Souris
Evaluation de l’efficacité d’un candidat médicament, le masitinib dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de son impact sur la réponse inflammatoire à l’aide d’un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 189 étant classées en souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par trois injections pour reproduire une paralysie progressive des muscles proche de la sclérose latérale amyotrophique, avec administration orale de masitinib jusqu'à 42 jours et tests moteurs hebdomadaires de force, coordination et endurance. Le porteur décrit un déficit moteur menant à des paralysies chroniques et une perte de poids, et indique qu'aucun animal ne pourra être réutilisé du fait de ces signes irréversibles. Il présente l'évaluation du masitinib comme "critique et nécessaire" pour renseigner les agences réglementaires et affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire qui conduit généralement au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par un déficit moteur puis une paralysie progressive des muscles (incapacité à marcher, manger, parler, respirer). Cette paralysie est dû à la mort progresse des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière. La SLA est la plus fréquente des maladies du neurone moteur (2.7 cas/an pour 100 000 habitants en France). Il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. Un seul traitement est approuvé en Europe, le Riluzole (Zentiva) qui ralenti modestement l’évolution fatidique de la maladie. Le besoin médical est donc urgent et critique. Le masitinib est une molécule qui un effet protecteur des neurones dans le système nerveux central et périphérique. Il actuellement est en dernière phase de développement clinique pour la SLA et la sclérose en plaque (SEP). Cette molécule a reçu la désignation de médicament orphelin dans la SLA à la fois de l’Agence Européenne du Médicament (EMA) et de la Food and Drug Administration américaine (FDA). En 2023, la FDA a validé une molécule appelée neurofilament comme marquer de l’efficacité d’un candidat médicament pour les maladies du système nerveux. Le but de ce projet est d’étudier l’impact du masitinib sur la libération de ces marqueurs comme le demande la FDA. De plus, la mise en perspective des signes cliniques et des analyses biomoléculaires effectués sur les prélèvements de sang permettra également de comprendre les mécanismes biologiques conduisant à la maladie. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la SLA, SEP, la maladie de Huntington (HD),…. L’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques : déficit moteur lié à la mort progressive des cellules nerveuses - Les mécanismes biologiques impliqués (comme l’inflammation) qui conduisent à la mort des motoneurones - Les marqueurs de la maladie tels que les neurofilaments demandés par les agences règlementaires.
Bénéfices attendus
Le masitinib est actuellement à la fin de sa phase de développement clinique dans plusieurs pathologies neurodégénératives dont la SLA, la SEP et la maladie d’Alzheimer. Il a d’ores et déjà reçu la désignation de médicament orphelin pour la SLA à la fois de l’EMA et de la FDA. En 2023, la FDA a validé l’application d’une molécule appelée neurofilament comme marqueurs des pathologies neuro-dégénératives. Ce marqueur est un point de terminaison nécessaire aux développements d’un candidat médicament. Il est donc aujourd’hui critique et nécessaire d’évaluer l’impact des nouvelles thérapies, dont le masitinib, sur le taux de neurofilament dans des modèles précliniques dédié à la SEP et la SLA. Les résultats de ce projet permettront donc de renseigner les agences réglementaires et ainsi d’accélérer la mise à disposition du masitinib aux patients, avant même l’achèvement des études cliniques en cours. Le masitinib pourrait ainsi devenir la première molécule thérapeutique dans le traitement de la SLA. Par ailleurs, la mise en perspective des modifications des signes cliniques avec les analyses biologiques des échantillons de sang permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule et potentiellement d’étendre son utilisation à d’autres pathologies (Parkinson et Huntington) qui partagent les mêmes marqueurs et certains mécanismes biologiques.
Procédures
Le modèle utilisé consiste à induire les signes cliniques en stimulant le système immunitaire. L’induction de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est effectuée en 3 injections : 1 injection en sous-cutanée et 2 injections en intrapéritonéale. Pour étudier l’action neuro-protectrice du masitinib, la molécule sera administrée par voie orale 1 fois par jour pendant au maximum 42 jours. Tout au long de la période expérimentale, les souris feront l’objet d’un suivi très étroit : - observations quotidiennes. - Enregistrement du poids et les observations cliniques au minimum 3 fois/semaine - Evaluation des capacités motrices (force, coordination, endurance) 1 fois par semaine Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au modèle EAE et les signes cliniques associés: - L’induction se fait par une injection d’un produit qui peut être irritant. En effet, le produit injecté induit une réaction inflammatoire désiré sur le même principe que la vaccination. Cette réaction peut générer une douleur modérée et transitoire (
Devenir
Le modèle d’EAE utilisé reproduit chez l’animal les signes cliniques de la SLA. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé en raison de ces signes sévères, irréversibles et inévitables. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le masitinib est actuellement en phase final de développement clinique et a donc été caractérisé de manière très précise par des études préalables. Pourtant, aucune de ces études vitro ou ex-vivo n’a pu permettre d’étudier les liens entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. En effet, les maladies neurodégénératives comme la SLA sont des maladies multifactorielles et complexes. Ces maladies ne peuvent être réduites à une simple mutation ou à un simple mécanisme dans des cellules isolées. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Analyser les paramètres biologiques tels que la réponse immunitaire, l’accès de la molécule au cerveau, l’évolution des marqueurs au cours du traitement comme le demande les agences règlementaires (FDA). •Valider l’effet du médicament sur les signes cliniques et donc confirmer le mécanisme d’action à l’échelle moléculaire.
Réduction
Le candidat médicament testé est le masitinib qui est actuellement en phase final de développement clinique. La toxicité de la molécule et les schémas de traitement sont donc parfaitement maîtrisés. Le nombre d’animaux utilisé sera donc réduit au strict minimum pour répondre à la problématique du projet. Le nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement sur la base d’une méthode validé et consensuelle de façon à n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les laboratoires de recherche privés.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les souris sont suivies quotidiennement, leur poids sera enregistré et les observations cliniques seront évaluées 3 fois par semaine. L’EAE est un modèle très utilisé et très bien décrit. Dans la majorité des publications, la progression de la maladie est évaluée sur la base des observations cliniques selon un scoring strict, validé et utilisé par l’ensemble de laboratoire utilisant ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes (score + poids + 2 tests de performances musculaires) pour garantir une évaluation précise, quantitative et donc objective de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et permettra conclusion étayée par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle d’EAE, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition des signes cliniques dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté l’EAE présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des pellets mouillés (disposées sur le fond de la cage) et un complément alimentaire gélifié (riche en eau et en ions) seront apportés aux animaux pour faciliter la nutrition et à l’hydratation.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE a été choisi par ce que c’est un modèle éprouvé et largement utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives tel que la SLA, sclérose en plaque (SEP) ou encore la maladie de Huntington (HD). Pour étudier le masitinib, l’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques: déficit moteur progressif menant à la paralysie des muscles - les mécanismes : inflammation du système nerveux central et périphérique qui entraîne la mort des cellules nerveuses - Les marqueurs de la maladie: neurofilament qui est désormais demandé par les agences règlementaires Le modèle d’EAE est développé et utilisé uniquement sur des souris. Ce modèle mime parfaitement la SLA et la SEP qui se développe très majoritairement chez les adultes. De plus, en termes de méthode, l’ensemble des publications indiquent qu’il faut utiliser des souris de 9-13 semaines lors de l’induction. Nous utiliserons par conséquent dans ce projet des souris adultes. Les animaux utilisés seront uniquement des femelles comme préconisé par la littérature scientifique. En effet, il existe une différence significative entre les 2 sexes. Les femelles sont beaucoup plus sensibles à l'induction que les mâles : - Le taux d’immunisation est supérieur chez la femelle que chez le mâle ce qui aura pour conséquence la réduction du nombre d’animaux dans ce projet. - Les signes cliniques sont plus marqués chez la femelle que chez le mâle, les effets seront donc plus marqué ce qui améliore la significativité des résultats.
Contrôle de l’immunité anti-tumorale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
7 656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections intrapéritonéales d'anticorps répétées et des prélèvements sanguins dont un prélèvement terminal, pour étudier l'immunosurveillance anti-tumorale. Le porteur décrit une tumeur pouvant se nécroser en son centre et des points limites censés arrêter les atteintes avant un stade avancé. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à terme, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à la souris pour l'étude in vivo de ces mécanismes.
Objectifs
Dans le domaine complexe de la biologie humaine, la lutte contre le cancer est un combat permanent qui exige un arsenal d'approches innovantes. Parmi celles-ci, le concept d'immunosurveillance est apparu comme un gardien essentiel dans la lutte contre les tumeurs malignes. L'immunosurveillance fait référence à la capacité innée du système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cellules anormales, y compris celles qui ont un potentiel cancéreux. Ce mécanisme de défense naturel constitue une ligne de défense cruciale, détectant et éradiquant les cellules indésirables avant qu'elles ne se transforment en tumeurs à part entière. On ne saurait trop insister sur l'importance de l'immunosurveillance dans la lutte contre le cancer. Contrairement aux traitements traditionnels du cancer qui ciblent souvent la tumeur elle-même, l'immunosurveillance s'attache à donner aux défenses de l'organisme les moyens d'identifier et d'éliminer les menaces cancéreuses. Toutefois, ce processus n'est pas sans faille, car les cellules cancéreuses peuvent échapper à la détection immunitaire grâce à diverses stratégies. Il est donc urgent d'améliorer et d'affiner les mécanismes d'immunosurveillance afin de garantir une défense plus efficace contre le cancer. L'amélioration de l'immunosurveillance implique une approche multidimensionnelle. En outre, il est essentiel de démêler l'interaction complexe entre le système immunitaire et les microenvironnements cancéreux. En comprenant comment les tumeurs manipulent leur environnement pour échapper à la détection, nous pourrons développer des stratégies pour contrer ces tactiques et renforcer l'immunosurveillance. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer comment les cellules tumorales échappent à leur éradication par le système immunitaire et de déterminer si le ciblage de ces voies représente une option thérapeutique prometteuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancers.
Procédures
Les souris seront rasées sur un des flanc (environ 30 secondes, réalisé sur souris vigile avec du matériel spécifique) et recevront une injection unique en sous-cutanée de cellules cancéreuses. Chaque injection prendra environ 5 minutes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles. Une partie des souris recevra une injection intrapéritonéale d'anticorps tous les 2 jours pendant 2 semaines ou deux fois par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection prendra environ 30 secondes et sera réalisée sur des souris vigiles. Pour ¼ des animaux, un prélèvement sanguin sera réalisé en cours de procédure et toutes subiront un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvements prendront environ 1 minute par souris. Un dernier groupe de souris recevra 4 injections intrapéritonéales sur 4 jours (une par jour). Chaque injection prendra environ 30 secondes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles.
Impact sur les animaux
Lors d'injections intrapéritonéales répétées, il peut y avoir une inflammation au point d'injection. En ce qui concerne l'aspect et la taille de la tumeur, la tumeur peut présenter un trou en son centre. Avant l’arrivée aux points limites, les animaux pourraient subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection d’immunothérapies. Nous avons une grande expertise de ces modèles. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…) qu’à un stade avancé de du développement de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes et tumeurs et ainsi réaliser les études in vitro nécessaires à savoir analyser la composition cellulaire (cytométrie, immuno-histochimie) et biochimique de la tumeur.
Remplacement
Comme notre projet repose sur l’influence de l’expression de gène tumoraux sur le dialogue entre système immunitaire et les cellules cancéreuses, il n’existe pas à ce jour d’autre alternative que l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes moléculaires et des interactions complexes impliqués.
Réduction
Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre de souris minimum à utiliser afin d’être statistiquement significatif, grâce à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées. De plus nous avons conçu le projet de façon à ce que les procédures soient réalisées les unes après les autres. En cas de résultats non concluant de la procédure initiale, les procédures suivantes ne sont pas réalisées, ce qui réduira le nombre d’animaux prévus dans ce projet. Enfin aucun effet hormonal n’a été décrit à notre connaissance dans ce modèle. Cela nous permettra de limiter notre étude exclusivement aux femelles, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé pour ce projet.
Raffinement
Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En termes de raffinement, les souris sont hébergées en groupe avec de l'eau stérilisée par filtration, des aliments à volonté et un enrichissement systématique du milieu par diamond twist et igloo rouge. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés à la pathologie du lymphome B. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées. D’autre part, afin de minimiser l’inconfort des procédures concernées nous alternerons les sites d’injections en intra-péritonéal, utiliserons des aiguilles très fines adaptées aux injections répétées afin de minimiser/s’affranchir de problème lié à l’injection et nous utiliserons également une tondeuse spéciale rongeurs.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Les modèles utilisés sont les modèles les mieux adaptés pour étudier la réponse antitumorale. Nos souris seront âgées de 6 à 20 semaines car c’est durant cette période que le développement tumoral est optimal.
Mécanismes de l’action anti-tumorale d’exopolysaccharides issus de probiotiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 836 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart. Elles subissent des chirurgies dont une sur anse iléale clampée, des injections de cellules cancéreuses et des gavages, avec des tumeurs sur le flanc pouvant devenir douloureuses au toucher, pour évaluer l'effet anti-tumoral de sucres issus de probiotiques associés à une immunothérapie. Le porteur reconnaît que les bénéfices des probiotiques sont très controversés et vise d'abord à publier et à valoriser un brevet. Il affirme qu'aucun système alternatif ne permet d'étudier la biodistribution de ces composants dans un organisme vivant.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet et de confirmer l’activité anti-tumorale d’une fraction purifiée d’une macromolécule composée essentiellement de sucres, issue de probiotique, chez la souris. A partir des études structurales menées sur les différentes fractions de cette macromolécule, nous avons identifié la sous-unité responsable d’une activité immunogène sur des lignées cellulaires in vitro. Il est désormais essentiel de tester cette fraction sur le modèle souris, en complément d’un traitement ciblé d’immunothérapie. Nous souhaitons ensuite apporter des éléments nouveaux concernant la biodistribution et la métabolisation des unités qui composent la paroi bactérienne, dans un organisme vivant.
Bénéfices attendus
Les effets bénéfiques d’une consommation régulière de probiotiques sur la santé sont très controversés dans la communauté scientifique. Nous souhaitons apporter une réponse claire et factuelle sur les mécanismes exactes des macromolécules composées de sucres, sur le système immunitaire et leur participation à la réponse anti-tumorale d’un traitement ciblé. L’objectif de ce travail en collaboration est, en premier lieu, de publier nos résultats sur la molécule identifiée qui fait l’objet du dépôt de brevet.
Procédures
Ce projet comprend au total cinq procédures expérimentales dont trois procédures chirurgicales. Parmi ces trois procédures, une est classée sans réveil et ne nécessite pas la reprise de conscience de l’animal. La chirurgie de l’anse iléale clampée a une durée de 15-20 min par individu. La sévérité d’une des procédures, tient compte essentiellement du développement tumoral chez le modèle murin et des effets délétères associés. Les actes chirurgicaux pour l’induction des cellules cancéreuses et l’administration du traitement sont, par leur nature, peu invasifs et très rapides ; les injections de cellules cancéreuses et l’administration du traitement sont de courte durée (
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sur les animaux tout au long du projet sont : 1) Le stress, lié à la préhension, contention et au gavage. 2) Une potentielle dégradation de l’état de santé de l’animal sous anesthésie durant la procédure opératoire. Au cours de l’intervention, l’effet des anesthésiques et de l’acte chirurgical, en lui-même, peuvent entraîner une détresse respiratoire, une bradycardie, tachycardie, une déshydratation et une hémorragie. Ces signaux physiologiques sont la traduction d’un stress thermique, d’une manifestation de la douleur, d’une défaillance de l’homéostasie. 3) Inconfort et douleur physique liés à la présence de tumeurs sur le flanc pour les animaux inclus dans l’étude probiotiques et cancer. La douleur peut se caractériser par une extrême sensibilité au toucher lors de la toilette et lors des interactions avec des congénères. Dans un environnement non adapté, c’est-à-dire avec des objets d’enrichissement plastique, l’animal peut se blesser au niveau de la zone tumorale. La douleur physique engendrera du stress, une éventuelle perte d’appétit et une absence d’activité physique (absence de déplacement et d’entretien du « nid » au sein de la cage).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour les procédures sans réveil et de sévérité légère, l’objectif final est de prélever certains organes après traitements pour des études d’histopathologie et pour la détection de nos molécules d’intérêt. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts. A la fin de l’expérience menée sur les différents traitements antitumoraux, nous ne pourrons pas maintenir les animaux en vie car la tumeur induite produira des métastases à long terme et engendrera une très forte dégradation de la qualité de vie.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre aux questions scientifiques suivantes : - Comprendre la biodistribution des composants de la paroi bactérienne des probiotiques dans l’intestin. - Evaluer les effets bénéfiques d’un régime alimentaire basé sur ces composants lors d’une immunothérapie ciblée - Comprendre le devenir de ces composant, leur transformation au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Le nombre optimal d’animaux pour chaque procédure a été longuement débattu en comité. Concernant l’expérience du modèle murin de cancer, nous avons estimé que 1536 souris au total seraient nécessaires pour mener de A à Z cette expérience. En fonction des résultats obtenus lors des premiers essais nous déciderons de la maintenir ou non. Si l’effet bénéfique de notre molécule d’intérêt sur l’immunothérapie n’est pas avéré alors nous mettrons fin à l’expérimentation. Par conséquent, le nombre total d’animaux pourrait être largement inférieur à notre estimation de départ.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est nécessaire pour le bien-être des animaux. Durant cette période et avant chaque procédure, les expérimentatrices rendront régulièrement visite aux souris pour les habituer à leur voix et aux manipulations Des exercices de simple contention de l’animal, pourront être réalisés afin de « routiniser » le geste afin de minimiser tout stress de contact. Dans le cadre du modèle murin de cancer le suivi des animaux sera renforcé car les animaux seront hébergés avec une pathologie contrôlée. L’enrichissement des cages, le nombre d’animaux par cage et les soins médicaux à fournir dépendront des signes cliniques observés. Par exemple, des dômes ou rouleaux en cartons et des pièces en coton (coton dentaire) viendront enrichir l’environnement des cages. Nous pourrons réduire de moitié les animaux par cage pour réduire les interactions intragroupes en cas de comportements agressifs et leur procurer un espace sécurisant Les animaux en attente de chirurgie seront disposés dans un endroit calme et éloigné du champ opératoire pour limiter l’anxiété. Un voilage peut recouvrir les cages en attente pour fournir une obscurité apaisante. Chaque procédure du projet sera réalisée dans un environnement calme, avec un nombre limité de personnel (2 personnes max.) dans la pièce dédiée aux expérimentation afin de ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris est le modèle de prédilection dans l’étude des interactions hôte-pathogènes au sein de la recherche médicale. Ce projet s’inscrit également dans la continuité des études publiées sur cette thématique. Une lignée de souris génétiquement modifiée est actuellement disponible pour servir de population contrôle. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront de préférence âgées de 7 semaines mais le temps d’acclimatation peut être prolongé pour travailler sur animaux âgées de 8-9 semaines. Les animaux sélectionnés seront issus d’une même fratrie afin d’éviter au maximum les comportements agressifs entre individus. La fourchette d’âge définie entre 7 à 8 semaines pour les souris a été choisie afin de travailler sur des jeunes adultes. Les premières expériences menées sur l’effet antitumoral des macromolécules de sucres, ont été réalisées sur de jeunes adultes, afin d’éviter tout biais lié à l’âge, il est essentiel de reproduire cette expérience dans les mêmes conditions afin de confirmer les résultats préliminaires. Si le nombre de semaines peut être flexible à plus ou moins 3 semaines d’écart, l’utilisation de jeunes adultes pour l’ensemble des procédures est requise pour l’ensemble du projet.
Évaluation d’un traitement anticancéreux par hyperthermie localisée (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 032 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée ou induite, puis traitée par échauffement de nanoparticules sous anesthésie, avec injections et imageries répétées et un transport entre deux établissements, pour évaluer une thérapie localisée du cholangiocarcinome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients au conditionnel, des doses plus faibles et moins d'effets toxiques. Il affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier et que le passage par l'animal est un passage obligé avant tout transfert à l'homme.
Objectifs
Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs. Le développement du modèle (implantation des tumeurs) est réalisé dans un autre centre (établissement 1), les traitements par hyperthermie et le suivi échographique sont réalisé dans notre établissement (établissement 2). Aucun animal n'est ajouté au décompte global du projet.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses. Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire). Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés dans notre établissement à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner). Le transport des animaux est réalisé par un transporteur agréé, dans un véhicule adapté et agréé, les animaux diposent d'alimentation et de gel d'eau pendant le transport, et celui-ci est effectué dans la journée.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.
Développement d’une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose artérielle et l’AVC ischémique EU ½
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
860 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 240 menées sans réveil. Un accident vasculaire cérébral ou une thrombose leur est provoqué par chirurgie, suivi d'IRM à 24 et 72 heures, avec au réveil des atteintes de la motricité, du comportement et de la nutrition, pour tester un anticorps ciblant le caillot afin de limiter les saignements des traitements actuels. Le porteur situe les bénéfices au conditionnel, réduction des lésions et élargissement de la fenêtre thérapeutique de l'AVC. Il affirme que ces pathologies, trop complexes, ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
Le projet se fera dans deux établissements utilisateurs. L’hémostase regroupe les processus biologiques assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui se développe dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à l’érosion ou la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un thrombus pouvant entrainer des pathologies graves comme l’AVC ischémique suite à l’obstruction d’une artère cérébrale. Il existe aujourd’hui en clinique 3 classes d’agents antiplaquettaires pour traiter efficacement la thrombose artérielle, mais leur principal effet indésirable est qu’ils induisent des saignements. Concernant les AVC ischémiques, le traitement de référence est basé sur une approche pharmacologique activant la destruction du thrombus (fibrinolyse), combiné ou non à une approche chirurgicale permettant de retirer de manière mécanique le thrombus. Cependant, à cause du risque hémorragique, ces deux approches doivent être réalisée respectivement dans les 4h30 ou 6h après l’apparition des premiers symptômes, ce qui limite fortement le nombre de patients pouvant être traités, puisque que passé ces délais, ils ne peuvent plus recevoir les traitements. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée qui permettrait de limiter le risque hémorragique lié à ce type de traitement. Cette approche est basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, le rtPA, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de ces anticorps sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique, ainsi que leur risque hémorragique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur 2 aspects : • La thrombose artérielle : on pourrait mettre en évidence une réduction de la thrombose dans les modèles expérimentaux et ce potentiellement en réduisant les risques de saignement, que l’on sait importants avec les traitements actuellement disponibles. • L’AVC ischémique : on pourrait mettre en évidence une réduction de la taille des lésions post-AVC couplée à une potentielle réduction des saignements par rapport au traitement rtPA du fait du ciblage spécifique du thrombus. Cette réduction des saignements pourrait également conduire à une augmentation de la fenêtre thérapeutique des traitements de l’AVC : à ce jour, la rtPA ne peut être administrée que 4.5 heures après l’AVC. L’identification de tels résultats pourraient déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ou un AVC ischémique ainsi qu’à une réduction des séquelles à long terme de ces pathologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale (animal vigile), sous-cutané, intra-veineux et intranasal (animal anesthésié). Certains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celles-ci seront de maximum 60 min. Des IRM de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site chirurgical. Si le saignement observé est trop important la souris sera sacrifiée afin de limiter toute douleur ou inconfort. Pour les modèles d’AVC, on s’attend au moment du réveil à un impact sur le comportement (activité réduite), sur l’apparence physique (apparence des poils, paupières), sur la nutrition et sur la motricité (rotation). Pour le modèle de saignements pulmonaires, au moment du réveil on s’attend à un impact sur le comportement (baisse d’activité) et la respiration (accélération).
Devenir
Modèles de thrombose Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Temps de saignement Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Modèle d’inflammation pulmonaire induite par LPS Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements au niveau des poumons après leur mort. tMCAO Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort. Modèles d’AVC Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort.
Remplacement
Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose et de l’AVC, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Les deux pathologies étudiées étant des processus particulièrement complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 2 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé pour évaluer la formation de thrombus. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Effet de l’insulino-résistance sur la réponse à l’inflammation intestinale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué et une inflammation ou une infection intestinale induite, avec jeûnes prolongés, gavages, injections, prélèvements sanguins et pose d'une pompe sous la peau, pour étudier si la résistance à l'insuline fragilise la barrière intestinale. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais conclut que la complexité des dialogues entre organes impose le recours à l'animal.
Objectifs
L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la sécrétion d’hormones et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinale et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.
Procédures
Sur animaux vigiles : 240 animaux: (1 mise a jeun de 16h, 6 à 7 contentions de 45 secondes pour 1 administration orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 2 à 3 injections de produit de 45 secondes), 240 animaux : (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 16h, 7 à 8 contentions de 45 secondes pour 2 administrations orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 3 à 9 injections de produit de 45 secondes). Sur animaux anesthésiés : 240 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)). 240 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).
Impact sur les animaux
L’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Les souris rendues diabétiques présenteront une augmentation de leur prise hydrique et de leur volume urinaire. Les incisions cutanées chirurgicales peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des bactéries pathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.
Réduction
L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.
Raffinement
La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) sera effectué.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.
Etude des effets d’une d’irradiation sur l’évolution d’une hématopoïèse clonale.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées et greffées de moelle osseuse, elles subissent des irradiations du corps entier et locales, jusqu'à dix-sept prélèvements de sang, des gavages pour induire une mutation et des imageries cardiaques sous anesthésie, pour déterminer si de faibles doses d'irradiation favorisent leucémies et maladies cardiovasculaires. Le porteur relie ces résultats au suivi des populations exposées et à la radiothérapie, bénéfices présentés comme préalables à un essai clinique. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de modéliser ces effets à l'échelle d'un organisme entier et complexe.
Objectifs
Les cellules souches à l’origine de l’ensemble des cellules du sang sont localisées dans la moelle osseuse. La présence d’une modification de l’ADN (mutation) dans ces cellules souches peut aboutir à la production d’un ensemble de cellules mutées, appelé clone, détectable dans le sang sans pathologie associée. On parle alors d’hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé. Chez l’humain, cette anomalie est détectable dès 30 ans et devient très fréquente avec l’âge. Chez ces individus, une fraction des globules blancs, appelés cellules myéloïdes, est pro-inflammatoire et augmente le risque de développement de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires. Notre projet a pour objectif d’étudier une des mutations les plus fréquentes associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé : la mutation du gène Tet2 (Ten-eleven-translocation 2). Cette mutation, qui conduit à la perte de fonction de la protéine, a pour conséquences une multiplication plus active des cellules souches et une augmentation de la production des cellules myéloïdes. De plus, l’exposition à une inflammation chronique favorise l’expansion de ces clones mutés et leur évolution en cancers du sang ou en maladies cardiovasculaires. L’exposition à de faibles doses d’irradiation pouvant provoquer une inflammation chronique, notre projet vise à déterminer si une irradiation à faible dose peut favoriser l’apparition d’une leucémie et/ou d’anomalies cardiovasculaires dans un organisme présentant une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2. Cette recherche permettra de déterminer si cette mutation augmente les risques sanitaires pour les populations exposées à de faibles doses d’irradiation (travailleurs du nucléaire ou professions médicales) et d’identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin transgénique dans lequel le gène Tet2 est inactivable dans une fraction de cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques de façon contrôlée après traitement médicamenteux et donc de mimer une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2.
Bénéfices attendus
Les objectifs sont ici de déterminer si, et à quelle(s) dose(s), l’irradiation corps entier d’un individu porteur de la mutation du gène TET2, de type hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé, augmente les risques de survenue de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires, et identifier les mécanismes impliqués dans un modèle murin transgénique porteur de la mutation du gène Tet2. Les résultats de cette étude pré-clinique sont nécessaires pour envisager l’initiation d’un essai clinique chez l’humain. La recherche de mutations associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé dans le sang pourrait être un paramètre important à prendre en compte : 1) dans le suivi médical des populations exposées à des doses faibles/modérées d’irradiation, notamment dans un cadre professionnel ; 2) pour la personnalisation des traitements des patients porteurs de cancers et traités par radiothérapie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - identification des animaux de génotype d’intérêt (1fois - 30 secondes) ; - des irradiations locales (2 fois – maximum 10 minutes sur animaux anesthésiés) - des irradiations corps entier (3 fois - maximum 15 minutes sur animaux vigiles) ; - prélèvements de sang (un maximum de 17 prélèvements/animal – 2 minutes par prélevement) ; - injections pour l’anesthésie des animaux avant les irradiations locales (2 fois - 2 minutes/animal) ; injection pour la transplantation des cellules de moelle osseuse nécessaire pour établir le modèle murin transgénique (1 fois -2 minutes) - gavage avec un médicament permettant d’induire la mutation du gène Tet2 (5 fois - 2 minutes) - anesthésie gazeuse (4 fois maximum - 30 minutes/animal), rasage/dépilation (4 fois maximum– 4 minutes/animal) pour les imageries du cœur par écho-doppler
Impact sur les animaux
L’irradiation corps entier sera susceptible de générer un stress, en raison de la contrainte physique de l’animal dans un compartiment de la boîte à irradiation, des transports allers-retours à l’irradiateur et pour les imageries écho-doppler et les anesthésies permettant la répétition de ces analyses au cours du temps. L’injection de cellules de moelle osseuse, la section de l’extrémité de la queue pour le génotypage, les prélèvements de sang pourront induire une douleur brève. Une altération physique et du comportement sont possibles en cas d’apparition de leucémies ou d’anomalies cardiaques.
Devenir
A l’issue des expériences, tous les animaux seront euthanasiés et les organes, notamment le cœur, la moelle osseuse et la rate seront collectés à des fins d’études histologiques, cellulaires et/ou moléculaires. Ces analyses sont nécessaires pour caractériser de manière la plus complète possible les effets différentiels de l’irradiation sur le groupe contrôle et sur le groupe de souris transgéniques.
Remplacement
L’objectif même de notre projet étant d’étudier les effets physiopathologiques d’une irradiation corps entier à faible dose, il n’existe actuellement aucune méthode de substitution à l’utilisation d’animaux vivants permettant de modéliser ce type d’effet à l’échelle d’un organisme entier et complexe. D’autres modèles murins, dans lesquels le gène que nous étudions est inactivé soit dans toutes les cellules de l’animal soit dans toutes les cellules hématopoïétiques, ont montré des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles observées chez l’humain. Ces travaux justifient l’utilisation de souris transgéniques pour répondre aux questions scientifiques décrites dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum mais doit être suffisant pour prendre en compte la possibilité, bien que peu fréquente, d’absence de transplantation efficace des cellules de moelle osseuse (prise de greffe). Les données issues d’expériences précédentes et la bibliographie montrent que 6 animaux par groupe contrôle et 12 animaux par groupe test sont nécessaires pour réaliser les analyses statistiques et s’assurer d’une différence significative entre les différents groupes. De plus, pour une même condition, 2 expériences indépendantes doivent être réalisées pour s’assurer de la robustesse des conclusions scientifiques établies à partir des résultats. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet pourra également être réduit en fonction des résultats obtenus lors des toutes premières expériences. Ainsi, le nombre de dose d’irradiations corps à tester pourra être revu à moins des 5 maximum estimées.
Raffinement
Afin de favoriser le bien-être animal, les animaux seront hébergés en groupe selon la règlementation en vigueur dans un environnement enrichi composé de tunnels en carton et de boules de coton. Les irradiations locales et les analyses par échographie sont réalisées sous anesthésie générale. L'évaluation de la souffrance éventuelle des animaux est basée sur l'observation quotidienne, par le personnel animalier ou l’expérimentateur, des signes cliniques (aspect, comportement spontané, comportement alimentaire, comportement dans le groupe social). En cas de douleur, une analgésie adaptée sera mise en place après concertation avec le vétérinaire. Si à tout moment de l’étude, les animaux présentent des signes d’affaiblissement, une cupule d’aliment riche gélifié sera placée au fond de la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation et réhydrater les animaux. Dans un cas extrême de déshydratation, a priori très peu probable dans le cas de cette étude, les animaux pourront être traités avec des injections sous cutanées de liquide physiologique. Des points limites précoces ont été définis.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier le système de production des cellules du sang. En effet, ce modèle présente des similarités physiologiques et génétiques avec l’humain, et permet l’obtention de lignées transgéniques pour cibler un ou plusieurs gènes d’intérêt, et dont l’activation ou l’invalidation peut être réalisée de façon contrôlée (par traitement médicamenteux des animaux), cette dernière caractéristique étant cruciale pour notre projet. De plus, l’utilisation de lignées de souris exprimant exclusivement certains marqueurs à la surface des cellules hématopoïétiques nous permettra d’étudier parallèlement, après transplantation, les cellules donneuses et receveuses. Pour ce projet, nous utiliserons des animaux âgés de plus de 8 semaines, considérés comme adultes et avec une hématopoïèse stable.
II : Approche thérapeutique pour lutter contre une maladie neurodégénérative : validation d’un candidat médicament
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
648 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour un modèle de maladie neurodégénérative, elles reçoivent un candidat médicament par mini-pompe implantée ou par régime alimentaire pendant jusqu'à dix mois, avec prélèvements sanguins mensuels et tests comportementaux impliquant isolement de 48 heures et jeûne de 24 heures. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur ni perte d'autonomie liés au phénotype, et tue les animaux pour prélever leur cerveau. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement les traits comportementaux de la maladie.
Objectifs
Notre projet vise à développer une thérapie contre une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié responsable de nombreux dérèglements dans la physiologie des neurones. En utilisant un système in vitro innovant, nous avons identifié qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones d’un modèle souris de la maladie. Cette étude a permis de démontrer que le traitement améliore les défauts moteurs et cognitifs de l’animal après 1 mois de traitement. Cette première étude nous a également permis de caractériser précisément le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du candidat médicament. Le projet a pour objectif d’identifier un schéma de traitement transposable à l’homme confirmant l’intérêt thérapeutique du candidat médicament.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à différents stades d’avancement de la maladie, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans des études cliniques. En parallèle, nous travaillons à la caractérisation du mode et du mécanisme d’action moléculaire associé au candidat médicament. Ces études sont fondamentales pour la construction d’une stratégie clinique cohérente puisqu’elles nous permettront de décider s’il est pertinent ou non d’initier le traitement avant le développement des symptômes chez les patients, mais aussi de définir une durée de traitement et une posologie (dose, nombre prise par jour) adaptées.
Procédures
Une partie des animaux seront traités pendant un mois grâce à un dispositif vétérinaire assurant une délivrance continue de la molécule sans douleur ni atteinte du bien-être animal. L’installation de ce dispositif nécessitera une chirurgie sous-cutanée de 5 minutes maximum par animal. L’autre partie sera traitée grâce à un régime à façon spécialement formulé correspondant au régime habituel des animaux dans lequel la molécule est intégrée. Toutes les souris seront traitées avec le régime à façon sur une durée maximale de 10 mois. Pendant toute la durée du traitement, un prélèvement mensuel de sang (5min/animal) sera effectué après le début du régime afin de vérifier que le médicament est bien passé dans le sang (entre 3 et 10 prélèvements au total en fonction des groupes). Enfin, des tests comportementaux (tests de 30 min max hormis pour 1 test réalisé sur 48h) destinés à étudier l’effet du traitement sur les comportements anxio-depressif et locomoteurs des animaux seront effectués.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle largement utilisé dont le phénotype évoluera avec l’âge, occasionnant l’apparition de symptômes cognitifs et moteurs qui sont uniquement décelés à l’aide de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnement pas de perte d’autonomie, et pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer d’altérations significatives de la qualité de vie, ni de mort prématurée chez ces animaux dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères : 1/ une potentielle douleur de nature interventionnelle : induction potentielle d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe. 2/ une légère douleur due aux prélèvements sanguins mensuels. 3/ une gêne potentiellement attendue sur les animaux lors de l’expérimentation, à savoir l’induction d’un stress léger lors de certains tests comportementaux impliquant soit un isolement prolongé de 48h afin d’analyser l’activité et le métabolisme de l’animal, soit une mise à jeun de 24h afin d’analyser l’anxiété de l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré sur un modèle cellulaire in vitro que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie neurodégénérative que vous étudions. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. L’étape actuelle consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
La procédure 2 sera réalisée uniquement si la procédure 1 est validée. Dans nos deux axes d’étude, nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post- mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Pour chacun des axes, dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement lors de l‘analyse des données afin d’augmenter la puissance des tests statistiques. Dans notre étude visant à caractériser l’efficacité du traitement à long terme à différents stades d’évolution de la maladie, nous ne prévoyons pas de traiter avec notre composé les animaux sains. En effet, nous avons déjà testé précédemment l‘effet de notre composé sur un nombre réduit d’animaux sains et nous n‘avons observé aucune toxicité, et aucune altération du comportement. Cela permet donc d‘éliminer plusieurs conditions expérimentales, dans un principe de réduction du nombre total d‘animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de polycarbonate autoclavées, de dimension 192 mm x 170 mm x 421 mm (
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de notre pathologie d’intérêt. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le candidat médicament que nous développons est donc destiné à des adultes raison pour laquelle nous réalisons notre étude sur des animaux à l’âge adulte. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 ou 12 mois car c’est à partir de 6 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et cognitifs observables en étude de comportement.
Etude longitudinale de l’administration chronique d’un activateur d’ANO1 dans Un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
176 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 32 d'entre elles. Le modèle repose sur des souris atteintes de mucoviscidose qui naissent en sous-poids et dont environ 30 % meurent au sevrage d'occlusions intestinales, part que le porteur intègre au protocole, les autres recevant jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées sur douze mois. L'objectif est de tester une approche par ARN pour les patients sans traitement, le bénéfice restant à démontrer. Le porteur affirme qu'il faut passer par un organisme vivant entier portant la même mutation et qualifie le modèle murin d'incontournable.
Objectifs
L’objectif de ce projet a pour but de valider une approche thérapeutique basée sur les ARN dans le but de trouver un nouveau médicament pour les patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de cette étude, nous voulons montrer le bénéfice que pourrait apporter notre approche thérapeutique sur la survie des souris qui normalement meurent au moment du sevrage. D’autres paramètres importants seront étudiés comme la prise de poids. Ces données seront importantes pour, à terme, proposer cette nouvelle stratégie à des patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.
Procédures
Les souris homozygotes ont un caractère dommageable et naissent avec un poids plus faible que des souris hétérozygotes ou sauvages avec une mortalité de l’ordre de 30 pour cent qui fait partie intégrante du modèle. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu (12 mois) ou avant en cas de point limite. Les interventions effectuées sur les souris seront : - Prélèvement d'un échantillon caudal de 2mm pour le génotypage sur animal vigile avant J11 (moins de 1 minute par souris), - Prises de poids régulières (moins de 1 minute par souris), - Injections sous-cutanées sur animaux vigiles à J11 et J18 après la naissance puis tous les 15 jours jusqu’à l’euthanasie de l’animal soient 25 injections maximum pour 12 mois (moins de 1 minute par souris).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées ont à la naissance un poids inférieur et la prise de poids peut être réduite par rapport aux souris hétérozygotes ou sauvages ce qui les rend particulièrement fragiles. Les animaux seront susceptibles de ressentir une douleur de courte durée à la suite du prélèvement d’un petit bout de tissus caudal en vue du génotypage nécessaire. Les animaux homozygotes avec un phénotype dommageable ont une mortalité qui apparaît au moment du sevrage provoquée par des occlusions intestinales. Une fois que ces souris ont passé le sevrage, elles demeurent fragiles et la prise de poids est un élément déterminant dans la survie de ce modèle. Les nuisances que l'on peut attendre dans ce projet sont liées à la manipulation des souris lors de l'injection en sous-cutanée. La contention et la piqûre vont induire un stress à l'animal. L'utilisation des oligonucléotides en sous-cutanée de manière répétée peut provoquer une inflammation locale qui peut être palliée en changeant le site de l’injection. Dans d’autres études avec des oligonucléotides, il a été observé une toxicité hépatique que nous n’avons pas retrouvée dans nos études précédentes sur un autre modèle murin en utilisant la même approche.
Devenir
A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer une analyse des principaux organes (poumon, foie, reins, intestins, cœur, pancréas, testicules, ovaires).
Remplacement
Dans la pathologie de la mucoviscidose, les modèles les plus utilisés sont des cellules issues de patients. Ces cellules peuvent être cultivées de différentes façons mais ne permettent pas de rendre compte des effets des molécules sur la toxicité et l’efficacité des molécules testées. De plus ces modèles ne miment pas les effets dans un organe ou dans un animal vivant. Les souris atteintes de mucoviscidose possèdent des caractéristiques physiologiques similaires à celles des humains, en particulier en ce qui concerne les atteintes respiratoires et intestinales. Avant de commencer ce projet, nous avons montré que notre molécule était active et n’était pas toxique sur des lignées cellulaires, mais également sur des cellules issues de patients. Afin de valider une approche thérapeutique potentielle pour les patients atteints de mucoviscidose, nous devons passer par un organisme vivant entier et qui possède la même mutation que les patients. Le modèle murin est le modèle le plus souvent utilisé dans les recherches sur la maladie de la mucoviscidose. En utilisant le modèle murin, nous pouvons étudier la mucoviscidose à différents niveaux, allant de la biologie moléculaire à la physiologie des organes. Cela permet aux chercheurs de mieux comprendre la maladie et de développer de nouveaux traitements. Ce modèle se révèle incontournable pour étudier les effets d’une molécule pouvant traiter la maladie.
Réduction
Nous utiliserons le minimum de souris qui nous permettra d’obtenir des données statistiques fiables et de valider ou non nos résultats obtenus sur des cellules isolées. Pour la détermination du nombre minimal de souris requis, nous nous appuierons sur les standards utilisés pour ce genre d'études. En tenant compte de la mortalité lié au modèle, nous avons prévu de produire 32 souris homozygotes (24 seront traitées et nous estimons à 8 souris qui décéderont avant le traitement) et nous arrêterons le projet dès ce nombre atteint. Pour produire ces 32 souris homozygotes nous devrons produire 96 souris hétérozygotes et sauvages à l'aide de 8 fondateurs. Une étude de fertilité sera également effectuée, ce qui implique la production supplémentaire de 40 animaux. Au total ce projet implique donc 176 souris.
Raffinement
Les animaux sont élevés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès permanent à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Une prise de poids régulière, mesurée 3 fois par semaine les deux premières semaines puis toutes les deux semaines et une grille d’évaluation comportementale seront effectuées avant le début de la procédure expérimentale. Des croquettes humides ou l’utilisation d’un gel enrichi seront ajoutées dans les premières semaines, car les souris atteintes de mucoviscidose présentent une taille et un poids inférieur aux souris normales ce qui peut limiter l’accès à la nourriture et à l’eau. Une perte de 15 pour cent du poids des souris atteintes de mucoviscidoses entraînant l’euthanasie de l’animal. Une absence ou une perte de prise de poids des souriceaux entrainera l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle murin proposé pour cette étude est le modèle de référence dans le cadre de la pathologie de la mucoviscidose pour mimer au mieux ce qui est observé chez l’homme. Ce modèle murin est intéressant pour cette pathologie, car il reproduit les atteintes que l’on retrouve chez les patients qui ne sont pas traités. Nous retrouvons une atteinte qui va toucher de nombreux organes comme le système gastro-intestinal, les os, les organes reproducteurs ainsi que les dents. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une molécule sur le modèle murin sur ces différentes atteintes et de voir l’amélioration de la survie induite. Les souris seront traitées précocement à J11 et J18 avant le sevrage qui est une étape critique des souris atteintes de mucoviscidose. Ensuite les souris seront traitées tous les 15 jours.
Evaluation d’immunomodulateurs dans deux modèles de chondrosarcome chez le rongeur.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 282
498 rongeurs, souris et rats, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du cartilage leur est implantée sous anesthésie, puis suivie par imagerie, la croissance tumorale pouvant perturber la locomotion et l'accès à la nourriture, pour évaluer deux molécules ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans le chondrosarcome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients à long terme. Il indique que des essais sur cellules ont déjà été menés mais que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du tissu tumoral, rendant selon lui l'évaluation animale inévitable.
Objectifs
Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 20 % des tumeurs malignes osseuses et se place en deuxième position, en termes de fréquence, après l’ostéosarcome. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, le chondrosarcome est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la présence de cellules immunitaires dans le tissu tumoral et plus particulièrement aux « macrophages associés aux tumeurs », ou TAMS qui jouent un rôle important dans le développement de la tumeur et la résistance à la chimiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons évaluer l’intérêt de deux molécules ayant un impact sur les TAMs. Les évaluations seront réalisées dans deux modèles de chondrosarcome chez le rongeur (un chez la souris et un chez le rat).
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de juger de la pertinence de stratégies thérapeutiques ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans la prise en charge du chondrosarcome pour, à plus long terme, améliorer la prise en charge de cette pathologie chez le patient.
Procédures
Induction du modèle d’étude sous anesthésie. La durée de l'intervention dépend du modèle : 3 à 4 minutes d'anesthésie pour le modèle souris et 10 minutes d'anesthésie pour le modèle rat. Les examens d'imagerie permettant de suivre la volume tumirol se dérouleront sous anesthésie. La durée de l'anesthésie dépendra de l'examen et durera entre 10 minutes et 1h30.
Impact sur les animaux
La croissance de la tumeur pourrait perturber la locomotion ce qui pourrait gêner la prise de nourriture. Des solutions pourront alors être apportées telles qu’un accès facilité à la nourriture et à la boisson. De plus, les injections répétées des traitements pourraient être à l’origine d’un stress chez les animaux. Pour éviter cela, une période d’habituation sera systématiquement réalisée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en vue des analyses histologiques du tissu tumoral.
Remplacement
Des études préliminaires sur cellules ont déjà été réalisées et les résultats semblent prometteurs. Toutefois, la culture cellulaire ne représente pas totalement la complexité du tissu tumoral. Ainsi, une évaluation chez l’animal est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.
Réduction
Du fait de l’hétérogénéité des tumeurs propre à l’expérimentation chez l’animal, un nombre de 6 animaux par stade a été défini pour les analyses histologique. Ce nombre est le nombre d’animaux minimal permettant une analyse statistique puissante. D’autre part, l’imagerie est une méthode qui permet de réaliser un suivi longitudinal sur un même animal ce qui permet une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, hébergement en groupe pour les souris ou par 2 pour les rats, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin.
Choix des espèces
Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale notamment en cancérologie. L’évaluation des molécules sera réalisée sur un modèle souris et un modèle rat. En ce qui concerne le modèle souris. Il s’agit d’une tumeur d’origine humaine implantée sur un animal immunodéprimé. Des études préliminaires ont été réalisées au sein du laboratoire et ont permis de valider la pertinence du modèle. Pour ce qui est du modèle rat, il s’agit d’une tumeur de rat implanté sur un rat. Ce modèle est largement utilisé dans la littérature pour l’étude du chondrosarcome. Concernant les rats, ils seront commandés à 150 g (3-4 semaines) et les souris à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 à 4 semaines chez le rat, jusqu'à 8 semaines chez la souris).
ONCO-MMTV-PyMT : Évaluation des composés diagnostiques ou thérapeutiques sur des souris transgéniques MMTV-PyMT (FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)634Mul/J)
- Recherche appliquée
- Cancers
1 000 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des tumeurs mammaires spontanées, elles reçoivent des traitements par voies multiples, subissent palpations, mesures de tumeurs et prélèvements répétés, le développement tumoral pouvant gêner la mobilité et la respiration, pour évaluer des composés anticancéreux commandés par des clients. Le porteur, prestataire de recherche préclinique, présente ce modèle comme le plus prédictif pour transposer les molécules à l'homme. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo et que les reconstructions de tumeurs en 3D restent marginales.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer. Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est de d’utiliser un modèle spontané de cancers comme approche prédictive en oncologie. Ce modèle permet une approche pertinente pour investiguer les premiers stades de la maladie et notamment l’initiation spontanée de tumeurs. Le modèle de souris MMTV-PyMT est le modèle de souris génétiquement modifiées le plus couramment utilisé pour la recherche sur le cancer. Les lésions mammaires apparaissant chez les souris MMTV-PyMT suivent une évolution moléculaire et histologique similaire à celle des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un outil de choix pour les chercheurs en cancérologie. Il est aussi intéressant de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un modèle animal particulièrement représentatif de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de nouveaux médicaments destinés à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle mis en place dans nos laboratoires, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie humaine, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 (inférieur à15min). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral. Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Les animaux sont traités par voie : - intra-veineuse, intrapéritonéale, sous cutanée avec (inférieur à 15min) ou sans anesthésie générale (3min) - intra-musculaire ou intra-dermique sous anesthésie générale avec analgésie (
Impact sur les animaux
L’identification des animaux pourra induire une douleur légère (moins de 1 journée). Les animaux recevront des traitements par voie intramusculaire, intradermique, sous cutanée, intraveineuse, orale, intra-tumorale, intrapéritonéale. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère (de quelques minutes). L’imagerie induira un stress léger. Le jour de la constitution des nouveaux groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress léger de 1-2j. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral ainsi que les palpations entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le développement spontané des tumeurs pourra avoir un impact sur la mobilité (point limite). Le développement de lésions localisées dans les poumons pourra induire une gêne respiratoire et une perte de poids (point limite).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Au cours de leur vie les animaux vont développer des tumeur spontanées, ayant fait l’objet de gestes techniques et ayant reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe non traité et un groupe a traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 20% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant sélection) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes. Si possible, ce nombre sera réduit à l’issue de la procédure 1. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Les administrations des produits/prélèvements seront effectués suivant les recommandations vétérinaires (anesthésie, de volume, fréquence et antalgie). Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf per-os) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé. Des animaux adultes seront utilisés.. Lorsque la mobilité des animaux sera réduite, un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée.. L’exsanguination intracardiaque ou par l’aorte abdominale, se fera sous anesthésie profonde et avec administration préalable d’un opiacé.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme.
Mise au point d’une méthode de détection de l’interleukine 1 beta in vivo dans le cerveau de la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
70 souris vont être utilisé·es, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, dans des procédures menées sans réveil. Un volet crânien est ouvert et des électrodes sont implantées dans le cerveau pendant trois à quatre heures sous anesthésie, avec administration d'une substance pro-inflammatoire pouvant aller jusqu'au choc septique, pour mettre au point un microcapteur mesurant une cytokine de la neuroinflammation. Le porteur présente cet outil comme un moyen futur de réduire le nombre d'animaux, les mesures actuelles étant destructrices. Il affirme que l'interaction entre système nerveux et système immunitaire ne peut pas encore être modélisée in vitro et que le recours à l'animal vivant est indispensable.
Objectifs
La neuroinflammation fait référence à un large spectre de réponses immunitaires du système nerveux central, impliquant non seulement les cellules résidentes du cerveau mais aussi des cellules immunitaires sanguines. Ces types cellulaires communiquent entre eux en libérant des cytokines, des molécules de signalisation cellulaire capable de moduler la neuroinflammation, en exerçant des actions aussi bien pro- qu’anti-inflammatoires. Une neuroinflammation excessive ou prolongée est au cœur d’un large éventail de pathologies neurologiques comme la maladie d’Alzheimer ou la sclérose en plaques, ou les agressions cérébrales aiguës comme les accident vasculaires cérébraux ou les traumatismes crâniens. Pour mieux comprendre le rôle de la neuroinflammation dans les maladies neurologiques, il est nécessaire de disposer d'outils efficaces pour monitorer la neuroinflammation in vivo. La mesure des concentrations de différentes cytokines pro- et anti-inflammatoires in vivo est une stratégie importante pour comprendre l'état neuroinflammatoire du cerveau. Les techniques actuelles pour doser les cytokines sont destructrices et impliquent la mise à mort de l’animal pour obtenir une seule mesure. Elles ne permettent pas de suivre ces concentrations dans le temps. Les techniques d'imagerie cérébrale sont mal adaptées au suivi des cytokines cérébrales car il n'existe pas de marqueurs spécifiques. Nous proposons ici de développer des microcapteurs électrochimiques qui peuvent être implantés dans le cerveau avec une perturbation limitée du tissu nerveux, qui détecteront spécifiquement les cytokines clés dans le cerveau vivant et suivront leurs concentrations dans le temps. Cette approche reposera sur le développement de polymères à empreintes moléculaires. Ils peuvent être déposés à la surface d'une électrode et lorsque la molécule ciblée se lie au polymère, des modifications électrochimiques peuvent être mesurées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo l’utilisation d’un nouvel outil de monitorage de l’IL1b chez la souris. Si nos microélectrodes sont bien sélectives et sensibles à l’IL1b in vivo, elles seront mises à disposition de la communauté scientifique pour permettre des mesures longitudinales qui se substitueront avantageusement aux mesures destructives réalisées actuellement qui ne permettent qu’une mesure ponctuelle impliquant la mise à mort de l’animal. Ainsi, ce nouvel outil devrait considérablement stimuler la rechercher sur l’IL1b et sur les mécanismes de la neuroinflammation. La capacité de mener des expériences de monitorage pouvant décrire l’intégralité d’une cinétique pendant plusieurs heures chez le même animal permettra de réduire le nombre d’animaux qui était nécessaire jusqu’à présent pour décrire le décours temporel d’un phénomène biologique.
Procédures
Réalisation d’un volet osseux crânien et implantation d’électrodes intracérébrales sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de l’expérimentation sous anesthésie est de 3-4 h.
Impact sur les animaux
Ce projet est entièrement réalisé sur des animaux anesthésiés sans réveil. Les nuisances sur le bien-être animal sont donc très réduites. L’administration lipopolysaccharide est pro-inflammatoire et peut conduire à une baisse de la pression artérielle, une baisse de la résistance vasculaire périphérique, compensée en partie par une augmentation du rythme cardiaque. Cet effet peut aller jusqu’au choc septique. Cependant, ces possibles effets néfastes seront toujours induits sous anesthésie et analgésie.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie en raison du caractère invasif de la procédure
Remplacement
Les phénomènes de neuroinflammation reposent sur l’interaction entre le système nerveux central et le système immunitaire sanguin périphérique. Cette interaction ne peut pas encore être modélisée in vitro. Dans les tranches de cerveau, notamment, les capillaires sanguins sont découpés et le flux sanguin est absent. Pour cette raison, le recours à l’animal vivant est indispensable à la fois pour mettre au point des outils d’investigation in vivo comme c’est le cas ici, et pour mener des expériences scientifiques de monitorage de cytokines, qui est l’objectif de cette mise au point.
Réduction
Notre plan d’expérience est prévu avec un nombre d’animaux minimal de 10 souris (incluant deux expériences non concluantes par groupe à cause de biocapteurs cassés ou décès en cours d’anesthésie) permettant d’effectuer des comparaisons statistiques. L’approche statistique consiste à pratiquer une analyse de normalité et une analyse de variance. Pour réduire le nombre d’animaux total utilisé pour chaque procédure, nous pratiquerons une analyse de puissance dès l’obtention de six mesures concluantes indépendantes. Cette approche estimera le nombre minimal d’expériences permettant de mettre en évidence un effet statistiquement significatif, en fonction de l’effet mesuré expérimentalement. Notons que des comparaisons statistiques seront pratiquées dès l’obtention de six mesures indépendantes et si l’effet attendu est déjà significatif, les expériences seront arrêtées sans utiliser la totalité des 10 animaux par groupe.
Raffinement
Pour prévenir la douleur, un traitement analgésique est prévu avant et pendant la chirurgie. Il consistera en une injection intrapéritonéale de buprenorphine et de lidocaïne pratiquées 30 min avant l’incision de la peau. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à trois dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (tunnel de plastique rouge, matériau de nidification). Tout au long du projet et dès la réception des animaux, des points limites sont appliqués afin de mettre fin aux souffrances des animaux si cela s'avère nécessaire.
Choix des espèces
La souris C57 Bl6/J est une espèce qui a été largement caractérisée en neuroscience. Cette souche de souris a servi de fond génétique à la création de la souris C57BL/6J-Il1bem2Lutzy/Mmjax déficiente pour l’IL1b. Les procédures permettant de réaliser cette mesure chez la souris ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Souris adultes de 7-12 semaines pour bénéficier d'une taille maximale