Souris

Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, l'infection pouvant provoquer une parésie et une perte de poids. Le projet teste de nouvelles molécules avant un éventuel essai clinique, et le porteur revendique un "besoin de générer un maximum de données" pour de "meilleures armes" contre la maladie.

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours maximum par semaine pendant 4 à 8 semaines. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de très faible volume seront effectués. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – sur un nombre restreint de souris sélectionnées. Il s’agit d’un acte rapide de quelques secondes. 4. Des prélèvements de sang seront effectués sur animaux anesthésiés juste avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend pas plus d’1 minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

Soumises à une batterie de tests moteurs et cognitifs, labyrinthe, force de préhension, suspension et tapis roulant, 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal d'un volume incompatible avec la survie, complété par le prélèvement d'organes. L'étude porte sur le rôle des plaquettes sanguines au cours du vieillissement, sur des souris de 6, 12 et 18 mois. Le RNT évoque des stimulations électriques pour forcer la marche sur le tapis tout en les qualifiant ailleurs de douces et non douloureuses, sans trancher.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins, dans lesquelles les plaquettes jouent un rôle important, sont très fréquentes chez les personnes âgées. Pourtant, nos connaissances sur le fonctionnement des plaquettes avec l’âge restent limitées. La plupart des données disponibles proviennent d’études menées chez des adultes d’âge moyen, et leurs résultats sont souvent simplement appliqués aux personnes âgées. Or, chez les personnes plus âgées, le contexte est très différent : elles présentent souvent plusieurs maladies chroniques et prennent de nombreux traitements, qui peuvent modifier le fonctionnement des plaquettes sans que l’on en comprenne bien les effets. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment les plaquettes se dérèglent au cours du vieillissement et d’identifier de nouveaux moyens de les surveiller ou de les cibler. Ces recherches pourraient aider à mieux prévenir les complications plaquettaires chez les personnes âgées et à améliorer leur prise en charge médicale.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie du vieillissement et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour un vieillissement en bonne santé.

Procédures

Les animaux seront évalués à l’aide d’une série de tests comportementaux et moteurs couramment utilisés en recherche, répartis sur quatre jours consécutifs, et réalisés sur animaux vigiles, dans des conditions contrôlées et avec une surveillance constante. • Fonctions cognitives (mémoire spatiale à court terme) Les capacités d’exploration et de mémoire spatiale sont évaluées dans un dispositif de type labyrinthe, dans lequel chaque animal se déplace librement pendant environ 8 minutes. • Fonction motrice – force de préhension La force des membres est mesurée à l’aide d’un dispositif standardisé, au cours de trois essais courts espacés d’une heure. La durée de chaque essai est limitée, pour un temps total d’environ 5 minutes par mesure. • Coordination et équilibre La coordination motrice est évaluée par un test de suspension sur câble, réalisé au-dessus d’une surface amortissante afin de prévenir tout risque de blessure. Le temps de maintien est mesuré avec une durée maximale limitée et trois essais espacés d’une heure. • Activité locomotrice et comportement exploratoire L’activité spontanée est observée pendant 10 minutes dans une arène dédiée, permettant à l’animal d’explorer librement l’environnement. • Endurance physique Les capacités d’endurance sont évaluées à l’aide d’un tapis roulant automatisé, avec une augmentation progressive de l’effort. La durée du test est adaptée aux capacités individuelles des animaux. Les encouragements à la marche reposent exclusivement sur des stimulations douces et non douloureuses, calibrées au niveau minimal nécessaire, et le test est interrompu dès l’apparition de signes de fatigue. Afin de limiter la fatigue globale et les interactions entre les différentes évaluations, les tests de mémoire spatiale, de force de préhension et de coordination motrice sont réalisés à des jours distincts, tandis que les évaluations de coordination motrice et d’endurance sont regroupées le même jour. Dans le cadre du protocole, les animaux pourront également faire l’objet de procédures de courte durée, incluant des injections d’environ 15 secondes, un prélèvement sanguin périphérique réalisé jusqu’à l’obtention de l’hémostase, ainsi qu’un prélèvement sanguin terminal de 1 à 2 minutes, effectué sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certain niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux fait suite au prélèvement sanguin terminal de grand volume nécessaire à la caractérisation des plaquettes (volume incompatible avec la survie de l'animal) et est nécessaire pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment les plaquettes sanguines agissent lorsque l’on vieillit. Les plaquettes sont de très petits éléments du sang qui servent à arrêter les saignements, mais qui jouent aussi un rôle important dans certaines maladies fréquentes chez les personnes âgées, comme les maladies du cœur et des vaisseaux. D’autres animaux utilisés en recherche, comme la mouche ou le poisson zèbre, ne conviennent pas pour cette étude, car leur sang fonctionne d’une manière très différente de celui des humains. Les cellules qui remplacent les plaquettes chez ces espèces ne se comportent pas de la même façon, ce qui ne permet pas de faire des parallèles fiables avec la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris fonctionnent presque comme celles des humains. C’est pourquoi les souris sont le meilleur modèle pour étudier l’impact du vieillissement sur les plaquettes sanguines. Ces recherches permettront de mieux comprendre certaines maladies liées à l’âge et, à terme, d’aider à mieux les prévenir afin de favoriser un vieillissement en meilleure santé.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le début des tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. Les animaux seront également acclimatés à la salle d’expérimentation pendant la phase d’habituation. Des éléments d’enrichissement seront mis en place dans la cage d’hébergement afin d’assurer leur bien-être et réduire le stress : animaux placés en groupe dans les cages et papier pour faire un nid. Si l’animal présente des signes de détresse ou une agressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécessaire des soins adaptés. Si l’animal présentent des signes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, une perte de poids inhabituel, difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort. Toutes les procédures utilisent des analgésiques/anesthésiants locaux ou généraux.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. D’autres modèles animaux, comme la mouche (drosophile) ou le poisson zèbre, ne sont pas adaptés à cette étude, car leur système sanguin est très différent de celui de l’être humain. Chez ces espèces, les cellules équivalentes aux plaquettes n’ont ni la même structure ni les mêmes fonctions, ce qui empêche de tirer des conclusions pertinentes pour la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris sont très proches de celles de l’Homme, tant par leur mode de formation que par leur fonctionnement. C’est pourquoi le modèle murin est aujourd’hui le plus approprié pour étudier comment le vieillissement modifie l’action des plaquettes et comment ces changements peuvent influencer la santé, notamment le risque de maladies liées à l’âge. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, des souris de 6, 12 et 18 mois seront utilisées

Hébergées seules pendant environ quatre mois pour protéger leurs implants, 197 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles subissent une chirurgie cérébrale de quatre heures, l'implantation de fibres optiques et d'électrodes, puis des tâches de navigation dont un labyrinthe aquatique, sous restriction alimentaire pour les motiver. Le RNT reconnaît que l'isolement contrarie une espèce qui vit normalement en groupe et que la nage induit stress et légère hypothermie. La mise à mort permet d'analyser leur cerveau et de vérifier la position des dispositifs implantés.

Objectifs

Le cervelet a été classiquement considéré comme une structure impliquée dans le contrôle, la synchronisation et l'apprentissage des habiletés motrices. Cependant, un ensemble de preuves récentes ont également mis en évidence son rôle dans les processus cognitifs par ses interconnexions avec les régions du cerveau impliquées dans la cognition, notamment l'hippocampe. L'hippocampe est consideré comme le siége de la navigation, une fonction fondamentale qui permet aux individus de se repérer dans l'environnement et de la mémoire spatiale, la composante de la mémoire responsable de l'enregistrement des informations sur notre environnement et notre orientation. Des études menées sur des souris ont révélé que le cervelet est crucial pour l'activité neuronale de l'hippocampe et l'efficacité des comportements de navigation. Cependant, les voies reliant le cervelet à l'hippocampe et les mécanismes sous-jacents restent inconnues. Notre projet vise à caractériser les projections cérébelleuses vers l'hippocampe, tant sur le plan anatomique que physiologique, chez des souris au comportement libre. Nous sollicitons une demande de modification car compte-tenu des premiers résultats obtenus, nous souhaitons réaliser un test comportementale complémentaire sans modification du nombre total d’animaux.

Bénéfices attendus

Les fonctions cognitives, telles que la navigation et la mémoire spatiale, sont des processus complexes qui impliquent l'intégration d'informations provenant de différentes régions du cerveau. L'étude des connexions entre ces régions permet d’appréhender non seulement les bases neuronales de ces processus, mais contribue également aux domaines plus vastes des neurosciences et de la psychologie cognitive. Elle fournit une base pour développer et tester des théories sur la façon dont le cerveau traite les informations et décide du comportement. La navigation et la mémoire spatiale sont souvent altérées dans divers troubles neurologiques et psychologiques, tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Comprendre les circuits neuronaux en conditions normales, peut aider à détecter et à comprendre les altérations et les dysfonctionnements cérébraux qui surviennent dans ces conditions pathologiques. En étudiant les interactions entre le cervelet et l’hippocampe, ce projet permettra donc de mieux comprendre le réseau cérébral qui soutient la navigation et la mémoire spatiale en conditions normales, avec des applications potentielles dans les pathologies associées.

Procédures

Dans cette étude, trois groupes d’animaux seront soumis à des interventions distinctes. Premier groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale comprenant une injection de solution, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée maximale de cette intervention est de 4 heures. Après un délai maximal d’un mois, les animaux seront de nouveau anesthésiés puis euthanasiés au cours d’une procédure chirurgicale, sans réveil intermédiaire, afin d’éviter toute souffrance en fin d’expérience. Deuxième groupe – MODIFICATION: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, pour une durée maximale de 4 heures. Après une période de récupération d’une semaine, ils participeront à des séances d’exploration comportementale dans une arène, à l’état éveillé, pendant 60 minutes maximum par jour durant deux semaines. Des tests comportementaux seront ensuite réalisés pendant 120 minutes maximum par jour sur une période de trois mois. Ces tests incluront l’observation du comportement, l’enregistrement de l’activité cérébrale et l’utilisation de l’optogénétique, permettant la stimulation ciblée de zones cérébrales par la lumière. Une légère restriction alimentaire sera appliquée certains jours afin de motiver l’exploration de l’environnement. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil. Troisième groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, d’une durée maximale de 4 heures. Après une semaine de récupération, ils participeront à une expérience de navigation impliquant un labyrinthe aquatique. Ils passeront environ 15 minutes par jour dans l’eau pendant 15 jours, avec des sessions de nage limitées à 2 minutes maximum, entrecoupées de périodes de séchage et de repos. Cette expérience inclut l’utilisation de l’optogénétique. À l’issue de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil, selon la même méthode que pour les autres groupes.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certains effets indésirables peuvent survenir pour les animaux à différents moments du processus : Premièrement, les effets liés aux chirurgies : Les interventions chirurgicales, comme celles réalisées au niveau du cerveau, peuvent provoquer des effets indésirables tels que la perte de poids, une baisse de la température corporelle, de la déshydratation, ainsi que des douleurs ou un inconfort. Deuxièmement, le stress dû à l'hébergement en cage individuelle : Après les chirurgies, les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pour protéger les implants fragiles placés lors des chirurgies. Bien que ces cages permettent des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux, les souris sont des animaux qui vivent habituellement en groupe. Cette séparation peut donc provoquer un certain stress ou de l'angoisse, car elles se retrouvent privées de la compagnie de leurs congénères. Troisièmement, les expériences comportementales : Les animaux sont motivés soit par une récompense alimentaire, associée à une légère restriction alimentaire avant certaines séances, soit par la recherche d’une plateforme dans des expériences aquatiques. Ces situations peuvent induire un stress temporaire ou de l’anxiété. MODIFICATION certains animaux réaliseront une tache comportementale aquatique qui peux provoquer un stress et une légère hypothermie.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures. Des prélèvements seront réalisés après la mort afin d’analyser le cerveau. Ces analyses permettront d’identifier les connexions cérébrales étudiées, de vérifier la position des dispositifs implantés (fibres optiques et électrodes) et de réaliser des analyses biologiques complémentaires (notamment immunologiques).

Remplacement

L’étude des bases neurales qui sous-tendent les capacités de navigation requiert de manière indispensable l’utilisation d’animaux capables de telles performances de manière à en étudier les mécanismes sous-jacents. Étant donné que les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'investigation de comportements complexes, le rongeur demeure donc l'espèce la plus appropriée. La souris est un animal explorateur, ce qui se prête parfaitement à notre sujet de recherche. Ainsi, des travaux précédents de l’équipe ont montré la validité de ce modele animal dans l’étude de la navigation spatiale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 197 animaux. Ce nombre est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et réduit au maximum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ce projet utilisera des implants permettant des enregistrements électrophysiologiques simultanés d'une grande population de neurones localisés dans différentes structures cérébrales, permettant de collecter des données en plus grande quantité par souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux requis. L’analyse des données électrophysiologiques et comportementales s’effectuera avec des tests statistiques en ajustant des modèles à effets mixtes généralisés avec des effets aléatoires imbriqués pour tenir compte de la variabilité entre les souris ou les sessions au sein des souris.

Raffinement

À leur arrivée dans l’animalerie les animaux ont une periode d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils sont ensuite manipulés et surveillés quotidiennement par les mêmes experimentateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (Grille de scoring). Les souris subissant une chirurgie seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthesiant et receveront une injection d'analgésique et d'un anesthésique local au lieu de l’incision chirurgicale. De plus, un anesthésique local sous forme de créme est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au debut et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de déterioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront isolés pendant environ 4 mois. Néanmoins pendant cette période un nid végétal ainsi qu’un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Pour obtenir un comportement optimal, nous régulons la quantité de nourriture disponible pour les animaux durant les jours d’enregistrement (environ 3 mois) afin qu’ils soient plus motivés pour trouver les miettes de céréales au chocolat qui sont disposées aléatoirement dans l’environnement. Nous diminuons donc la quantité de nourriture d’ad libitum à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids. Les souris sont pesées chaque jour et nous surveillons que leur perte de poids ne soit pas excessive. Pendant le weekend les souris ont de la nourriture ad libitum ce qui leur permet de retrouver leur poids de référence.AJOUT: Pour les tests de comportement aquatique, des mesures de raffinement supplémentaires sont mises en place : durée limitée des essais, séchage et repos entre chaque session, et surveillance continue pour minimiser stress et hypothermie.

Choix des espèces

La souris est le modèle traditionnellement utilisé au laboratoire. Nous disposons donc de tout le matériel réglementaire et nécessaire à son hébergement. Il s’agit d’un mammifère explorateur, qui est le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants en termes de performance de navigation qui est notre sujet de recherche. L'équipe a développé de nombreux tests de comportement pour cet animal au cours de travaux antérieurs, parmi lesquels ceux qui servent de fondement à nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Comme les procédures d'enregistrement électrophysiologique combinées à l'optogénétique prennent plusieurs semaines, elles ne peuvent être effectuées que sur un cerveau dont le développement est stable. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 8 mois maximum.

Des seuils d'alerte déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort des animaux qui se dégradent trop. 64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant une à cinq semaines pour reproduire une malnutrition infantile, avec trois injections et un retard de croissance attendu. Le projet, présenté comme pilote, cherche à décrire comment ce régime modifie la multiplication des cellules de l'intestin, en comparant mâles et femelles.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait altérer le développement des cellules qui contribuent à l’absorption des nutriments. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une procédure pilote qui guidera le protocole pour la procédure complète, l’idée étant de comprendre à quel rythme les cellules intestinales se divisent en fonction du régime, celui-ci étant un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description de la multiplication des cellules dans l’intestin permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

64 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 1 ou 5 semaines. Chaque animal sera injecté avec 3 produits différent (30 secondes / injection) : un jour et demi avant, un jour avant, et juste avant la fin de la procédure. A 28 jours, 36 souris seront anesthésiées (3 minutes). A 56 jours, 28 souris seront anesthésiées (3 minutes).

Impact sur les animaux

Les trois injections de produits peuvent entraîner un gonflement ou un oedème, dont l’apparition sera surveillée après la procédure. Le régime faible en protéines a pour conséquence un retard de croissance en taille.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 7 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur des données que nous avons déjà pour la mesure de la prolifération chez les souris adulte. La mesure de plusieurs paramètres sur chaque souris permet d’éviter la multiplication des cohortes. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. La nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 1 ou 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.

197 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, pour étudier le rôle d'un neuropeptide, la kisspeptine, dans le traitement cérébral des odeurs sociales. Chaque animal subit une neurochirurgie d'environ cinquante minutes, les femelles une ovariectomie, des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine répétés, plus six injections avant des tests olfactifs. La chirurgie peut provoquer hémorragies, baisse de température et douleurs pendant deux à trois jours, et l'isolement sept jours avant les tests ajoute un stress. Les souris ayant reçu un traitement sont tuées pour prélever le cerveau, celles servant aux prélèvements d'urine étant tuées ou remises à d'autres chercheurs.

Objectifs

Chez la plupart des animaux, les odeurs sont cruciales pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont perçues, intégrées et codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Il a été montré que la kisspeptine, un neuropeptide déterminant dans le contrôle de la reproduction, ou son récepteur, sont exprimés dans deux structures cérébrales connectées participant au relai des informations olfactives. Récemment, une de ces deux régions cérébrales participant à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions de cette structure chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs et provoquent une diminution de la réactivité sexuelle et un évitement des contacts sexuels. Cependant, le rôle de la Kisspeptine dans les deux structures cérébrales d’intérêt comme centres de traitement olfactif régulant les comportements sociaux reste peu compris à ce jour. L'objectif de ce projet est donc de déterminer le rôle de la Kisspeptine dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de montrer que la Kisspeptine n'est pas seulement un régulateur clé de l'axe « cerveau-appareil génital » mais qu’il peut aussi agir en amont dès la transmission des odeurs. Les résultats issus de ce projet pourront potentiellement permettre d'ouvrir la voie vers l'utilisation de la Kisspeptine en voie intranasale pour la modulation des comportements sexuels chez les rongeurs de manière non invasive.

Procédures

Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 50 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectuée par animal. Les ovariectomies sont d'une durée de 15 minutes environ par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevée entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Chaque souris recevra au total 6 injections de traitement (Kp10, Kp54 ou contrôle) (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections sous cutanées ne dureront que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l'injection des traitements ou du retrait des ovaires peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne ou des flancs. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines ou réaliser les administrations intranasales est possible. Il s’agira d’un stress aigü de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests de comportement sexuel pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.

Devenir

Tous les animaux test recevant un traitement intranasal ou dans la LHb seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine seront euthanasiés par le personnel animalier ou mis à disposition d'autres chercheurs pour d'autres études.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité de neurones appartenant à plusieurs structures olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulation interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. Le nombre d’individu défini par groupe permet d'assurer une puissance statistique suffisant pour obtenir des résultats robustes. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaires, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. Enfin la significativité des résultats sera testée en utilisant les tests statistiques appropriés. Dans le détails, nous aurons donc besoin de 197 animaux au total, 65 animaux stimuli (15 mâles pour les comportements sexuels et collecte d'urine, 30 femelles pour la collecte d'urine et 20 femelles pour le comportement sexuel); 60 animaux pour la procédure 1 : 10 animaux pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes; 72 animaux pour la procédure 2 : 12 animaux par groupe pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes

Raffinement

Lors des chirurgies, les souris recevront une sédation analgésique suivi d’une anesthésie. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroidien. L’administration d'anti-inflammatoire sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoires si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant les chirurgies pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra un antagoniste de l'anesthésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes qui seront âgés de 8 semaines, âge minimum de la maturité sexuelle, nécessaire à notre étude.