prendre charge les patients atteints de maladie de Crohn en fonction de la composition de leur microbiote intestinal en leur proposant une thérapie personnalisée modulant le microbiote qui inclura une alimentation adaptée, une activité physique, et une prise de probiotiques et d’extraits de plante.

Procédures

-Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront par voie orale (gavage) 1/le cocktail de bactéries-extraits de plante (26 administrations réparties sur 6 semaines), les bactéries adhérentes et invasives (1 administration) et le traceur fluorescent pour suivre la perméabilité intestinale (2 administrations), soit 29 gavages/animal sur la totalité du protocole de 22 semaines. -Les animaux auront 2 prélèvements sanguins en cours de protocole (en semaines 18 et 21). Ce prélèvement sera réalisé sur animal endormi sous anesthésie gazeuse. Un dernier prélèvement sera réalisé sur animal anesthésié sans réveil. - Les propriétés contractiles (force maximale isométrique et puissance maximale concentrique) des muscles fléchisseurs plantaires seront évaluées une fois sous anesthésie à l’isoflurane. Les contractions musculaires seront évoquées électriquement à l’aide d’électrodes de surface (technique non invasive).

Impact sur les animaux

L’administration d’un régime alimentaire riche en graisse va induire une prise de poids accompagnée d’une légère inflammation intestinale. En fin de protocole, les animaux vont recevoir dans l’eau de boisson une faible dose d’un produit irritant qui peut accentuer les symptômes de colite. L'activité physique va permettre de diminuer la prise de poids des animaux placés sous régime riche en graisse. Le projet impose que les animaux soient placés un par cage, de réaliser des gestes de gavage et des prélèvements de fèces et de sang, ce qui peut induire un stress chez l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés lors de la procédures (72 animaux) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il est nécessaire de prélever un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques (signes de colite), des analyses de microbiote fécal, ou des paramètres inflammatoires déterminés suite à des dosages dans les fèces des animaux.

Remplacement

Avant de réaliser l’essai chez l’animal, le cocktail de bactéries/extraits de plante a été finement analysé in vitro, sur des modèles de cellules en culture (cellules épithéliales intestinales humaines et cellules immunitaires) afin de sélectionner la meilleure combinaison pour lutter contre les bactéries adhérentes et invasives retrouvées chez les patients atteints de maladie de Crohn. Cependant, il est nécessaire de valider l’efficacité de ce cocktail à l’échelle d’un organisme entier, afin de prendre en compte l’effet du passage digestif (pH acide de l’estomac, sels biliaires…) et la présence du système immunitaire et du microbiote intestinal. Mais surtout dans ce protocole, nous voulons savoir si l’activité physique peut augmenter l’effet bénéfique du cocktail, ce qui impose de passer chez l’animal.

Réduction

-Le nombre d'animaux a été réduit dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le nombre de 8 animaux/lot devrait permettre de réaliser des tests statistiques adaptés d’après l’ensemble des données animales antérieures. -Le fait de réaliser la procédure en 2 temps permet d’intégrer un ‘go/no go’ dans la procédure : le protocole sera mené sur 24 des 72 animaux avec des lots justement pensés, permettant de juger si le modèle reflète suffisamment les symptômes de la maladie de Crohn (inflammation intestinale de bas grade et déséquilibre du microbiote intestinale). Si celui-ci est le reflet de la maladie, alors l’étude sera poursuivie sur le second groupe d’animaux. -Les études antérieures ont montré que le nombre de bactéries adhérentes et invasives dans les fèces des animaux était le reflet du nombre de bactéries associées à la muqueuse. Cette mesure permet de réaliser un suivi de colonisation en fonction du temps de façon non invasive et sans douleur pour l’animal. La quantification des bactéries dans les fèces en fonction du temps permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux auront libre accès à l'eau et la nourriture. Les animaux seront disposés dans des cages de 1500 cm² en IVC (individually ventilated cages) afin de pouvoir y placer une roue d’activité connectée. L’environnement sera donc enrichi avec plusieurs types d’enrichissements : lamelles de cartons compressées et maisonnettes ou tremplins avec abris. Lors de la phase 2 du projet, les lots sédentaires seront placés sur un portoir à distance des groupes avec activité physique afin de diminuer les potentiels effets délétères du bruit que peuvent produire les roues. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement à base de buprénorphine (0,05mg/kg en sous-cutanée) pour réduire leur douleur. Des critères d’arrêt ont été déterminés. Si un animal rempli ces 3 critères lors du protocole (points limites) : 1/perte de poids corporel > à 15% par rapport au début de l’étude 2/modification de l’activité (hypoactivité importante ou prostration ou spasmes abdominaux ou réticence à se déplacer) ou de la posture (dos vouté, décubitus ventral ou latéral) ou de la respiration (pénible ou rapide avec effort) 3/signes cliniques d’inflammation intestinale (arrière train ou anus souillés avec diarrhée et/ou présence de sang dans les fèces ou au niveau de l’anus) -->il sera immédiatement sorti du protocole, anesthésié à l’isoflurane (2,5%) et mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris C57BL/6 qui est un modèle employé régulièrement pour étudier l’activité physique spontanée sur roue. C’est également un modèle de choix pour la réalisation d’un modèle de colite induite par un produit chimique placé dans l’eau de boisson. L’ensemble des souris utilisées lors de ce projet seront utilisées au stade de jeune adulte, (6-8 semaines) reflétant le pic d’incidence de la maladie de Crohn (15-30 ans).