Souris

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du rein, puis un traitement par gavage et injection cinq jours par semaine, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs, afin de tester une combinaison censée lever la résistance au sunitinib. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance importante et prévoit une mise à mort avant l'apparition de nécroses tumorales. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre cellules et vaisseaux au sein de la tumeur.

Objectifs

Malgré une réponse objective ou une stabilisation de la maladie, les patients atteints d’un cancer du rein vont progresser de manière inéluctable et résister au traitement sunitinib après environ 1 an de traitement. Dans ce protocole nous proposons de combiner le traitement sunitinib à un inhibiteur d’une voie métabolique qui semble jouer un rôle majeur dans la résistance au sunitinib. Ainsi, valider l’efficacité de cette combinaison chez l’animal représente un enjeu thérapeutique important pour le cancer du rein. Nous espérons ainsi pouvoir proposer une nouvelle alternative thérapeutique afin de contrecarrer la résistance au traitement sunitinib.

Bénéfices attendus

L'échec thérapeutique auquel font face les patients atteints d'un cancer du rein est inéluctable. Grâce à nos recherches, nous espérons ainsi proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d'offrir une solution pour empêcher les mécanismes à l’origine de la résistance au traitement sunitinib. Un transfert vers la clinique serait donc l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous injecterons dans le flanc droit de souris jeunes (6 à 8 semaines) des cellules tumorales humaines de cancer du rein (modèle de xénogreffe). Ensuite, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, ces mêmes souris seront traitées soit avec un traitement de référence du cancer du rein (sunitinib), soit avec un composé chimique (le NCT-503 / inhibiteur voie métabolique), soit avec une combinaison des 2 traitements (le sunitinib et le NCT-503). Ces traitements seront réalisés 5 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou l’inhibiteur NCT-503 (voie intrapéritonéale), ne dureront que quelques secondes à chaque fois. Le traitement par gavage (sunitinib), réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigile. Les souris impliquées seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des 80 souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Avec l’ensemble des procédures comprenant : l’injection de cellules tumorales et les traitements par gavage ou par voie intrapéritonéale, nous classons la procédure en modérée.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales, nous n'attendons pas de nuisance importante chez la souris liée à la procédure en elle-même. Celle-ci ne nécessite aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. S'agissant d'un protocole impliquant l'injection de cellules tumorales et le suivi du développement des tumeurs qui en résulteront, nous classons la procédure en modérée. On rappelle que les souris Nudes ne sont pas à phenotypes dommagables. Le sunitinib et l'inhibiteur NCT-503 ont déjà été utilisés dans des modèles in vivo, par notre équipe et d'autres équipes, respectivement et n'ont pas présenté d'effets indésirables.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs pour analyse nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents acteurs cellulaires présents au sein de la tumeur. Le sunitinib est un inhibiteur de l’angiogenèse, il est donc nécessaire de travailler sur un système plus complexe mettant en jeu les vaisseaux sanguins.

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de la douleur ou d’une perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri- hebdomadaire puis journalier (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adapté au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet des drogues sur la croissance tumorale. En effet, la souris constitue un modèle classique pour la validation de l'activité pro/anti-tumorale de protéines et de composés pharmacologiques. De plus, cette espèce animale est un modèle expérimental que nous connaissons parfaitement et qui est couramment utilisé par la communauté scientifique. Dans ces études, nous utiliserons les souris NUDE, qui constituent le meilleur modèle (données publiées). Ces souris sont immunodéficientes ce qui permet de réaliser des xénogreffes de cellules humaines dans un modèle murin (NUDE femelles, agées de 6 à 8 semaines lors de l'injection des cellules tumorales) sans rejet par le système immunitaire. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les différents traitements, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux âgés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules de lymphome puis des cellules CAR-T par voie intraveineuse, avec plusieurs prélèvements sanguins, et 320 d'entre elles sont irradiées, pour étudier comment le métabolisme de la tumeur influence la réponse à cette immunothérapie. Le porteur indique que la croissance tumorale ne provoque des signes de souffrance qu'à un stade avancé, où l'animal est alors mis à mort. Il présente comme bénéfice attendu de mieux sélectionner les patients éligibles, et affirme qu'aucune alternative in vitro ne reproduit ce dialogue immunitaire.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGC-B) est un cancer du sang très agressif et très fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très diverse et hétérogène, ce qui explique qu'environ 40 % des patients ne répondent pas au traitement de référence. S'ils sont éligibles, les patients qui échappent au traitement peuvent bénéficier d'une thérapie innovante appelée "thérapie par transfert de cellules adoptives" (ou cellules CAR-T). Pour cela, un type spécifique de cellules du système immunitaire du patient (lymphocytes) est prélevé puis génétiquement modifié en laboratoire pour leur permettre de reconnaître les cellules tumorales du patient. Une fois ces cellules immunitaires réintroduites chez le même patient, elles peuvent alors reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Bien que très efficace dans le traitement du LDGC-B, environ 50 % des patients ne répondent pas à ce traitement ou rechutent rapidement (dans l'année qui suit). Il est donc important de comprendre comment améliorer la réponse à ce traitement. Les LDGC-B ont différentes façons de produire leur énergie cellulaire, un support essentiel à leur division constante et rapide. En effet, ces cellules tumorales utilisent soit la voie des sucres (glycolyse), soit l'usine de fabrication d'énergie de la cellule (la mitochondrie). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si la façon dont la cellule tumorale produit son énergie va limiter ou favoriser la réponse des cellules CAR-T.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de mieux sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie innovante.

Procédures

Toutes les souris (640) seront injectées par voie intra-veineuse dans la veine caudale 2 fois au cours de l’expérience pour 1/ recevoir les cellules de lymphome (allogreffe) puis 2/ 7 jours plus tard les cellules T (contrôle ou CAR-T). Chaque injection prendra environ 5 min par souris et sera réalisé sur souris vigile. Un prélèvement de sang (100 µl) sera effectué sur souris vigile 2-3 jours avant l’injection des cellules CAR-T puis une fois par semaine dans la veine caudale de la souris ou en sub-mandibulaire à l’aide d’une aiguille 25G (le volume maximal qui sera prélevé à chaque fois est de 100 µl). Ainsi chaque souris aura entre 4 et 6 prélèvements sanguin sur l’ensemble de la durée de l’expérience. Les souris de la procédure 2 (320) seront irradiées à une dose sublétale (4 Gy). Pour cela elles seront placées 5 par cages (cage spéciale pour l’irradiateur) et seront irradiées pendant 206 secondes (3 min et 26 secondes) pour atteindre 4 Gy (notre irradiateur dispense 1,16 gray par 60 secondes). Cette irradiation ne sera réalisée qu’une fois par souris.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les souris pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des cellules immunitaire (CAR-T), soit par l'irradiation modérée. Nous avons une grande expertise de ce modèle. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation) qu’à un stade avancé de la maladie. Cependant en cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera mis à mort. Les sites d’injections seront surveillés attentivement.

Devenir

mise à mort et mesure du poids des organes, analyses métabolomiques, cytométrie de flux, analyses moléculaires et immuno-histochimiques

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement par les CAR-T. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre minimum de souris à utiliser afin d’être statistiquement significatif.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En terme de raffinement, les souris sont hébergées par groupe de 5 avec un milieu enrichi. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Finalement, en absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

561 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale d'environ une heure pour électroporer le cerveau des embryons in utero, les embryons étant ensuite prélevés et les mères tuées, afin d'étudier le rôle de micro-ARN dans le développement du cortex cérébral. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer douleurs, infection de la plaie ou rupture des sutures, et justifie la mise à mort des mères par des "raisons éthiques" les empêchant de générer d'autres portées. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas la complexité du cortex et que seule la souris permet cette approche transgénique.

Objectifs

Le cortex cérebral est organisé en 6 couches de neurones qui sont générées successivement entre les stades embryonnaires E12 et E16 (12 et 16 jours de vie fétale). Les neurones des différentes couches présentent une grande variabilité de morphologie, de connectivité et de propriété physiologique, alors qu’ils sont issus du même pool de progéniteurs. Ce projet s’inscrit dans la thématique de recherche générale visant à comprendre les bases génétiques permettant à une même population de progéniteurs de générer des neurones très différents entre eux en fonction du stade de développement de l’embryon. Dans ce projet nous nous intéresserons en particulier au rôle des micro-ARNs. Les micro-ARNs sont de petites molécules d’ARN de 21-24 nucléotides capables de réguler l’expression des gènes. Il est couramment admis qu’un même micro-ARN peut réguler plusieurs centaines de gènes et qu’inversement un gène peut être régulé par de nombreux micro-ARNs. Ainsi nous pensons que, compte tenu de leur mode d’action, des changements subtils dans l’activité des micro-ARNs sont susceptibles de modifier significativement la compétence neurogénique des progéniteurs. Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, nous allons mener cette recherche en 4 objectifs successifs : - 1/ Etudier l’expression des micro-ARNs dans les progéniteurs au cours du temps entre les stades E12 et E16 - 2/ Déterminer parmi le pool des micro-ARNs exprimés, la fraction réellement engagée dans une activité de régulation - 3/ Déterminer les gènes dont l’expression est régulée par ces micro-ARNs actifs - 4/ Valider expérimentalement le rôle fonctionnel de certains micro-ARNs actifs, en manipulant leur expression et en analysant les conséquences de ces manipulations sur la morphologie et la physiologie des neurones générés.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux ont montré que l'expression des gènes au sein des progéniteurs des neurones corticaux varie en fonction du stade de développement embryonnaire. Cette variation d'expression des gènes dans les progéniteurs selon le stade de développement induit une grande diversité morphologique et physiologique des neurones corticaux générés à partir de ces progéniteurs. Cette dynamique d'expression génique est encore mal comprise. Nous pensons que les micro-ARNs, parce qu’ils sont capables de réguler simultanément de nombreux gènes et donc de modifier en profondeur l’expression des gènes d’une cellule, peuvent jouer un rôle dans cette dynamique. Le projet présent va permettre de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse ce qui présente un intérêt non seulement pour comprendre comment la structure spécifique du cortex cérebral se met en place mais également d’une manière générale pour appréhender comment une cellule souche initiale va évoluer et se renouveler au cours du développement pour générer l’ensemble des tissus qui composent un organisme.

Procédures

Chirurgie abdominale sur 80 souris gestante sous anesthésie générale (environ 1h par souris). Prélèvement de 241 embryons à un stade supérieur ou égal à E14,5 (10 mn par embryon).

Impact sur les animaux

L’électroporation corticale in utero aux stades embryonnaires entre E12,5 et E16,5 est une technique bien établie pratiquée par de nombreux laboratoires. Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes. Chez la mère : - L'anesthésie, - La laparotomie, - Des injections intra-péritonéale et sous-cutanée, - D’éventuelles problèmes postopératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture. Chez le foetus - L'injection d’acide nucléique intra-ventriculaire suivi d’une électroporation

Devenir

Pour les objectifs 1 à 4, les analyses seront réalisées post-mortem sur les cellules de cerveaux d’embryons électroporées. Pour des raisons éthiques, les mères gestantes dont seront issus ces embryons, ne peuvent être réutilisées pour générer de nouvelles portées et seront donc euthanasiées à l’issue de la procédure. Pour l’objectif 5, les analyses seront réalisées post-mortem sur le cerveau d’animaux de 14 jours issus d’embryons électroporés. Les mères de ces animaux seront également euthanasiées à l’issue de la procédure pour les mêmes raisons que précédemment.

Remplacement

L’option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souche de souris. En effet, il a été montré que la différenciation in vitro des cellules souche génère au cours du temps une succession de sous-types de neurones glutamatergiques qui mime la génération des différentes couches du cortex. Cependant, la culture in vitro ne permet pas de récapituler l’ensemble de la complexité du cortex cérebral. Par exemple, il n’est pas possible de recréer la segmentation du cortex en aires fonctionnelles, ni d’aboutir à une maturation totale des neurones en boite de petri. D’autre part, si la culture in vitro de cellules souche semble maintenir l’existence des facteurs intrinsèques impliqués dans la régulation de la dynamique de différenciation des neurones corticaux, d’autres facteurs de régulation extrinsèques, encore mal connus, ne peuvent pas être maintenus in vitro.

Réduction

Les procédures que nous allons mettre en œuvre visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Elles font appel à certaines techniques délicates à réaliser, c’est pourquoi nous avons recruté pour ce projet un chercheur contractuel ayant une longue expérience dans l'utilisation de ces techniques et de ce fait les maitrisant parfaitement. Le nombre d’animaux par expérience a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques de chaque expérience. L’objectif final du projet vise à identifier le rôle de micro-ARNs particuliers dans les cellules souche neurales du cerveau d'embryons de souris pour générer de nouveaux neurones. Cette recherche impliquera de manipuler l'expression de ces micro-ARNs et d'observer l'effet de ces manipulations en comparaison avec une condition témoin (sans traitement). Pour chaque micro-ARN étudié les deux conditions « traitement » et « témoin » seront réalisées dans des embryons de la même souris gestante. Ceci permet de limiter le nombre d’animaux utilisés par rapport à des procédures où la même condition seraient appliquées à tous les embryons d’une même portée. De plus, le fait d’avoir les 2 conditions à comparer dans la même souris gestante permet également d’augmenter la solidité des résultats et donc finalement de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, l’utilisation de coupes fines de cerveau permet d’étudier tous les paramètres pertinents nécessaires à la caractérisation des conséquences d’un traitement à partir d’un seul individu.

Raffinement

L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. Les cages sont enrichies et les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Les animaux ayant subi une procédure sont surveillés et observés régulièrement. Une grille de score a été définie pour chaque procédure pour l’application de points limites précis et adaptés, avec des actions et des prises de décisions définies grâce à un arbre décisionnel. Des soins spécifiques seront apportés à la mère gestante qui subira l’électroporation in utero. En particulier nous aurons pour impératif de réduire au maximum la douleur induite par les procédures, qui seront réalisées par des personnes très expérimentées. Ainsi, des analgésiques seront injectés avant et après la chirurgie qui se déroulera sous anesthésie. De même des actions spécifiques seront entreprises pour contrecarrer les effets induits par l’anesthésie et la chirurgie. Les animaux ayant subi la chirurgie seront hébergés dans une salle de stabulation spécifiquement dédiée.

Choix des espèces

Chez les mammifères, l’espèce souris est la seule pour laquelle nous pouvons réaliser ce projet, et ce pour des raisons techniques et de connaissances théoriques. En effet, notre projet est basé sur l’utilisation d’une lignée transgénique de souris exprimant T6B de façon conditionnelle. Or, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle la fabrication de lignée transgénique est faisable facilement. D’autre part, l’électroporation in utero est une technique qui n’est réellement bien maitrisée chez les mammifères que chez la souris. Enfin, chez les mammifères non humains, c’est chez la souris que les connaissances génétiques sont les plus développées. Ce projet cherche à comprendre comment la variabilité morphologique et physiologique des neurones du cortex cérebral de souris est codée dans les progéniteurs neuronaux. Comme la différenciation des neurones corticaux s’initie entre 12 et 16 jours de vie fétale, les expériences de ce projet seront réalisées sur des embryons entre E12,5 et E16,5.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Elles sont sensibilisées puis exposées à un allergène d'acarien par voie intranasale, ce qui peut provoquer inflammation pulmonaire et difficultés respiratoires, avant une ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine PCSK9 dans l'asthme allergique. Le porteur décrit une grille de points limites déclenchant l'injection de buprénorphine ou la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin asthmatique le rend possible.

Objectifs

Ayant déjà débuté un projet sur l’étude de PCSK9 dans l’allergie alimentaire, nous souhaitons continuer cette approche et vérifier l’impact de celle-ci dans un contexte d’asthme allergique. De plus, il n'existe pas de méthodes alternatives d'étude des mécanismes appondis de PCSK9 et de l'allergie respiratoire. Le modèle PCSK9 KO associé à l’allergie respiratoire n'est que peu ou pas décrit dans la littérature. C'est pourquoi un modèle d’allergie respiratoire à l’acarien permettra de se rapprocher de la physiopathologie présente chez l'homme tout en évaluant les effets de l'absence ou non de PCSK9 sur l'inflammation.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’asthme allergique, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Étant donné les fortes similitudes entre l’asthme allergique et l’allergie alimentaire, nous pensons que le traitement anti-PCSK9 chez des souris asthmatiques sera bénéfique.

Procédures

Les souris sont soumises à des sensibilisations par voie percutanée ( 4 sensibilisations de 45 minutes), et à des déclenchements par voie intranasale (2 déclanchements de 45 minutes). A la fin du protocole, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids, une inflammation pulmonaire ou difficultés respiratoires au moment des challenges intranasaux.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane et un maximum de sang sera prélevé.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’asthme allergique. Seul un modèle murin asthmatique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’asthme. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Au cours de la procédure d’induction de l’asthme allergique, les souris sont anesthésiées sous isoflurane. Elles sont surveillées jusqu’à leur réveil. Durant la phase de réveil les souris elles sont placées sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et sont hébergées en groupe dans des cages enrichies par des frisottis ou une petite maison en carton. Une observation quotidienne des souris sera effectuée, et les souris seront pesées 3 fois par semaine ce qui permettra de détecter tout changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Notables : Aspects extérieur : Pelage sale, Position recroquevillée à la manipulation Réticent à se déplacer, Zone urogénitale souillée, respiration difficile Évolution pondérale : Perte de poids10% En présence d'un signe notable: administration de buprénorphine à 0,1 mg/kg en sous-cutanée 2 fois/jour.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires et métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles reçoivent un régime déséquilibré autour de la gestation, puis leur descendance subit un transfert de flore intestinale et des tests comportementaux avant d'être tuée pour prélever des tissus, afin de relier alimentation, microbiote et traits autistiques. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans préciser lesquels, et déclare peu d'effets indésirables. Il affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" exprimant tout son répertoire comportemental.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des maladies neurodeveloppementale de plus en plus fréquentes, avec une incidence moyenne de près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Les causes de ce trouble sont encore mal identifiées. Le développement de l’autisme pourrait être le résultat d'une combinaison de facteurs environnementaux toxiques et d’une susceptibilité génétique. Parmi les causes environnemantales possibles, l’obésité, conséquence d’un régime alimentaire déséquilibré, est un facteur particulièrement intéressant, puisqu’elle est de plus en plus répandue dans les sociétés occidentales et pourrait ainsi expliquer l’augmentation inquitétante des cas d’autisme dans ces pays. Des études cliniques récentes montrent que les mères souffrant d’obésité ont un risque accru d’avoir un enfant souffrant de TSA. Actuellement il n’existe pas de modèle animal mimant ce facteur de risque, qui permettrait d’en comprendre les mécanismes. Nous avons montré que la descendance de souris gestantes exposées à un régime cafétéria présente une trajectoire développementale altérée ainsi que des symptômes d’autisme à l’âge adulte. La composition de la flore intestinale des ces souris est également altérée. Nous voulons maintenant la contribution du mircobiote intestinal aux altéartions comportementales observées chez les souris exposées au régime cafétéria. Le projet comprendra deux étapes : 1)Exposition de femelles au régime cafétéria une semaine avant l’accouplement et pendant la gestation puis la lactation, 2)Etude comportementale de la descendance avant et après un transfert de flore microbienne entre le groupe exposé au régime cafétéria et le groupe exposé au régime contrôle. L’enjeu de ce projet est d’identifier une nouvelle cause potentielle de développement des troubles autistiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact du microbiote intestinal sur le développement du phénotype autistique des animaux exposés de manière précoce à un régime déséquilibré.

Procédures

Les animaux seront soumis à un transfert de flore. Ce type d'intervention est en essai clinique chez l'homme pour soulager les patients atteints d'autisme. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ethologique non ivasif. L'ensemble de notre protocole expérimental durera 16 semaines. Les tests comportementaux, que réaliseront auront une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental ne présente pas d’effet indésirable notoire. Dans une expérirnce précédente, l’exposition au régime cafétéria a conduit à une augmentation de 10-15% du poids des mères, et de moins de 10% chez leur descendance. L’ensemble des tests comportementaux ne génère pas de stress particulier.

Devenir

En fin d'expérience les animaux seront euthanasié dans le but de prélever des tissus et étudier l'impact du transfert de flore au niveau moléculaire

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique . Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. La trajectoire développementale des animaux sera étudiée dès la naissance des animaux. Nous suivrons le développement des animaux jusqu’à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau modéré. Elles reçoivent une injection puis des séances d'imagerie par bioluminescence de dix minutes par semaine sous anesthésie répétée, avant d'être tuées pour l'analyse histologique du cerveau, afin de mettre au point un modèle de suivi de la protéine aSynucléine impliquée dans la neurodégénérescence. Le porteur présente l'imagerie comme non invasive et justifie ces 360 animaux par la volonté de suivre la maladie dans le temps et de limiter à terme le nombre d'animaux non-humains utilisés. Il indique valider le matériel en culture cellulaire en amont, l'imagerie in vivo ne pouvant selon lui se faire que sur des animaux vivants.

Objectifs

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection de virus permettant la surexpression d’une protéine mutée qui forme des agrégats et qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation de cette protéine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal. L'objectif est la création d’un modèle permettant le suivi au cours du temps de l'évolution du modèle par imagerie, permettant une étude longitudinale tout en limitant le nombre d'animaux pour étudier le modèle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le suivi de la mise en place et de l’évolution de la "pathologie" à différents temps et sans sacrifier les animaux, pour ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches et travailler avec un modèle bien maitrisé temporellement.

Procédures

Les animaux sont soumis à de l'imagerie in vivo : 10 minutes par semaine pendant toute la durée de l'étude, sous anesthésie générale. C'est une technique non invasive et nécessitant juste une injection qui est non douloureuse et se fait sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par la répétition de l'anesthésie durant l'imagerie, mais celle-ci est de courte durée (10 minutes maximum) et légère car gazeuse. Et par le transfert entre le site d’hébergement et la plateforme d'imagerie, réalisé par les porteurs du projet.

Devenir

Les animaux sont sacrifiés à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.

Remplacement

Nous souhaitons améliorer un modèle pathologique afin d’être plus en adéquation avec la réalité de la maladie chez l’humain, nécessitant l’utilisation de modèles animaux robustes. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique est testé en culture cellulaire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct. L'imagerie in vivo ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Modèle : la souris C57BL6/JR a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. Quant à la souche B6RjTyr c/c, elle représente un atout majeur pour l'imagerie in vivo, du fait de sa dépigmentation cutanée. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité des modèles est éprouvée. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés. Ainsi pour ces deux études nous utiliserons : étude 1 : 3 expériences indépendantes x 3 groupes de 10 animaux x 2 souches = 180 souris et dans l'étude 2 : 3 expériences x 3 groupes de 10 souris x 2 souches = 180 souris, il n'y aura pas d'étude statistisque de différences entre les groupes, mais ce nombre nous permet de valider la fiabilité des nos modèles en imagerie.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement décrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines, car la pathologie étudiée apparait à l'âge adulte chez l'humain.

288 souris, 144 mâles et 144 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Une myosite est déclenchée par des injections sous anesthésie, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant sept jours et subissent un test de force musculaire au grip test, avant d'être tuées pour prélever muscles et organes, afin de tester des molécules candidates contre les myopathies inflammatoires. Le porteur indique que l'induction fait perdre environ 30 % de force musculaire sans, selon lui, provoquer de souffrance décrite dans la littérature. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système cellulaire ne reproduit les interactions en jeu dans la maladie.

Objectifs

Les myopathies inflammatoires (MI) sont des maladies caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et une capacité réduite d'exercice, ainsi qu’une baisse de la qualité de vie et une mortalité accrue. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des effets indésirables. Même si des médicaments sont disponibles, ils ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons démontré chez la souris atteinte de myosite que la prednisone, permet de récupérer la force musculaire après 7 jours de traitement. Cet effet thérapeutique passe par l’activation de la voie b adrénergique dans les cellules inflammatoires. De ce fait, l’activation de cette voie pourrait récapituler les effets thérapeutiques de la prednisone en l’absence de ses effets indésirables. Cette stratégie thérapeutique a été testée dans un modèle murin de Myasthénie grave et un essai clinique est actuellement en cours chez l’homme. Nous avons mis en évidence que les fibres musculaires des patients atteints de dermatomyosite (DM), un sous-type de myosite, présentent une augmentation de l’activité du protéasome. De plus, les inhibiteurs du protéasome ont montré une efficacité in vitro, parmi les inhibiteurs du protéasome déjà utilisés pour le traitement d’autres pathologies auto-immunes et du cancer, Ixazomib et KZR-616 sont les mieux tolérés

Bénéfices attendus

Les myopathies inflammatoires (MI) sont caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et capacité réduite d'exercice, et qui est associées à une baisse de la qualité de vie et à une mortalité accrue par rapport à la population générale et aux patients atteints d’autres maladies chroniques. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention dans cette maladie car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des évènements indésirables et les médicaments qui ciblent l’infiltrat inflammatoire ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons précédemment démontré que la fibre musculaire est un acteur à l’origine des MI ainsi qu’une cible thérapeutique des GC et potentiellement d’autres médicaments. Ces données obtenues par des études in vitro, in vivo et chez l’homme ont ouvert des nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de MI. Notamment, l’activation de la voie b adrénergique et l’inhibition du protéasome dans la fibre musculaire permettront spécifiquement de cibler les mécanismes à l’origine de la maladie. Cela permettra d’améliorer le pronostic d’un groupe de maladies handicapantes et associées à une surmortalité.

Procédures

La myosite expérimentale (ME) sera réalisée, sur chaque souris, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites sous anesthésie à l’isoflurane le même jour et une seule fois sera suffisante pour induire la maladie. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. Seront générées 288 souris ME (144 males, 144 femelles) afin de permettre l’évaluation des nouvelles molécules pour les deux sexes. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile. Les médicaments seront administrés par gavage afin de garantir l’administration de la même quantité dans tous les souris. Chaque gavage induit une contention de 15 secondes par souris, le gavage dure 5 secondes et sera répété pendant les 7 jours de traitement. Au jour 21, 100µL de sang sera prélevé au niveau de la veine faciale (10 secondes maximum), puis les animaux seront mis à mort lors de la même contention et les prélèvements suivants seront alors réalisés : - muscles quadriceps, tibialis antérieur, gastrocnémien : afin d’étudier l’efficacité du traitement ; - foie, rate, cœur : afin d’étudier la tolérance du traitement dans le cas où il y aura des signes de toxicité au bilan dans le sang. La force musculaire sera mesurée au jour 0, 14 et 21 après l’immunisation, en utilisant un test de résistance de la préhension (Grip test). Lors de la mise en place de l’expérimentation, les souris seront différenciées par un marquage au feutre au niveau de la queue afin d’éviter toutes contentions inutiles, la durée du grip-test est de 10 secondes par souris (3 prises de mesures).

Impact sur les animaux

La myosite expérimentale (ME) sera induite sur chaque souris, sous anesthésie à l’isoflurane, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites le même jour et une seule fois. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. L'Induction de la Myosite entraine une perte de force musculaire entre 14 et 21 jours après l’induction. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile.

Devenir

La myosite expérimentale (ME) est induite le jour 0. 14 jours après l'induction de la ME, le traitement est administré pendant 7 jours par gavage dans l’eau de boisson. 21 jours après l'induction de la maladie, les animaux sont mis à mort afin d’étudier l’efficacité des molécules candidates thérapeutiques et leur tolérance par le prélèvement des muscles, du foie, du cœur et de la rate.

Remplacement

Le modèle murin de myosite décrit dans ce projet n’est pas remplaçable et reste indispensable afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité des molécules ayant possiblement un effet thérapeutique dans les myosites. En effet, il n’est pas possible actuellement de modéliser au moyen d’un système cellulaire les interactions dynamiques et complexes entre les cellules musculaires, inflammatoires et l'environnement au cours des myopathies inflammatoires. De plus, chez l’homme, il n’est pas éthiquement possible de ne pas traiter les patients avec des glucocorticoïdes malgré leurs effets iatrogènes connus et de tester des autres molécules candidates en l’absence d’études sur des modèles animaux.

Réduction

Pour répondre à la question scientifique posée, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande une cohorte de 12 souris (6 mâles, 6 femelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs De ce fait, 12 souris seront nécessaires pour les analyses histologiques, 12 pour étudier l’expression des gènes et des protéines, 12 souris pour étudier l’activité mitochondriale, 12 souris pour la cytométrie en flux, au total 48 souris. Vu qu’on compare 6 conditions, au total il faut 288 souris. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions significatives. Les expériences sur les animaux seront stoppées lorsque le niveau de signification statistique est atteint pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisées. Sur la base de notre bibliographie, la question scientifique à laquelle répondra ce protocole n’a jamais été étudiée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées agrémentées de nid, en groupes sociaux. Pour minimiser le stress des souris, toutes les injections pour induire la maladie seront faites par des seringues insuliniques et dans le cadre de la même anesthésie. Dans notre projet précédent, nous avons montré que l’induction de la myosite, même en fin d’anesthésie, ne provoque pas de douleur ni de nécrose dans les sites des injections. Cependant, si les souris présentent des rougeurs au niveau des sites d'injection, ou des détresses respiratoires liées à l'anesthésie, ces dernières seront sorties de l'étude. A partir de l’induction de la myosite inflammatoire, une perte de force étant attendue, de la nourriture en gel sera mise à disposition dans la cage afin d’assurer l’alimentation des souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien adapté. Le poids, le comportement général, la posture, l’état du pelage, les blessures potentielles seront suivies pendant toute la vie des animaux. En cas de doute, un suivi de poids pourra être mis en place et toute baisse de poids sera notifiée au responsable de projet et au vétérinaire. Nous avons montré que l’induction de la myosite (ME) diminue la force musculaire des souris de 30%, mais n’affecte pas leurs capacités à se nourrir. Cependant, après l’induction de la maladie, de la nourriture gel sera placée tous les jours dans la cage pour assurer leur alimentation même dans des conditions de faible mobilité. La prednisone n’induit pas de signe de souffrance, au contraire, ce traitement ainsi que les molécules candidates, devraient réduire la sévérité des symptômes de la ME. La mise à mort sera faite par des méthodes appropriées et par personnes compétentes pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animal la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants car la composition en termes de type de fibre des muscles squelettiques chez la souris mime celle humaine. De façon concordante, la myosite chez la souris mime la maladie humaine pour la présence d’une diminution de force musculaire, d’inflammation et variabilité de taille des fibres au niveau histologique. Des souris adultes seront utilisées. L’âge adulte selon les répondants varie entre 6 et 20 semaines. L'âge auquel les modèles animaux sont couramment utilisés est de 8 à 12 semaines. De ce fait, l’âge des souris sera de 8 semaines car pour les modèles de maladies auto-immunes la puberté est préférable afin d’avoir un système immunitaire compétent. En effet, la plupart des modèles expérimentaux de myosite présents dans la littérature ont été décrits chez la souris adulte et dans ces modèles, aucune souffrance animale n'a jamais été décrite.