Souris

486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à deux reprises puis reçoivent une transplantation de moelle osseuse et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le vieillissement des cellules souches du sang. Le porteur indique que l'irradiation et la greffe peuvent provoquer des infections et un rejet se traduisant par prostration et grande fatigue. Il affirme qu'aucun système in vitro comparable au corps du mammifère n'existe pour étudier l'hématopoïèse.

Objectifs

Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de cellules capables de former toutes les cellules du sang, appelée cellules souches hématopoïétiques ou CSH, entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies malignes du sang telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "physiologique" est une succession de moments de stress, c’est-à-dire une pression ou contrainte de l’environnement. Nous avons déjà montré que les CSH dépourvues d'une protéine spécifique de la réponse des CSH sont moins activées ; c’est-à-dire qu’elles présentent des défauts dans leur division, et nous pensons donc que ces cellules mutées peuvent conserver leurs caractéristiques de jeunesse. Notre hypothèse est donc de vérifier si des signaux de stress provoquent des changements dans l’ADN ou les ARNm constituant ainsi une signature du vieillissement des CSH.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est d’identifier de futures cibles thérapeutiques qui permettront de développer de nouvelles thérapies dans le but d’améliorer la qualité de vie de la population vieillissante.

Procédures

Les souris seront injectées en intra-veineux une, deux ou trois fois (15s environ par injection). Les souris seront irradiées 2 fois à 4 à 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes et une irradiation de 5 et 4,5Gy respectivement. Les souris seront également soumises à des transplantation (une par souris receveuse, injection des cellules de 15s environ), et à des prélèvements sanguins (prélèvement de 15s environ, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines post-transplantation).

Impact sur les animaux

Les injections en intra-veineux peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution du système immunitaire des souris receveuses de transplantation peut entrainer des infections par une diminution de l’efficacité du système immunitaire. La transplantation peut induire un rejet de greffe qui se traduit par une absence de système immunitaire (donc des infections), une prostration des animaux et une grande fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.

Remplacement

Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les mêmes processus in vitro. Cependant, il n'existe pas de système in vitro approprié pour étudier l'hématopoïèse, qui soit comparable au corps du mammifère. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, que nous allons mettre en place. Par conséquent, les expériences in vivo utilisant des souris sont essentielles.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Concretement dans notre étude, et afin d'obtenir des résultats solides, même en cas d'échec de la prise de greffe (environ 5% de rejet de greffe attendus), nous aurons besoin de 3 répliquats biologiques (donneurs)*3 expériences indépendantes = 9 animaux par condition et par âge. La moelle osseuse isolée de chaque animal donneur sera ensuite injectée dans 3 souris de type sauvage irradiées (receveurs).

Raffinement

Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Lors des prélèvements sanguins une pression sera appliquée sur le site de prélevement pour arrêter l'hémorragie. Les souris seront surveillées pour détecter tout signe d'inconfort 10 à 15 minutes après la procédure. Un manque de soin ou un isolement de l’animal entrainera une surveillance quotidienne. Un deplacement anormal nécessitera l’administration d’eau gélifée et de nourriture directement dans la cage. Une respiration haletante entrainera une surveillance quotidienne. L’animal sera mis à mort dans tous les cas si les symptomes persistent plus de 3 jours. Une perte de poids de plus de 10% sans récupération sur 2 semaines entrainera une vigilance accrue des autres paramètres. Une perte de poids supérieure à 20% entrainera la mise à mort de l’animal. Des rougeurs ou gonflements au niveau des sites de prélèvement ou d’injection entraineront l’utilisation quotidienne de solution antiseptique non colorée. Les animaux seront mis à mort s’il n’y a pas d’amélioration après 3 jours.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse car le système hématopoïétique est hautement conservé entre la souris et l'humain. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Enfin, la capacité d'isoler les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris est bien définie et les CSH peuvent être préservées dans un système normal où elles sont situées dans leur niche et peuvent donc conserver leur quiescence (état de repos). Les procédures telles que la transplantation sont également réalisables chez la souris puisque des protocoles sont en place et utilisés en routine. Les animaux utilisés pour les expériences de vieillissement seront jeunes (6-12 semaines), d'âge moyen (10-14 mois), ou âgés (18-24 mois) ces âges simulant respectivement les systèmes humains jeunes, d'âge moyen et âgés. Les souris receveuses de la transplantation seront quant à elles toutes agées de 3 mois (âge idéal pour une transplantation optimisée). Une attention particulière sera portée aux groupes, afin d'équilibrer autant que possible les âges dans chaque expérience.

Les 225 souris utilisées sont des souris NSG, immunodéficientes, qui tolèrent la greffe de cellules humaines. Elles reçoivent par la veine de la queue, éveillées, des cellules cancéreuses stimulées ou non par des vésicules issues de cellules métastatiques, puis passent jusqu'à 20 séances d'imagerie par bioluminescence d'environ 20 minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, les souris pouvant développer tumeurs et micrométastases, et toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse post-mortem de leurs organes. Les tests in vitro menés en amont montrent déjà, selon le porteur, le rôle de ces vésicules dans le potentiel métastatique des cellules de cancer du sein, et il conclut : "Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal."

Objectifs

Les métastases sont responsables de 90% des causes de décès lié au cancer selon l’OMS, et représente un problème majeur de santé publique. En effet, le mécanisme de formation des métastases est très complexe et il n’existe actuellement aucun traitement. La compréhension du mécanisme de formation des métastases constitue donc un enjeu majeur pour identifier de nouvelles cibles et axes thérapeutiques. L’objectif de ce projet vise à comprendre l’impact de vésicules extracellulaires produites par des cellules agressives métastatiques sur la capacité à former des métastases de cellules moins invasives (qui potentialiseraient le pouvoir métastatique des cellules moins invasives). Ce projet implique l’injection de cellules cancéreuses chez la souris afin de pouvoir suivre la formation de micrométastases en réponse à la stimulation aux vésicules extracellulaires ou non. Nous avons montré un effet significatif de ces vésicules extracellulaires sur l’augmentation des capacités invasives in vitro. La présence de ces vésicules dans un modèle in vitro 3D a également été confirmée. Les expériences in vivo nous permettrons de tenir compte de l’environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier. Seules les expériences in vivo nous permettront de valider notre hypothèse.

Bénéfices attendus

A la fin du projet, ces résultats nous permettront de valider que ces vésicules sont impliquées dans la formation de métastases. A des fins thérapeutiques, ces vésicules pourront par la suite être ciblées par des traitements visant à réduire la formation de métastases aujourd’hui largement responsable de la gravité des cancers et des rechutes. Grâce à cette étude, nous pourrons apporter des bénéfices sur la meilleure compréhension des cellules à former des métastases mais aussi une nouvelle cible thérapeutique pour espérer mieux soigner les patients à terme.

Procédures

Greffe par voie caudale sur animaux vigiles (une fois par procédure, moins de 5 minutes) Imagerie par bioluminescence ( 1 à 2 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction de la procédure et en fonction du développement tumoral obtenu soit au plus 20 fois -durée de la séance d'imagerie : environ 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les souris pourront développer des tumeurs et des micrométastases. Des points limites suffisament précoces ont été établis pour limiter ces nuisances au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser l'analyse post-mortem des différents organes qui présenteront des micrométastases.

Remplacement

Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent le rôle important de ces vésicules dans la tumorigénicité des cellules de cancer du sein et notamment dans le potentiel métastatique. Cependant, les tumeurs sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Une expérience pilote nous permettra de déterminer le nombre nécessaire et suffisant à la greffe tumorale. Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale sera suivie de manière longitudinale tout au long de l'expérience notamment grâce l’expression de la luciférase dans nos cellules, système très sensible qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lot est de 10, les expériences seront réalisées en duplicat et des tests statistiques seront effectués.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Les cellules greffées exprimeront la luciférase ce qui permettra de détecter l’apparition de cellules tumorales très précocement permettant ainsi d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes, en particulier sur des souris NSG, qui permettent la greffe de cellules humaines Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée une plaie cutanée qu'on infecte par des bactéries avant de poser un pansement au chitosane, avec un suivi par imagerie sous anesthésie pendant cinq à quatorze jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie. Il présente l'étude comme une preuve de concept préalable à des tests sur "gros animal" puis à un essai clinique humain.

Objectifs

Les infections de plaies traumatiques et chirurgicales sont un problème majeur dans le domaine médical. L’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant. La notion de «bon usage » des antibiotiques doit être élargie à la notion de « moindre usage ». Dès lors, il existe un besoin croissant d’utilisation de produits antimicrobiens topiques (application directement sur le site d'infection) pouvant être appliqués sur des plaies potentiellement infectées. Le chitosane est utilisé pour de nombreuses applications médicales et pharmaceutiques. Les préparations de chitosane ont beaucoup attiré l’attention en raison de leurs propriétés biologiques potentiellement bénéfiques. Ces propriétés incluent notamment l'hémostase (la coagulation), l'activité antimicrobienne et la stimulation de la guérison. L'activité antimicrobienne à large spectre du chitosane a suggéré qu'il pourrait être utilisé comme pansement pour plaie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer qu’un pansement guérit une plaie cutanée infectée sans traitement antibiotique : c’est une alternative à la thérapie actuelle, lourde et source de résistance aux antibiotiques. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal et ensuite un essai clinique chez des patients humains.

Procédures

Les souris subiront une intervention chirurgicale sur la peau (création de la plaie + traitement, 30 minutes en tout) puis seront suivies 5 jours (18 souris, 5 suivis) ou jusqu'à 14 jours (24 souris, 8 suivis) par imagerie PhotoImageur. Chaque procédure PhotonImageur dure 5 minutes (les souris seront anesthésiées).

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique l'anesthésie, la réalisation de la plaie, l’inoculation des bactéries, la pose du pansement avec une suture, puis la réalisation d’imagerie. L’infection provoquée pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

Suite à l’euthanasie, la plaie sera observée : - Signes inflammatoires locaux - Présence d’abcès - Taille de la plaie. Une analyse bactériologique et histologique sera réalisée sur chaque plaie avec les tissus adjacents.

Remplacement

En raison des interactions complexes entre l'hôte et l'agent pathogène, les systèmes in vitro ne peuvent pas reproduire fidèlement les conditions d'infection et de guérison des tissus. Il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux qui reflètent l'infection des tissus pour évaluer les stratégies d'ingénierie tissulaire.

Réduction

Un suivi par photonimagerie diminue le nombre de souris nécessaires à l’étude en permettant un suivi bactérien longitudinal et en évitant les sacrifices aux temps intermédiaires. L’étude sera réalisée sur 6 souris par groupe et les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de l’enrichissement ni de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. L’hébergement est réalisé en cages ventilées individuellement. Elles sont stérilisées par autoclavage. L’enrichissement est adapté. - Des protocoles précis de prémédications, d’analgésie, d’anesthésie et de mise à mort sont mis en place. - Plusieurs points limites éthiques généraux et spécifiques seront suivis tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les résultats de cette étude préclinique serviront pour la prise en charge de plaies infectées avec la mise en place d’un nouveau pansement. Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais détient un potentiel translationnel car elle est réalisée chez le mammifère. La souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur la cicatrisation de la peau et l’effet de différentes modalités de traitement. La région dorsale sera utilisée pour l’évaluation des pansements pour la réduction des possibilités de grattade par la souris et la facilité d’évaluation quotidienne. L’utilisation des souris permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme car il tient compte de la biologie tissulaire. En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique et la réponse biologique face aux bactéries. Les souris seront âgées de 7 semaines et pèseront environ 20-25gr. Des souris âgées de plus de 6 semaines sont choisies afin qu'elles aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques anesthésiques et pour faciliter l'intervention chirurgicale. Toutes les souris auront le même âge pour une meilleur comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille de la souris.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie d'environ deux heures sous anesthésie, des injections d'antibiotique et une inoculation d'Enterococcus faecalis, avant d'être tué pour prélèvements. Le porteur indique que les douleurs post-opératoires constituent l'effet indésirable majeur et prévoit une analgésie associée. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer ce modèle intégrant le dialogue entre microbiote, organisme et pathogène.

Objectifs

Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontrée, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l'homme et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l'homme en bonne santé, certaines souches de Enterococcus faecalis en particulier celles résistantes à la vancomycine sont à l'origine d'infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent à E. faecalis de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. E. faecalis est une bactérie qui possède autour d’elle une enveloppe constituée d'une membrane et d'une épaisse paroi. Le peptidoglycane (PG) est un composant majeur de cette paroi bactérienne. Le métabolisme du PG joue un rôle crucial dans la structure et la forme de la cellule bactérienne, et la résistance aux antibiotiques et aux anti-microbiens. La formation du PG et son renouvellement au cours de la vie de la bactérie nécessite des enzymes spécifiques c’est-à-dire des protéines dont le rôle est de réaliser des réactions chimiques assurant la synthèse et le recyclage du PG. L’objet de cette demande vise à comparer la susceptibilité de E. faecalis à des antibiotiques ciblant la paroi au moment de sa prolifération intestinale. Afin de comprendre les mécanismes de résistance aux antibiotiques, plusieurs souches de E. faecalis seront testées en fonction de leur capacité à synthétiser ou recycler leur paroi. Enfin, nous testerons si la présence d’un autre type d’anti-microbien dirigé contre E. faecalis peut augmenter l’effet des antibiotiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre la sensibilité de E. faecalis aux agents anti-microbiens qui ciblent le PG et les mécanismes de résistance qui y sont associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettta de produire de nouvelles connaissances fondamentales sur une voie métabolique essentielle et partagée par plusieurs espèces bactériennes dont des espèces pathogènes. Les résultats générés permettront d'améliorer notre compréhension globale de la synthèse de la paroi bactérienne, une cible courante des antibiotiques que nous consommons et pour lequels des résistances apparaissent au cours du temps. Nous apporterons de nouveaux éléments pour le développement de stratégies antibactériennes innovantes, comme celles visant à potentialiser l’action d’un antibiotique par une autre molécule présentant une activité anti microbienne comme les bactériocines. Ceci est d’un intérêt majeur dans la mesure où les médicaments ciblant la biogénèse des parois bactériennes sont parmi les antibiotiques les plus efficaces. Ce projet représente donc un fort potentiel pour leur exploitation ultérieure dans des stratégies antibactériennes, telles que le ciblage des enzymes impliquées dans la synthèse et le recyclage de l’enveloppe des bactéries.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à environ 2h de chirurgie et à 24h de soins post-opératoires. Ils seronts mis à jeun la nuit précédent l’intervention chirurgicale. Ces interventions nécessiteront de réaliser sur le même animal et sur tous les animaux mentionnés dans la demande : - Des Injections sur animaux vigiles o 3 fois un antibiotique, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs o 1 fois un analgésique le jour de la chirurgie avant l’anesthésie o 1 fois pour l’anesthésie généréale o 1 fois un analgésique en fin de journée pour prévenir les douleurs post-opératoires o 1 fois d’une solution saline pour la réhydradation - Une Laparotomie sous anesthésie générale pendant 2h

Impact sur les animaux

L’inoculation par E. faecalis ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses faibles de E. faecalis bien tolérés par les souris. L’absence d’effets indésirables sera néanmoins contrôlée au cours de l’expérience. Le poids, le poil ébouriffé (ou hérissé), les yeux clos, la léthargie et le dos courbé seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des reflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les effets indésirables majeurs sont les douleurs post-opératoires. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et avec une analgésie associée pour limiter les douleurs et souffrances pré et postopératoires.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l’issue des protocoles pour des prélèvements d’échantillons en raison de leur infection par un agent pathogène.

Remplacement

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions complexes. En effet, les approches in vitro bien que complémentaires ne peuvent pas remplacer un modèle intégrant des interactions in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés nous porterons une attention particulière à la reproductibilité des expériences. Nous réaliserons des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales des molécules d’intérêt. Nous veillerons également à diminuer le nombre de groupes contrôles en comparant plusieurs mutants pour une seule souche sauvage. Pour calculer le nombre d’individus à utiliser par groupe, nous avons estimé sur la base de nos précédents travaux que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 15 pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, ne seront pas soumises à de longues périodes de jeûne pendant la durée de l’expérience. Une évaluation préopératoire pour contrôler le bon état général de l’animal sera réalisée avant la chirurgie. Seuls les animaux en parfait état de santé seront utilisés. Une prémédication avec un dérivé morphinique sera effectuée pour réduire le stress des animaux, faciliter leur contention et potentialer l’effet des anesthésiques. Les 4 qualités requises pour une anesthésie générale (narcose, analgésie, myorelaxation et sécurité) seront respectées. Un anesthésique local sera utilisé au site d’incision pendant la chirurgie et un anti-inflammatoire sera utilisé pour prévenir les douleurs post-opératoires pendant la nuit. Une solution saline sera aussi utilisée pendant le temps de la chirurgie pour prévenir l’assèchement des tissus. Pour palier les effets négatifs de l’anesthésie : i) les souris seront maintenues sur un matelas chauffant ii) leurs yeux seront protégés de la dessiccation par l’application d’une compresse imbibée d’eau, iii) un fluide de remplacement sera injecté pour palier les pertes de fluide pendant l’intervention, iv) un environnement calme et un approvisionnement en nourriture molle sera proposé pendant les 24h qui suivront la procédure chirurgicale. Un matelas chauffant sera aussi utilisé pour lutter contre l’hypothermie pendant la phase de réveil. Pour la surveillance post-opératoire, un personne responsable bien-être veillera à ce que toutes les souris se réveillent. L’aire de réveil sera confortable dans une zone calme et sombre. Puis les souris réveillées seront remises au fur et à mesure dans leur cage d’origine sur une litière propre. Le milieu sera enrichi avec des « maisons » en carton et du sopalin. Enfin, pour prévenir les douleurs post-opératoires, les animaux seront médicamentés avec un anti-inflammatoire non stéroidien sous réserve de l’absence d’interaction potentielle avec l’infection par E. faecalis.

Choix des espèces

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une dysbiose post-antibiotique comme cela est observé chez l’homme. Notre organisme modèle est un pathogène opportuniste issu du microbiote intestinal. Des modulations du microbiote intestinal des souris femelles peuvent se produire au cours de leur cycle menstruel. Afin de limiter ce facteur potentiel de variation, nous utiliserons des souris mâles pour les expérimentations. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles » âgées au minimum de 8-10 semaines seront donc utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colorectal, puis des traitements répétés par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale pendant plusieurs semaines. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'accompagner d'infections cutanées, de plaies ou de nécroses, et prévoit un score clinique déclenchant soulagement ou mise à mort. Il utilise des souris immunodéprimées et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" au modèle animal pour reproduire le dialogue entre tumeur et environnement.

Objectifs

Le cancer colorectal figure au troisième rang des cancers les plus diagnostiqués dans le monde. Il représente la quatrième cause de décès dont l’incidence continue à augmenter. Malgré l’ampleur de cette pathologie les origines moléculaires de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de patients ne peuvent être efficacement soignés. Au cours de la progression tumorale, les cellules cancéreuses acquièrent des propriétés spécifiques, dont la capacité à envahir les tissus environnants pour métastaser vers des sites distants. L’acquisition de ces propriétés malignes reflète des perturbations dans les voies de signalisation cellulaires qui contrôlent la prolifération, la motilité et à la survie cellulaire. Notre recherche vise à comprendre comment la dérégulation de ces voies de siganlisation conduit à l’agressivité des cancers et à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques asociées. Les modèles souris de greffes sous-cutanées de cellules de cancer colorectaux constituent des outils importants pour étudier et comprendre le développement du cancer colorectal et permettent aussi d’évaluer la réponse tumorale à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre programme de recherche qui se déroulera en 5 ans permettra de mieux comprendre le processus relié à la formation des métastases et de proposer de nouvelles thérapies ciblées dans le cancer colorectal.

Procédures

Des greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses seront réalisées sur l’ensemble des animaux (une seule injection en sous-cutanée sur souris vigile, durée du geste

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une infection cutanée, des plaies, ou des tumeurs nécrosées. L’examen quotidien des souris permettra également la détection des premiers signes comportementaux liés à la douleur (isolement, absence de mobilité et de réponse aux stimuli, étirements, absence de toilettage, pilo-érection, absence de prise de boisson…). Les signes relatifs à la dégradation de l’apparence physique et aux troubles du comportement seront scorés et des mesures de soulagement ou la mise à mort de l’animal seront envisagées en fonction du score.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement et à l’analyse fine des tumeurs.

Remplacement

Nous utiliserons des modèles in vitro de tumoroïdes issus de cellules en culture pour étudier les effets des protéines étudiées et des traitements proposés dans les cellules épithéliales intestinales. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation des modèles animaux pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle de ces protéines et l’effet de ces traitements dans un contexte mimant la physiopathologie et prenant en compte le dialogue entre les cellules tumorales et l’environnement de la tumeur, notamment avec la matrice extracellulaire et le système immunitaire.

Réduction

Grace aux données de la littérature et à l’utilisation de tests statistiques nous pouvons définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe pour chaque procédure.

Raffinement

Toutes les dispositions ont été prises pour le raffinement les conditions d’expérimentation. Le bien-être animal est évalué quotidiennement. Une attention particulière est portée à la formation de l’expérimentateur afin de limiter la durée de la procédure expérimentale et ainsi réduire la douleur et limiter les variations expérimentales. Une fiche de suivi est établie pour chaque animal de la procédure expérimentale. Les souris seront observées régulièrement et les signes cliniques seront recherchés : perte de poids, isolement, dos vouté… A l’apparition d’un de ces signes, des stratégies seront mises en place pour mettre fin à la douleur et au stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris nude immunodéprimée est le modèle utilisé internationalement pour étudier la croissance tumorale des cellules humaines. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Les souris immunocompétentes sont un modèle de référence pour étudier la croissance tumorale des cellules murines qui permet de prendre en compte l’implication du système immunitaire de l’hôte. Nous utiliserons des souris de 6-7 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe et des femelles, en raison de leur caractère moins agressif entre-individus.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes ou d'ARNm et des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, afin de produire des anticorps monoclonaux destinés aux programmes d'une société. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une détresse modérée, des réactions inflammatoires et, en intramusculaire, une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs. Il revendique une qualité "souvent supérieure" des anticorps dérivés d'animaux et affirme qu'aucune méthode alternative n'est possible pour les hybridomes murins.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’immuniser des souris avec un antigène et/ou de l’ARNm afin d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront potentiellement être sélectionnés au sein des programmes de la société. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer les méthodes analytiques nécessaires à un projet scientifique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique ainsi celle de potentiels candidats médicaments pour de la thérapie humaine.

Procédures

Ce projet comporte 3 procédures expérimentales correspondant chacune à une stratégie d’immunisation spécifique. Un même animal ne pourra pas être impliqué dans plusieurs procédures. Les animaux seront, donc, soumis à une seule procédure comportant plusieurs étapes/interventions. Des échantillons de sang seront prélevés, sous anesthésie gazeuse associée à une analgésie locale, au cours de chacune des procédures. Les animaux recevront également un nombre d’injection variables d’antigène et/ou d’ARNm, en fonction de la stratégie sélectionnée. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes lymphoïdes. Typiquement, les interventions seront réalisées entre 1 et 2 fois toutes les 2 semaines pendant 4 ou 8 semaines. Cependant, la durée maximale de chacune des procédures est de 6 mois pour permettre la réalisation d’un protocole « retardé ». Chacune des interventions réalisées est de courte durée (≤10 minutes).

Impact sur les animaux

La majorité des souris subiront des injections répétées pouvant générer une légère douleur lors de leur réalisation. Cependant, celles-ci étant répétées, il y aura des effets cumulatifs, ce qui pourrait entraîner une détresse modérée chez ces souris. L’injection d’antigène ou d’ARNm peut provoquer des réactions inflammatoires importantes, notamment, durant les 2-5 jours suivant l’injection. Ces dernières peuvent, dans certains cas, se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilité, une réduction de la réactivité aux stimuli verbaux et sensoriels et/ou un pelage ébouriffé. De par la faible masse musculaire de la souris, l’injection intramusculaire peut, parfois, causer une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs.

Devenir

À la fin de l’étude, les animaux présentant la meilleure activité contre l’antigène d’intérêt seront euthanasiés pour la collecte d’organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la génération des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme.

Remplacement

In vivo, les anticorps monoclonaux sont des molécules complexes qui font intervenir de multiples étapes permettant une sélection des plus efficaces. Le principal avantage des anticorps dérivés d’animaux par immunisation est donc leur qualité, souvent supérieure à ceux non-dérivés d'animaux (ex : phage display). Ces derniers nécessitent, également, des coûts et des délais de génération beaucoup plus importants. De plus, leur qualité pour les phases de développement non clinique d’anticorps thérapeutiques peut poser des difficultés supplémentaires. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux qui seront utilisés a été calculé afin d’optimiser les chances d’obtenir au minimum un anticorps d’intérêt, par stratégie d’immunisation. Dans le cas où les technologies, réalisées à partir des organes lymphoïdes des souris sélectionnées, ne permettront pas d’obtenir d’anticorps de qualité ou possédant les caractéristiques désirées, un protocole retardé pourra être réalisé sur les animaux immunisés restant. Les animaux utilisés seront généralement issus de lignées consanguines.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où un animal devrait être maintenu seul dans sa cage, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse) associée à un analgésique local et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. L’utilisation d’aiguilles de diamètre adapté au type d’injection à réaliser et le plus petit possible seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. L’évolution pondérale, l’aspect général et le comportement des animaux (apparence, plaie/traumatisme, excrétion) seront suivis une fois par semaine. En post-injection d’antigène ou d’ARNm, période durant laquelle l’animal peut perdre du poids ou présenter des signes physiologiques marqués de détresse, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que le poids de l’animal ne diminue plus sur 2 pesées successives et que celui-ci ne présente plus d’éventuels signes physiologiques de détresse aiguë (hypomobilité/hyporéactivité, respiration accélérée/ralentie, etc.). Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera, également, mis en place en pré et post-injection durant la totalité de cette période. Dans le cas d’injection intramusculaire, une surveillance accrue du site d’injection et de la motricité du membre de l’animal sera, également, effectuée. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra, cependant, être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. Des points limites spécifiques relatifs à une perte de poids trop importante et/ou un aspect général/comportement très dégradé seront des critères pouvant justifier l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des lymphocytes B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. Le développement de nombreuses souches consanguines a, également, permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les animaux utilisés auront préférentiellement un âge compris entre 6 et 8 semaines. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.