Souris
Maintien des lignées de souris Delta F508 et CFTR à phénotype dommageable.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir et produire deux lignées reproduisant la mucoviscidose. Ces souris présentent un phénotype dommageable, amaigrissement, difficultés respiratoires et constipation, atténué par un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson. Les descendants homozygotes et sauvages sont expédiés à des équipes collaboratrices, les hétérozygotes réutilisés pour la reproduction ou mis à mort. Le porteur affirme que l'étude de cette maladie génétique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier", au motif des interactions entre organes et microbiote.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de maintenir et produire des lots expérimentaux de deux lignées à phénotype dommageable : souris Delta F508 et CFTR. Ces 2 lignées touchent le gène CFTR mais les 2 modifications génétiques sont différentes. Pour la lignée CFTRUNC, le gène CFTR a été modifié afin que celui-ci ne soit plus actif. Cette lignée créée par une équipe américaine a été envoyé en France en 1993 à la demande de l’association Vaincre la Mucoviscidose (anciennement AFLM). Pour la lignée CFTR deltaF508, la mutation est créée dans le gène CFTR en 1995 par une équipe Néerlandaise , celle-ci est identique à celle observée chez certains patients atteints de mucoviscidose. L’association Vaincre La Mucoviscidose est propriétaire des élevages de ces deux lignées dans notre établissement. Elle lance annuellement des appels à projets de recherche sur la mucoviscidose, valide scientifiquement ceux qui seront autorisés à recevoir des lots d’animaux. Notre établissement reçoit la liste des lauréats retenus par l’association et organise les élevages pour être en mesure de distribuer les lots aux chercheurs selon les consignes données. Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Ces souris fragiles doivent donc être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le laxatif doux est un médicament de santé humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré par nos souris. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote. Cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l'âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de fournir des animaux aux porteurs de projet de l’association Vaincre La Mucoviscidose. Les souris Delta et CFTR sont à ce jour les modèles murins les plus utilisés dans la recherche fondamentale sur la mucoviscidose. Notre établissement possède une expertise reconnue dans le maintien des lignées fragiles, nous sommes en capacité de maintenir ces lignées dans les meilleures conditions pour limiter au maximum la souffrance chez ces animaux.
Procédures
Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Les souris Delta F508 et CFTR présentent des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation et donc d'amaigrissement observés chez les individus homozygotes.
Devenir
Les descendants seront sélectionnés selon leur génotype : Les animaux homozygotes et sauvages seront expédiés aux collaborateurs. Les animaux hétérozygotes seront mis en accouplements pour renouvellement des duo/ trio ou mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de cette maladie génétique qu'est la mucoviscidose ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, ainsi qu’avec le microbiote intestinal, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Afin de répondre aux besoins annuels d’animaux pour les porteurs de projet, nous mettons en place le nombre minimal d’accouplements nécessaires. Le but étant de limiter au maximum le nombre d’animaux à phénotype dommageable
Raffinement
Ces souris fragiles doivent être hébergées dans un environnement propre et à faible empoussièrement (isolateur ou portoir ventilé). Afin de limiter les symptômes, un laxatif doux est administré en continu dans l’eau de boisson et une nourriture riche en protéines/lipides et vitamines doit leur être apportée. Le phénotype dommageable de ces lignées est présent seulement à l’état homozygote, cependant, le laxatif ainsi que l’alimentation plus riche seront donnés à tous les individus. Le laxatif permet d'éviter en très grande partie les symptômes de constipation observés chez les individus homozygotes. Ce laxatif est un médicament de sante humaine mais il n’existe pas d’équivalence en spécialité vétérinaire aussi efficace et bien toléré. L’aliment enrichi est de type Harlan teklad Global 2018.L’apparition des symptômes est plus précoce et plus marqué chez la lignée CFTR que la lignée Delta F508. Nous pouvons observer les premiers signes dès l’âge de 10 jours. Les expéditions de ces animaux ont lieu vers l’âge de 8- 10 semaines. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. Au sevrage, les souris seront baguées à l’oreille et un prélèvement d’échantillon caudale sera effectué afin de réaliser le génotypage. La taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la mucoviscidose. Dès 1992, trois ans à peine après la découverte du gène Cftr, le premier modèle de souris transgénique est créé, des souris « knock-out » pour CFTR . Elles présentent à l'état homozygote des symptômes communs avec les patients humains : une stérilité, des altérations des glandes muqueuses et séreuses, et des obstructions des structures glandulaires. Sans traitement laxatif, les souris KO-CFTR décèdent au bout de 3-4 semaines en raison d’une sévère obstruction intestinale. Ces souris n’ont pas d’inflammation chronique, ni d’infection pulmonaire. La lignée Delta F508 a été générée par une équipe néerlandaise en 1995. Ces souris montrent un phénotype : un poids diminué, une maladie intestinale aboutissant à une obstruction intestinale non létale. Par contre, aucune accumulation de mucus dans les poumons, le pancréas, les canaux biliaires n’a été observée. L’élevage des lignées Delta F508 et CFTR sera réalisé avec des souris adultes âgées d’environ 2 mois. Les animaux sont envoyés aux collaborateurs vers l’âge de 8 à 10 semaines, afin qu’ils soient assez robustes pour le transport. Les animaux seront observés avant le départ afin de s’assurer qu’ils sont aptes au transport, une pâté aliment enrichi + laxatif est mise dans la boite de transport. Seuls les animaux qui présentent un score de 0 seront expédiés aux chercheurs. Les animaux qui ne présentent pas un score de 0 avant le transport, seront maintenus en hébergement, en attente qu'ils soient aptes au transport (score de 0) Le protocole de traitement du laxatif sera fourni au destinataire en amont de l'expédition.
Analyse de pathologies du développement sexuel
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Cinq cents femelles sont superovulées par injections d'hormones pour produire un maximum d'ovocytes, puis tuées pour les prélever, et cent autres subissent une laparotomie de réimplantation d'embryons. Le porteur indique que les receveuses ne sont pas réutilisées car une seconde laparotomie serait plus douloureuse que la première. Il affirme que le recours à la souris est "essentiel" pour la biologie du développement, les cultures cellulaires ne reproduisant pas la vascularisation et le contexte tridimensionnel des organes.
Objectifs
A l ‘heure ou on constate que l’incidence de la plupart des maladies dépend du sexe, il est paradoxal que certains gènes importants pour la détermination du sexe restent à identifier. Chez l’homme (et la souris), les mutations de certains gènes sont responsables d’anomalies du développement du système urogénital (rein et appareil génital). L’appareil génital comprend différents organes dont les gonades qui sont présentes chez l’embryon. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Les patients affectés ont des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe c’est-à-dire que l’appareil génital présente toutes les caractéristiques de l’appareil génital de garçon ou de fille quel que soit le sexe génétique de l’enfant. Pour comprendre le rôle des facteurs responsables du développement normal de la gonade (testicule chez le mâle et ovaire chez la femelle), nous devons reproduire les mutations de ces gènes chez la souris, ce qui nous permet d’étudier finement les conséquences pathologiques à différents stades. Ainsi notre projet permettra d’identifier les facteurs clés des premières étapes du développement de la gonade avec un intérêt particulier sur l’ovaire. Cela nous donnera un point d’entrée pour étudier les pathologies telles que l’insuffisance ovarienne précoce dont les symptômes sont le dérèglement ou l’absence de puberté, les problèmes de fertilité, les dérèglements hormonaux et les cancers de l’ovaire.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène qui est responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Procédures
500 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront microinjectés. La réimplantation des embryons sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 100 femelles.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 de superovulation, les nuisances en lien avec la superovulation est une douleur légère et brève liées aux injections intrapéritonéales d’hormones, les hormones n’induisent pas de douleur chez les femelles. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, les nuisances sont principalement la douleur liée à la laparotomie et à sa cicatrisation. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de l’intervention. Brièvement, des difficultés opératoires telles qu’une hémorragie supérieure à 0,5 ml, un temps d’intervention de plus de 30 mn ou post opératoire majeures (réveil retardé de plus de 15 mn, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) peuvent subvenir en de rares occasions.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les femelles donneuses seront euthanasiées afin de collecter leurs ovocytes. A l’issue de la procédure 2, les femelles receveuses ne seront pas réutilisées et euthanasiées car une deuxième laparotomie serait bien plus douloureuse que la première.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étude des causes des maladies de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour l’utilisation d’un nombre minimal de souris. Nous avons besoin de femelles donneuses et receveuses et pour ne pas générer des males surnuméraires, nous commandons les femelles chez un fournisseur agréé ce qui permet d’obtenir que le sexe d ‘intérêt et de réduire le nombre de souris. Nous utilisons la super-ovulation des femelles donneuses qui permet de produire de 2 à 3 fois plus d’ovocytes par femelle, ce qui permet de réduire le nombre de femelles donneuses. Les femelles receveuses sont mises en accouplement avec des males stériles. Ainsi si la réimplantation des ovocytes n’a pas pu avoir lieu, ces femelles ne donnent pas de portées surnuméraires et peuvent être remises en croisement rapidement. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux nouveau-nés. Les protocoles sont standardisés et nous avons déjà réalisés cette chirurgie permettant la réimplantation d’ovocytes. Ainsi notre rapidité d’exécution nous permet de réimplanter des embryons dans les deux cornes utérines de la souris et ainsi de réduire le nombre de souris receveuse par deux. Nous pouvons anticiper la fréquence d’obtention de certains paramètres tels que le sexe de la souris (nous étudions les femelles soit un animal sur 2) mais nous ne pouvons pas évaluer l’activité du transgène car elle dépend du site d’insertion dans le génome (qui est imprévisible) pour déterminer le nombre de souris à générer (ainsi nous anticipons de 3 à 8 réplicas pour un sexe donné). Cependant les micro-injections d’un transgène donné seront réalisées sur plusieurs jours avec un ou deux jours par semaine, ce qui nous permet d’analyser les résultats de façon échelonnée. Dès que le résultat est reproductible au moins 2 fois, nous arrêterons ces travaux ce qui réduira le nombre d’animaux.
Raffinement
Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Les animaux sont néanmoins surveillés afin de déceler tout signe de souffrance ou de blessure à l’issue d’accident ou bagarre afin de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, pendant et après la chirurgie, l’anesthésie au gaz isoflurane et l’administration d’antalgiques permet de limiter au maximum les douleurs engendrées. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Ce protocole inclue la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés permettant de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. De plus, les souris seront hébergées par deux ou par trois dans des cages comportant des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier chez la souris, l’impact de copies de gènes contenant les mutations responsables de maladies. Nous utiliserons des femelles adultes âgées de 3 à 4 semaines pour les superovulations ou âgées de plus de 6 semaines car c’est l’âge optimum pour la superovulation (avant la mise en place des cycles ovariens ou après leur stabilisation) et 6 à 20 semaines pour les pseudo-gestantes.
Regeneration du thymus et des fonctions immunitaires au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les modèles, elles reçoivent des greffes de mélanome ou de tumeurs mammaires, ou subissent deux irradiations corporelles suivies d'une greffe de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer douleur, perte de poids et gêne à la mobilité, d'intensité croissante au fil de la procédure. Les retombées annoncées contre le vieillissement immunitaire et le cancer restent présentées comme une "preuve de concept" à moyen terme, l'objectif immédiat étant de tester une protéine censée régénérer le thymus.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT), acteurs clés du système immunitaire. Ces cellules se développent au sein du thymus, hébergeant la production et sélection appropriée des LT. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie telles que les thérapies cyto-réductrices précédant une greffe de moelle osseuse ou le vieillissement. En effet, dans ces contextes physiopathologiques, cet organe subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus appelé « involution thymique » résulte en une diminution de la production de nouveau LT, réduisant ainsi fortement le renouvellement des LT de l’organisme. Par ailleurs, l’utilisation de thérapies cyto-réductrices chez des individus âgés aggrave l’involution lié à l’âge, réduisant ainsi de façon additive le renouvellement des LT. L'involution thymique résulte en une susceptibilité accrue notamment aux cancers, ainsi qu’aux rechutes tumorales dans le cas de thérapies cyto-réductrices et greffe de moelle osseuse chez des patients atteints de leucémies. Dans le cas de cancer et leucémies, le succès de la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaire (ICBT) repose sur un large répertoire de lymphocytes T capable de reconnaître spécifiquement les cellules cancéreuses. Bien que ces traitements aient récemment amélioré les chances de survie des patients atteints de différents types de cancer, une grande partie des patients ne répondent pas en raison d'un répertoire de LT sous-optimal. L’appauvrissement et la senescence progressive de LT de l’organisme résultant de l’involution thymique contribue à ces réponses de moindre qualité. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration de la protéine X promeut la régénération du thymus et la production des LT au cours des thérapies cyto-réductrices et de l'involution associée à l'âge. Ainsi, l'objectif de notre projet est d'apporter la preuve du concept que la régénération thymique médiée par X renforce l'immunité des cellules T antitumorales et augmente l’efficacité des thérapies par blocage des points de contrôle immunitaire.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’augmentation de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge qui est étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeur. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et là l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude apportera la preuve de concept que le boost de la production de LT médié par la régénération thymique, et ainsi le renouvellement des LT périphériques, confère une protection supérieure contre le développement de tumeurs. De plus, notre approche de combinaison de la régénération thymique avec les ICBT devrait potentialiser l’efficacité de ces molécules thérapeutiques et ainsi améliorer plus fortement les réponses anti-tumorales dans les contextes d’hémopathies malignes et de tumeurs solides. Par ailleurs, notre étude pourrait à plus long terme permettre de définir des biomarqueurs du vieillissement immunitaire et améliorer la prise en charge des patients de façon ciblée. Ainsi, nous nous attendons à ce que les sujets répondant le moins aux ICBT soient les patients avec une immunosénescence prononcée pouvant nécessiter une régénération du développement des LT. Il est également envisageable à plus long terme que notre projet participe au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts fonctionnels des processus biologiques liés à l’âge.
Procédures
Pour les tumeurs solides (mélanomes et tumeurs mammaires), les souris (au nombre de 432) recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Trois semaines plus tard, les animaux recevront des cellules tumorales par injection intradermique (mélanomes) ou intra-mammaire (tumeurs mammaires) sous anesthésie générale légère (2 injections simultanées par animal, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours de j8 à j20 sous anesthésie générale légère (2 minutes par animal). Pour les lymphomes, les souris (au nombre de 144) seront soumises à deux irradiations corporelles de 4minutes30 (5Gray) à 12heures d'intervalle, suivi d’une greffe de moelle osseuse (injection de cellules par voie intraveineuse sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal). Les animaux recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal aux jours 2,4 et 6 après la greffe. Trois semaines après greffe, les animaux recevront une injection intraveineuse de cellules de lymphome sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal. A partir du 10eme jour après l’injection des cellules de lymphome, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sous anesthésie générale légère à la fréquence d’un prélèvement tous les 3 jours avec un maximum de 4 prélèvements. Dans les 3 procédures, la moitié des animaux recevra un traitement anti-tumoral (immunothérapie) et l’autre moitié un traitement contrôle (placebo) par injection intrapéritonéale (4 injections par animal avec 3 jours d'intervalle entre les injections)
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont : - un stress lié à la manipulation et à la procédure d'irradiation. - une douleur lié aux injections (rétro-orbitales, intra-dermiques, intra-péritonéale) ainsi que aux prélevements sanguins mandibulaires. - une perte de poids, une gêne à la mobilité et/ou une douleur liées à la croissance tumorale et à la réponse immunitaire déclanchée. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour analyse.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération du thymus par le traitement RANKL en contexte de cancer. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes cellulaires et tissulaires impliquées dans la réponse anti-tumorale étudiée. En effet, une alternative ex vivo serait de cultiver des lymphocytes T purifiés de souris jeunes ou âgées (traitées ou non avec RANKL) en présence de cellules tumorales et d'étudier l'efficacité de ces cellules. Ceci sera réalisé au cours du projet. Toutefois, cette approche limitée ne récapitule pas l’organisation tumorale complexe observée in vivo, la capacité des lymphocytes T à être recrutées au site tumoral, à interagir avec le microenvironnement et les autres cellules immunitaires, à ralentir la croissance tumorale et à stopper la pousse tumorale. Par ailleurs, l'approche ex vivo à court terme ne permet pas de tester l'efficacité des thérapies anti-tumorales qui agissent sur les interactions entre lymphocytes T et cellules immunitaires et tumorales. Ainsi, le modèle murin, qui présente l'avantage d'avoir une physiopathologie proche de l'homme, permettra d'étudier avec le plus de précision possible les différents points de notre projet, à savoir la régénération des lymphocytes T par notre traitement, leur circulation dans l'animal, leur recrutement au site tumoral et leur mode d'action au sein du microenvironnement tumoral.
Réduction
Le choix du nombre de souris est réalisé en prenant en considération les variabilités inter-individuelles, de réponse au traitement, ainsi que de pousse des tumeurs. Ce choix vise également à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 animaux par groupes seront utilisées pour le suivi de croissance tumorale et des cohortes de 3 animaux pour les analyses en points intermédiaires, avec un total de trois expériences indépendantes dans les deux cas. D’après la littérature et notre expérience passée, un nombre de 10 à 12 animaux par groupe (en tenant compte de la mortalité précoce) devrait fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. La même démarche sera suivie pour les analyses en point intermédiaire et en point final. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, des tests fonctionnels in vitro seront menés sur des cellules isolées des mêmes tumeurs que celles analysées pour la composition de l’infiltrat immunitaire des tumeurs. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté en utilisant un logiciel (gpower) afin d'estimer le nombre nécessaire permettant une analyse statistique robuste.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress, les souris seront manipulées par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de randomisation des groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés générale légère par inhalation d’isoflurane avant chaque injection et mesure du volume tumoral. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance accrue quotidienne dès le début de la procédure expérimentale afin d’identifier tout signe de gène ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation. De plus, le poids des animaux sera mesuré tous les deux jours, avec une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids et un point limite de perte de poids de 20% du poids maximal. En cas de gène de mouvement pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront évalués avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs. Dans le cas des tumeurs solides, l’apparition de signes d’ulcération constituent un point limite. Un autre point limite sera le volume tumorale (répartis entre les deux tumeurs injectées par animal).
Choix des espèces
La souris est le modèle de bases des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire et à l’oncologie. Les souris seront de fond génétique C57Bl6/J sauf pour le modèle 4T1 qui se développe chez des souris de fond génétique Balb/c. Deux âges sont prévus (cf. procédures): - stade pre-involution thymique : souris âgées de 6 à 8 semaines d’âge - stade avancée d’involution thymique : souris âgées de 12 mois.
Etude de la résistance du parvovirus de la souris à différents modes de stérilisation (irradiation, autoclavage)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une inoculation du parvovirus par gavage, puis des prélèvements sanguins et de fèces toutes les deux semaines pendant douze semaines. L'objectif déclaré est de mesurer la résistance du virus aux modes de stérilisation, le porteur affirmant que son infectiosité ne peut être validée que par l'inoculation à un "organisme vivant". Toutes les souris sont mises à mort à la fin, en raison de la présence possible de l'agent infectieux dans leur organisme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la résistance du parvovirus de la souris (ou MPV) à différents modes de stérilisation comme l’irradiation et l’autoclavage. Le MPV est un des virus de la souris le plus fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche. Il ne génère pas de signe clinique chez les animaux mais perturbe le système immunitaire de la souris et les résultats de la recherche. Sa présence entraîne donc l’arrêt immédiat des procédures avec un impact éthique non négligeable. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permet d’améliorer la prévention de la présence de cet agent dans les laboratoires.
Bénéfices attendus
Le parvovirus de la souris (MPV) est un virus à ADN non enveloppé qui peut être persistant dans l'environnement et chez les animaux infectés pendant une longue période. Après infection, il n'y a pas de signe clinique détectable chez les animaux, même gravement immunodéficients. Cependant, le MPV provoque de fortes interférences avec la recherche et les résultats obtenus en modulant notamment la réponse immunitaire des souris infectées. Sa présence dans un laboratoire entraîne l’arrêt immédiat des procédures en cours et invalide les résultats préalablement obtenus. La prévention de sa contamination permet donc de garantir un état de santé des animaux n’interférant pas avec les recherches et donc une application des 3Rs (réduction du nombre d’animaux utilisés pour obtenir des résultats exploitables). De nombreuses recherches sur le MPV afin de comprendre sa physiopathologie ont été effectuées. Cependant, aucune donnée quant à sa résistance à différents modes de stérilisation n’existe. Comprendre sa résistance aux modes de stérilisation existants permettrait d’améliorer nos connaissances sur cet agent et la prévention de sa présence dans un laboratoire.
Procédures
Inoculation unique par gavage d’une durée de maximum une minute sur tous les animaux. Prélèvement sanguin d’une durée de maximum une minute toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux. Contention d’une durée de maximum une minute pour prélèvement de fèces toutes les deux semaines sur une durée maximale de 12 semaines pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Stress provoqué par les contentions, l’acte de prélèvement sanguin toutes les 2 semaines sur 12 semaines et l’inoculation par gavage lors du premier jour de la procédure.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux due à la possible présence dans leur organisme d’un agent infectieux interférent.
Remplacement
Les méthodes in vitro actuellement disponibles permettent de tester la présence du MPV dans différents substrats en contact avec l’animal (air, aliment, litière) mais pas son potentiel infectieux dans sa globalité. L’étude finale de son infectiosité ne peut être validée que par l’inoculation de l’agent à un organisme vivant. L’inoculation d’un agent potentiellement infectieux et la compréhension des mécanismes associés à son infection dans un organisme vivant est un phénomène complexe, mettant en jeu divers processus biologiques et systèmes physiologiques, ne permetttant pas de réaliser de nos jours un tel protocole sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été fixé afin d’obtenir des résultats expérimentaux exploitables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Sur la base de la littérature scientifique existante et de recherches similaires préalables (Henderson et al, 2015), des groupes de 4 animaux maximum sont prévus.
Raffinement
Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentés ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le MPV est un agent infectieux de la souris. L’étude de la possibilité de le détecter après stérilisation par différents procédés (irradiation ou stérilisation à la vapeur) et sa capacité ultérieure à infecter des animaux naïfs ne peut se faire que chez son hôte primaire, la souris. Des animaux de 4 semaines seront utilisés, sur la base de leur sensibilité à une infection au MPV et de la littérature scientifique.
Rôle des canaux ioniques K2P dans la physiopathologie de l’oeil
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée par instillation quotidienne de chlorure de benzalkonium pendant sept jours, puis leur douleur est mesurée en appliquant une pression croissante près de l'œil jusqu'au clignement, une gêne que le porteur indique ne pas pouvoir soulager par analgésiques "puisque c'est ce paramètre que nous évaluerons". L'étude porte sur le rôle de canaux ioniques dans la douleur oculaire. Le porteur affirme que ce syndrome multifactoriel "ne peut être remplacé" par des modèles in vitro et exige un organisme entier.
Objectifs
La sécheresse oculaire est l'un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez les sujets de plus de 50 ans. La pathologie peut se déclarer chez des sujets plus jeunes en cas de maladie auto-immune, de pollution environnementale, de prise médicamenteuse répétée, après une chirurgie de la cornée ou suite à l'usage intensif des écrans. En conséquence, la prévalence de la sécheresse oculaire est grandissante. Les symptômes regroupent des troubles visuels et des douleurs d’intensité variable qui peuvent devenir chroniques. Les patients se plaignent également d’une sensibilité accrue à la lumière. La sécheresse oculaire est difficile à traiter et ses mécanismes physiopathologiques sont peu connus. Ce constat impose un approfondissement de nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la douleur oculaire. Des mutations dans les gènes codant des transporteurs de potassium appelés K2P sont à l'origine de douleur chez les patients humains et chez les rongeurs (exemple: migraine). Leur fonction dans l'oeil n'a pas encore été caractérisée. Nous disposons 1) de différents modèles de souris dans lesquels les K2P sont absents, et 2) de molécules analgésiques mises au point pour moduler l'activité des K2P. Nous souhaitons combiner ces outils pour caractériser le phénotype oculaire de ces animaux et déterminer l'effet thérapeutique de ces molécules dans la physiopathologie de l'oeil. L'étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement de la pathologie oculaire. Ce projet utilisera au maximum 1080 souris. Grâce à nos études préalables in vitro, nous connaissons le mode d'action de ces transporteurs (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des souris (raffinement). Les prévisions obtenues avec les logiciels statistiques nous permettent d'anticiper le nombre maximal de souris pour obtenir des résultats significatifs et nous réduirons ce nombre en cours de projet dès que nos données seront suffisamment robustes (réduction).
Bénéfices attendus
La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. Le projet que nous souhaitons développer permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie et éventuellement de proposer une stratégie thérapeutique nouvelle si ce projet donne les résultats escomptés. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire.
Procédures
La procédure 1 dure 2X 1 semaine maximum (à 3 mois et à 12 mois environ), la procédure 2 dure 2 semaines maximum. Dans chaque procédure, la mesure du volume des larmes dure 5 minutes (coton au coin de l’œil); la mesure de la stabilité des larmes dure 10 minutes (anesthésie à l’isoflurane, puis administration d’une goutte de fluorescéine). La mesure de la douleur oculaire par un test qui consiste à appliquer une pression croissante sur la zone péri-orbitale et à mesurer la pression (en grammes) induisant le clignement des paupières et le retrait volontaire de la face par la souris, dure 1h. La séance d'imagerie DOLPLER dure 15 minutes (sous anesthésie légère). Dans la procédure 1, chaque animal subira ces 3 tests 1 fois dans sa vie, et 2 fois dans la procédure 2 (avant et après administration de la molécule régulatrice des K2P). Le modèle de la procédure 2 consiste en une injection quotidienne de BAC (chlorure de benzalkonium) pendant 7 jours. Les molécules régulatrices des K2P ou la solution saline contrôle seront administrées en IP, en 1 injection.
Impact sur les animaux
Chez l'homme, la sécheresse oculaire peut occasionner un ressenti très variable selon les individus allant d'une simple gêne soulagée momentanément par des larmes artificielles à une douleur pouvant être plus inconfortable chez certains patients. Il est vraisemblable que cette variabilité entre individus existe également chez la souris. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera d'intensité modérée. Elle engendre potentiellement un inconfort voire éventuellement une gêne chronique (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Les animaux auront 3 et 12 mois environ lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances auxquelles ils seront exposés sera donc de 5 jours pour les souris mutantes pour les transporteurs étudiés: habituation aux tests pendant 2 jours et 3 jours de tests (c'est-à-dire 2 fois 2h de tests à 36h d'intervalle: 1 série de tests pendant la journée, 1 seconde série pendant la nuit). La durée des nuisances sera de 6 semaines maximum pour les souris dans lesquelles nous aurons induit la sécheresse oculaire (habituation aux tests, 7 jours d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement avec une série de tests par semaine). Les effets des traitements seront évalués sur 7, 14 et 28 jours maximum puis les animaux seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort selon la législation en vigueur afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nos études préalables et celles de nos collègues ont permis de caractériser in vitro (neurones en culture) et in vivo (rongeurs) les effets des molécules d'intérêt et de déterminer leur mode d'action sur les K2P. Cette phase du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément in vivo sur l'oeil et quantifier le phénotype oculaire des animaux déficients pour les gènes codant les canaux K2P d'intérêt et les effets thérapeutiques des molécules que nous avons testées.
Réduction
Le nombre d‘animaux (1080) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution et en considérant mâles et femelles séparément, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires.
Raffinement
Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests, dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse pour limiter la photoallodynie et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test, et nous réaliserons la plupart de ces tests sous anesthésie légère à l'isoflurane (15-20 minutes). En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage conséquent dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie réalisée par l'expérimentateur principal formé à l'utilisation de l'appareil.
Choix des espèces
Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin reproduisant la sécheresse oculaire est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Deux âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux.
Optimisation des paramètres d’utilisation d’un nouvel équipement MicroTEP/MicroCT et d’un nouvel équipement d’Autohistoradiographie (Opti-TEP-AHR)
- Formation professionnelle
Rats : 4
8 rongeurs, quatre souris et quatre rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections de produits radioactifs et des mesures de glycémie sous anesthésie, puis sont mis à mort pour prélèvement d'organes. L'objet du projet n'est pas une question biologique mais le réglage d'un nouvel appareil d'imagerie et la formation du personnel de la plateforme. Le porteur affirme que la biodistribution des traceurs "ne peut être appréhendée qu'à l'aide d'un modèle animal", le réglage sur fantômes ne suffisant pas.
Objectifs
L’acquisition d’un nouvel équipement MicroTEP/MicroCT par la plateforme d'imagerie petit animal nécessite l’adaptation et la transposition des procédures d’acquisition et de reconstruction des images de l’ancien appareil vers le nouvel équipement ainsi que sa prise en main par le personnel en charge des études précliniques. L’objectif sera de valider les paramètres optimisés au préalable sur fantômes sur l’animal et ainsi mettre en place des protocoles d’acquisition et reconstruction optimaux pour les projets futurs. La plateforme s'est également équipé d'un appareil d'autohistoradiographie (AHR) dont l'optimisation de fonctionnement est également nécessaire.
Bénéfices attendus
Les bénefices attendus sont l'optimisation des paramètres d'acquisition et de reconstruction ainsi que la formation du personnel sur les nouveaux équipements.
Procédures
Mesures de glycémie sur 4 rats et 4 souris sous anesthésie générale (4 fois au total, chacune à 3 jours d'intervalle, durée 15 secondes) Injection de produits radioactifs pour imagerie TEP sur ces 4 rats et 4 souris. 2 rats et 2 souris recevront 7 injections (3 injections d'un traceur à 3 jours d'intervalle chacune et 4 injections d'un autre traceur à 3 jours d'intervalle chacune). 2 souris et 2 rats recevront 4 injections d'un troisième traceur à 3 jour d'intervalle chacune. Durée des injections : 30 secondes
Impact sur les animaux
Les examens MicroTep/MicroCT sont des techniques non invasives qui seront realisées sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (2%) n'induisant ainsi aucune douleur, stress ou inconfort de l'animal. L'injection IV du/des radiotraceur(s) dans la veine caudale n'induira également aucune nuisance puisque effectuée également sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (2%). Les animaux seront pesés et surveillés quotidiennement. La surveillance quotidienne des animaux aura lieu à l’animalerie dans un environnement sécurisant pour l’animal. Les examens in vivo seront réalisés sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, le remplacement des animaux ne peut être effectué. Les paramètres d'utilisation du MicroTEP/MicroCT et de l'appareil d'autohistoradiographie (AHR) seront optimisés au mieux à l'aide de fantômes mais la vérification et une mise au point plus fine des paramètres devra être validée sur l'animal. La biodistribution des différents traceurs ne peut être appréhendée qu'à l'aide d'un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux nécessaire pour l'optimisation des nouveaux équipements et suffisant pour élaborer des protocoles d'acquisition et de reconstruction qui pourront être utilisés pour les futurs projet de la plateforme.
Raffinement
Les animaux seront suivis depuis leur arrivée, tout au long de l'expérimentation et jusqu'à leur mise à mort. Aucun antalgique ni analgésique ne sera administré aux animaux, les prodédures ne devant normalement induire aucune douleur ni souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long des expérimentations afin de s'assurer qu'aucun changement de leurs comportement (cachexie, vocalise, voussures, etc...) ne survient au cours des expérimentations. Les animaux seront également pesés avant le début des expérimentations et seront ensuite pesés quotidiennement. Si une perte de poids supérieure à 15% entre deux pesées survient ou si un changement comportemental est observé, les animaux seront mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
L'équipement de la plateforme d'imagerie petit animal est dédié aux rongeurs. Les rats et les souris de différentes souches sont majoritairement utilisées dans divers domaines de recherche scientifique. Des rats seront utilisés à l'âge de 8-9 semaines pour un poids d'environ 200-250g et des souris à l'âge de 3-4 semaines pour un poids compris entre 20 et 35g, poids moyens auquels ces deux espèces sont généralement utilisées pour les études TEP.
Fonction modulatrice des cellules dendritiques sur la thérapie tumorale par radiothérapie et anti-PD-1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une irradiation sous anesthésie et des injections de traitements, dont certaines directement dans la tumeur, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. L'étude porte sur le rôle des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire déclenchée par la radiothérapie associée à une immunothérapie. Le porteur déclare la croissance tumorale et l'irradiation "indolores" et affirme qu'il "n'y a pas de modèles alternatifs" pour cette étude du système immunitaire.
Objectifs
Dans les pays occidentaux, deux tiers des patients reçoivent une radiothérapie au cours de leur cancer. Le but de la radiothérapie est de tuer une tumeur ou une métastase aussi directement que possible. Les recherches expérimentales de ces dernières années ont montré que la radiothérapie peut également induire une réponse immunitaire anti-tumorale dans certaines conditions. Cependant, de fortes réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie n'ont que rarement été observées dans le traitement des patients. L'objectif de ce projet est d'étudier de nouveaux mécanismes qui peuvent limiter ou améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales après radiothérapie. Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles capables d'induire une réponse immunitaire. En s’appuyant sur les connaissances déjà acquises selon lesquelles les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans le développement d'une réponse immunitaire anti-tumorale dans le cadre de l'immunothérapie ou de la chimiothérapie, ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques dans l'induction d'une thérapie anti-tumorale après radiothérapie et à développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes biologiques qui devraient permettre le développement de nouvelles thérapies à moyen terme. Il devrait ainsi contribuer à soulager la souffrance des patients atteints de cancer grâce à des thérapies améliorées. Cela inclut les nouvelles thérapies basées sur les cellules dendritiques (thérapies cellulaires). De plus, les résultats du projet de recherche devraient jeter les bases de nouvelles thérapies qui effectuent une modulation ciblée des voies de signalisation dans les propres cellules dendritiques de l'organisme (thérapies ciblées).
Procédures
Injection de cellules tumorales une fois par souris, ansethésie locale, durée 1 minute. Irradiation sous anesthésie générale, durée 11 minutes. Injections de traitements sous anesthésie locale tous les 3 jours à partir de J8 jusqu’à J14 ou J20, durée 1 minute. Injections intra-tumeurs dans certains lots: 2x à 3 jours d'intervalle (J7 et J10) Durée : maximum 1 minute, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Croissance tumorale sous-cutanée : La formation de tumeurs sous-cutanées dans la région du flanc ou de la patte arrière n'est pas associée à la douleur. Elle peut entraîner des restrictions de mouvement chez la souris. . L'injection de traitements induit une réaction systémique très limitée. L'irradiation tumorale locale est indolore, et z très peu de conséquence. Elle peut induire une perte de poids légère et transitoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyse sur tissus post-mortem et car il seront porteurs de tumeurs.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation ou l’inhibition du système immunitaire lors de radiothérapies.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, avons déterminé par calcul de puissance le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Différents tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats et l'étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l'hypothèse de travail.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale dépendamment de l'intervention à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Des souris sont nécessaires pour les expériences, car pour l'étude de la radiothérapie ciblée de tumeurs individuelles, selon le recul obtenu, la souris est la seule espèce possible. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.
Etude des mécanismes cellulaires conduisant à l’alloimmunisation plaquettaire transfusionnel et à l’état réfractaire associé
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Les souris désignées comme "donneuses" sont tuées lors d'un prélèvement de sang terminal, les "receveuses" reçoivent des transfusions de plaquettes hebdomadaires puis subissent une chirurgie abdominale sans réveil pour observer leur rate au microscope. L'étude cherche à comprendre le rejet des plaquettes transfusées chez les patients sous chimiothérapie. Le porteur affirme que ces observations dynamiques "ne peuvent se faire que sur modèle animal" et ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
La prise en charge des patients sous chimiothérapie aplasiante nécessite un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Une des complications graves de ces transfusions multiples est l’état réfractaire aux transfusions plaquettaires (ERTP), c’est-à-dire le rejet des plaquettes transfusées par le receveur. La transfusion est alors inefficace et ne permet pas de prévenir les risques hémorragiques. Ce rejet est expliqué par la présence, chez le receveur, d’anticorps spécifiques qui entrainent l’élimination rapide des plaquettes transfusées. Le mode d’action de ces anticorps conduisant à l’élimination des plaquettes n’est pas bien compris. Nous proposons d’étudier les mécanismes d’élimination des plaquettes in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Nous étudierons finement les mécanismes moléculaires mis en jeu grâce à l’utilisation de souris transgéniques expriment des protéines humaines qui pourraient être impliquées dans ces réponses. Nous souhaitons caractériser, grâce à l’utilisation d’un microscope permettant les observations intra-vitales, les interactions entre les plaquettes transfusées et la rate du receveur dans une situation d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires.
Bénéfices attendus
Les patients qui nécessitent un support transfusionnel important et itératif, notamment ceux sous chimiothérapie, sont susceptibles de développer un état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Des anticorps produits par le receveur peuvent mener à l’élimination des plaquettes nouvellement transfusées entrainant ainsi une inefficacité thérapeutique de la transfusion. Identifier les mécanismes sous jacents de cette réponse immunitaire pourrait permettre de faire évoluer la prise en charge des patients nécessitant un support transfusionnel important. En effet, déterminer la cinétique et l’organe dans lequel les plaquettes sont éliminées nous apporterait des éléments de réponses quant aux mécanismes impliquées et nous permettrait ainsi de réfléchir à des nouvelles stratégies thérapeutiques pour éviter les etats réfractaires aux transfusions. Ceci permettrait une meilleure prise en charge des patients limitant ainsi les coups d’hospitalisation, la consommation des produits sanguins labiles et la surmortalité induit par les états réfractaires.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera fait sur animal vigile. Prélèvement artériel : prélèvement terminal (dure moins de 5 minutes) Prélèvement sanguin au niveau de la queue (prélèvements hebdomadaires pendant 5 semaines consécutives ; prélèvement dure moins d'une minute Transfusion en intra-veineux hebdomadaire pendant trois semaines consécutives, Procédure chirurgicale (pose d'une chambre d'observation abdominale) (procédure terminale sans réveil, durée de l'observation 30 minutes)
Impact sur les animaux
Possible douleur suite à la transfusion en i.v., durée estimée à 1h post-injection. Les sites d’injections seront particulièrement observés pendant le suivi quotidien des animaux. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue, durée de 30 secondes avant endormissement Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min
Devenir
Les souris "donneuses" sont par définition toutes mises à mort après le prélèvement sanguin car ce prélèvement artériel est terminal. Tous les animaux prévus dans la procédure d'alloimmunisation (souris receveuses) sont gardés en vie car utilisées dans les autres procédures. Après les expériences de microscopie intra vitale, tous les animaux sont mis à mort car c'est une procédure chirurgicale sans réveil (une fois la rate exposée et la chambre d'observation en place, on ne peut pas réveiller l'animal).
Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer les mécanismes d’élimination des plaquettes transfusées. L’approche en temps réel sur l’élimination des plaquettes sanguines par la rate et/ou le foie et dans le sang ne peut se faire que sur modèle animaux afin d’observer des processus dynamiques entre le sang et ces organes. Ces approches de cytométrie en flux et de microscopie intravitale nécessitent un modèle in vivo et ne peut pas être modélisée par des techniques in vitro.
Réduction
Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des observations suffisamment représentatives. Des tests sur des tissus fixés ont eu lieu dans un premier temps pour mettre au point les conditions expérimentales optimales de visualisation des plaquettes (cinétique, quantité de plaquettes, optimisation des marquages,) ce qui nous a permis de réduire au minimum le nombre d’animaux requis pour les observations in vivo.
Raffinement
Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin depermettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie et pendant toute la durée d’observation sous le microscope. - Anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. - Injection d’analgésique avant chaque procédure. - Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons mimer la différence génétique entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des animaux de fond génétique différent. La consanguinité des souris et la bonne connaissance de leur système immunitaire en font un modèle de choix. Nous avons donc choisi deux lignées de souris bien caractérisées : les souris "donneuses" seront de fond génétique C57Bl6 et le souris "receveuses" de fond génétique BALB/c. De plus, nous souhaitons éudier l'importance d'un récepteur exprimé par les plaquettes des souris "donneuses", nous utilisons donc des souris C57Bl6 modifiées génétiquement qui expriment ce récepteur ou d'autres souris qui expriment une protéine fluorescente pour pouvoir les visualiser quand elles sont transfusées dans la souris receveuse. Enfin, un microscope dédié aux observations intravitales sera utilisé sur le modèle murin. La taille de la souris est compatible et adaptée à l’équipement ce qui rend ce modèle totalement pertinent. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubère, agé de 8 à 25 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.
Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques capable de ralentir la progression des néphropathies tubulo-interstielles chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont génétiquement modifiées et gavées pour déclencher une maladie rénale, ou opérées sous anesthésie pour obstruer le conduit urinaire d'un rein, puis reçoivent des injections quotidiennes de composés ou de placebo pendant plusieurs mois, avec passages en cage métabolique et prélèvement sanguin rétro-orbital avant la mise à mort. L'étude évalue trois composés censés ralentir la maladie rénale chronique et éviter la greffe. Le porteur affirme que les organoïdes rénaux ne reproduisent pas un rein vascularisé et qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer au modèle murin.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. L’étude proposée ici a pour objectif de valider l’effet thérapeutique de 3 composés sur le développement de la maladie rénale chronique. Ces composés ont été identifiés et validés dans des cultures de cellules rénales. A cette fin, trois modèles animaux seront utilisés. Le premier utilise des souris génétiquement modifiées qui seront gavées à 1 mois pour induire la maladie humaine puis les souris seront traitées quotidiennement par injection avec les 3 composés et leur placebo jusqu’à 5 mois. Le deuxième modèle utilise d’autres souris génétiquement modifiées pour lesquelles la maladie rénale débute à 5 semaines de vie. Ces animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés à partir de 4 semaines (avant le début de la maladie) et jusqu’à 3 mois. Enfin, le troisième modèle utilise une chirurgie qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins. Ce modèle chirurgical développe une maladie rénale 2 semaines après la chirurgie. Les animaux seront traités quotidiennement par injection avec les 3 composés 1 semaine avant la chirurgie et jusqu’à deux semaines après.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs composés identifiés in vitro permettant ainsi à terme d’éviter la greffe rénale aux patients.
Procédures
L’ensemble des animaux seront injectés tous les jours, avec les médicaments ou leur placebo à compter de 1 mois et pour une durée maximale de 4 mois. Les 360 animaux du premier modèle de souris génétiquement modifiées seront soumis à l’âge de 1 mois à un gavage sur 5 jours consécutifs. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Les 90 animaux du troisième modèle seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. La durée de la chirurgie est d’environ 5 minutes. Pour les 2 premiers modèles de souris génétiquement modifiées, chaque mois, les urines seront prélevées par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé, les animaux seront placés en cage métabolique pendant 48h. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. Les patients atteints de maladie rénale génétique souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux traités avec le placebo sont donc susceptibles de développer ces symptômes alors que ceux traités avec le(s) médicament(s) devraient s’améliorer. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections répétées des médicaments peuvent entraîner une irritation de la zone d’injection. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Le modèle chirurgical d’obstruction est « indolore » d’un point de vue rénal puisqu’un seul des 2 reins est obstrué, l’autre rein permettant de maintenir une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection.
Devenir
L’ensemble des 810 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été établi selon le logiciel InVivoStat pour permettre d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Des souris mâles et femelles seront utilisées et 15 souris par groupe de traitement seront explorées. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages et aux injections répétées, des sondes de gavage adaptées à la taille de l’animal et des seringues très fines seront utilisés. Afin de limiter les nuisances liées à la polyurie (volume urinaire élevé), les biberons d’eau et la propreté des cages seront contrôlés régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront mises à mort à l’âge adulte, temps déjà étudié dans d’autres pathologies rénales.
Implication d’un variant de la protéine RPL13 dans le développement osseux d’un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées après le sevrage soit dans une cage équipée pour l'effort physique soit dans une cage à enrichissement réduit, elles subissent une imagerie par microscanner sous anesthésie de vingt minutes, puis sont euthanasiées pour analyse du squelette. L'étude porte sur le rôle d'un variant de la protéine RPL13 dans le développement osseux, le porteur classant la lignée comme à "phénotype non dommageable". Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" le modèle in vivo pour étudier la qualité osseuse et la plaque de croissance.
Objectifs
L'objectif du projet est de comparer l’impact d’une activité physique augmentée versus une activité sédentaire, sur la qualité osseuse et la plaque de croissance des animaux issus de l’élevage. La souche de souris utilisée est RPL13, lignée à phéntoype non dommageable. Les souris seront élevées après leur sevrage de 1 mois jusqu’à l’âge de 2 mois dans deux types de cages : une cage enrichie en équipement d’activité stimulant l’effort physique (roue d’activité volontaire, grille d’agrippement, mangeoire en hauteur) et une cage avec un enrichissement moindre avec accès à la nourriture et à l’eau sans effort physique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'étudier le rôle des ribosomes dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des chondrocytes. Ce projet contribuera à une meilleure compréhension de la croissance osseuse par l'étude du processus physiopathologique d'une dysplasie sévère. Il permettra de mieux comprendre la régulation post-transcriptionnelle donnée par les ribosomes qui interviennent dans le développement osseux et fournira de nouvelles cibles pour le traitement des maladies cartilagineuses.
Procédures
L'anesthésie pour imagerie durera 20 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress lié à la contention des animaux lors de l'anesthésie isoflurane pourra être observé. L'imagerie par microscanner (radiographie et microtomographie) se déroulant sous anethésie générale, les effets indésirables liés à l'anesthésie seront observés. Concernant le phénotype dommageable, celui-ci n'ayant pas encore été observé chez ces animaux, il est difficile de décrire les effets indésirables potentiels. Néanmoins, par transposition aux observations faites chez l'homme, un élargissement de la plaque de croissance pourrait être observé, conduisant à une modification du squelette, notamment au niveau des membres postérieurs et antérieurs.
Devenir
Le but du projet étant de caractériser le phénotype des animaux et particulièrement le squelette, l'euthansie des animaux est indispensable.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'étidier le la qualité osseuse et la plaque de croissance des animaux, il n'est pas possible de remplacer le modèle in vio par des méthodes alternatives.
Réduction
Des études préliminaires sur cette lignée nous ont permis de mettre en évidence des différences statistiquement significatives pour les paramètres étudiés avec un échantillonnage de 6 individus par groupe, sans distinction entre mâles et femelles. Cependant, ce faible échantillonnage a été rendu possible du fait de la grande homogénéité intra mais également inter sexes au stade de développement étudié (entre 3 et 6 semaines). Ce nouveau projet quant à lui nécessite d'étudier des animaux plus âgés rendant obligatoire la discrimination des sexes. Ainsi, dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en conservant une puissance statistique adéquate, les groupes étudiés seront composés d'environ 8 individus.
Raffinement
Jusqu'au sevrage, le souris seront hébergées en cage ventilée. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un dôme en carton et des lanières de papier seront disposés dans la cage. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h-12h), d’une température (20-24°C) et d’une hygrométrie (45-65%) contrôlées en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance.
Choix des espèces
Le but du projet étant d'analyser en profondeur le rôle physiopathologique du variant RPL13 au niveau cellulaire, un modèle in vivo a été développé par Crispr/Cas9. En effet, des souris RPL13 -/- seront utlisées dans le cadre de cette étude. La croissance et l'évolution du squelette dans le temps étant au coeur de ce projet, les animaux utilisés auront entre 2 semaines et 12 mois d'âge.
Rôle de l’Angiopoïétine-like 4 dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent un arrêt cardiaque provoqué suivi d'une réanimation par massage cardiaque et ventilation mécanique, le porteur estimant que 20 pour cent meurent dans les trois heures et 40 pour cent dans les six heures malgré la réanimation. L'étude cherche une cible pour limiter la fuite capillaire au cours des chocs, l'arrêt cardiaque induisant selon le porteur un coma qui rendrait la procédure sans inconfort. Il affirme que les études in vitro préalables "ne sont pas satisfaisantes" et que le modèle animal est nécessaire pour intégrer les composantes physiologiques.
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez des patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’angiopoïétine-like 4 comme cible d’intérêt particulier. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Une antalgie prophylactique par injection sous-cutanée sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure (typiquement 1 à 2 secondes). Un cathéter veineux sera ensuite mis en place (la procédure complète dure environ 30 minutes). Toutes les différentes injections sont administrées via le cathéter et ne nécessitent donc pas d’interventions supplémentaires sur l’animal. La réanimation cardio-circulatoire comporte un massage cardiaque (8 minutes) et une ventilation mécanique (i.e. une assistance respiratoire) d’au moins 1h jusqu’à atteindre une fréquence respiratoire supérieure à 100/min. L’imagerie cardiaque par échographie (non invasive) dure typiquement 15 minutes.
Impact sur les animaux
De par la variabilité physiologique des animaux ou de par leur génotype, certains animaux répondent moins bien à la réanimation et le cœur reste en arrêt malgré la réanimation cardio-respiratoire : nous estimons une perte d’effectifs de 20% à 3h et 40% à 6h. Cependant, l’arrêt cardiaque induit une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (c'est-à-dire un coma), et les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS (Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique). La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire. Notamment, l'imagerie cardiaque par échographie sera effectuée sur les mêmes animaux que les mesures de fuite capillaire. De plus, les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés. En parallèle, notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et sur le modèle de façon à ne par dupliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours des procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la manipulation. Ensuite, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie appropriée. L’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures. L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans des modèles d’inflammation et d’emphysème induits par l’inhalation de fumée de cigarette ou l’administration d’élastase pancréatique de porc chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bronchopneumopathie leur est provoquée par inhalation de fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc, ce qui induit des douleurs pulmonaires et une perte de poids, puis elles reçoivent des traitements pouvant atteindre 30 administrations et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. L'étude teste, pour le compte de laboratoires donneurs d'ordres, de nouvelles molécules anti-inflammatoires contre la BPCO. Le porteur affirme que l'exploration de cette maladie "demande l'étude d'un organisme complet".
Objectifs
La BPCO (Bronchopneumopathie chronique obstructive) est considérée comme la troisième cause de mortalité cette année dans le monde avec le tabagisme comme facteur de risque majeur. Aujourd’hui, très peu de traitements efficaces contre la BPCO sont disponibles. L'objectif de ce projet est de rechercher et de tester de nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement inhibitrices de l’inflammation et du développement de l’emphysème dans un modèle in vivo de BPCO. Pour développer un médicament, il faut réaliser des tests de toxicité cellulaire mais aussi tester in vivo sur un animal la/les molécules car aucun médicament ne peut être testé chez l’Homme avant que son profil de sécurité ne soit établi. Les études toxicologiques sont réalisées en amont par le laboratoire pharmaceutique ou de recherche publique donneur d'ordres.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n'y a pas de traitement curatif pour la BPCO, mais les traitements disponibles (broncho-dilatateurs, anti-inflammatoires) visent à ralentir l'évolution, prévenir les complications, réduire les symptomes et améliorer la qualité de vie. Dans les cas les plus sévères de BPCO, l'unique solution est l'intervention chirurgicale (greffe du poumon). Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules à caractère anti-inflammatoire dans un modèle d'inflammation ou d’emphysème induits par l’inhalation de fumée de cigarette ou l'administration d'élastase pancréatique de porc chez la souris. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel dans ce modèle, plusieurs prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques, analyses histologiques. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées (diminution de cytokines inflammatoires dans les tissus, diminution du recrutement cellulaire et étude de la structure pulmonaire au niveau histologique...).
Procédures
Un prélèvement de sang rétro orbital (durée du prélèvement 30 secondes) sous anesthésie sera effectué une seule fois juste avant la mise à mort. En ce qui concerne les traitements (voie d'administration variable en fonction des études): En aigue : entre 1 et 8 injections et en chronique : entre 7 et 30 traitements, durée moyenne : 3 secondes/injection
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires pulmonaires à l'animal liées au développement de la pathologie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. La douleur pourra générer une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques, ainsi de valider notre modèle et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la BPCO demande l’étude d’un organisme complet.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum (n=10) nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, de la Buprénorphine pourra être administrée ou ils seront mis à mort selon les points limites décrits dans la procédure. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 à 9 semaines) afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’évaluation du degré de l’inflammation et le développement de l’emphysème après exposition à la fumée de cigarette ou administration d'élastase pancréatique de porc. Un animal juvénile ou trop âgé induira un biais dans l’expérimentation.