Souris

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection pour éteindre un gène, puis des injections destinées à marquer les cellules, y compris des souriceaux nouveau-nés gavés tous les deux jours. Le porteur indique que ces manipulations peuvent entraîner une perte ou une prise de poids, une diarrhée et une déshydratation. Il relève de la recherche fondamentale sur la membrane basale de l'intestin, utilise des organoïdes "dans la mesure du possible" mais affirme qu'ils ne reproduisent pas cette membrane.

Objectifs

L'épithélium intestinal est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile de la lumière intestinale. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours chez la souris. L'épithélium recouvre les villosités, des protubérances en forme de doigts qui s'avancent dans la lumière de l'intestin, et les cryptes, des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif de l’épithélium. Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire, les grands changements morphologiques tel que l'invagination des cryptes, ne se produisent que pendant la période postnatale. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM). Elle est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un support structural à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient le sens des cellules. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme, elle change tout au long de la vie et de la maladie. Le rôle que joue la composition de la membrane basale dans le comportement des cellules épithéliales reste inexploré. Les cellules épithéliales intestinales présentent un cycle de vie étroitement régulé. Les cellules souches se divisent dans les cryptes et se différencient en cellules sécrétrices et absorbantes à la sortie des cryptes. Les cellules migrent ensuite activement vers l'extrémité de la villosité, où elles meurent après s'être détachées de la BM. Nous ne savons pas ce qui détermine les limites des cellules en division dans la crypte, limite la perte des cellules à l'extrémité de la villosité, caractérise les signaux qui guident la migration des cellules et déclenche le commencement de la migration cellulaire au cours de la vie de l'animal. Dans ce projet, nous visons à évaluer le rôle de certaines des protéines qui composent la membrane basale sur le comportement des cellules pendant le développement postnatal et la vie adulte.

Bénéfices attendus

Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général et de la Laminine 5 en particulier dans la régulation de l'homéostasie intestinale peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.

Procédures

Dans la première procédure, l’élimination ciblée du gène d’intérêt sera générée par l’administration de tamoxifène par gavage oral ou par injection IP. Pour la suppression complète, le tamoxifène sera administré une fois par jour pendant 5 jours consécutifs à des souris adultes. Pour l’élimination à long terme des gènes de la membrane basale, nous mettrons également en œuvre un régime d’administration à long terme de tamoxifène à l’aide d’aliments contenant du tamoxifène. La nourriture tamoxifène remplacera la nourriture normale pendant 4 à 12 semaines. Jusqu’à 54 heures avant la mise à mort de l’animal, les souris seront injectées une fois avec un produit non irritant ni toxique pour marquer les cellules proliférantes et suivre leur migration vers le haut des villosités. 2 heures avant de mettre à mort l’animal, les souris seront injectées une fois (selon la première injection) pour marquer les cellules proliférantes. Dans la deuxième procédure, des expériences similaires seront réalisées sur des souris néonatales. Les animaux seront gavés 2 à 3 fois toutes les 48h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection ou gêne de courte durée dans la gorge lors des gavages. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L'intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphatiques, neurones, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L'objectif principal de ce projet étant d'identifier la régulation de la membrane basale sur l'homéostasie et le développement de l'intestin, la réduction du système in vitro pourrait nous empêcher d'identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l'intestin. Nous utiliserons des organoïdes dans la mesure du possible, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n'existe aucun moyen de reproduire la membrane basale in vitro, mais seulement certains de ses composants de base. Pour l'utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d'organoïdes provenant des mêmes souris mutantes et de type sauvage pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour optimiser le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajustés au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de déterminer les conditions expérimentales optimales. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d'animaux de tous les génotypes d’intérêt. Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris, comme le suivi de la prolifération, de la migration. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Il n’y a pas besoin d’analgésique ou d’anesthésiant puisque l’administration de tamoxifène se fera par voie orale avec l’aide d’une canule souple en plastique non traumatisante. Pour les injections intrapéritonéale, une administration d’analgésique ou d’anesthésiant reviendrait à faire subir l’injection 2 fois. Aucun change de cage ne sera effectué la première semaine après la naissance afin de limiter le stress. De plus, la mère sera manipulée à chaque fois avant les souriceaux, afin d’y incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon par la mère. La bonne prise en charge des souriceaux par la mère sera vérifiée Les procédures décrites ont un faible impact sur le bien-être des animaux. Néanmoins, comme il s'agit d'un nouveau modèle génétique pour l'ablation de gènes, nous ne pouvons pas déterminer si l'ablation du gène entraînera un phénotype nocif. Par conséquent, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant l'administration du tamoxifène. Pour l'effet à long terme, les animaux seront surveillés tous les 3-4 jours. Leurs poids, ainsi que leur comportement général et leur apparence seront notés et les signes d'inconfort selon la grille de score seront évalués. Si des signes de douleur sont identifiés, l'animal sera mis à mort dans les 24 heures.

Choix des espèces

Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen intéressant reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l'Homme, tant au niveau génétique qu'au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l'organe, font qu'il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l'Homme. En outre, la disponibilité d'une variété d'outils génétiques, ainsi qu'un assemblage complet et annoté du génome, de même qu'une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet. Une petite cohorte de 5 animaux nouveau-nés de chaque groupe d'âge : P2, P7, P14, P21 sera utilisée pour tester le rôle de la membrane basale sur le développment de l’intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change considérablement, et nous aimerions tester l’implication de la membrane basale dans ces changements. Pour tester l'effet de la perte de Lama3 pendant l'homéostasie, nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 4 mois. À cet âge, le système intestinal est considéré comme mature et sa fonction est connue, ce qui constitue une bonne base de comparaison lorsque nous modifions la composition de la membrane basale.

5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie, une auto-administration de cocaïne et des injections de cocaïne ou de yohimbine, avant des tests comportementaux de rechute. Le porteur indique que la cocaïne peut provoquer une perte de poids et une hyperactivité transitoires, et que la yohimbine reproduit chez la souris des effets observés chez l'humain. Il vise à établir le rôle des neurones de l'insula portant les récepteurs à la progestérone, et renvoie au long terme les retombées thérapeutiques annoncées contre la rechute à la cocaïne.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les récepteurs à la progestérone sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones de l’insula qui expreiment les récepteurs à la progéstérone est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.

Procédures

Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal quotidien. Les échantillons seront collectés à l'aide d’un coton-tige stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Toutes les procédures chirurgicales, seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.

Impact sur les animaux

La prise de cocaïne peut engendrer plusieurs nuisances expérimentales : 1) une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial 2) une hyperactivité qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme : l'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire. Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.

Raffinement

La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.

Choix des espèces

Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous la peau des fragments de tumeurs pancréatiques de patients, une série de 750 d'entre elles étant traitée par cinq molécules de chimiothérapie avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare des tumeurs de patients à survie courte et longue pour chercher des cibles et des marqueurs prédictifs, les tumeurs pouvant provoquer inconfort et ulcérations. Le porteur affirme que les souris immunodéficientes forment un modèle "qui ne peut être remplacé" pour conserver les caractéristiques des tumeurs humaines.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ACP) est l’un des cancers les plus graves. Avec plus de 12000 décès par an en France qui lui sont imputés, il pose un problème majeur de santé publique. En dépit des importants efforts de recherche consentis au cours des dix dernières années, les traitements conventionnels n’ont qu’un impact limité. La chirurgie reste la seule stratégie potentiellement curative, mais seuls 20% des patients peuvent en bénéficier car la plupart du temps, au moment du diagnostic, ce cancer est déjà à un stade très avancé, la médiane de survie de ces patients restant inférieure à 6 mois et la survie à 5 ans inférieure à 3%. Pratiquement tous les patients souffrant d’un ACP développent des métastases (cellules cancéreuses qui ont migrées dans d’autres organes) et décèdent des conséquences dévastatrices de leur développement. Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteints d’ACP survivent longtemps ; de plus nous manquons de nouvelles molécules thérapeutiques capables de s’attaquer spécifiquement aux cellules cancéreuses pancréatiques en épargnant autant que possible les cellules non cancéreuses. De nombreux travaux de recherche ont montré que les tumeurs pancréatiques sont très hétérogènes d’un patient à un autre et que cette hétérogénéité est associée au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Nous avons donc émis l’hypothèse que les tumeurs des patients de courtes ou de longues survies présentent des mécanismes et des caractéristiques moléculaires différentes entre elles, ce qui nous a déjà permis, dans des travaux antérieurs, d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la survie des patients. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes survies et celles des patients de longues survies associées ou non à des protocoles de chimiothérapies, puis de les comparer entre elles ceci dans le but de mieux comprendre la biologie de l’ACP, de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques à chaque groupe de patients et d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la réponse aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteint d'ACP survivent longtemps. Notre projet a donc pour objectif de comparer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes et longues survies obtenues par des analyses biologiques et moléculaires, lesquelles sont associées au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc l'identification de nouveaux mécanismes moléculaires activés par la cellule tumorale permettant ainsi le développement de nouvelles molécules thérapeutiques, de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la résistance / sensibilité aux chimiothérapies et/ou de permettre un diagnostic précoce des patients. Il nous permettra ainsi de mieux comprendre la biologie du cancer pancréatique ainsi que les raisons de son pronostic sombre et de la réponse limitée des patients aux différents traitements.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, 3 procédures seront réalisées : Pour les procédures 1 et 2 les tumeurs seront découpées en petits morceaux et injectées sous anesthésie chez la souris en sous-cutanée entre les omoplates avec une aiguille. Une fois que la tumeur aura atteint le volume souhaité, la souris sera mise à mort puis la tumeur sera prélevée pour réaliser les différents analyses biologiques. Une 3ème procédure nous permettra de déterminer l’efficacité anti-tumorale des différentes chimiothérapies actuellement utilisées en clinique sur les xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients, puis d’identifier des signatures moléculaires prédictives de la sensibilité aux traitements, recherchées sur les tumeurs prélevées. Une série de souris porteuses d’une xénogreffe de tumeur pancréatique de patient établit selon la procédure n°2, sera traitée avec 5 molécules thérapeutiques différentes composées de 3 injections maximum par souris par traitement. Les souris témoins recevront une solution de sérum physiologique. Les animaux seront pesés avant injection et les tumeurs mesurées au pied à coulisse (instrument de mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs faites en sous cutanée entre les omoplates sous anesthésie ; le développement de tumeurs sous-cutanées qui peuvent générer éventuellement un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes lors de notre vigilance quotidienne ; les injections de molécules chimiothérapeutiques qui peuvent générer une douleur, ces traitements peuvent être la source de différentes nuisances telles que la diminution du poids, l’absence d’activité bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes ; la contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections ou les mesures des volumes tumoraux ou les manipulations de l’animal pour prise de poids corporel ou l’anesthésie peuvent être un facteur de stress éventuel.

Devenir

L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort sous anesthésie afin de prélever les tumeurs qui serviront (1) à maintenir la bio-banque de tumeurs pancréatiques et à extraire le matériel biologique (ADN, ARN, protéines, …) de chaque tumeurs de patients pour des analyses moléculaires ultérieures, (2), à réaliser des coupes histologiques des tumeurs (anatomo-pathologie) afin d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques prédictifs de la résistance / sensibilité aux chimiothérapies.

Remplacement

Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation des souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale, est justifiée et ne peut être remplacée car elles permettent d’une part la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques dérivées de patients et éviter les phénomènes de rejets et d’autre part le maintien des caractéristiques moléculaires de la tumeur originelle du patient ; ces caractéristiques seront nécessaires pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques et thérapeutiques et de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la sensibilité aux différentes chimiothérapies spécifiques selon le profil « tumoral du patient ». Cependant, dans un souci de remplacement, les marqueurs biologiques qui seront identifiés et les informations de sensibilité /résistance aux chimiothérapies qui seront obtenues dans ce projet, auront pour avantage dans le futur de diminuer fortement l’utilisation d’animaux, en particulier en testant directement les marqueurs biologiques prédictifs de l’efficacité des traitements sur les tumeurs du patients. De plus, ce projet va nous permettre de cultiver les cellules tumorales pancréatiques de chaque tumeur de patients en 2 et 3 dimensions pour réaliser des études in vitro et ex vivo ce qui nous évitera l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Réduction

Concernant les procédures 1 et 2, le nombre de souris nécessaires est fondé sur une estimation maximale du nombre de xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients à implanter et à la quantité de matériels biologiques nécessaires pour réaliser les différentes analyses moléculaires et biologique. Pour la procédure 3, nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 750 animaux. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de puissance. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons aussi mis au point un système de congélation de tissu qui nous permet de congeler les xénogreffes de tumeurs pancréatiques pour les conserver en "dormance" dans l'azote liquide. Ce système permet de conserver des tissus vivants pour des études futurs en dehors de la souris et limitera considérablement l'utilisation des animaux.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement ; les litières sont changées toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les souris sont endormies sous anesthésie pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs état le nécessite.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d'une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des xénogreffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules chimiothérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu coûteuse, ce qui en fait un modèle expérimental de choix pour notre projet. Les souris seront reçues à 4 semaines. Cela permettra aux animaux de récupérer du stress engendré par le transport et de s'adapter à leur nouvel environnement. Nous les laissons s'habituer et s'adapter pendant 1 à 2 semaines avant de commencer les expérimentations. De plus, cela nous permettra de travailler chez le jeune adulte et de garder nos animaux sur une durée plus longue, certaines tumeurs mettent plusieurs semaines avant d’atteindre une taille compatible avec les besoins en matériels biologiques nécessaires à nos projets.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles subissent des chirurgies abdominales pour implanter des tumeurs du côlon ou du pancréas, parfois une ablation de la rate, puis une seconde chirurgie de résection guidée par fluorescence, avec risque de douleur, de perte de poids et d'infection. Le projet fait la preuve de concept d'anticorps couplés à une sonde pour mieux repérer et retirer les tumeurs pendant l'opération. Le porteur affirme que cette démonstration ne peut se faire que sur des animaux porteurs de ces tumeurs, les tests in vitro ayant déjà été réalisés.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation des structures anatomiques en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant une imagerie pré-opératoire par imagerie nucléaire (SPECT) pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (radionucléide/fluorescence) afin d'améliorer la stadification pré-opératoire (SPECT), la détection per-opératoire des tumeurs et leur résection (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). Nous avons déjà montré dans des modèles de tumeurs sous-cutanées que ces Ac bimodaux étaient visualisables par imagerie in vivo (SPECT et fluorescence) et qu’ils nous permettaient de réaliser de la FGS. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant utiliser des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles orthotopiques de cancer du côlon et du pancréas, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objectif est d’optimiser la résection tumorale par l’utilisation de chirurgie assistée par fluorescence après injection de ces Acs bimodaux et de démontrer l’absence de reprise tumorale suite à l’acte chirurgicale. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet ce déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir faire la preuve de concept de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence à l’aide d’Ac bimodaux afin d’éliminer les tumeurs primaires ou disséminées. Ce projet nécessite donc la mise au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs orthotopiques mimant des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques ou pancréatiques (modèles orthotopiques) et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans le pancréas, la réalisation d’une splénectomie ou encore la ligature d’un morceau de tumeur sur le caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (3 fois par semaine) et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection I.P. de luciférine. Les séances d’imagerie courte étant réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, cet acte n’induira pas de stress supplémentaires aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris étant immunodéprimées, elles seront hébergées sous couvercle filtrant et une antibiothérapie préventive sera utilisée avant chaque chirurgie. La totalité des procédures chirurgicales impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse, imagerie, chirurgie abdominale) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (cellules pour le modèle de carcinomatose péritonéale et luciférine) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines (HCT116-luc et PANC-1-luc). Ces souris ont déjà été utilisées lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines xénogreffées. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont rendues hypothyroïdiennes par un régime pauvre en iode, leurs portées adoptées par d'autres mères, puis les descendants sont exposés cinq jours à 4 °C ou soumis à un régime obésogène avec des tests de glycémie par incisions répétées de la queue. Le porteur indique qu'un échec d'adoption expose les nouveau-nés à la dénutrition et à l'hypothermie, et que l'exposition au froid comme l'obésité font perdre du poids. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude de la communication mère-petits à l'échelle de "l'organisme entier".

Objectifs

Chez l’homme comme chez la souris, les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense d’énergie. Les hormones thyroïdiennes agissent en particulier dans le tissu adipeux brun. Ce dernier est spécialisé dans la dissipation d’énergie et la production de chaleur. Chez la souris lors d’une exposition au froid mais aussi en réponse à un régime riche en graisse ce tissu est activé ce qui permet respectivement le maintien de la température corporelle et de limiter la prise de poids. Outre cet effet stimulateur de la dépense d’énergie chez l’adulte, les hormones thyroïdiennes sont présentes en forte concentration durant la période périnatale, pendant laquelles elles contrôlent le développement de nombreux organes, dont celui du tissu adipeux brun. La grossesse entraîne très fréquemment une baisse des concentrations sanguines d’hormones (hypothyroïdie). Si cette dernière est corrigée dans de nombreux pays, elle ne l’est pas en général dans les pays en voie de développement. La mère, mais aussi le fœtus/nouveau né, se retrouvent alors en hypothyroidie. Dans ce projet nous étudierons si une hypothyroïdie limitée à la période de développement du tissu adipeux brun chez l’embryon/nouveau né, impacte la capacité de ce tissu à produire de la chaleur lors d’une exposition au froid ou à un régime obésogène à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Les périodes fœtale et postnatale sont critiques pour déterminer les capacités métaboliques de l’adulte que ce soit chez l’homme mais aussi chez la souris. Les concentrations d’hormones thyroïdiennes sont fortement régulées pendant ces deux périodes et sont très importantes pour le développement de nombreux organes. Nous établirons ici si une hypothyroïdie précoce entraine une prédisposition à développer des anomalies métaboliques chez l’adulte. Si tel est le cas, une meilleure maîtrise de la concentration des hormones chez la mère et/ou le nouveau né permettrait non seulement de limiter les problèmes développementaux mais aussi d’assurer un équilibre métabolique chez l’adulte. Ceci est particulièrement important dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité et d’hypothyroïdie fœtale et postnatale mal contrôlées dans de nombreux pays.

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans une première expérience des femelles gestantes seront nourries pendant la gestation avec de la nourriture pauvre en iode contenant une molécule bloquant la production d’hormone thyroïdienne entraînant une « hypothyroïdie ». D’autres auront un régime contrôle. A la naissance, les portées des mères hypothyroïdiennes sont données à adopter à des mères normales et vice versa. Les mères hypothyroïdiennes sont maintenues sous leur régime spécial jusque 15 jrs après la naissance. Ensuite tous les animaux reçoivent un aliment normal jusqu’à leurs 2 mois. Ils sont alors injectés sous la peau (1 fois, 15s) pour introduire sous anesthésie gazeuse (1 fois, 5 mn) une puce éléctronique qui permettra de monitorer la température corporelle. Après 5 jrs de récupération, une partie des animaux est gardée à 23°C, l’autre hébergée pendant 5 jrs à 4°C. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal Dans une deuxième expérience des femelles gestantes seront nourries pendant la gestation avec de la nourriture pauvre en iode contenant une molécule bloquant la production d’hormone thyroïdienne entraînant une « hypothyroïdie ». D’autres recevront un régime contrôle. A la naissance, les portées des mères hypothyroïdiennes sont données à adopter à des mères normales et vice versa. Les mères hypothyroïdiennes sont maintenues sous leur régime spécial jusque 15 jrs après la naissance. Ensuite tous animaux reçoivent un aliment normal jusqu’à leurs 2 mois. Pour certains des animaux, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène pour 2 mois. Avant changement et à l’issue de ces 2 mois, toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. injections en sous-cutanée sont réalisées à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang final

Impact sur les animaux

Après sevrage les mâles issus d’une même portée doivent être répartis dans les différents groupes expérimentaux (température ou nourriture), certains peuvent être isolés pendant une partie des expériences. En cas d’échec d’adoption les petits risquent d’être dénutris et en hypothermie Légères douleurs liées à différents types d’injection dans l’abdomen (glucose, insuline, anesthésique) ou au gavage Légères douleurs liées à la présente de la puce implantée sous la peau L’hypothyroïdie chez le nouveau né, et l’exposition au froid chez l’adulte peut entrainer une perte de poids Les prélèvements à la queue dans les tests de réponse au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur légère. Sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de réponse à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre la mère et ses petits, différents organes et des effets au cours du temps. Les mécanismes sont complexes et doivent être envisagés à l'échelle de l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 8 animaux par condition expérimentale sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. De plus les points limites peuvent être atteints pour quelques animaux durant les expériences ce qui entraînent leur retrait de la procédure. Nous utiliserons donc 10 animaux par groupe pour prendre en compte ce risque. Nous ne répéterons pas les expériences si nous n’avons pas besoin de matériel supplémentaire. D’autre part, toutes les femelles gestantes que nous utilisons pour obtenir des petits ayant été exposés à une hypothyroïdie précoce ne seront pas commandées en même temps. Dès que le nombre de petits sera suffisant, les commandes seront arrêtées

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement supplémentaire dans leur cage. Nous veillerons au bien être et à la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids lorsque les animaux sont hébergés à 4°C, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois, voire trois fois par jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors de l’implantation de puces électroniques sous la peau et lors des prélèvements sanguins avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes contrôlent le développement de nombreux organes et stimulent la dépense énergétique chez l’adulte. La souris est aussi le modèle le plus utilisé de nos jours pour le genre d’études que nous proposons (adoptions, effet du développement sur la physiologie de l’adulte) ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous nous intéressons aux conséquences d’une hypothyroïdie précoce sur la capacité au maintien de la température et sur la prédisposion à l’obésité chez l’adulte. Nous travaillerons donc avec des femelles gestantes et étudierons leurs descendants jusqu’à l’âge de 2 ou 4 mois selon les expériences.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse une dose unique de candidats anticancéreux, subissent des prélèvements de sang répétés à la queue, puis un prélèvement terminal de grand volume par ponction cardiaque sous anesthésie "pouvant induire un arrêt cardiaque", les effets indésirables attendus allant de la perte d'appétit à la diarrhée. Le porteur précise que les souris écartées du protocole, trop légères ou mal injectées, servent d'abord à s'entraîner aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est "nécessaire" pour ces analyses de tolérance.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

# Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins(en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement). # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de cheveux…), pouvant aller jusqu'à l'atteinte des critères ethiques. Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

L’ensemble des animaux entrés en procédure seront euthanasié : - Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. - Les animaux ayant atteint les critères éthiques et dont l’état ne permet pas de pratiquer ce prélèvement de grand volume , seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. - Les souris non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g...), seront reformées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme.. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous anesthésie un tatouage puis des injections intradermiques de mélanocytes humains, avant un suivi photographique de la pigmentation puis leur mise à mort à deux et quatre semaines pour prélever la peau. Cette étude pilote vise seulement à fixer le nombre de cellules à injecter en vue de futurs essais sur un modèle de vitiligo, maladie décrite comme "bénigne" mais lourde psychologiquement. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable" car aucun modèle in vitro ne suivrait la fonctionnalité des mélanocytes dans le temps.

Objectifs

Les objectifs de ce projet constituant une étude pilote, sont d’évaluer in vivo chez la souris l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps suite à l’injection intradermique de différentes quantités de cellules responsables de la pigmentation cutanée appelées mélanocytes. Il s’agit d’un nouveau produit de thérapie innovante en cours de développement qui utilise des mélanocytes obtenus par différenciation de cellules souches humaines. Ce nouveau produit permettrait de repigmenter des zones cutanées dans le cadre d’une maladie appelée vitiligo au cours de laquelle des taches blanches, parfois des poils blancs, apparaissent sur la peau. Pour effectuer l’évaluation de ce nouveau produit de thérapie innovante, une suspension de mélanocytes à différentes concentrations, sera injectée en différents points dans une zone préalablement délimitée par tatouage sur des souris immunodéficientes, c’est à dire dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Un suivi de la pigmentation cutanée sera effectué de façon hebdomadaire à l’aide d'une caméra. Des prélèvements des sites d’injection des mélanocytes seront effectués à 2 temps différents mais relativement précoces après injection des mélanocytes humains afin de réaliser des analyses qui permettront de caractériser la présence et la fonctionnalité des mélanocytes. Cela permettra notamment de définir le nombre de mélanocytes à injecter dans le cadre d’études d’efficacité futures sur un modèle de vitiligo.

Bénéfices attendus

Le vitiligo est une maladie auto-immune, liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, au cours de laquelle des taches blanches (parfois des poils blancs) apparaissent sur la peau. Elle concerne 0,5 à 1,0 % de la population mondiale selon des données de 2017. Ces dépigmentations peuvent survenir à n’importe quel moment de la vie, n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien qu’il soit considéré comme une maladie bénigne, le vitiligo n’est pas anodin : il a des répercussions psychologiques importantes qui peuvent altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent (dépression, angoisse, isolement…). Des traitements existent, à base de crèmes, en association ou non avec un traitement par la lumière (photothérapie), traitements par voie orale ou sous-cutanée, mais la repigmentation est un phénomène long, 6 à 24 mois de traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants, avec des effets secondaires plus ou moins importants, et une récidive dans 40 à 50% des cas. La greffe de mélanocytes provenant du patient lui-même est une solution mais elle nécessite de prélever de la peau dans une zone pigmentée, engendrant la création de cicatrices pouvant elles-mêmes être peu ou pas pigmentées. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter et de repigmenter plus rapidement les zones atteintes de dépigmentation, d’en évaluer la fonctionnalité et la stabilité au cours du temps par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie de personnes atteintes de vitiligo.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront tout d’abord soumises à un tatouage de 4 points effectués sur le dos en arrière des omoplates, sous anesthésie générale, réalisés en 10 minutes environ. Une semaine plus tard, les 24 souris seront soumises chacune à 4 injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, à l’intérieur de la région délimitée par les 4 points de tatouage. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Pour chaque souris, les sites d’injection seront observés et photographiés chaque semaine afin de suivre l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps. Ces observations et photographies seront effectuées sous anesthésie générale, en 5 à 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

La douleur induite lors de la réalisation des points de tatouage puis des injections intradermiques des mélanocytes sera très limitée du fait de leur exécution sous anesthésie générale en un temps relativement court (moins de 10 minutes). Le suivi de l’évolution de la pigmentation cutanée effectué de façon hebdomadaire au cours de l’étude, nécessitant la mise sous anesthésie générale afin de positionner correctement la caméra au niveau de la région délimitée par les 4 points de tatouage, n’engendrera pas de douleur et sera réalisé en un temps très court (5 à 10 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Les 24 souris seront euthanasiées pour moitié 2 semaines après injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, et pour l’autre moitié au bout de 4 semaines, avec 3 souris de chacun des 4 groupes expérimentaux par temps de prélèvement, par injection d’une surdose d’euthanasique sous anesthésie générale profonde. Un prélèvement sera effectué au large des sites d’injections pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité des cellules injectées au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de mélanocytes injectés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané et réaction immunitaire). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet constituant une étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. La réalisation de 4 sites d’injection intradermique par souris permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires mais de fournir suffisamment d’échantillons par temps de mesure pour la réalisation des analyses envisagées. Une analyse statistique sera réalisée à partir des résultats des analyses effectuées.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des points de tatouage, des injections intradermiques et des prises de photos hebdomadaires avec la caméra, effectuées sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection des sites d’injection ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 2 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm équipées d’un couvercle filtrant dans une animalerie dédiée au souris immunodéficientes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des bâtonnets d’ouate étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière. De la nourriture irradiée et de l’eau filtrée seront mises à disposition pour chaque cage.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation d’injections intradermiques. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes, très peu pigmentées, permettra d’éviter le rejet des mélanocytes humains injectés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines), l’injection intradermique de mélanocytes humains étant considérée comme une greffe cutanée.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie pour induire une tumeur du foie, des injections d'un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des mesures de tumeur par imagerie, la tumeur pouvant provoquer gêne et douleurs. Le projet cherche à confirmer qu'un anticorps déjà développé freine le cancer du foie et l'associe à des immunothérapies existantes. Le porteur affirme qu'une "validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier" reste nécessaire avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 20 minutes. Une fois par semaine, les animaux recevront une injection d’un composé permettant de mesurer la taille des tumeurs sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Puis les animaux seront anesthésiés afin de réaliser la mesure, qui dure au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps par le biais d'une étude pilote sur une petite cohorte d'animaux afin de choisir la dose la plus éfficace. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton et de la frisure de kraft pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte à partir de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.