Souris

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques exprimant deux onco-protéines du papillomavirus reçoivent un allergène cutané, une exposition aux UV ou des mesures d'oreille sous brève anesthésie, pour étudier l'effet de ces protéines sur le système immunitaire. Le porteur indique que l'application de l'allergène ne génère pas de douleur apparente et que les doses d'UV sont contrôlées pour éviter des lésions cutanées. Il affirme que le développement d'une réponse immunitaire est trop complexe pour être étudié in vitro.

Objectifs

Le cancer de la peau de type non-mélanome (Non-Melanoma Skin Cancer, NMSC) est la forme de cancer la plus répandue dans le monde et particulièrement chez les populations adultes à peau claire. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l’apparition de ce type de cancer reste un enjeu sociétal mondial, le nombre de cas détectés par an étant en constante augmentation. Parmi les facteurs de risques majeurs impliqués dans le développement de ce cancer, il a déjà été démontré une coopération entre les rayons ultraviolets et l’infection par les papillomavirus humains cutanés (HPV). L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’impact de 2 onco-protéines du virus HPV sur l'immuno-surveillance tumorale et plus globalement, sur les réponses immunitaires. Pour cela, des souris transgéniques exprimant ces onco-protéines au niveau de la peau seront comparées à des souris sauvages contrôles. Leur réponse immunitaire sera étudiée dans un modèle d’hypersensibilité de contact induite par l'application d'un allergène sur la peau, car il reproduit bien le phénomène d'inflammation locale généré suite à une exposition aux UVs. Ce modèle est bien établi et couramment utilisé dans la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir les connaissances sur les mécanismes de la coopération entre les UVs et une infection par un papillomavirus dans le développement de cancers cutanés. A terme, la mise en évidence des mécanismes immunitaires qui sont dérégulés dans ce contexte pourrait mener à l’identification de cibles thérapeutiques pour le développement de traitement prophylactiques face à ces cancers.

Procédures

_Application d’un allergène sur la peau. Cette procédure concerne 560 animaux. Parmi eux, 220 animaux subiront une application unique, 340 animaux subiront 2 applications espacées de 5 jours. La durée nécessaire pour cette intervention est de 3 minutes par souris environ. _Mesure quotidienne de l'oreille, sous brève anesthésie, pendant 3 jours consécutifs. Cette procédure concerne 220 animaux, et sa durée est d'environ 3 minutes par souris. _Exposition de la peau aux UVs. Cette procédure concerne 80 animaux, qui seront exposés à une faible dose d’UVs quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. Sa durée est de 2 minutes par souris environ.

Impact sur les animaux

L'application épicutanée d'un allergène chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. Cette procédure peut conduire les souris à se gratter, mais il n'a jamais été observé de signe excessif de grattage dans ce modèle. Concernant les expositions aux UVs, elles sont réalisées à faible dose, et cette dernière est bien contrôlée de manière à ne pas induire de lésions cutanées chez l'animal. Il est à noter que les onco-protéines exprimées par les souris transgéniques utilisées dans ce projet peuvent conduire au développement de tumeurs cutanées uniquement en coopération avec les UVs, si ces souris sont exposées à des doses croissantes et pendant de longues périodes (plus de 20 semaines). Les expériences d'exposition aux UVs qui seront réalisées dans ce projet ayant une durée maximale de 18 jours, les animaux transgéniques n'ont pas de risques de développer des tumeurs. En résumé, les effets indésirables attendus dans ce projet sont donc le stress généré par le contact avec l’expérimentateur, et une réaction inflammatoire locale et modérée au niveau du site d’exposition aux UVs ou à l'allergène.

Devenir

A l’issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort de manière à récolter les tissus ou organes étudiés. Cela permettra de réaliser ex vivo une analyse fine de la réponse immunitaire développée chez ces animaux, à l’échelle moléculaire et cellulaire.

Remplacement

Le papillomavirus humain est impliqué dans le développement de tumeurs épithéliales bénignes et malignes. L’influence des protéines du papillomavirus ne peut être visible que dans un épithélium complet, étant capable de se différencier (habitat naturel du papillomavirus). De plus, le développement d’une réponse immunitaire est un phénomène biologique très complexe impliquant une collaboration étroite de l’ensemble des cellules immunitaires, ainsi qu’une forte influence de l’environnement, rendant impossible son étude par des tests in vitro.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base d'expériences précédentes ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique des résultats. Ainsi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et une grande importance sera accordée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le plus adapté pour l'étude de mécanismes immunologiques. De plus, ce modèle permet d’utiliser des animaux génétiquement modifiés n'existant que dans cette espèce. Le modèle murin utilisé correspond ainsi au seul modèle connu pour étudier les effets des papillomavirus cutanés sur le système immunitaire. Enfin, ce modèle étant couramment employé, cela permettra de discuter les résultats obtenus à la lumière des données existantes dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 8 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire doit être mature et non vieillissant.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale sous-cutanée, puis des agents anticancéreux par injection intrapéritonéale ou péritumorale, pour tester une technologie de délivrance locale prolongée dans le mélanome. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité systémique et renvoie les applications cliniques à un brevet et à des essais futurs. Il conclut que la preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles précliniques proches de la tumeur humaine et qualifie cette étape d'"incontournable".

Objectifs

L’apparition de nouvelles molécules anticancéreuses durant ces 10 dernières années a conduit à une révolution dans le traitement de certains cancers, en particulier le mélanome. Cependant seule une fraction des patients (30% à 50%) montrent une réponse efficace et durable au traitement et nombre d’entre eux sont obligés de stopper le traitement à cause d’effets secondaires sévères, surtout lorsque plusieurs molécules sont combinées et administrées au patient. Il y a donc une urgence pour comprendre les mécanismes de résistances aux thérapies actuelles et mettre en évidence de nouveaux protocoles thérapeutiques avec une toxicité plus faible et une tolérance maximale. Ce projet vise en particulier à démontrer une meilleure tolérance et une meilleure efficacité de traitements combinés montrant des effets secondaires sévères aux doses efficaces. Nous utiliserons une nouvelle technologie, nommée BEPO, pour administrer des molécules en solution ou en suspension localement sur le site tumoral permettant une diffusion lente des médicaments. Nous éviterons de ce fait les effets indésirables observés lorsque ces molécules sont injectées par voie classique intraveineuse. Cette technologie a fait ses preuves dans des modèles de maladies inflammatoires (polyarthrite rhumatoïdes) et l’objectif principal de ce projet et d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ce procédé dans le modèle de tumeur solide de mélanome cutané pourlequel nous avons une grande expertise. Ce nouveau mode d’administration ouvrira de nombreuses possibilités en thérapie anti-cancéreuse et constituera une véritable avancée dans l’administration des agents anti-cancéreux. D’autre part la diffusion lente et continue des drogues au voisinage de la tumeur augmentera l’efficacité thérapeutique, nous permettant de tendre vers des rémissions totales plus fréquentes. L’idée, à travers les modèles d’études précliniques décrits dans ce projet, est de rapidement mettre en œuvre de tels protocoles chez les patients.

Bénéfices attendus

Le but de notre projet est double: i) améliorer l’efficacité des médicaments antitumoraux en administrant plusieurs molécules en même temps, en une dose unique et avec une diffusion de longue durée sur le site de la tumeur ii) éliminer les effets secondaires souvent sévères de ces médicaments lorsqu’ils sont administrés de manières répétées par voie intraveineuse. En effet la délivrance locale évitera d’endommager les tissus sains, ce qui se passe en général lorsque les agents anticancéreux sont inoculés par voie intraveineuse et ce qui explique la majeure partie de leur toxicité et parfois pousse à l’arrêt du traitement. Le partenariat que l’on développe dans le cadre de ce projet nous permettra de rapidement breveter ce concept et d’envisager des applications cliniques dans la mesure où nous aurons validé les effets sur les deux modèles précliniques proposés dans ce projet. Nous sommes également en collaboration avec des cliniciens désireux de démarrer des essais cliniques utilisant ces thérapies inovantes capables d'améliorer grandement le confort des patients au cours du traitement et surtout d'augmenter leur chance de guerison sans récidive.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude (1600 souris) seront greffés une fois en sous cutané (15 secondes/souris, contention comprise). Pour la procédure n°1, en plus de la greffe sous-cutanée, la moitié des animaux (260 souris) recevra les différents agents thérapeutiques en injection intrapéritonéale (10 secondes/souris, contention comprise), l’autre moitié (260 souris) recevra ces mêmes agents thérapeutiques sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Pour les procédures suivantes n°2 et 3 les lots validés dans la procédure n°1 recevront la ou les molécules sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Aucun prélèvement n'est prévu sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’y aura aucun effet indésirable de toxicité systémique de ces drogues comme on pourrait s’y attendre en injection conventionnelle. Des preuves de concepts de ce mode d'administration ont été établies sur des pathologies inflammatoires (polyarthrite) et montrent notamment que ce procédé n’engendre aucun rejet ni effet secondaire avec une tolérance maximale chez la souris. Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs et le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept de ce nouveau mode de délivrance d’agents anticancéreux revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouveaux modes d’administrations de combinaisons thérapeutiques en clinique. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les deux modèles proposés très proches des deux grands groupes de patients atteints de mélanome cutané, nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements sur la croissance tumorale mais aussi de valider ce nouveau mode d’administration très innovant et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale pour un contrôle durable de la pathologie. L'obtention de tels résultats est une étape incontournable si on veut démarrer par la suite des essais cliniques chez l'homme avec ce nouveau procédé. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos combinaisons thérapeutiques et surtout pour valider ce nouveau mode d’administration.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 1600 souris sur 4 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos combinaisons thérapeutiques. Les molécules et combinaisons utilisées le seront de manière séquentielle ce qui implique que lorsque nous aurons des effets significatifs sur un protocole nous nous focaliserons sur celui-ci et ne testerons pas les autres molécules. D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été évalué de manière à obtenir une significativité statistique de nos résultats afin de valider ou d’invalider notre procédure. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur le modèle de mélanome mais également sur d’autres modèles de tumeurs solides nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum . Grace à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous-cutané, nous éviterons ainsi les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l'agressivité et l'isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant à l'euthanasie des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux afin de réduire le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, des diarrhées (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

L'espèce murine C57Bl/6 utilisée dans notre étude est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long-terme. Ces souris C57Bl/6 dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique . Nous avons déjà obtenus l'ensemble des données préliminaires à l'origine de ce projet sur ce modèle et devont continuer avec le même modèle pour une cohérence des résultats. L'âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge ou le système immunitaire est complètement fonctionnel.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une pancréatite, chaque souris reçoit jusqu'à dix-huit injections de céruléine, des gavages et des injections d'antibiotique ou de bactéries, la céruléine pouvant causer des douleurs modérées répétées. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem. Le porteur affirme que les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas ne peuvent être reproduites in vitro et que le modèle animal est le seul auquel il peut recourir.

Objectifs

Le microbiote intestinal influence le développement des maladies digestives. En effet, les patients avec une pancréatite alcoolique présentent des modifications de leur microbiote intestinal en comparaison des patients avec une consommation alcoolique similaire mais sans pancréatite ou développant une atteinte hépatique. On trouve notamment une augmentation des entérocoques, en particulier d’Enterococcus faecalis. Il a été́ démontré que, chez les patients ayant une hépatite alcoolique aigue, les souches d’E. faecalis produisant la toxine cytolysine sont augmentées, cela est corrélé à la sévérité de la maladie. Il est montré que les patients avec une consommation alcoolique excessive développant une pancréatite alcoolique hébergent plus souvent des souches exprimant la cytolysine que les patients ayant une hépatite alcoolique. De plus, l’abondance relative d’E. faecalis productrice de cytolysine est de 10 à 100 plus importante chez les patients développant une pancréatite par rapport à ceux développant une hépatite. Cependant, le rôle de cette souche dans l’apparition et la gravité de la pancréatite n’est pas connu. Notre objectif est de démontrer que cette bactérie est un facteur prédisposant à la pancréatite en particulier lorsque la souche est productrice de la toxine cytolysine. Nous avons isolé des souches de E. faecalis de patients ayant une pancréatite. Notre projet vise à évaluer sur des modèles murins de pancréatite chronique ou aigue induites par la céruléine, l’implication de E. faecalis (avec ou sans production de cytolysine) sur le développement des lésions de pancréatite.

Bénéfices attendus

La pancréatite et ses complications, notamment le risque de cancer du pancréas, sont associées à une mortalité élevée et il existe peu de traitements actuellement. Notre approche vise à évaluer le rôle du microbiote intestinal chez les patients alcooliques, et en particulier d’Enterococcus faecalis, dans la survenue des dommages du pancréas. Si notre hypothèse se confirme, des stratégies de modification du microbiote intestinal, avec éradication de E. faecalis, pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de pancréatite chronique, soit environ 15 000 patients en France, et potentiellement prévenir les complications de la pancréatite sur le long terme, comme le cancer du pancréas.

Procédures

- Induction d’une pancréatite chronique : de 3 à 6 injections maximum intrapéritonéales de céruléine espacées d’une heure, une fois par semaine, pendant 3 semaines soit 18 injections /souris, ce qui concerne 180 souris au total. - Induction d’une pancréatite aiguë : 6 injections intrapéritonéale de céruléine espacées d’une heure,suivi du sacrifice la même journée soit 6 injections intrapéritonéale /souris/ ce qui concerne 120 souris au total. - Gavage PBS ou E. Faecalis : 1 gavage par semaine pendant 2 semaines soit 2 gavages/souris ce qui concerne 168 souris au total. - antibiothérapie préalable au gavage : 1 injection sous cutanée de clindamycine pendant 3 jours, pendant 2 semaines soit 4 injections /souris ce qui concerne 168 souris au total. - injection intraveineuse d’E. Faecalis : 1 injection intraveineuse de souches d’enterococcus faecalis par semaine pendant 2 semaines soit 2 injections intraveineuse/souris ce qui concerne 36 souris au total.

Impact sur les animaux

Le traitement à la céruléine par injections intra péritonéales peut engendrer des douleurs modérées, mais répétées lors des injections et dans les heures qui suivent. Les injections sous cutanées d’antibiotiques peuvent entrainer des douleurs légères au moment de l’injection. Le gavage peut entrainer un stress de la souris, et des douleurs modérées lors du gavage.

Devenir

Mise à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les complications qui vont être observées au cours de la pancréatite mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet correspond à un travail qui permettra de comprendre le lien entre microbiote intestinal, la barrière intestinale et le développement d’une pancréatite. Le modèle animal est le seul auquel nous pouvons avoir recours et qui permet d’intégrer les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas.

Réduction

Nous nous sommes basés pour calculer la taille des groupes sur le dosage d’un marqueur sérique de pancréatite qui est augmentée dans le modèle avec céruléine. Nous avons ainsi déterminé la taille des groupes de souris afin à la fois d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, 12 souris par groupe de comparaison seront utilisées dans les procédures.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 4. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique. Le jour de la mise à mort, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. C’est une des raisons pour laquelle nous demandons à ne pas avoir à pré-traiter les souris par une pommade à la lidocaïne. Nous utilisons pour les injections intra-péritonéales des petites aiguilles et un volume réduit afin de minimiser la douleur de la piqure. Pour les injections en intra-veineuse au niveau du sinus retro-orbital, les souris seront anesthésiées et les 2 injections à une semaine d’intervalle seront réalisées sur le sinus gauche puis à droite la semaine suivante. Les gavages réalisés sur souris vigile pour éviter les fausses routes seront également réalisées 2 fois à 1 semaine d’intervalle avec un volume réduit à l’aide de canules de gavage fine et courte bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les injections sous cutanées permettant l’administration des antibiotiques au niveau interscapulaire seront réalisées. Dans tous les cas les souris hébergées par 4 seront remises dans la cage avec leurs congénères avec une quantité de sciure augmentée favorisant leur enfouissement, en particulier après les manipulations.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la physiopathologie de la pancréatite sont proches de ceux observés chez l’Homme.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, rendue obèse par un régime hypercalorique, subit l'implantation chirurgicale de canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus, opération d'une quarantaine de minutes qui peut provoquer un saignement du crâne, puis des prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur reconnaît que certaines souris supportent mal l'anesthésie et que la chirurgie peut entraîner douleur et difficultés de récupération. Il affirme que ces expériences ne peuvent se faire in vitro car elles requièrent l'observation de paramètres sanguins.

Objectifs

>>>Contexte. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial. Elle résulte d’un déséquilibre entre les apports (alimentation) et les dépenses (exercice physique) d’énergie. Une des complications majeures dans l'obésité est l'apparition d'un diabète de type 2 qui conduit à un taux de glucose dans le sang (glycémie) trop important, ou hyperglycémie chronique, par une altération de la secrétion et/ou de l'effet de l'hormone pancréatique hypoglycémiante, l'insuline. Le GLP-1 (pour glucagon-like peptide-1) est une incrétine, une hormone intestinale qui stimule la sécrétion d'insuline pancréatique lorsque la glycémie est élevée, après un repas notamment. Les analogues du GLP-1 sont commercialisés afin d'aider les patients diabétiques à réguler leur glycémie. Cependant, les mécanismes d'action du GLP-1 sur le cerveau sont très mal connus. Au laboratoire, nous avons montré que l'action du GLP-1 sur son récepteur dans le BO a pour conséquence d’améliorer la tolérance au glucose de souris rendues obèses par une alimentation hyperlipidique. Il s'agit donc d'un effet protecteur très prometteur à étudier. Ceci est d'autant plus intéressant que le BO est une structure cérébrale qui permet de donner des indications sensorielles sur la toxicité ou l'aspect agréable des aliments et qu'un mauvais fonctionnement du BO a été décrit chez le patient obèse. >>>Objectifs. Dans ce projet, nous voulons donc caractériser le rôle de la voie neuronale entre le BO et l'hypothalamus dans la régulation bénéfique de la glycémie chez les souris obèses. L'hypothalamus est une structure-clé de la régulation du métabolisme énergétique, qui permettrait l'augmentation d'insuline plasmatique en périphérie par l’activation de la voie GLP-1 dans le BO. Pour vérifier l'hypothèse d'un passage du signal engendré par le GLP-1 dans le BO vers le pancréas via l'hypothalamus, nous proposons d'injecter de la bicuculline par une canule placée à demeure dans le noyau paraventriculaire et ainsi en empêcher l'activation. Le PVN est le noyau de sortie de l'hypothalamus et module les neurones sympathiques prégangliaux de la moëlle épinière qui projettent sur le pancréas. Si la bicuculline bloque l'action bénéfique de l'injection du GLP-1 dans le BO, alors nous aurons démontré que l'hypothalamus est la structure cérébrale intermédiaire permettant un relais avec la périphérie dans la régulation de l'insuline. >> Nombre total de souris: 48 (24 souris obèses et 24 témoins).

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, les expériences publiées afin de démontrer que les mécanismes d'action bénéfique du GLP-1 sur les problèmes de régulation glycémie et de la prise alimentaire chez les souris obèses et diabétiques passeraient uniquement par une action sur l'hypothalamus n'ont pas été concluantes et les recherches sont portées sur l'identification de nouvelles structures cérébrales permettant cet effet. Il est en fait apparu qu'il existe un réseau de structures cérébrales complexes sensibles au GLP-1 et qui permet cette régulation de la glycémie. Nous avons précédemment exploré et montré la possiblité de la participation du BO dans ce réseau, une structure impliquée à la fois dans le codage cérébral des informations olfactives et la régulation de l'homéostasie glucidique. Ce projet permettra de mieux comprendre les effets du GLP-1 et de ses analogues sur le système nerveux central, et notamment sur le système olfactif. Il est tout à fait possible que dans le futur le GLP-1 puisse être délivré au patient par voie intranasale, de façon totalement non invasive contrairement aux piqures répétées, comme l'insuline, qui est depuis récemment utilisée par cette nouvelle voie d'injection.

Procédures

Le cumul des cinq expériences qui sont effectuées dans chaque procédure les classent toutes en une classe de sévérité modérée. En particulier, trois expériences requièrent une procédure chirrugicale et des prélévements sur animaux vigiles >>> Expérience 2 (toutes procédures): chirurgie. Les 48 souris seront implantées avec des canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus. Chaque chirurgie dure une quarantaine de minutes. >>> Expérience 4 (procédure 1 et 2, 24 souris): prélévements sanguins mineurs chez la souris vigile en vue d'un test de tolérance au glucose. Le prélévement se fait en quelques secondes après avoir effectué une petite coupure sur le bout de la queue. >>> Expérience 5 (toutes procédures, 48 souris): Réponse insulinémique de la phase céphalique (Cephalic phase insulin release: CPIR). Pour mesurer le taux d'insuline dans le sang, deux prélévements sanguins de faible volume seront effectués au bout de la queue.

Impact sur les animaux

Pour chaque procédure, des nuisances sont possibles et une approche bioéthique est adaptée pour les prévenir, les diminuer et les éliminer si possibles. Pour l'expérience 1 (procédure 1 et 3) de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion. Pour l'expérience 2 dans toutes les préocédures, qui consiste en une chirurgie pour installer les canules d'injection dans le BO et le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, des souris peuvent mal supporter l'anesthésie et la chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour les tests métaboliques, OGTT (expérience 4, procédure 1 et 2) et ITT (expérience 4, procédure 3 et 4) des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir et pertuber l'animal dans sa récupération.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. 3 souris de chaque procédure seront perfusées au paraformaldéhyde 4% après une injection de pentobarbital en overdose afin de vérifier l'emplacement des canules par immunohistochimie de coupes cérébrales.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet visant à étudier le rôle de l'incrétine GLP-1 sur le cerveau et sur la glycémie, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres sanguins. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Même si chez les poissons il existe des équivalents de certains groupes de neurones des mammifères, nous ne disposons pas de modèle d'obésité dans cette espèce, qui se nourrit de façon très différente par rapport aux mammifères. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6 mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés est fortement liée à la puissance statistique qui pourra montrer l'effet recherché, ici si nous pouvons bloquer l'effet du GLP-1 bulbaire par l'injection de bicuculline dans l'hypothalamus. Ceci nous permettra de définir la voie cérébrale impliquée dans la régulation de la glycémie à partir du bulbe olfactif. L'ensemble des expériences réalisées au laboratoire ont montré qu'un nombre maximal 12 individus doit être engagé par groupe. Ce nombre permet de compenser des exclusions éventuelles de souris qui ne répondent pas aux tests pharmacologiques ou métaboliques. Nous aboutissons ainsi toujours à un nombre minimum de 8 souris nécessaires à la puissance statistique de nos comparaisons. De plus, ce projet bénéficiera du développement de 2 projets antécédents qui nous ont permis de déterminer les doses de GLP-1 dans le bulbe et de bicuculline dans l'hypothalamus. Il n'y aura donc pas d'animaux engagés dans la recherche d'un effet dose/réponse de ces agents pharmacologiques. De plus, l'implantation de canules à demeure pour injecter le GLP-1 dans le bulbe olfactif et la bicuculline dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus chez la souris vigile permet d'utiliser chaque souris comme sa propre témoin et de réduire grandement le nombre de souris qui aurait été nécessaire par une approche pharmacologique aigüe: nous effectuerons différentes expérimentations sur des mêmes groupes de souris tant que celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses, non stressantes pour l’animal. Tests statistiques: vérification de la normalité de la distribution par un test de Shapiro-Milk. Si la distribution suit la loi normale, comparaison intragroupe sous différentes injections par un test d'ANOVA, sinon par un test de Kruskal-Wallis (et tests posthoc adaptés si nécessaires).

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Les animaux seront examinés individuellement tous les jours par le personnel de l'animalerie. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

La souris C57BL6 représente une souche murine adéquate comme modèle d'étude du récepteur du GLP-1 dans le bulbe olfactif chez les souris obèses versus des souris contrôles. Elle a notamment été utilisée pour les études précédentes sur l'action des incrétines dans le système nerveux central. De plus, elle a un système olfactif développé propice à l'étude du bulbe olfactif. Enfin, nous avons l'expertise depuis plusieurs années i) du régime hypercalorique rendant les souris progressivement obèses ii) de l'implantation de canule dans le BO chez la souris anesthésiée et de la surveillance postchirurgicale iii) du suivi du bien-être de l'animal après injection. Pour rendre les souris obèses, une alimentation hypercalorique leur est fournie: à partir de 3 mois de cette alimentation, elles présentent un poids allant jusqu'à 10 ou 15 grammes supérieures aux souris sous régime standard. Comme le régime commence à 6 semaines d'âge, les souris qui seront injectées et testés métaboliquement auront donc au moins 4 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.

Objectifs

L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.

Bénéfices attendus

En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.

Remplacement

Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.

Réduction

Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.

Raffinement

Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).