Souris
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation du thorax entier chez la souris avec déplétion des cellules club par le naphtalène (NA)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
820 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 500 d'entre elles. Elles reçoivent une irradiation du thorax entier à 20 Gy sous anesthésie et des injections répétées de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, et sont gardées jusqu'à six mois, pour étudier la réponse de l'épithélium bronchiolique à la radiothérapie. Le porteur indique que cette irradiation entraîne à elle seule la mort de 35 % des animaux sur six mois et des difficultés respiratoires, l'absence des cellules ciblées pouvant aggraver les lésions. Il conclut que la réponse du tissu pulmonaire ne peut être appréhendée qu'in vivo, dans un système biologique intégré.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral mais également la qualité de vie des patients. La radiothérapie est très efficace mais génère néanmoins des séquelles. La réponse pulmonaire à la radiothérapie fait l’objet de publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages de type inflammatoire ou fibreux post-irradiation. En revanche, très peu de données existent sur la réponse de l’épithélium bronchiolique. Lors d’un projet précédent, nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans le développement de la fibrose au niveau du poumon. Les cellules club sont situées sur l’épithélium bronchiolique et sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Elles sont également des cellules capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. Cette protection passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une substance particulière, l’utéroglobine. Une diminution de cette sécrétion ou une modification génétique impactant les gènes codant pour celle-ci ont été associés au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique. L’objectif du présent projet est donc d’utiliser un modèle dans lequel les cellules club sont éliminées afin de déterminer l’impact de ces cellules sur le développement des lésions pulmonaires après irradiation du thorax entier chez la souris. Cela est possible, de façon transitoire, par injection de naphtalène qui toxique pour les cellules club. Ce modèle, très utilisé, ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux. L’élimination des cellules club maintenue dans le temps peut être obtenue en répétant les injections tous les 3 à 4 jours. Une expérimentation préalable sera effectuée afin d’évaluer la toxicité éventuelle de ces injections répétées. Deux lignées de souris seront utilisées car elles ont des spécificités en lien avec le développement de lésions pulmonaires. Comparer ces deux lignées de souris pourrait nous permettre de comprendre quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution des dommages pulmonaire depuis l’inflammation vers la fibrose, une notion importante dans la gestion clinique des séquelles des radiothérapies thoraciques.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Selon les procédures et lots : • Irradiation 20 Gy, sous anesthésie (durée 10 min) • Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée) jusqu’à 1 injection tous les 3 ou 4 jours pendant 4 semaines (soit 16 injections maximum) • Injections répétées de naphtalène/véhicule, 1 injection/semaine/4 semaines, sur animal vigile • Scanner sous anesthésie (8 min, max 3 fois) • Les animaux sont gardés au maximum 6 mois.
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation du thorax entier sur un irradiateur de type médical à une dose unique de 20 Gy entraine une mortalité de 35% des animaux sur une période de 6 mois. On peut s’attendre à une mortalité comparable suite à une irradiation sur un irradiateur guidé par l’image. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Les effets cliniques de l’irradiation thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une injection unique de naphtalène n’a pas d’effet clinique notable. Les injections répétées de naphtalène peuvent générer de la fibrose péribronchique en 14 semaines, nous prévoyons d’injecter pendant 4 semaines seulement. Une expérimentation dédiée sera réalisée. La procédure complète ne sera mise en place que si cette expérimentation préalable ne démontre pas d’effet toxique notable.
Devenir
La collecte d’organes pour les analyses ultérieures (histologie, analyse génétique) nécessite l’euthanasie des animaux. Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 10 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement). Les souris sont suivies régulièrement et tout signe d’atteinte importante du bien-être animal (amaigrissement, immobilité, déshydratation importante, signes de détresse ou douleur, incapacité à se redresser lors du test de redressement) entrainera l’euthanasie anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Rôle de la modulation d’un sphingolipide hépatique dans le développement du diabète de type 2 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
736 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une amputation de l'extrémité de la queue sert au génotypage, puis un virus est injecté sous anesthésie, un régime gras est imposé douze semaines, avec gavages de glucose, injections d'insuline, sept prélèvements de sang à la queue et trois jours d'isolement en cage calorimétrique, pour étudier le rôle d'un dérivé lipidique du foie dans le diabète de type 2. Le porteur situe les retombées au conditionnel, l'identification de possibles cibles thérapeutiques. Il justifie la souris par le fait que l'homme partagerait 95 % de son génome avec elle et que le diabète de type 2 y serait bien reproductible.
Objectifs
Chez les personnes en bonne santé, l'équilibre entre la production du glucose et son utilisation est finement contrôlé. Lorsque la glycémie atteint un seuil critique, les cellules beta pancréatiques sécrètent de l'insuline qui a pour action de diminuer les concentrations circulantes de glucose en facilitant son stockage, principalement dans le muscle squelettique et le foie, tout en inhibant sa production par le foie. En cas d'obésité, lorsque l'action tampon du tissu adipeux pour stocker les acides gras est altérée, les tissus non adipeux comme les cellules musculaires, hépatiques et beta pancréatiques, accumulent des acides gras et cette accumulation conduit à un phénomène appelé lipotoxicité et finalement au diabète de type 2. Au cours de l'obésité, les acides gras ectopiques accumulés dans les tissus non adipeux sont métabolisés sous forme de dérivés de de dérivés lipidiques spécifiques. Alors que le rôle de certains de ces lipides dans le développement du diabète de type 2 est bien établi, l'effet d'autres sphingolipides dérivés des céramides sur la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. la relation d'autres lipides avec la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Des études ont montré que ces derniers auraient un effet positif ou négatif sur la lipotoxicité selon les tissus. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. D'une part, il s'agit d'étudier l'impact de la modulation des concentrations de ces lipides sur les tissus périphériques tels que les tissus adipeux, muscles squelettiques, cœur et cellules bêta pancréatiques au niveau métabolique durant l'obésité. D'autre part, nous essaierons de déterminer l'effet de la modulation des concentrations de ces lipides sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l'insulino-résistance dans le diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour lutter contre le développement d’une résistance à l’insuline des tissus périphériques en comprenant mieux les mécanismes intracellulaires mis en jeu en réponse à la modulation de certains dérivés lipidiques hépatiques. Ces informations seront précieuses pour contrôler le développement de l’insulinorésistance dans le foie, et donc le diabète de type 2. Elles pourraient permettre notamment l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, préalable au développement de molécules susceptibles de combattre le diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux sont pucés dès l’âge d'une semaine et un bout d'extrémité de la queue de moins de 0,5 cm est prélevé entre 7 et 10 jours après la naissance pour génotypage. Une injection intraveineuse d'un virus adénoassocié sous anesthésie durant quelques secondes. La mise en place d’un régime hyperlipidique durant 12 semaines. Un gavage au glucose pour le test de tolérance au glucose sur animal vigil durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d’insuline pour le test de sensibilité à l'insuline sur animal vigil durant quelques secondes. 7 prélèvements sanguins à la queue de 1 à 10 µL sur animal vigil lors des tests de tolréance au glucose et sensibilité à l'insuline durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour anesthésie durant quelques secondes. Un isolement de la souris pour mesures calorimétriques individuelles pendant 3 jours. Un placement en tube de contention pour mesure de la masse corporelle qui dure moins de 2 minutes. Les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires en fonction des besoins expérimentaux.
Impact sur les animaux
Le prelèvement d'un bout d'extrémité de la queue pour génotypage peut entrainer une douleur de courte durée. L'anesthésie gazeuse peut entrainer une perte de chaleur et un stress thermique. La mise à jeun des animaux pendant 4 heures lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent être stressant et entrainer une légère faim. Le gavage de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent aussi être stressant à cause de la contention de l'animal. L'injection d'insuline lors du test de tolérance à l'insuline peut induire une douleur de courte durée au niveau de la piqûre de l'aiguille et une hypoglycémie. Le prélèvement du sang à la queue pour mesurer la glycémie des animaux est un geste peu stressant pour l’animal. Une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue peut entrainer un léger inconfort et une douleur de courte durée. Les mesures de masse grasse et maigre par l'analyseur peuvent entrainer un stress lors de la contention de la souris dans le tube de l'appareil. La mise en cages calorimétriques pour 3 jours afin d’évaluer l’apport alimentaire et hydrique ainsi que la consommation métabolique de O2 et production de CO2 peuvent entrainer un stress à cause de l'isolement d'une souris par cage.
Devenir
A l’issue des différents actes, les animaux seront euthanasiés par deux méthodes réglementaires différentes en fonction des analyses à réaliser sur les organes/prélèvements.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les conséquences métaboliques d’une modulation de la concentration hépatique d'un dérivé lipidique chez la souris. Il s’agit d’un projet de physiologie intégré dans lequel tous les organes de régulation de l’homéostasie glucidique sont impliqués. C’est la raison pour laquelle le modèle de souris a été privilégié. Il serait difficile de mener à bien ce projet en utilisant qu’un seul modèle cellulaire car nous pensons que la modulation de la concentration hépatique du dérivé lipidique aura des conséquences intrahépatiques, mais sûrement aussi sur le métabolisme lipidique et glucidique d’autres tissus périphériques tels que les muscles squelettiques, les cellules beta pancréatiques et les tissus adipeux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un programme informatique pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous nous sommes basés sur des résultats obtenus précédemment sur la mesure des variables. De plus, nous utiliserons un test statistique adapté à notre étude pour déterminer si des différences existent entre les groupes des animaux après traitement ou régime. Nous utiliserons 736 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Pour atténuer le stress de la manipulation des souris dans le temps, le même expérimentateur effectue toutes leurs pesées régulières afin que les souris soient familiarisées au même expérimentateur. Quand vient l’heure des injections, nous gardons les animaux dans un environnement calme avec le minimum de personne dans la pièce pour éviter tout stress additionnel et inutile aux souris. Si un animal reste prostré dans sa cage pendant 48h maximum, ou montre une anomalie importante de la qualité du poil on ne le laisse pas souffrir et il est euthanasié. Les animaux sont observés tous les jours, y compris le week-end. Une grille de suivi sera mise en place avec comme contrôle une pesée hebdomadaire des animaux. Pour une souris sous régime normal, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. Idem, pour une souris sous régime gras, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. L'injection de virus adénoassocié est réalisée sous anesthésie et analgésie. Durant toute anesthésie, les animaux seront gardés sous une lampe chauffante pour éviter toute perte de chaleur. Des protocoles d’enrichissement de l’environnement de l’animal sont mis en place avec notamment la présence de nids végétaux et de tunnels.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris C57B6J génétiquement modifiées de 6 semaines, âge où les animaux sont sevrés et pubères et sont dans les conditions métaboliques stables. Le fait que l’homme partage 95 pour cent de son génome avec celui de la souris valide l’utilisation de cet animal. De plus, le diabète de type 2 est une pathologie humaine bien reproductible chez la souris.
Rôle de l’irradiation de la zone intestinale à faible dose dans la réponse tumorale au blocage de PD-L1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus et organes, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une prise de sang par ponction sous anesthésie générale, une injection de cellules tumorales et jusqu'à cinq injections de traitement sous anesthésie locale, certaines deux gavages, et une partie d'entre elles une irradiation localisée à faible dose sous anesthésie générale, que le porteur dit sans "nuisance". L'hypothèse vient d'un essai clinique de l'équipe associant radiothérapie et immunothérapie, où les patients dont l'intestin avait reçu une irradiation non voulue comptaient davantage de survivants à long terme, et le projet cherche chez la souris si cette irradiation renforce l'immunothérapie en modifiant le microbiote intestinal. Pour le choix de l'espèce, le porteur décrit les souris comme "génétiquement proches de l'Homme" et de "parfaits organismes-modèles", du fait de "leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie" plus courte.
Objectifs
Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.
Bénéfices attendus
L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.
Procédures
Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire de courte durée due à la préhension et au geste lui même.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.
Raffinement
Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.
Choix des espèces
Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.
Imagerie fonctionnelle de la partie intracrânienne du nerf optique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter une lentille au-dessus du nerf optique, une partie recevant en plus des injections dans l'œil ou dans le péritoine, puis elles sont observées éveillées ou anesthésiées jusqu'à dix fois sur un an sous stimulation visuelle, avant d'être tuées pour prélever le cerveau, afin d'étudier le couplage entre activité nerveuse et flux sanguin dans le nerf optique. Le porteur signale une douleur postopératoire de trois jours, une inflammation possible de l'œil après l'injection virale et un stress lié à l'imagerie chez l'animal éveillé. Il affirme que l'étude du flux sanguin exige un "animal entier" et que les données in vitro se sont révélées inutilisables faute de circulation.
Objectifs
L’hyperémie fonctionnelle est un réflexe déclenché par l’activation neuronale qui aboutit à une augmentation locale du flux sanguin. Ce réflexe, qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’Homme, met en cause un ensemble de mécanismes impliquant différentes cellules: les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les astrocytes et les neurones. Le poids des différentes voies de signalisations mises en jeu reste controversé. S’il a été particulièrement étudié au niveau de la substance grise, très peu de données expérimentales concernent la substance blanche. Le nerf optique, dans sa partie intracrânienne, est un modèle de substance blanche complètement inexploré. Le but du projet est d’analyser les bases cellulaires de l'hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique. Nous souhaitons plus précisément caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie des cellules ganglionnaires au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons 3 paramètres quantitatifs du nerf, jusqu’alors inaccessibles : la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Ceci pourra amener, dans un deuxième temps et dans le cadre d'une nouvelle demande, à utiliser cet outil pour comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique.
Procédures
Une partie des animaux (44souris) recevront 3 injections intrapéritonéales rapides pour induire le modèle (1/jour pendant 3 jours). L'injection ne dure que quelques secondes. Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie gazeuse et en conditions stériles. La procédure consistera en l’implantation d’une fine lentille au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (48 animaux) recevra une unique injection virale intravitréenne de virus adéno associés (AAV) dans un seul œil, sous anesthésie gazeuse. La procédure d’injection dure environ 10 minutes. Les animaux seront observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les sessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants en intra veineux. Durant les sessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les sessions d'imagerie, une partie des animaux (12 souris) est euthanasiée par une méthode réglementaire sous anesthésie pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale pourra induire une perte de poids (rarement supérieur à 10% du poids initial, après le dernier jour d’injection) ainsi qu'un stress et une douleur au point d'injection. L'acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale au niveau du site opéré (crâne) ainsi qu'une douleur durant les trois jours suivants la chirurgie. L'injection de virus adéno associés dans le vitré de l'œil peut entrainer une inflammation de l’œil. L'imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l'expérience particulièrement chez l'animal éveillé. Il existe un faible risque de mauvaise réaction à l’anesthésie.
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l'exactitude des données obtenue en imagerie.
Remplacement
Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique puisqu’il qu’il n’y a plus de flux sanguin sur les modèles in vitro.
Réduction
Le nombre de 132 animaux a été estimé sur la base d’expérimentations similaires effectuées précédemment au sein de notre équipe ainsi que par des logiciels de statistique. Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l'utilisation d'animaux autant que possible en observant plusieurs fois les mêmes animaux et en développant des analyses statistiques robustes pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : - en améliorant les conditions expérimentales par l'administration d'anesthésiques et analgésiques chaque fois que nécessaire - en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d'éviter toute souffrance à l'animal et son euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge - en garantissant des conditions d'hébergement appropriées aux animaux (ajouts d'enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) - en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la structure du bien être animal.
Choix des espèces
Il n'existe pas de méthode alternative possible à l'utilisation d'animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures. Les souris sont identifiées par tatouage aux pattes et génotypées après une biopsie de l’extrémité distale de la queue.
Mise au point d’un dispositif expérimental externe et non-invasif pour la mesure de paramètres physiologiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes réutilisées à l'issue. Rasées et anesthésiées à plusieurs reprises, elles sont équipées d'un textile connecté porté jusqu'à vingt-quatre heures, parfois isolées, pour mettre au point un dispositif de mesure cardiorespiratoire présenté comme une alternative aux capteurs implantés par chirurgie. Le porteur reconnaît que les souris peuvent chercher à retirer le dispositif et se blesser en se grattant, que l'isolement les stresse et que le rasage provoque hypothermie et inflammation. Il affirme que des modèles 3D précèdent la phase animale mais que le recours à la souris reste un "passage obligé" pour évaluer le comportement et la tolérance.
Objectifs
Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.
Bénéfices attendus
L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.
Procédures
Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.
Impact sur les animaux
Une fois équipé du dispositif, il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène qui a été décrit avec d’autres dispositifs externes et pour d'autres espèces, peut conduire à une irritation et des lésions dues à des grattages excessifs. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.
Devenir
À l’issue de ces procédures légères, à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis, tous les animaux pourront être réutilisés dans d’autres projets, contribuant à réduire le nombre d’animaux requis à des fins scientifiques.
Remplacement
Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.
Réduction
Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.
Choix des espèces
La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.
Détermination de la toxicocinétique d’un candidat médicament en vue de son utilisation clinique dans la lutte contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 36 en gravité sévère. Elles reçoivent chaque matin pendant onze jours, par voie orale, un candidat médicament contre la maladie de Huntington à doses croissantes, avec des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour examiner leurs organes et l'atteinte du cerveau, pour mesurer la toxicité du composé. Le porteur reconnaît qu'aux fortes doses la molécule peut provoquer une toxicité et des signes d'inconfort. Il affirme que les études de toxicité sont "obligatoirement" réalisées chez l'animal et constituent une "étape indispensable" avant tout médicament.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Un candidat médicament capable de réparer l’activité des neurones humains et de souris a été identifié. Il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie de Huntington. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de la maladie de Huntington à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet : 1/ identifier les éventuels effets toxiques d’une prise répétée à différentes doses de la molécule et 2/ évaluer les effets de plusieurs doses d’administration. Cette molécule est un traitement potentiel pour la maladie de Huntington qui n’a jamais été utilisée auparavant et qui mérite d’être étudiée.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que l'administration d’une seule dose de cette molécule avait un effet thérapeutique chez les souris atteintes de maladie de Huntington sans induire de toxicité. Afin de développer un traitement pour les malades, nous allons ici étudier l’effet de cette molécule administrée en dose répétée et voir quelles sont les meilleures doses répétées pour avoir un effet thérapeutique sans toxicité.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie orale tous les matins pendant 11 jours. Ce geste, d’une durée inférieure à 10 secondes, est bien toléré par l’animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après gavage, le premier et le dernier jour du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin et n’engendrera qu’un léger stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Le traitement sera administré oralement, voie d’administration obligatoire car c’est celle qui sera utilisée chez l’homme. La contention et l’administration orale peuvent engendrer un léger stress chez l’animal. Une toxicité induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de mesurer l’atteinte du cerveau par cette molécule.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont une étape indispensable à la validation d’une molécule avant d’en envisager son utilisation comme médicament chez le patient. Notre étude permettra de documenter les éventuels effets toxiques de cette molécule et aidera à définir les doses répétées à utiliser.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons le nombre d’animaux au minimum afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 13 groupes de 4 animaux. Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations de la molécule dans le sang et pour doser les différents paramètres de toxicité. Également, cet effectif sera suffisant pour nous permettre d’écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard par des analyses statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement par gavage sera réalisé par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à préparer les études de toxicité réglementaires qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie musculaire rare, elles subissent des tests de force et de coordination, une course forcée jusqu'à l'abandon entretenue par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures et des prélèvements allant jusqu'à 15 % de leur volume sanguin, avant un test terminal sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur signale une faiblesse musculaire dès quatre mois, une angoisse modérée et des douleurs musculaires liées à la course forcée. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne suffit pas à évaluer une thérapie et qu'il faut mesurer les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, réparties entre deux établissements. Selon les protocoles, elles reçoivent des injections répétées et subissent des tests de douleur par immersion de la queue dans l'eau chaude, pression sur la queue, filaments de Von Frey ou plaque froide, certaines après une chirurgie de constriction d'un nerf, pour tester des molécules ciblant des récepteurs de l'hypersensibilité à la douleur. Le porteur décrit un abaissement du seuil douloureux, des inflammations aux points d'injection et de suture et des troubles de la locomotion et de l'alimentation. Il affirme que l'évaluation de la douleur n'est "réalisable que sur l'animal entier" et présente la souris comme "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment identifié des composés capables de bloquer sélectivement ces récepteurs à neuropeptides RFamide impliqués dans l’hypersensibilité. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur chez la souris nous permettra de mieux comprendre le rôle de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi il nous sera possible d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 3020, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche génétique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces récepteurs à neuropeptides RFamide et de leurs ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception, c’est-à-dire de la perception de stimulus douloureux et dans le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x5 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection é x20 (10 secondes) / 15 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 15 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE3 : Injection x5 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE4 : Groupe 1 : Injection x6 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection x9 (10 secondes) / 14 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 14 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE5 : Groupe 1 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes Groupe 2 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes)/ 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes PE6 : Chirurgie incisionnelle (5 minutes) / Injection (10 secondes) x7 / 10 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 10 tests du plantar d’une durée de 15 minutes PE7 : Groupe 1 : Injection ITH sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection ICV sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes PE8 : Injection composé (10 secondes) x1 / Injection anesthésie générale x1 (10 secondes) / injection analgésie locale x1 (10 secondes) / Ouverture thoracique (30 secondes) / Prélèvement de sang (30 secondes) / Perfusion / Prélèvement du cerveau PE9 : Injection composé (10 secondes) x1 / Prélèvement sanguin sur animal vigile (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Les molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour les différents récepteurs RFamide disponibles au laboratoire dans les mêmes modèles de douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands des récepteurs RFamide sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris dont le fond génétique permet de visualiser au mieux le développement de l’hyperalgésie. Par ailleurs, c'est également ce fond génétique que nous avons utilisé pour générer des souris génétiquement modifiées pour les différents récepteurs RFamide, ce qui nous permettra de comparer les conséquences du blocage pharmacologique et génétique de ces différents récepteurs. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.
Evaluation de l’efficacité de l’injection de vecteurs thérapeutiques et de l’utilisation des ultrasons focalisés dans un modèle d’épilepsie néonatale liée au gène Kcnq2.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 responsable d'une épilepsie, elles reçoivent dès un à cinq jours de vie des injections de vecteurs dans le cerveau, sous anesthésie par le froid pour les nouveau-nés, puis des ultrasons focalisés déclenchent des crises et des tests de comportement évaluent leur développement, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les crises spontanées peuvent conduire à la mort de l'animal et décrit la séparation précoce d'avec la mère. Il affirme que les cellules isolées ne reproduisent pas un "cerveau entier" et présente cette lignée comme le seul modèle disponible de la maladie.
Objectifs
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie chez l'Homme. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises durant les tous premiers mois de vie (avant 3 mois) et est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Actuellement, il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Nous parlerons d'une souris mutée hétérozygote pour Kcnq2. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester des approches thérapeutiques. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par injection de vecteurs thérapeutiques et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et du comportement. Les vecteurs thérapeutiques seront délivrés dans le cerveau de souris mutées hétérozygotes pour Kcnq2 par des injections intracerébrales entre 1 et 5 jours post natal ou par voie veineuse dès 15 jours post-natal. L’injection des vecteurs thérapeutiques dès P15 sera couplée à l’utilisation de la technique de FUS (ultrasons) permettant de faciliter l'entrée des vecteurs dans le cerveau. Nous avons pour objectif d'identifier un traitement qui apportera un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèles devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible. Nous réaliserons des tests de comportement afin d'évaluer le neurodéveloppement de nos souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un vecteur thérapeutique s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine avec les neuropédiatres collaborateurs de notre équipe.
Procédures
Dans ce modèle de souris, les interventions sont : - biopsie auriculaire pour identification et génotypage (maximum 5 minutes)- anesthésie pour réalisation des injections thérapeutiques (maxiumum 20 minutes) - anesthésie pour pose de puce RFID (maximum 20 minutes) - induction des crises d'épilepsie par ultrasons (une seule sois, habituation de 30 minutes et soumission aux ultrasons de maximum 40 s) - des tests de comportement : apprentissage, mémorisation et préférence sociale (selon les tests de comportement, la durée varie entre 1h et plusieurs blocks sur une semaine) - anesthésie profonde terminale (l’injection dure moins de 2 minutes)
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de souris, les effets indésirables sont: - crises épileptiques spontanées conduisant à la mort de l'animal - séparation de la mère pour les nouveau-nés et les animaux de 15 jours pour l'injection et l'implantation de la puce pour les P15 - anesthésie sur glace pour les nouveau-nés avant injection et tatouage de la patte et à l'isoflurane chez les animaux de 15 jours avant injection ou implantation de la puce d'identification et avant perfusion terminale - biopsie auriculaire à l’aide d’un biopsy punch pour les animaux de 13 jours - injections thérapeutiques réalisées sous anesthésie- déclenchement des crises d'épilepsie par ultrasons - stress lié aux tests comportementaux - stress lié à la contention pour les injections avant perfusion et euthanasie des animaux de 15 jours
Devenir
Les animaux sont conservés pendant la durée de l'expérimentation (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques) puis mis à mort afin de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immunohistologiques et biochimiques (transcriptomiques et protéomiques). D'autres organes tels que le foie seront également prélevés afin de réaliser des contrôles supplémentaires de notre expérimentation et dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. L'étude de l’impact d’un traitement par injection de vecteurs thérapeutiques sur les capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.
Réduction
Dans le but de permettre l’obtention de résultats significatifs à partir de nos recherches, chaque groupe de souris (traité ou placebo) doit être composé de 12 animaux. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Par ailleurs nous prélevons le maximum d'organes (cerveau, foie, sang) sur la même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux. Ils sont hébergés, au maximum par 5, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température, la luminosité, l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. Les animaux sont hébergés dans une pièce avec peu de passage. Une affiche sera positionnée sur la porte indiquant le caractère sensible des souris, en particulier pour l'exposition sonore. Le personnel animalier et les utilisateurs seront formés et s’assureront de ne pas faire de bruit aux alentours des cages. La pièce de stabulation est directement située en face de la pièce d’expérimentation. Le change et le suivi seront réalisés par des personnes sensibilisées à la spécificité de cette lignée. La méthode d'administration du traitement la moins contraignante sera utilisée dans le cadre du respect de la douleur éventuelle et du stress de l’animal. Les crises d'épilepsie spontanées ou induites par les ultrasons durent quelques secondes et induisent généralement le décès de l'animal. Si la crise intervient en présence d'un expérimentateur, une stimulation des pattes et un massage du corps de l'animal permet de le sauver. La mère des nouveau-nés sera conditionnée aux manipulations et exposée aux odeurs qu’elle risque de rencontrer pendant 7 à 10 jours avant la procédure. Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant les injections ou l'implantation de la puce. Pour les animaux nouveau-nés, nous profitons de l'anesthésie pour les identifier avec de l’encre sous une des pattes pour les différencier. Nous ferons le génotypage a posteriori sur prélèvement post-mortem afin de moins perturber les nouveau-nés et la mère. Les animaux de 15 jours injectés seront génotypés par prélèvement d’un morceau d’oreille à 13 jours qui permet de les marquer. Les animaux injectés à un stade ultérieur seront génotypés lors du sevrage. Nous instillerons un anesthésique local sur l'œil injecté et un gel oculaire sur l'autre cornée. La profondeur de l’anesthésie sera attestée par une respiration profonde et régulière, une absence de réflexe de retrait et palpébral chez les souris de 15 jours. Les tests de comportement présentent une phase d’habituation. Nous réalisons une anesthésie profonde ou euthanasie avant tout prélèvement de tissu
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les injections de vecteurs thérapeutiques seront réalisées à différents stades : 2 groupes entre 1 et 15 jours post natal, deux groupes entre le sevrage et l'âge adulte - 1 à 5 jours post natal: pour un traitement en préventif - 15 jours post natal c’est-à-dire deux semaines avant l’apparition des premières crises - 30 jours post natal au moment des crises spontanées -90 jours post natal afin de voir si une injection tardive permet d’améliorer les capacités cognitives des souris
Effet de l’entrainement physique sur la santé cérébrale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis pendant quatre à huit semaines pour induire une fatigue physique et mentale, puis subissent huit tests comportementaux non précisés, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau, afin de mettre au point un modèle de fatigue cognitive liée au sport. Le porteur reconnaît que l'entraînement fatigue les animaux et que les tests provoquent un stress modéré. Il indique que ce projet mené avec trois industriels servira ensuite à tester un extrait végétal, et affirme que le modèle "ne peut pas être développé in vitro".
Objectifs
L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs des industriels est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, ce projet s’inscrit dans le cadre d’un partenariat entre 2 laboratoires académiques et 3 industriels afin de démontrer l’efficacité d’un extrait végétal sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Cette partie de projet dont il est question dans cette demande d'autorisation de projet (DAP) vise à développer un modèle d’entrainement physique en utilisant un tapis de courses qui induit une fatigue physique et mentale. La suite de ce projet (qui sera soumis dans une autre DAP) sera de déterminer si la supplémentation nutritionnelle avec l’extrait végétal améliore ces états.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de mettre en place au laboratoire le modèle d’entrainement physique chez la souris afin de tester, par la suite, dans une autre DAP, l’effet d’extraits végétaux sur les paramètres mesurés dans ce projet. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des symptômes de troubles de la fatigue chez les souris et une amélioration des comportements anxieux et cognitifs. L'objectif général de ce projet est de valider l'efficacité d'un complément alimentaire en vue de réduire la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et répétée.
Procédures
Les animaux réaliseront un entrainement physique pendant 4 ou 8 semaines après lequel ils effectueront 8 tests comportementaux qui durent au maximum 10 minutes afin d'évaluer leur fatigue physique ou mentale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests qui ne durent pas plus de 10 minutes. L'entrainement physique des animaux induira une fatigue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau et réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir et n’induisent pas de choc électrique comme la majorité des tapis utilisés. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien-être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la cellule SBEA. La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. L'objectif du projet est d'améliorer la fatigue cognitive de sportifs adultes. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois).
Développements méthodologiques et formations sur la plateforme imagerie par résonance magnétique (IRM) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 100
300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt séances d'IRM sous anesthésie, d'une durée maximale de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste, non pour répondre à une question précise mais pour mettre au point des protocoles d'imagerie et former de nouveaux utilisateurs de la plateforme. Le porteur signale les risques de l'anesthésie répétée, hypothermie, troubles cardio-respiratoires et non-réveil, ainsi qu'une douleur au point d'injection. Il indique développer d'abord les méthodes sur échantillons in vitro ou ex vivo et ne recourir à l'animal vivant que pour valider les protocoles.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment la caractérisation d'une cohorte d'animaux (phénotypage), le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d’imagerie. Un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants est possible avec l'IRM petit animal. L’objectif de ce projet est large et consiste à : (i) Développer des méthodes spécifiques innovantes aux besoins des équipes de recherches (ii) Adapter des méthodes standards existantes aux besoins des équipes de recherches (iii) Pratiquer des sessions de formation aux nouveaux utilisateurs de la plateforme Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices à long terme. Du point de vue scientifique, ce projet permet à la plateforme de rester à la pointe de la technologie et d’appliquer de nouvelles méthodes pour répondre à des questions scientifiques diverses (phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie). D’autre part, ce projet permet de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie déjà existants. A la fin de chaque étude, nous pouvons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permet de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes peuvent être utilisées pour appuyer une demande de financement. Du point de vue humain, ce projet permettra au personnel d’acquérir de nouvelles compétences : la préparation de l’animal (si la formation initiale d’expérimentation animale est validée), connaissances techniques de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des séquences, prise en main de la console IRM, traitement des données IRM.
Procédures
Les animaux, 300 au total incluant 200 souris et 100 rats, réaliseront des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés jusqu’à 20 fois sur le même animal avec un délai de 24h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : Risques liés à l’anesthésie : stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose Risque liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement
Devenir
Tous les animaux (300 au total, rats et souris confondus) peuvent être utilisés plusieurs fois dans le même projet : plusieurs examens par imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ou sans injection de produit de contraste peuvent être réalisés sur le même animal. En fin de période de maintien (15 mois ou 20 examens IRM) ou en cas de points limites atteints les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles IRM (imagerie par résonance magnétique) existants seront dans un premier temps réalisés sur des échantillons in vitro ou ex vivo (organe prélevé). Seules les méthodes nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées in vivo. Pour les autres méthodes, des tests in vivo seront réalisés en fin de processus afin de valider la méthode précédemment testée et développée sur des échantillons in vitro ou ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Selon les études, entre 1 et 3 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Un animal est le minimun nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode et 3 animaux est le minimum pour calculer la moyenne et l’écart-type sur les mesures réalisées. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant afin d’obtenir un échantillon plus représentatif. L’imagerie est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi longitudinal, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps de références d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous favorisons la réutilisation d’animaux ayant déjà été utilisés dans d’autres études avec des procédures classées légères. Un total maximum de 300 animaux est prévu sur les 5 années de ce projet, dont 200 souris et 100 rats. La réalisation d’un examen IRM (imagerie par résonance magnétique) sur un animal permettra également de former une équipe directement sur son étude pilote et d’éviter d’utiliser des animaux seulement pour de la formation. Le but de ce projet étant plutôt de réaliser des études de faisabilité, nous n’envisageons pas de réaliser systématiquement des tests statistiques. La moyenne et écart type seront calculés (pour les groupes supérieurs à 3 animaux) pour avoir une référence et pourront être utilisés à posteriori pour des calculs de puissance pour les études ultérieures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température/hygrométrie/éclairage. Les cages sont enrichies (nids, congénères, bâtonnets à ronger). Le transport des animaux entre la zone d’hébergement et la salle d’IRM (imagerie par résonance magnétique) se fait à l’aide d’un chariot dans une cage d’hébergement avec un enrichissement identique à celui de la cage d’origine. Les animaux sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle de préparation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Une seule cage à la fois est amenée dans la pièce de préparation. Pendant qu’un animal est utilisé, les autres animaux de la cage sont laissés dans leur cage avec nourriture, eau ad libitum et enrichissement. Avant l’installation de l’animal sur le berceau IRM, du gel oculaire est appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire, de la lidocaïne est appliquée sur les zones en contact avec les barres d’oreilles et de la vaseline est appliquée avant d’insérer la sonde rectale. La chambre de réveil est thermostatée, l’animal n’est remis dans sa cage d’origine que lorsqu'il est parfaitement réveillé. Il sera à nouveau examiné sous 24 heures pour vérifier sa récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration supérieure à 120 respiration par minute (RPM) ou inférieure à 20 RPM malgré l'ajustement d'anesthésique ; une température supérieure à 40 degrés pendant plus de 5 min, une chute de température (perte de 1 degré en moins de 5 min) non liée à la baisse de température de consigne du bain marie ou de modification de l’anesthésie, une température trop basse (inférieure à 34 degrés pendant plus de 5 min et sans augmentation de cette dernière). Un animal inclus dans un lot test fera au plus 20 IRM dans sa vie (entre 3 semaines et 15 mois) avec un délai de récupération de 24h minimum et en ayant vérifié son état de récupération. Les animaux engagés seront surveillés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe. En cas de signes de mal être : poils piqués, amaigrissement, posture voutée, un avis sera demandé à la structure en charge du bien être animal et au vétérinaire.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles rongeurs sont développés pour mimer des pathologies humaines. Les animaux peuvent être imagés entre 3 semaines et 15 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation longitudinale des animaux. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles.
Effet d’un inhibiteur de Janus kinases (JAK) sur la fonction plaquettaire, l’hémostase, et la thrombose artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Gavées une fois ou pendant sept jours avec un inhibiteur de JAK, elles subissent ensuite soit un prélèvement de sang terminal à l'aorte, soit la provocation d'une thrombose de la carotide sous anesthésie, pour confirmer que ce médicament de la polyarthrite favorise la formation de caillots. Le porteur signale que le gavage peut perforer l'œsophage ou provoquer une fausse route avec du sang dans la bouche, et que l'anesthésie peut perturber la respiration. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer la souris par des modèles in vitro pour étudier la thrombose.
Objectifs
La famille JAK (Janus Kinase) comprend 4 membres (JAK1, JAK2, JAK3 et TYK2) qui sont liés à des récepteurs appelés tyrosine kinases. Ce sont des enzymes qui sont responsables de la régulation de nombreuses fonctions cellulaires liées au système immunitaire. Les inhibiteurs de JAK ont un impact sur les maladies auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, l'utilisation d'inhibiteur universel de JAK, qui ciblent tous les membres de la famille, dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, pourrait présenter un risque de formation accrues de caillots sanguins. L'objectif de ce projet est de confirmer l'effet d’augmentation de formation des caillots sanguins d'un inhibiteur universel de JAK à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront de mieux comprendre l’effet de l'inhibiteur universel de JAK afin de permettre une meilleure prise en charge des patients atteints d’arthrite rhumatoïde i) sur la fonction des plaquettes,ii) l’hémostase qui est un processus qui permet au corps de stopper un saignement. L’hémostase « colmate » une blessure par exemple en formant un caillot qui va arrêter le saignement et iii) la thrombose artérielle qui va correspondre à la formation d’un caillot dans un vaisseau sanguin. Ce caillot peut obstruer partiellement ou complétement le vaisseau et ainsi entrainer des problèmes de circulation sanguine et des complications médicales.
Procédures
Ils seront soumis à un gavage en administration unique ou répété sur 7 jours sur animal vigile. Le gavage d'un animal prend environ 2 minutes, un prélèvement de sang terminal à l’aorte abdominale sous anesthésie qui dure environ 10 minutes ou à une thrombose à la carotide sous anesthésie qui dure environ 1 heure.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie (nécessaire au prélèvement de sang à l’aorte abdominale et au modèle de thrombose) sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Il existe également un risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang à l’aorte et du modèle de thrombose .L’insertion de la canule lors du gavage présente des effets indésirables tel qu’un risque de perforation. Un autre effet indésirable possible est le risque de fausse route lors de l'administration de l'inhibiteur universel par voie orale se manifestant par des difficultés respiratoires et/ou la présence de sang dans la bouche.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort. La formation d’une thrombose sur la carotide altère la circulation sanguine et donc la fin de la procédure nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Le but de ce projet est de confirmer l'effet pro-thrombotique du pan-inhibiteur de JAK en évaluant son impact sur la thrombose et les caillots sanguins à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo. La formation de thrombose est un processus complexe car il implique différents types de cellules et des conditions spécifiques liées à la circulation du sang (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin). En raison de cette complexité, il est impossible de remplacer l'utilisation de souris par des modèles in vitro ne nécessitant pas de recours à la souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est réduit au minimum, avec un nombre de 10 souris par groupe pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont plusieurs par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’étude in vivo y sont largement répandus et maîtrisés. Des souris WT C57BL/6J seront utilisées dans ce projet. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.