Souris

945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant un mois, un rasage et des injections de cellules tumorales, avec un suivi de la croissance des tumeurs, avant la mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que les lignées transgéniques développent dès trois semaines une tumeur de l'œil qui métastase à la peau, aux poumons et aux ganglions, avec une baisse de l'acuité visuelle. Il présente l'amélioration de la prise en charge des patients comme un bénéfice conditionnel.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau à haute capacité métastatique responsable de nombreux décès chaque année. Ces dernières années, les nouvelles immunothérapies restaurant les fonctions protectrices du système immunitaire ont permis d'améliorer le pronostic vital des patients. Néanmoins 60% d’entre eux résistent à ces nouveaux traitements, d’où la nécessité d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques ou de résistance à l’immunothérapie. Du fait de ses propriétés pro-tumorales, notre protéine d'intérêt a émergé comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Nous nous intéréssons plus particulièrement à son rôle délétère sur le système immunitaire. Sachant qu'elle est principalement exprimée par des cellules immunitaires associées à un mauvais pronostic, nous émettons donc l’hypothèse qu’elle favorise leurs fonctions pro-tumorales. Nous souhaiterions déterminer le rôle spécifique de chacune des cellules exprimant l'enzyme dans le développement du mélanome.

Bénéfices attendus

Nous déterminerons comment notre enzyme affecte la fonction des cellules immunitaires dans le contexte du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d'action de l'enzyme afin, à terme, de mieux la cibler. En combinaison avec les immunothérapies actuelles, la prise en charge des patients atteints de mélanome métastatique sera donc améliorée.

Procédures

Gavage quotidien sur souris vigiles (5 minute/gavage/souris) pendant 1 mois soit 30 gavages/souris au total. Rasage sur souris vigiles (5 minutes/souris). Une injection sous cutanée d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (5 minutes/injection/souris). Une injection par voie intra-veineuse d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (6 minutes/injection/souris). Evaluation de la croissance tumorale 3 fois par semaine par mesure de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Les lignées transgéniques présentent un phénotype dommageable : elles développent une tumeur primaire au niveau de l'oeil dès l'âge de trois semaines qui métastase rapidement au niveau de la peau, puis des poumons et des ganglions. Les principales nuisances attendues sont un trouble du comportement et une diminution de l'acuité visuelle de ces souris due au développpement de la tumeur primaire. Les souris transplantées peuvent présenter une tumeur ulcérée ainsi qu'un trouble du comportement. La transplantation intra-veineuse de cellules tumorales peut exceptionnellement induire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyse de la composition immunitaire des différents organes prélevés (tumeur primaire, métastases, ganglions drainants et non drainants, rate, péritoine).

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour étudier les conséquences sur les fonctions de différentes cellules immunitaires. Des expériences de stimulation in vitro ont également été réalisées pour déterminer quelles sont les cellules qui expriment l'enzyme. Cependant, le recours à un modèle animal est indispensable car la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives in vitro ou ex vivo.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi, les expériences reposant sur le modèle de souris transgénique de mélanome spontané nécessitent 40 souris par groupe. Le modèle de transplantation de cellules tumorales présente l’avantage d’être fortement reproductible d’une souris à l’autre. Ainsi, les expériences de transplantation de mélanome nécessiteront des groupes de seulement 10 souris.

Raffinement

Nous avons défini des points limites adaptés aux différents modèles utilisés et au delà desquels les animaux seront mis à mort. Ainsi, l’état général des animaux sera suivi lors des changes par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal sera communiqué aux responsables de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie). De plus, les souris RET seront diagnostiquées une fois par semaine par les responsables de projet pour suivre l'évolution du mélanome. La tumeur sous-cutanée des souris transplantées sera mesurée trois fois par semaine afin de surveiller l'aspect et la croissance tumorale. Les animaux injectés par des cellules B16 en IV seront pesés à J0, J7 et J12. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. De plus, les souris transgéniques développant une tumeur spontanée permettent de comparer la réponse immune à différents stades du développement du mélanome (à un stade précoce ou tardif de la maladie). Ce modèle est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine et permettra d’étudier les cellules immunes au sein d’une tumeur qui vient de se développer, ce qui est éthiquement impossible à partir de mélanome primitif chez l’homme. Enfin la disponibilité de modèles transgéniques permet d'étudier finement le rôle de l'enzyme dans le contexte tumoral. Le modèle de transplantation des cellules de mélanome, largement utilisé, présente l’avantage d’être reproductible d’une souris à l’autre et ne requiert pas un grand nombre de souris par groupe. Les données obtenues dans ces trois modèles seront complémentaires. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte (>6 semaines) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

1080 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou en profondeur, elles subissent des injections, des séances d'imagerie et une illumination laser de la tumeur sous anesthésies répétées, avant la mise à mort pour analyse des organes. Le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer". Il affirme que la biodistribution ne s'obtient que sur l'animal, sans autre modèle possible.

Objectifs

La PDT (thérapie photodynamique) consiste à sensibiliser les tissus cancéreux à l’action de la lumière par l’injection préalable d’une molécule photosensibilisante préférentiellement captée et retenue dans les tumeurs cancéreuses. Après injection intraveineuse du photosensibilisant en soi inactif, celui-ci va être capté et fixé préférentiellement par les tumeurs cancéreuses pour des raisons diverses. Dans un deuxième temps, l’exposition de la tumeur à une lumière de type laser va provoquer une photo activation définie par le changement d’état des molécules chromophores induit par la lumière. La molécule excitée possède un excès d’énergie qu’elle va perdre rapidement et spontanément soit sous forme de chaleur, soit en émettant une fluorescence (photo diagnostic), soit enfin, en passant par un état intermédiaire dit «triplet» responsable des phénomènes de photosensibilisation. La cytotoxicité induite par la PDT est donc principalement le fait de phénomènes d’oxydation entraînant la dégradation des acides aminés, de certaines bases nucléiques et des lipides composant les membranes cellulaires et les mitochondries. La thérapie photodynamique est une méthode thérapeutique originale et séduisante ; après une période de doute, un renouveau apparaît grâce à l’apport de nouvelles technologies, notamment au niveau des sources de lumières laser plus accessibles sur le plan financier et technique et aussi par le développement actuel de nouvelles molécules photosensibilisantes plus adaptées aux différentes pathologies cancéreuses. Le but ici sera d'évaluer l'efficacité de plusieurs nouvelles nanoparticule PDT.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Dans le cadre du développement de tumeurs sous-cutanée, les animaux subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (1 fois, 2 minutes). Dans le cadre du développement de tumeurs orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations orthotopiques de cellules cancéreuses dans leur environnement, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) puis des injections intrapéritonéales chaque semaine dans le cadre du suivi par bioluminescence (1 fois par semaine, 1 minute)suivi d'une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie (1fois par semaine, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie, les animaux subiront une injection IV sous anesthésie gazeuses (1 fois, 2 minutes) puis seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité PDT les animaux subiront une illumination de la tumeur sous anesthésie gazeuse (3 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude la principale nuisance attendue sera une exposition répétée à l'anesthésie gazeuse (pour l'implantation de tumeurs, pour l'imagerie et pour l'illumination des tumeurs). Certaines souris subiront une chirurgie pouvant également entrainer des nuisances (contrôlées grace à des antidouleurs). Ces souris auront également chaque semaine une injection intrapéritonéale.

Devenir

A l'issus des procédures 1 et 2, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en fluorescence invivo. A l'issus des procédures 3 et 4, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en histologique

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. (test satistique utilisé : Mann and Whitney). De plus, comme expliqué dans le projet, si la bioditribution d'une nanoparticule n'est pas satisfaisante, nous ne la passeront à l'étape P2, ce qui permettera de réduire le nombre d'animaux réelement utile à l'étude.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo. Les souris seront utilisées à 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le muscle de la jambe, après incision, une injection de cardiotoxine et de vésicules extracellulaires, avant l'euthanasie pour prélever les tissus. Le porteur indique n'avoir pas observé de nuisance importante lors d'injections comparables antérieures. Il affirme que l'animal est le "seul organisme vivant" permettant d'étudier l'effet de ces vésicules sur un muscle lésé.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de déterminer in vivo les impacts de deux types de Vésicules Extracellulaires (microvésicules et exosomes) produits par les macrophages au cours du diabète de type 2 sur le processus régénératif musculaire.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de déterminer si les Vésicules Extracellulaires relarguées par les macrophages au cours du diabète de type 2 affectent le métabolisme du muscle squelettique et participent à l'apparition d'une sarcopénie qui se caractérise par une diminution de la masse musculaire, de la force musculaire et des performances physiques, bien connue chez les patients diabétiques. Le rôle de l'inflammation musculaire, et plus particulièrement le rôle du dialogue macrophage-muscle est peu connu et ce projet permettra d'identifier des mécanismes nouveaux permettant d'expliquer la dégradation du métabolisme musculaire. Ce projet permettra aussi de travailler sur l'environnement du muscle faisant intervenir d'autres types cellulaires : les cellules immunitaires, les fibroblastes, les cellules satellites

Procédures

En dehors de l’injection de cardiotoxine et de Vésicules Extracellulaires, les animaux ne seront pas soumis d’autres interventions. La chirurgie consistera a réaliser une incision cutanée de 2 à 3 mm pour aller cibler le muscle TA (Tibial Antérieur) et y injecter en un ou plusieurs points les cardiotoxines et vésicules extracellulaires.

Impact sur les animaux

A travers une expérience précédente dans le cadre d’un projet de recherche similaire nous n’avons pas observé de nuisances importantes suite aux injections intramusculaires. Afin de minimiser d’éventuelles nuisances nous souhaitons réaliser une analgésie avec de la Buprénorphine (Vetergesic®) à la dose de 0.08 mg/kg injectée en sous-cutané minimum 30 minutes avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront suivis en post-injection à l'aide d'une grille de points limites afin de réagir au besoin et de prendre en charge une éventuelle douleur.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car l’objet est ici précisément de tester l’effet des vésicules extracellulaires in vivo après avoir généré des données expérimentales in vitro, et ce, dans le but de déterminer leurs pertinences biologiques. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier cet impact sur le phénotype d’un muscle lésé.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus sera de 11 souris par groupe soit un nombre maximal de 77 animaux au total. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie cellulaire lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie cellulaire lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Une étude statistique est prévue pour comparer les groupes.

Raffinement

1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons, frisottis de papier (sizzle dry), bûchettes de bois et hébergement à deux animaux si possible). 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), 3) l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie si pas d'autre alternative), 4) une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille de scoring de la douleur dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Le projet s'inscrit dans un contexte de diabète de type 2 et la souris C57BL6 est le seul fond génétique qui développe un diabète "gras" suite à un régime hyperlipidique ou hyperlipidique/hyperglucidique. Afin de rester cohérent avec les autres études de l'équipe sur le diabète, basés sur l'utilisation de la C57BL6, nous utiliserons ce fond génétique pour cette étude. L’injection des vésicules extracellulaires (VEs) sera réalisée chez les animaux à l'âge de 2,5 mois puis ceux-ci seront suivis durant 6 jours, date à laquelle ils seront sacrifiés. Il s'agit donc de jeunes adultes. Dans la mesure où une lésion musculaire va être générée pour suivre l'impact des vésicules sur le processus régénératif, nous souhaitons nous placer à un âge où la croissance est bien avancée et où les tissus musculaires présentent un aspect homogène pour éviter toute variable dans nos mesures.

1260 jeunes souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Irradiées au cerveau dès l'âge de dix jours sous anesthésie, elles subissent des imageries et des prélèvements de sang, puis sont euthanasiées à différents délais pour prélever le cerveau. Le porteur indique attendre surtout une hypothermie et un stress liés à l'anesthésie et à l'irradiation. Il justifie l'étude par l'évaluation du risque des scanners et opérations sous rayons X pratiqués chez les enfants, un bénéfice présenté comme lointain.

Objectifs

Des millions de scanners de la tête sont pratiqués chaque année chez des enfants. De même des opérations de chirurgie de la tête sous radio sont réalisées chez des enfants. Ces pratiques apportent un bénéfice considérable en termes de santé publique. Néanmoins, le risque lié à ces actes, nécessitant l’utilisation de rayons X, chez des enfants nécessite d’être évalué. D’un point de vue épidémiologique, les conséquences au niveau du développement du cerveau de l’exposition cérébrale d’enfants à des doses de rayonnements ionisants inférieures à 2 Gy ne sont pas clairement établies et sont peu documentées. En ce qui concerne les connaissances scientifiques dans ce domaine, elles restent limitées. Dans ce contexte, nous avons développé des modèles d’irradiation du cerveau ou de structures cérébrales chez la souris âgée de 10 jours afin d’évaluer : (i) les seuils d’apparition des troubles du comportement chez les souris adultes, (ii) les mécanismes liés à ces effets et (iii) la manière dont l’irradiation impacte le cerveau en développement selon la zone irradiée. Des troubles (comportement, mémoire) ont pu être observés à l’âge adulte par suite de ces irradiations dans des projets précédents. Afin d’évaluer les mécanismes liés à ces effets, la formation de nouveaux neurones au niveau de certaines parties du cerveau a été étudié ainsi que l’inflammation au niveau du cerveau chez les souris adultes. Pour compléter nos résultats, nous souhaiterions étudier, dans le temps, l’effet de l’irradiation (dans des doses faibles à modérées) du cerveau ou d’une partie du cerveau de jeunes souris sur la vascularisation et l’inflammation du cerveau.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, l’étude des vaisseaux et de l’inflammation après irradiation permettra d’améliorer notre compréhension sur les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant avoir des effets sur les fonctions cérébrales. Ce projet est un complément de projets déjà réalisés avec ces mêmes modèles expérimentaux. Ensuite, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances scientifiques sur les effets de l’irradiation sur la vascularisation cerveau dans le cadre d’exposition à des stades jeunes. Ainsi à plus long terme nos résultats pourraient contribuer à une meilleure évaluation du risque encouru par les enfants ayant été exposés à des dans des procédures médicales.

Procédures

Les jeunes souris mâles seront anesthésiées pour l’irradiation, les imageries éventuelles, le prélèvement de sang et les perfusions au moment de l’euthanasie (solution pour fixer les tissus et/ou pour colorer certains tissus).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de l’anesthésie et de l’irradiation peuvent être une hypothermie, un réveil plus long de l’anesthésie ou un stress lors de la journée d’irradiation. Aux doses d’irradiation utilisées, il n’est pas attendu et il n’a pas été observé de lésions de brulure pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de réaliser les prélèvements de cerveaux et des imageries.

Remplacement

L’impact de l’irradiation sur la mise en place de la vascularisation cérébrale ainsi que sur la réponse inflammatoire du cerveau et les conséquences potentielles à l’âge adulte nécessite d’être étudiés in vivo au sein d’un système complexe intégré qui évolue dans le temps. Ce type d’études n’est pas actuellement possible avec des méthodes non animales.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques. D’après nos études précédentes, il est nécessaire d’avoir 8 ou 10 animaux pour chaque groupe selon les analyses réalisées afin d’obtenir des résultats exploitables et robustes.

Raffinement

Avant la mise bas, les femelles gestantes seront mises une par cage afin d’éviter tout stress avec du papier kraft et du coton pour qu’elles puissent faire un nid et également une petite maison. Le jour de l’irradiation, les souriceaux sont mis ensemble dans une cage à 37°C, puis anesthésiés pour l’irradiation. Au réveil, ils sont remis dans leurs cages avec leurs mères. Puis, les petits resteront avec leurs mères jusqu’au moment du sevrage. Les animaux seront ensuite hébergés par groupe de 5 maximum dans des cages adaptées avec un enrichissement. Un suivi strict des animaux sera réalisé au quotidien. Leur comportement, leur poids, et tout signe clinique seront évalués afin d’identifier les points limites qui nécessiteront leur euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des souris dans ce projet. Elles ont été notamment choisies car elles ont déjà été largement étudiées en neurobiologie. De plus, nos modèles d’irradiation ont déjà été développés et validés dans ce modèle au sein de notre laboratoire. Les animaux seront irradiés 10 jours après leur naissance. Cet âge correspond à une période critique de sensibilité du cerveau aux effets de l’irradiation et autres chimiques. Les euthanasies seront réalisées pour plusieurs temps post-irradiation : 6 heures, 3 jours, 1 semaine, 4 semaines et 3 mois. Les effets préalablement observés l’ont été majoritairement au temps 3 mois post-exposition. D’une part, ce projet complétera les données pour ce temps. D’autre part, l’étude à différents temps post-irradiation permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant conduire aux effets observés à 3 mois post-irradiation.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras pendant quinze semaines, elles subissent un jeûne, un régime cétogène ou un gavage d'antidiabétique, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des prélèvements sanguins répétés, avant l'euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur signale une hypoglycémie et une hypothermie possibles lors du jeûne. Il affirme travailler sur "l'animal entier" au motif qu'aucune méthode alternative ne peut mimer les voies métaboliques en jeu.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Ces maladies représentent la deuxième cause de transplantation de foie et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer la capacité de différentes traitements ou interventions nutritionnelles et pharmacologiques à diminuer l'obésité, le diabète et la stéatose hépatique et à en comprendre les mécanismes. Ainsi pour cette étude, des souris mâles et femelles seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes interventions : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène, un traitement avec un anti-diabétique utilisé en clinique. Les effets de ces différentes interventions seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir les effets de différentes interventions sur la progression de l'obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2ème cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. A l'issue de ces 15 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 4 semaines , un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 4 semaines, un traitement par gavage oral avec un anti-diabétique (inhibiteur du transporteur de glucose rénal SGLT2, 10 mg/kg/jour dans un volume maximum de 200 ul)) utilisé en clinique pendant 4 semaines, un régime standard pendant 4 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 4 semaines. Le gavage oral avec l'anti-diabétique durera moins de 30 sec (contention comprise) par animal et par jour. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Pour les tests de réponse au glucose (OGTT) et à l’insuline (ITT), des prélèvements d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stétaose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et d'insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale afin de réaliser des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc) dans le but d'évaluer les effets des différentes interventions sur l'obésité, le diabète de type 2 et la stéatose.

Remplacement

Nous travaillons sur l’animal entier car les phénomènes biologiques étudiés (voies métaboliques) font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d'hébergement : hébergement collectif (4 ou 5 animaux/cage) et environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans les cages afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l'expérimenteur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l'apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de véridier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l'évaluation des ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l'animal sera aussitôt retiré de l'étude.

Choix des espèces

L'utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet de mimer rapidement la pathologie étudiée grâce à l'utilisation de régimes obésogènes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7 semaines d'âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l'individu adulte.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique créant une lésion cérébrale, un test comportemental du cylindre, puis des injections quotidiennes de lévodopa pendant trois à quatre semaines qui provoquent des mouvements involontaires. Le porteur décrit ces dyskinésies, rotations, mouvements excessifs des pattes et de la langue, toilettage excessif, ainsi qu'une perte de poids et de poils. Il justifie le modèle par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité du réseau neuronal en jeu.

Objectifs

La maladie de Parkinson est causée par la mort progressive des neurones dopaminergiques, qui se manifeste par des tremblements et la perte progressive de la mobilité du patient. Le traitement le plus courant consiste à administrer un précurseur de la dopamine, la lévodopa (L-DOPA), qui compense dans un premier temps le manque de dopamine. Malheureusement, au fil des années de traitement, l’administration de la lévodopa, nécessaire au patient pour son activité motrice, déclenche également des mouvements involontaires (dyskinésies). Ces dyskinésies s’amplifient progressivement au point d’amener à l’arrêt du traitement. Des études récentes sur des modèles animaux ont permis de mieux comprendre comment la répétition du traitement lévodopa génère ces dyskinésies. Ces travaux indiquent que, au fil du traitement, certains neurones développent une hypersensibilité à la levodopa, qui est directement la cause des dyskinésies. Nous proposons une nouvelle approche pour modérer la réponse neuronale à la dopamine en modifiant l’action d’une enzyme, ce qui pourrait prévenir les dyskinésies chez les patients. L’objectif de ce projet est d’établir la preuve de concept de cette nouvelle stratégie thérapeutique, et comporte deux volets. D’une part, nous validerons le mécanisme d’action thérapeutique sur des préparations de neurones in vitro ; d’autre part, nous testerons l’effet thérapeutique in vivo. Ces deux volets seront réalisés à partir de souris parkinsoniennes, traitées par la lévodopa pour l’induction de dyskinésies. L’effet thérapeutique sera validé in vivo en administrant des activateurs ou inhibiteurs de l’enzyme ciblée, et en mesurant l’effet de ces molécules sur la production de dyskinésies chez la souris. L’imagerie de biosenseurs permet de mesurer in vitro la réponse des neurones à la dopamine. Nous mesurerons avec cette méthode, sur des neurones provenant des mêmes animaux, l’efficacité des molécules thérapeutiques pour réduire la réponse à la dopamine.

Bénéfices attendus

Alors que l’administration de lévodopa plusieurs fois par jour reste la thérapie la plus courante, il reste malheureusement peu d’option thérapeutique lorsqu’un patient parkinsonien développe des dyskinésies trop invalidantes. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques apparaît donc comme un impératif de santé publique. Sur la base d’études fondamentales d’une part, et de données obtenues sur des modèles animaux de la maladie, nous mettons en avant une hypothèse tout à fait originale pour modérer la réponse neuronale excessive à la dopamine qui survient lors de l’administration de lévodopa, et qui est la cause des dyskinésies. Ce projet vise à tester cette hypothèse in vitro et in vivo : si elle se vérifie, notre travail apportera des arguments solides qui motiveront le lancement de nouvelles recherches pharmacologiques pour développer de nouveaux médicaments. Si notre hypothèse est invalidée, cela forcera à reconsidérer nos connaissances dans ce domaine et à affiner nos modèles théoriques, ce qui pourra alors orienter les recherches vers d’autres cibles thérapeutiques. Par ailleurs, la partie imagerie in vitro de notre étude apportera des données tout à fait nouvelles quant à la réponse à la dopamine dans les neurones provenant de souris parkinsoniennes. Ce nouveau jeu de données, avec une précision spatiale et temporelle encore jamais atteinte, amènera des nouvelles connaissances sur les changements subis par les neurones au cours des différentes phases de la maladie de Parkinson et de son traitement par la lévodopa. Enfin, ces mesures seront extrêmement utiles pour établir des modèles numériques de neurones, ce qui permettra d’avancer dans la direction d’études physiologiques «in silico».

Procédures

Tous les animaux seront impliqués dans les actes suivants : - une chirurgie stéréotaxique afin d’induire le modèle hémi-parkinsonien ; effectué sous anesthésie/analgésie (1h). - 3 semaines après la chirurgie : l’étendue de la lésion est évaluée par le test comportemental du cylindre réalisé 1 fois pendant 3 minutes (l’animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes et un expérimentateur compte le nombre de fois où l’animal touche la paroi du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche) - Traitement quotidien sur animal vigile pendant 3 à 4 semaines par injection intra-péritonéale, avec ou sans les molécules pharmacologiques à tester (quelques secondes par souris) - Une euthanasie en vue des différents prélèvement et analyses sous anesthésie Une partie des animaux subira une étape supplémentaire juste avant l’euthanasie : - une deuxième chirurgie sous anesthésie/analgésie (1h20) pour injecter un virus nécessaire pour de l’imagerie de biosenseurs. L’animal est euthanasié le lendemain.

Impact sur les animaux

A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans l’hémisphère droit. Des symptômes moteurs sont visibles dans les jours suivant la chirurgie, ce qui se manifeste par une activité motrice amoindrie, associée à une perte de poids. L’hémisphère cérébral gauche non lésé compense progressivement et après une à deux semaines, seuls des tests spécifiques peuvent révéler l’existence de la lésion. Le traitement répété par la lévodopa induit progressivement l’apparition de dyskinésies. Celles-ci peuvent apparaître entre 10 min et 3 h après injection de la lévodopa. La lésion étant effectuée à droite, les mouvements anormaux se produisent uniquement du côté opposé à la lésion. Ces mouvement anormaux apparaissent sous diverses formes : rotation à gauche, rotation du buste de l’animal vers la gauche, mouvement excessif des pattes, sortie excessive de la langue, toilettage excessif. Ce traitement quotidien peut mener chez certains animaux à une faible perte de poids ainsi qu’une perte de poils au niveau du flanc gauche suite aux mouvements et toilettages répétés à gauche.

Devenir

L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.

Remplacement

Ce projet vise à analyser les mécanismes neuronaux à l’origine des dyskinésies induites par le traitement à la lévodopa, et à tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour limiter ces mouvements involontaires. L’effet de la lévodopa et le développement des dyskinésies impliquent de nombreuses adaptations au sein d’un réseau de neurones impliquant diverses régions du cerveau. Il est à notre connaissance impossible de reproduire la complexité des effets du lévodopa sur des cultures de neurones. Les études par modélisation «in silico» ne sont pas non plus possibles pour étudier les dyskinésies induites par la lévodopa car le fonctionnement de neurones n’est pas encore connu avec suffisamment de précision pour pouvoir développer des modèles numériques fiables. Un des objectifs de notre projet est justement de produire des données qui permettront ensuite de concevoir des modèles numériques plus fiables et représentatifs de la maladie. Enfin, ni des observations sur cultures cellulaires, ni des modélisations numériques, ne prédisent avec une fiabilité suffisante l’efficacité éventuelle d’un traitement pour des patients. Pour que la nouvelle stratégie thérapeutique que nous suggérons puisse déclencher des recherches pharmaceutiques ultérieures, il est indispensable de démontrer cet effet dans une situation expérimentale qui reproduit les aspects critiques du phénomène, ce qui, à ce jour, ne peut être obtenu que dans un modèle animal. C’est pourquoi nous proposons d’utiliser des souris avec une lésion d’un seul hémisphère, une situation dans laquelle cette moitié lésée du cerveau reproduit de nombreux aspects des dyskinésies induites par la lévodopa.

Réduction

Les souris seront utilisées pour l’étude comportementale in vivo ainsi que pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Cette double utilisation permet de valoriser au mieux les animaux utilisés dans ce projet. De plus, pour l’étude mécanistique, nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs est établie grâce à un calcul de puissance et permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera un total de 320 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires. Ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie adaptée avec nourriture et eau à volonté, matériel pour édifier le nid. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. La lésion des neurones dopaminergiques est réalisée uniquement dans un hémisphère du cerveau ce qui induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, l’animal est pesé et reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. Pendant toute la durée de récupération, l’animal est placé sur un tapis chauffant et une nourriture enrichie est à sa disposition. Au delà des trois premiers jours, le poids de l’animal et la présence de signe de douleur sont évalués. Des points limités sont définis au préalable et un suivi quotidien permet de garantir le bien être des animaux. Dans le cas contraire, des mesures sont mises en œuvre pour y remédier (utilisation d’analgésique, d’anti-inflammatoire non stéroïdien ou euthanasie).

Choix des espèces

Notre projet doit faire appel à un modèle animal qui représente avec un maximum de fidélité les aspects de la maladie de Parkinson que nous souhaitons étudier. En particulier, notre modèle doit reproduire les dyskinésies produites par l’administration de L-DOPA, ce qui est le cas avec le modèle murin hémiparkinsonien. Ce modèle animal présente une lésion d’un seul côté du cerveau, ce qui minimise les dommages infligés à l’animal. De plus, les symptômes parkinsoniens et dyskinésies sont obtenus sur un laps de temps de quelques semaines, ce qui est court par-rapport à d’autres modèles de maladie de Parkinson : la durée des procédures est donc réduite. Ce modèle animal est bien décrit pour des souris mâles de 8 à 12 semaines au début du protocole, ce qui détermine notre choix.

1750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de virus dans le cerveau et l'implantation d'une fenêtre crânienne, puis une tâche de détection tactile la tête fixée, avant la mise à mort en fin de projet. Le porteur décrit un risque de douleur postopératoire et d'infection lié aux chirurgies et aux implants. Il présente les retombées pour la santé humaine comme lointaines et justifie le recours à l'animal vivant éveillé par la nécessité d'un cerveau intact.

Objectifs

L'attention spatiale régule la réactivité sensorielle et la perception, agissant comme un "projecteur" qui rend le stimulus plus significatif et plus visible. L’attention facilite galement les processus d'apprentissage. L'activité neuronale est modulée par l’attention dès les premières étapes du traitement sensoriel au niveau cortical. Il a été proposé que le substrat neuronal véhiculant l’information attentionnelle serait porté par des connexions descendantes (top-down), c’est-à-dire depuis des aires corticales secondaires ou associatives vers le cortex sensoriel primaire. Dans le cas de la perception tactile, ces informations attentionnelles descendantes seraient projetées sélectivement vers l’aire du cortex somatosensoriel primaire (S1) traitant des informations de la partie du corps concernée. Bien qu’il existe des données appuyant cette hypothèse, aucune démonstration directe de la transmission des signaux attentionnels par ces connexions descendantes n’a été faite. De même, les mécanismes permettant à ces connexions descendantes de moduler la perception et l'apprentissage sensoriel restent inconnus. Je propose de tester cette hypothèse chez des souris effectuant une tâche de détection tactile guidée par l'attention.

Bénéfices attendus

Dans nos sociétés vieillissantes, les problèmes d’attention liés à des conditions pathologiques ou à l’âge prennent une place grandissante. Il devient donc crucial de comprendre les mécanismes de l’attention pour améliorer les diagnostics médicaux et développer de futurs traitements. Les résultats issus de nos travaux auront donc des implications importantes dans le domaine de la santé, pour l’amélioration des conditions de vie humaine.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus :sur des animaux P0 et animaux adultes entre 10 et 20 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H

Impact sur les animaux

Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Les animaux seront maintenus en vie après les protocoles de chirurgie et comportement ensuite ils seront mis à mort à la fin du projet

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 1 semaines à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, une greffe sous-cutanée de cellules de lymphome puis des injections intraveineuses d'immunoliposomes, avec un prélèvement sanguin. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre 1500 mm3 et provoquer une détresse de l'animal isolé. Il affirme qu'après une validation in vitro, le remplacement "n'est plus possible à ce stade" du projet préclinique.

Objectifs

Le Lymphome représente la moitié des cancers du sang, c’est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération cancéreuse des cellules lymphocytaires matures. Le lymphome se caractérise par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Les principaux symptômes consistent donc en une augmentation de la taille des ganglions. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (liposomes) que nous avons validé dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines dans des souris immunodéficientes ou des greffes de cellules lymphomateuses murines dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces liposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de Lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels ou liposomes biologiques issus de la culture cellulaire des cellules de Lymphome) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Lymphomes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des traitements par voie intra péritonéale (i.p.) 15 et 7 jours (J-15 et J-7) avant l’injection des tumeurs. Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+6, J+9, J+12, durée par injection de 5 secondes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 1 minute) sera réalisé à J+15 jours après la greffe.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont des injections intraveinales et intraperitonéales, des contentions des souris dans un tube de contention afin de prélever le sang, des coupures sur la veine caudale pour prélever le sang. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal, jusqu’à 1500 mm3. Ce développement tumoral peut engendrer une détresse de l’animal qui peut se trouver isolé. L’ensemble de ces nuissances justifient la classe de sévérité des expérimentations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Les effectifs des souris seront déterminés et nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent plusieurs fois par jour à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules Lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires établies et commercialisées. Trois jours après l’injection, les cellules lymphomateuses forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection sous cutané. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin (A1, mus musculus). L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les Lymphomes en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation grasse, elles reçoivent un gavage quotidien puis le composé anti-obésité par gavage, et passent 72 heures en cages métaboliques en hébergement individuel. Le porteur reconnaît que l'isolement "peut induire une nuisance" chez ces animaux sociables, mais le juge "incontournable" et lié à la "nécessité" de mesurer les dépenses énergétiques. Il conclut que l'utilisation d'animaux devient "indispensable" faute de méthode de substitution, l'étude étant menée pour un client industriel.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule par gavage pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration, également par gavage. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les souris qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Les composés testés par le client ont tout d'abord été développés sur la base d'une approche computationelle des données existantes sur les cibles d'intérêt (ici la thermogenèse adptative). Ces approches ont permis de développer des composés ciblant théoriquement la thermogéenèse adaptative. Dans un second temps, des données préliminaires ont été acquises par le client par le biais d'approches sur cultures cellulaires d'adipoytes et sur explants tissulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence un impact des composés tests sur la thérmogénèse adaptative, notament par une forte activations du gène UCP-1. A ce stade de développement, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques devient indispensable car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact global d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le fait de travailler avec des animaux préconditionnés par le fournisseur permet de limiter la variabilité du phénotype obtenu, les animaux livrés ayant tous répondus au régime (pas d'animaux résistants). Ceci permet de limiter les effectifs de chaque groupe (pas d'animaux résistants).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de matériel de nidification spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris rendues obèse par une alimentation enrichie en graisse est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment employé dans les études précliniques de composés visant les troubles métaboliques. Ce modèle à pour avantage majeur de présenter une étiologie de la pathologie similaire à celle responsable de l'obésité chez l'humain.